Embed Size (px)
Citation preview
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ
UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
VYTAUTAS JAKUTIS
PUSIAU KIETO PREPARATO SU ARBUTINU TECHNOLOGIJOS
KŪRIMAS, KOKYBĖS IR STABILUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas:
Doc. dr. Zenona Kalvėnienė
KAUNAS, 2016
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ
UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
VAISTŲ TECHNOLOGIJOS IR SOCIALINĖS FARMACIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
PUSIAU KIETO PREPARATO SU ARBUTINU TECHNOLOGIJOS
KŪRIMAS, KOKYBĖS IR STABILUMO TYRIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas Darbą atliko
Doc. dr. Zenona Kalvėnienė Magistrantas Vytautas Jakutis
Data: Data:
Recenzentas:
Kaunas, 2016
3
TURINYS
SANTRUMPOS ...................................................................................................................... 6
SANTRAUKA......................................................................................................................... 7
SUMMARY............................................................................................................................. 9
ĮVADAS ................................................................................................................................ 12
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI .................................................................................. 13
Darbo tikslas: ......................................................................................................................... 13
1. LITERATŪROS APŽVALGA ......................................................................................... 14
1.1. Oda ir vaistinių medžiagų prasiskverbimas pro ją. ........................................................ 14
1.2. pH reikšmės svarba ........................................................................................................ 15
1.3. Pusiau kieti odos preparatai ............................................................................................ 15
1.4. Emulsiniai pagrindai ....................................................................................................... 16
1.5. Emulsijos v/a, jų savybės ir technologiniai aspektai ...................................................... 17
1.6. Odą balinančios medžiagos. ........................................................................................... 17
1.7. Bruknė ............................................................................................................................ 18
1.8. Arbutinas ........................................................................................................................ 19
1.9. Nuoviro gamyba ............................................................................................................. 19
1.10. Saulėgrąžų aliejus (Oleum Helianthi) .......................................................................... 20
1.11. Ricinų aliejus (Oleum Ricini) ....................................................................................... 20
1.12. Kakavos sviestas (Oleum Theobromatis) ..................................................................... 21
1.13. Kokosų aliejus (Cocois oleum raffinatum) ................................................................... 21
1.14. Bičių vaškas (Cera flava) ............................................................................................. 22
1.15. Vilnų riebalai (Adeps lanae) ......................................................................................... 22
1.16. Sorbitano monooleatas ................................................................................................. 23
1.17. Išgrynintas vanduo (Aqua purificata) ........................................................................... 23
1.18. 2-Fenoksietanolis (Phenoxyethanolum) ....................................................................... 24
4
2. TYRIMO METODIKA .................................................................................................... 24
2.1. Tyrimo objektas: ............................................................................................................. 24
2.1.1. Naudotos medžiagos: .................................................................................................. 24
2.1.2. Tyrime naudota įranga: ............................................................................................... 25
2.2. Tyrimo metodai .............................................................................................................. 27
2.2.1. Tyrimo atlikimo planas ............................................................................................... 27
2.2.2. Bruknių lapų žaliavos tyrimai. .................................................................................... 28
2.2.2.1. Drėgmės nustatymas ................................................................................................. 28
2.2.2.2. Žaliavos smulkumo nustatymas ............................................................................... 28
2.2.3. Bruknių lapų vandeninės ištraukos gamyba ................................................................ 28
2.2.4. Spektrofotometrija ....................................................................................................... 29
2.2.4.1. Bendrojo polifenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu ... 29
2.2.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodas ............................................ 31
2.2.6. Pusiau kieto odos preparato su bruknių lapų vandenine ištrauka, gamyba ................. 32
2.2.7. Centrifugavimo testas .................................................................................................. 32
2.2.8. pH reikšmės nustatymas .............................................................................................. 33
2.2.9. Tekstūros analizė ......................................................................................................... 33
2.2.10. Vienalytiškumo vertinimas ........................................................................................ 34
2.2.11. Antioksidacinio aktyvumo vertinimas ....................................................................... 34
2.2.12. Stabilumo tyrimai ...................................................................................................... 35
2.2.13. Statistinė analizė ........................................................................................................ 36
3. REZULTATAI .................................................................................................................. 37
3.1. Bruknių lapų žaliavos kokybės tyrimai .......................................................................... 37
3.2. Bruknių lapų vandeninės ištraukos tyrimai .................................................................... 37
3.2.1. Bendrojo polifenolinių junginių kiekio nustatymas .................................................... 37
3.2.2. Arbutino kiekio ištraukoje nustatymas ........................................................................ 38
3.3. Pusiau kieto preparato sudėties parinkimas .................................................................... 39
5
3.4. Šviežiai pagaminto pusiau kieto preparato AA palyginimas su kontrolinėmis grupėmis.40
3.5. Šviežiai pagaminto pusiau kieto preparato kokybės tyrimai. ......................................... 41
3.6. Šviežiai pagamintų mėginių centrifugavimo testas ........................................................ 42
3.7. Šviežiai pagamintų mėginių pH reikšmės nustatymas ................................................... 42
3.8. Šviežiai pagamintų mėginių antioksidacinis aktyvumas ................................................ 43
3.9. Mikroskopinis šviežiai pagamintų mėginių vaizdas. ..................................................... 43
3.10. Šviežiai pagamintų mėginių tekstūros analizė ............................................................. 44
4. PUSIAU KIETO PREPARATO STABILUMO TYRIMAI. ............................................ 46
4.1. Centrifugavimo testas stabilumo tyrimų metu ............................................................... 46
4.2. pH reikšmės pokyčio tyrimas ......................................................................................... 46
4.3. Antioksidacinio aktyvumo pokyčio tyrimas ................................................................... 47
4.4. Mikrskopinio vaizdo pokyčio tyrimas ............................................................................ 48
4.5. Pusiau kieto preparato tekstūros pokyčių nustatymas stabilumo tyrimų metu .............. 49
4.5.1. Kietumo pokyčių nustatymas ...................................................................................... 49
4.5.2. Konsistencija ............................................................................................................... 49
4.5.3. Kohezija ....................................................................................................................... 50
4.5.4. Klampos indeksas ........................................................................................................ 51
5. REZULTATŲ APTARIMAS............................................................................................ 52
6. IŠVADOS .......................................................................................................................... 54
7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ................................................................................ 55
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS ............................................................................................. 56
9. PRIEDAI ........................................................................................................................... 61
6
SANTRUMPOS
AA – antioksidacinis aktyvumas
al. – aliejus
a/v – aliejus vandenyje
DHICA – 5,6-dihidroksiindolo-2-karboksi rūgštis
DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilas
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija
Eur. F. – Europos farmakopėja
FDA – Jungtinių Amerikos Valstijų maisto ir vaistų administracija (US Food and Drugs administration)
HLB – hidrofilinis – lipofilinis balansas
ištr. – ištrauka
mg – miligramai
proc. – procentai (%)
RBD – rafinuotas, balintas, dezodoruotas (kokosų aliejus)
UV – ultravioletiniai spinduliai
UV-VIS – matomų ultravioletinių spindulių spektroskopija
vand. – vandeninė
v/a – vanduo aliejuje
7
SANTRAUKA
Vytautas Jakutis „Pusiau kieto preparato su arbutinu technologijos kūrimas, kokybės ir stabilumo
tyrimas“/ Mokslinio darbo vadovė doc. dr. Z. Kalvėnienė; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto
Medicinos akademija, Farmacijos fakultetas, Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedra,
Kaunas, 2016.
Tyrimo tikslas: sukurti pusiau kietą preparatą odai ir vertinti jo kokybę.
Tyrimo uždaviniai: 1) Surinkti ir susisteminti mokslinę literatūrą apie pigmentinių dėmių
atsiradimo priežastis, arbutiną, pusiau kietų odos preparatų technologinius ypatumus įvertinant bruknių
lapų ištraukų panaudojimo galimybes ir kokybės vertinimo metodus; 2) Parinkti pusiau kieto odos
preparato probleminei odai sudėtį ir technologiją; 3) Įvertinti pusiau kieto preparato kokybę, nustatant jo
klampą, pH reikšmę, tekstūrą ir stabilumą; 4) Nustatyti arbutino kiekį bruknių lapų ištraukoje ir
pagaminto pusiau kieto odos preparato antioksidacinį aktyvumą.
Tyrimo metodai: žaliavos kokybė vertinta nustatant žaliavos drėgmės kiekį ir smulkumą.
Veikliosios medžiagos nustatymui pagamintoje ištraukoje naudotas spektrofotometrinis ir ESC metodai.
Produkto stabilumo įvertinimui naudotas centrifugavimo testas. Nustatyta pH reikšmė, atlikta tekstūros
analizė ir vienalytiškumo vertinimas mikroskopuojant, bei antioksidacinio aktyvumo vertinimas DPPH
laisvojo radikalo surišimo metodu.
Tyrimo rezultatai: nustatyta, kad bruknių lapų smulkumas ir nuodžiūvis atitinka Europos
farmakopėjoje augalinei žaliavai keliamus reikalavimus. Pagamintoje bruknių lapų vandeninėje ištraukoje
(1:10) įrodytas arbutino buvimas ir nustatytas jo kiekis žaliavoje 4.08±0,21 proc. Nustatyta, kad bruknių
lapų nuoviruose bendrasis polifenolinių junginių kiekis pagal arbutiną yra 21.48 ± 0.68 mg/ml. Stabilumo
tyrimų metu buvo stebėtos fizikinės pagamintų mėginių savybės ir tikrintas antioksidacinis aktyvumas bei
pH reikšmė. Nustatytas geriausiai išsilaikęs mėginys M 27.
Išvados: 1) Vandeninė bruknių lapų ištrauka pagaminta pagal Eur.F. aprašą santykiu (1:10).
Bendras fenolinių junginių kiekis, ištraukoje nustatytas spektrofotometriniu metodu, o ESC analizės
metodu įrodytas veikliosios medžiagos arbutino, buvimas ištraukoje ir nustatytas jo kiekis žaliavoje. 2)
Sumodeliuota pusiau kieta, agregatyviai stabili, emulsinė sistema (v/a), kurios sudėtyje yra 33 proc.
vandeninės bruknių lapų ištraukos, pasižymėjo stipriu antioksidaciniu aktyvumu pagal DPPH laisvojo
radikalo inaktyvinimą, tačiau skirtingam antioksidaciniam aktyvumui tarp skirtingos sudėties mėginių
daro įtaką lipofilinė sistemos dalis. 3) Atlikus pagamintų pusiau kietų preparatų mėginių kokybės tyrimus
8
nustatyta pH reikšmė yra neutrali, o atlikus tekstūros analizę nustatyta, kad skystosios lipofilinės dalies
kiekis daro stiprią įtaką tekstūros parametrams, pH reikšmė yra nežymiai didesnė nei nustatyta arbutino
stabilumo ribinė reikšmė. 4) Stabilumo tyrimai parodė, kad pusiau kieto preparato su bruknių lapų
vandenine ištrauka mėginių mikroskopinis vaizdas išlieka nepakitęs 2 mėnesius, tekstūros pokyčiai nėra
statistiškai reikšmingi stebint 6 mėnesius, tačiau antioksidacinis aktyvumas kito statistiškai reikšmingai
jau po 2 mėnesių. Siūloma gaminti sudėtis M 27 (procentais: saulėgrąžų aliejus 19.0; ricinų aliejus. 5.0;
kakavos sviestas 5.0; kokosų aliejus 19.0; bičių vaškas 10.0; vand. bruknių lapų ištrauka 33.0; Span 80-
8.0; 2 – fenoksietanolis 1.0) gali būti naudojama 2 mėnesius.
9
SUMMARY
Vytautas Jakutis „Creation of technology of semi solid preparation with arbutin, quality and stability
evaluation“. Master Thesis. Scientific adviser: doc. dr. Z. Kalvėnienė; Lithuanian University of Health
Sciences, Medical Academy, Faculty of Pharmacy, Department of Drug Technology and Social
Pharmacy, Kaunas, 2016.
The aim of research: to design a semi-solid dosage form preparation and evaluate the quality of
the product.
The objectives of research: 1) To collect and organize scientific literature on: occurance of
pigment spots, semi solid dosage forms technological peculiarities, by evaluating decoctum of
lingonberry leaves usage opportunities and quality evaluation methods; 2) Choose the optimal
composition and technology of semi solid preparation for problematic skin; 3) Evaluate the quality of the
semi solid preparation, by determining its viscosity, pH, texture and stability; 4) Determine the amount of
arbutin in the decoctum of lingonberry leaves and the antioxidant activity of the established semi solid
preparation.
Methods used: the quality of plant material was evaluated by determining the humidity and
fineness. Detection of active compound in the decoctum was carried out by spectrophotometry and HPLC
methods. Stability of the preparation was tested by centrifugating. pH value has been determined, also
texture analysis and smoothness by microscopy, were carried out. Also antioxidant activity was evaluated
by using DPPH method of free radical scavenging.
Results: it has been clarified that the fineness of the lingonberry leaves and their loss in drying
coincide with the European Pharmacopoeia herbal raw material requirements. In the produced lingonberry
leaves decoctions (1:10) the presence of arbutin has been proved, and its quantity is 4.08±0,21 pct. The
quantity of phenol compounds in the lingonberry leaves decoctions is 21.48±0.68 mg/ml. During the
stability testing physical parameters of the preparations were monitored, also the antioxidant activity and
pH of the preparations were monitored. It was determined that the most stable preparation was M 27.
Conclusions: 1) The decoction of lingonberry leaves has been made according to Ph. Eur. at the
ratio of (1:10). The amount of phenolic compounds in the decoction has been determined
spectrophotometrically, the presence of arbutin has been proved and the amount of it in the plant material
has been determined by using HPLC method. 2) Stable, semi solid emulsion system (w/o), which had 33
pct. of lingonberry decoction, has been designed. It showed strong antioxidant activity acording to DPPH
10
free radical scavenging, and it has been determined that different composition of lipophilic part shows
different activity. 3) After quality analysis it has been determined that the pH of the preparation is neutral
and the texture analysis has shown that the amount of liquid lipophylic part affects texture parameters, the
pH in the preparation has been determined to be slightly higher than the arbutin stable pH limit. 4)
Stability testing has shown that the microscopic view of the preparation stays stable for 2 months, the
change in texture analysis was not significant during the 6 month period, but the antioxidant activity
changed significantly after 2 months. The proposed composition is M 27 (pct.: sunflower oil 19.0; castor
oil 5.0; cacoa butter 5.0; coconut oil 19.0; bees wax 10.0; lingonberry leaves decoction 33.0; Span-80 8.0;
2 – phenoxyethanol 1.0 ) this composition can be used for 2 months.
11
PADĖKA
Už suteiktas kokybiškas darbo sąlygas ir materialinę bazę atlikti magistrinį baigiamąjį darbą
tema: ,,Pusiau kieto preparato su arbutinu technologijos kūrimas, kokybės ir stabilumo tyrimas“ dėkoju
Lietuvos Sveikatos Mokslų Universiteto Vaistų technologijos ir socialinės farmacijos katedrai.
Už konsultacijas, pasiūlymus ir pagalbą tyrimų metu dėkoju savo darbo vadovei doc. dr. Zenonai
Kalvėnienei.
Už pagalbą tiriant žaliavą, dėkoju Analizinės ir toksikologinės chemijos katedrai ir Mindaugui
Marksai.
12
ĮVADAS
Odos spalvą nulemia tam tikros odos ląstelės – melanocitai. Melanino gamybą dalinai lemia
genai, tačiau odos spalvai įtakos turi saulės UV spinduliai, hormonų veiklos pokyčiai, kai kurie vaistai,
cheminės medžiagos ir bendra sveikatos būklė. Svarbiausia melanino paskirtis – apsaugoti organizmą nuo
saulės ultravioletinių spindulių. Veikiant tirozinazei (ląstelių fermentui), amino rūgštis tirozinas sudėtingų
biocheminių procesų metu transformuojamas į melaniną, kuris koncentruojasi specialiose molekulėse-
melanocituose. Bręsdami jie pasiekia epidermio paviršinius sluoksnius, transportuoja pigmentą į raginį
sluoksnį, kuris atlieka natūralų UV spindulių filtrą. Sutrikus melaniną gaminančių odos ląstelių
melanocitų veiklai ir jų kiekiui, pakinta odos pigmentacija - atsiranda apgamai, strazdanos, rudmės,
senatviniai šlakai bei pigmento nykimas (vitiligo). Apsisaugoti nuo padidėjusios pigmentacijos ir atgauti
tolygią odos išvaizdą gali padėti geras odos priežiūros režimas, apsauginių bei balinančių priemonių
naudojimas. Kosmetikoje, be kitų medžiagų, gerai žinomas odą balinantį poveikį turintis arbutinas. Ši
medžiaga yra nekenksminga, naudojant ant odos, ją balina, turi senėjimą mažinantį poveikį ir veikia kaip
UV filtras [1]. Teigiama, kad arbutino aktyvumas yra susijęs su substrato tirozinazės panašumu vienas
kitam, o tai priveda prie konkurencinio tirozinazės katalizinės funkcijos slopinimo. Taigi arbutinas stabdo
tirozinazės aktyvumą, nepaveikdamas ląstelės gyvybingumo [2]. Tyrimais yra nustatyta, kad miltinės
meškauogės, bruknės, kvapiojo mairūno, kriaušės lapuose yra nemaži kiekiai arbutino. Bruknių lapuose jo
kaupiama 5.0-10.0 proc. [3] 2008 m. Ilgen Ertam ir kt. tyrimais įrodė arbutino aktyvumą pigmentinių
dėmių gydyme [4]. 2015 metais buvo atlikti tyrimai naujo kremo, skirto odos melazmos gydymui. Kremo
sudėtyje yra veikliosios medžiagos: nikotinamidas, arbutinas, bisabololis ir retinaldehidas. Publikacijos
autoriai tyrimais įrodė šio kremo veiksmingumą [5]. Šiuo metu pigmentinių dėmių šviesinimui Lietuvos
rinkoje siūloma AVENE linijos priemonės (veikliosios medžiagos: melanidas, pretokoferilas ir
retinaldehidas), Derma viduals modular produkcija (veikliosios medžiagos: pipirmėtės, šlaitinės rasakilos,
vaistinės veronikos ir paprastosios kraujažolės ekstraktai), Trio white balinančiųjų produktų linija
(veikliosios medžiagos: α-arbutinas, askorbilo gliukozidas).
Iškelta hipotezė, kad bruknių lapų ištrauka, turinti arbutino, reguliuos melanino gamybą,
pasižymės odą balinančiu veikimu. Svarbu parinkti formą, sumodeliuoti sudėtį ir vertinti stabilumą.
Aktualu pagaminti pusiau kietą odos preparatą, panaudojant natūralios kilmės arbutino turinčią ištrauką,
skirtą naudoti kaip odą balinančią ir drėkinančią priemonę. Šio darbo tikslas yra sukurti pusiau kietą
preparatą ir vertinti jo kokybę.
13
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas: sukurti pusiau kietą preparatą ir vertinti jo kokybę.
Darbo uždaviniai:
1. Surinkti ir susisteminti mokslinę literatūrą apie pigmentinių odos dėmių atsiradimo priežastis, arbutiną,
pusiau kietų odos preparatų technologinius ypatumus, įvertinant bruknių lapų ištraukų panaudojimo
galimybes ir kokybės vertinimo metodus.
2. Parinkti pusiau kieto odos preparato probleminei odai sudėtį ir technologiją.
3. Įvertinti pagaminto pusiau kieto preparato kokybę, nustatant jo klampą, pH reikšmę, tekstūrą ir
analizuojant stabilumo tyrimų rezultatus.
4. Nustatyti arbutino kiekį bruknių lapų ištraukoje ir pagaminto pusiau kieto odos preparato
antioksidacinį aktyvumą.
14
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Oda ir vaistinių medžiagų prasiskverbimas pro ją.
Oda – didžiausias žmogaus organas. Jos plotas yra apie 1,6 – 2 m2 ir sudaro apie 20 proc.
kūno masės, tipinio suaugusiojo žmogaus, sveriančio 70 kg, oda sveria apie 4 kg, o kraujo cirkuliacija
odoje sudaro apie 5 – 10 proc. bendro širdies išstumiamo kraujo kiekio [6;7].
Odą sudaro 3 pagrindiniai sluoksniai, kurie dar skirstomi į smulkesnes dalis:
1) Epidermis: raginis ir pamatinis sluoksnis.
2) Tikroji oda (derma): limfagyslės, riebalų liaukos, prakaito liaukos, išorinis kraujagyslių tinklas.
3) Poodis: riebalų ląstelės, nervų skaidulos su receptoriais.
Oda tarnauja kaip barjeras apsaugantis organizmą nuo UV spindulių, mikrobų, cheminių
medžiagų, radiacijos poveikio, šilumos ir drėgmės netekimo. Pažeidus odą atidaromi vartai infekcijai,
atsiranda didelė rizika būti stipriai paveiktiems išorinių fizikinių veiksnių [8]. Nors oda atlieka barjerinę
funkciją tarp organizmo ir aplinkos, tai nereiškia, kad ji nėra laidi. Medžiagos, būdamos tinkamos
konsistencijos, gali patekti pro odą į organizmą, o dėl didelio paviršiaus ploto, kai kuriais atvejais oda gali
1 pav. Odos struktūra [18]
15
būti pagrindinis medžiagų patekimo kelias į organizmą [7]. Šis kelias naudojamas ir gydymo tikslais,
kuriant odos preparatus, iš kurių vaistinė medžiaga patektų į kurį nors odos sluoksnį ar į organizmą,
priklausomai nuo poreikio. Kaip vaistai prasiskverbia pro odą pavaizduota 2 paveikslėlyje.
1.2. pH reikšmės svarba
Odos funkcijos: svarbiausios yra apsauginė, termoreguliacinė ir jutiminė. Sveika oda turi
natūralią apsauginę sistemą, ją sudaro riebalinės ir prakaito liaukos, drėkinamieji veiksniai, amino ir pieno
rūgštys. Šios rūgštys padengia odos paviršių, sudarydamos pH reikšmę 5 – 6. Riebalinių ir prakaito liaukų
sekrecija sudaro odos apsauginį rūgščių sluoksnį. Dominuojant rūgštims, oda yra sausa ir tampri. O
dominuojant bazėms, oda yra riebi. Taigi, pH reikšmė yra svarbi odos priežiūros priemonėse. Jų
uždavinys yra atstatyti natūralią odos rūgščių ir šarmų pusiausvyrą [9]. Optimali odos pH yra nuo 4.0 iki
7.0 [10], o arbutinas yra stabilus kai pH ribos yra nuo 3.5 iki 6.5 [11]. Dėl šios priežasties arbutinas yra
tinkamas naudojimui preparate, skirtame tepti ant odos.
1.3. Pusiau kieti odos preparatai
Pusiau kieti odos preparatai Europos farmakopėjoje skirstomi į kremus, tepalus, gelius, pastas,
šuteklius, vaistinius pleistrus. Tepalai sudaryti iš vienos fazės pagrindo ir jame disperguotos skystos arba
kietos medžiagos. Emulsinio tipo tepaluose, emulsiklių pagalba, į riebalinį pagrindą įterpiama vandenyje
2 pav. Vaistinių medžiagų prasiskverbimo pro odą schema [6].
16
tirpi medžiaga arba atvirkščiai. Kremai yra sudėtingesnės sistemos, jų pagrindas – daugiafazis.
Dažniausiai tai vandeninė ir lipofilinė fazės. Todėl kremai skirstomi į lipofilinius ir hidrofilinius. Gelius
sudaro skysčiai, kurie yra gelifikuoti tam tikromis medžiagomis. Geliai taip pat gali būti lipofiliniai ir
hidrofiliniai. Pastos yra pusiau kieti odos preparatai, kurių sudėtyje yra 25 proc. ir daugiau disperguotų
sausųjų medžiagų.
Veikliųjų medžiagų veiksmingumas ir prasiskverbimas pro odą priklauso nuo farmacinių
veiksnių, tokių kaip: vaistinės medžiagos fizinė būklė, cheminė struktūra, pagalbinių medžiagų savybės ir
kiekiai, panaudotos technologijos ypatumai, o pasirinkta vaisto forma apsprendžia vaistinės medžiagos
atsipalaidavimą ir poveikį.
Pagrindas pusiau kietos formos vaistuose yra labai svarbus, todėl jam keliami dideli
reikalavimai. Veiklioji medžiaga turi būti gerai pasiskirsčiusi tepalo pagrinde tam, kad poveikis būtų
vienodas ir nesusidarytų didelės vaistinės medžiagos koncentracijos vienoje vietoje. Pagrindas neturi
erzinti odos, nepaveikti jos funkcijų, maišytis su odos sekretu ir būti netepus bei lengvai nuplaunamas.
Turi būti priimtina spalva, išvaizda bei kvapas.
Pusiau kieti odos preparatai turi būti patvarūs laikant realiomis sąlygomis. Taigi pagrindas turi
būti stabilus esant 25 ºC. Būtina pažymėti, kad negalima leisti tepalams užšalti ir reikia juos laikyti
sandariuose induose [12;13;14].
1.4. Emulsiniai pagrindai
Emulsiniai pagrindai yra difiliniai, jie pasižymi hidrofilinėmis ir hidrofobinėmis savybėmis. Gali
būti dviejų tipų: aliejus vandenyje (a/v) ir vanduo aliejuje (v/a). Emulsiniai pagrindai maišosi ir gerai
emulguoja daugelį medžiagų, soliubilizuoja netirpias medžiagas ir emulsiniuose pagrinduose, gerai
pasiskirsto vaistinės medžiagos. Difiliniai pagrindai turi savybę mažinti paviršiaus įtampą tarp tepalo ir
odos, o to pasekoje lengviau pasisavinamos vaistinės medžiagos ir nesutrikdomi odos kvėpavimo ir
šilumos reguliacijos procesai.
Emulsinių pagrindų privalumai: pagerina vaistinių medžiagų sugėrimą į odą, turi odą
minkštinantį poveikį, bei suteikia jai elastingumo. Labai svarbu tai, kad emulsiniai pagrindai turi
uždegiminius procesus mažinantį poveikį. Vaistines medžiagas galima įterpti tiek į vandeninę, tiek į
hidrofobinę terpę, tad galima rinktis vaistines medžiagas tiek tirpias vandenyje, tiek tirpias riebaluose. v/a
17
pagrindai pasižymi geru stabilumu, yra lengvai pašalinami nuo odos, taip pat turi gerą išvaizdą ir
konsistenciją, todėl pagamintas tepalas yra geros prekinės išvaizdos. Trūkumai: a/v emulsiniai pagrindai
yra mažiau stabilūs, tačiau tai ištaisoma naudojant stabilizatorius ir konservantus. v/a emulsijos nors ir
stabilesnės, bet pasižymi silpnesniu vaistinės medžiagos prasiskverbimu į odą [6;12;15;16;].
1.5. Emulsijos v/a, jų savybės ir technologiniai aspektai
Norint suprasti emulsinius pagrindus reikia suprasti ir jų savybes. Emulsijos v/a yra antro tipo
emulsijos, jose dispersinė terpė yra hidrofobinė, o dispersinė fazė –hidrofilinė. Antro tipo emulsijos yra
stabilizuojamos hidrofobiniais emulsikliais (tirpūs aliejuje ar milteliai, drėkinami aliejaus). Gaminant v/a
tipo emulsijas reikia teisingai parinkti emulsiklį: plėvelė turi susidaryti ne lašelio viduje, o išorėje.
Emulsiklių veiksmingumas išreiškiamas HLB (hidrofilinio – lipofilinio balanso) skaičiumi. Gaminant v/a
emulsijas, naudojami emulsikliai, kurių HLB skaičius pagal Griffin’o skalę yra ≤10.
Technologiniai aspektai v/a emulsijų gamyboje: kadangi sudaromos tarpusavyje nesimaišančių
medžiagų sistemos, jos turi būti stabilizuojamos emulsikliais, gaminant tokias emulsijas galimas
mikrobinis užterštumas, todėl reikalingi konservantai, kurie šį užterštumą reguliuotų, be to labai svarbu,
kad tepalo juslinės savybės būtų priimtinos vartotojui, tai pasiekiama parenkant tinkamas medžiagas bei
jų koncentracijas. Emulsijos v/a yra stabilesnės nei a/v tipo, tai įtakoja hidrofobinės terpės padidintas
sedimentacinis ir agregatinis pastovumas, tačiau juslines ir mikrobiologines savybes daro įtaką
komponentų prigimtis (sintetinės ar gamtinės kilmės medžiagų parinkimas emulsijų gamyboje)
[12;15;16].
1.6. Odą balinančios medžiagos.
Geriausiai žinoma ir labiausiai paplitusi odą balinanti medžiaga yra hidrochinonas. Ši medžiaga
yra efektyvi ir plačiai naudojama melazmos, použdegiminės hiperpigmentacijos ir kitų hiperpigmentacijos
sutrikimų gydymui. Hidrochinonas veikia stabdydamas tirozino virtimą melaninu. Nepaisant šios
medžiagos efektyvumo, būtina atsižvelgti į jos keliamus pavojus. Dažniausiai pasitaikantys šalutiniai
poveikiai yra odos dirginimas ir kontaktinis dermatitas. Rečiau pasitaiko tamsiai ruda hiperpigmentacija
18
gydymo vietoje. Dėl šių priežasčių pradėta ieškoti alternatyvų hiperpigmentacijos gydyme [17]. 2006m.
BC Decker Inc. publikuotame straipsnyje aprašomos alternatyvios medžiagos, tai – aloesinas, arbutinas,
azelaino rūgštis, glikolio rūgštis, kojinė rūgštis, saldymedžio ekstraktas, 4–hidroksianizolis, melatoninas,
niacinamidas, baltojo šilkmedžio (Morus alba L.) ekstraktas, soja, vitaminas C. Visos šios medžiagos turi
tinkamas balinančias savybes, yra saugios ir veiksmingos, be to šias medžiagas galima naudoti ir
kombinacijose [18].
1.7. Bruknė
(Vaccinium vitis-idaea L.) Šeima: Erikiniai – Ericacea.
Bruknė – daugiametis žemas (iki 25cm
aukščio) augalas. Visžalis krūmokšnis su požeminiais,
šliaužiančiais, žvynuotais, įsišaknijančiais ūgliais.
Jaunos šakelės pūkuotos. Lapai atvirkščiai elipsiški,
buki, stori, odiški, tamsiai žalia viršutine ir šviesiai
žalia, taškuota apatine puse, užsirietusiais žemyn
kraštais. Lapų gyslos ryškios, plunksniškos. Žiedai
maži, po 2-8 susitelkę tankiose viršūninėse kekėse,
nusvirę. Vainikėlis varpiškas, baltas arba baltai rausvas.
Žydi gegužę – birželį, neretai ir antrą kartą, nuo liepos
iki rudeninių šalnų. Vaisius – raudona, sultinga,
daugiasėklė, 3-8 mm skersmens, rūgštaus skonio uoga.
Dauginasi šakniastiebiais ir sėklomis, kurias išnešioja
uogomis mintantys paukščiai. Šviesomėgis. Žaliava – bruknių lapai ir vaisiai. Lapai skinami ketvirtaisiais
augimo metais rugsėjį – spalį arba pavasarį, balandį – gegužę. Uogos renkamos rugpjūtį. Veikliosios
medžiagos. Lapuose kaupiama iki 5,0-10,0 proc. arbutino, 8,0-9,0 proc. raugų, 450,0-550,0 mg.
flavanolių, fenolkarboninių rūgščių, hidrochinono, galo, elago, chino, ursolo, vyno rūgščių, vitamino C,
mikroelementų – mangano, arseno, vario [3].
3 pav. Bruknė [3]
19
1.8. Arbutinas
Arbutinas, tai natūralus hidrochinono
β-D-gliukopiranozidas, hidrochinono darinys
(molekulinė formulė: C12H16O7)[19,20,21],
aptinkamas sudžiovintuose tam tikrų augalų,
tokių kaip: miltinė meškauogė (Arctostaphylos
uva-ursi L., Ericaceae), bruknė (Vaccinium
vitis-idaea L., Ericaceae), kvapusis mairūnas (Origanum majorana L., Lamiaceae), kriaušė (Pyrus L.,
Rosaceae), lapuose [19;20;23;24]. Arbutinas veikia inhibuodamas melanosomų tirozinazės ir DHICA
(5,6-dihidrochindolo-2-karboksi rūgšties) polimerazės aktyvumą, netoksinėmis koncentracijomis,
netrikdant šio fermento sintezės ir išskyrimo. Manoma, kad arbutino aktyvumas yra susijęs su substrato
tirozinazės panašumu vienas kitam, o tai priveda prie konkurencinio tirozinazės katalizinės funkcijos
slopinimo. Taigi arbutinas stabdo tirozinazės aktyvumą nepaveikdamas ląstelės gyvybingumo [2]. Dėl
poveikio tiranozinui arbutinas plačiai naudojamas kosmetikoje, bei gydymo praktikoje naikinant
pigmentines dėmes, balinant odą.
1.9. Nuoviro gamyba
Nuoviras – tai vaisto forma, kurią gaminant žaliavos virinamos išgrynintame vandenyje.
Ruošiant nuovirus žaliava apdorojama grūstuvėje, didesniu išgryninto vandens kiekiu, taip, kad būtų
pakankamai drėgna, sudrėkinus ji paliekama stovėti 5 min. Vėliau apdorota žaliava užpilama reikiamu
kiekiu verdančio išgryninto vandens ir vandens vonioje šildoma 30 min., uždengtame porcelianiniame
inde, maišant. Pagaminta ištrauka filtruojama per marlę, kurioje yra nedidelis vatos gabalėlis ir yra
lengvai nuspaudžiama. Ištrauka papildoma išgrynintu vandeniu iki nurodytos žymos. Jei žaliavos yra
nestipriai veikiančios, 100-ui dalių išgryninto vandens imama 10 dalių žaliavos [25].
4 pav. α-Arbutino struktūra [22]
20
1.10. Saulėgrąžų aliejus (Oleum Helianthi)
Saulėgrąžų aliejus yra skaidrus, gelsvas, aliejingas skystis, turintis blyškų, neišreikštą silpną
skonį. Įprastai saulėgrąžų aliejus yra naudojamas maisto gamyboje. Taip pat plačiai naudojamas
kosmetikos bei farmacinių gaminių sudėtyje, kaip pagrindo sudedamoji dalis bei ingridientas, kuris teikia
ląstelėms energiją, bei būtinąsias riebalų rūgštis, parenteraliniu keliu. Saulėgrąžų aliejus laikomas
netoksiška ir nedirginančia medžiaga. Šis aliejus išgaunamas iš saulėgrąžų (Helianthus annus L.) sėklų,
presavimo arba ekstrakcijos būdu. Saulėgrąžų aliejuje randama: linoleno rūgšties (66 proc.), oleino
rūgšties (21,3 proc.), palmitino rūgšties (6.4 proc.), arachidono rūgšties (4,0 proc.), stearino rūgšties (1,3
proc.), bei benzeno rūgšties (0,8 proc.). Saulėgrąžų aliejaus virimo temperatūra 40 – 60 ºC, santykinis
tankis 0.915 – 0.919 g/cm3, rūgščių skaičius 14 – 16, jodo skaičius 125 – 140, užšalimo temperatūra -18
ºC. Saulėgrąžų aliejus maišosi su benzenu, chloroformu, anglies tetrachloridu, dietilo eteriu, praktiškai
netirpsta etanolyje (95 proc.) ir vandenyje [26;27].
1.11. Ricinų aliejus (Oleum Ricini)
Ricinų aliejus yra skaidrus, beveik bespalvis, arba blyškiai gelsvos spalvos klampus skystis. Šis
aliejus turi nestiprų kvapą bei silpną skonį, kurio ataskonis gali būti aitrus. Ricinų aliejus yra plačiai
naudojamas kosmetikoje, maisto produktuose ir farmacinėse vaistų formose, kaip pagalbinė medžiaga.
Kremuose ir tepaluose šio aliejaus naudojama nuo 5 iki 12,5 proc. Į vidų šis aliejus buvo vartojamas kaip
vidurius laisvinanti priemonė. Ricinų aliejus laikomas netoksišku ir nedirginančiu, kai yra naudojamas,
kaip pagalbinė medžiaga. Ricinų aliejus išgaunamas šaltojo spaudimo būdu iš paprastojo ricinmedžio
(Ricinus communis L.) sėklų. Aliejuje randama: ricinų rūgšties (87 proc.), oleino rūgšties (7 proc.),
linoleno rūgšties (3 proc.), palmitino rūgšties (2 proc.), stearino rūgšties (1 proc.) ir dihidrosterino rūgšties
pėdsakų. Ricinų aliejaus virimo temperatūra 313 ºC, savaiminio užsidegimo temperatūra 449 ºC,
santykinis tankis 0.955 – 0.968 g/cm3 esant 25 ºC, lydymosi temperatūra -12 ºC. Aliejus tirpus
chloroforme, dietilo eteryje, acto rūgštyje, metanolyje. Gerai tirpus etanolyje (95 proc.), benzene ir
eteryje. Praktiškai netirpus vandenyje [27;28].
21
1.12. Kakavos sviestas (Oleum Theobromatis)
Kakavos sviestas yra gelsvos ar baltos spalvos, kietos, birios konsistencijos, turinti nestiprų
savitą kvapą medžiaga. Naudojama kaip žvakučių pagrindas, tačiau galima naudoti ir tepalo pagrindo
kietumo formavimui. Kakavos sviesto lydymosi temperatūra 31-34 ºC, Kakavos sviestas tirpus
chloroforme, eteryje ir verdančiame etanolyje. Dalinai tirpsta etanolyje (95 proc.) Kakavos sviestas
gaunamas iš kakavmedžio pupelių, kurios yra fermentuojamos, kepinamos ir atskiriamos nuo lukšto.
Kakavos sviesto sudėtyje randama: oleino rūgšties iki 43 proc., stearino rūgšties iki 34 proc., laurino ir
palmitino rūgščių iki 25 proc., linolevino rūgšties iki 2 proc. Ir arachino rūgšties pėdsakų [26;27].
1.13. Kokosų aliejus (Cocois oleum raffinatum)
Kokosų aliejus paprastai yra balta arba gelsva masė, arba bespalvis ar gelsvas skaidrus aliejus,
turintis silpną kokosų kvapą bei skonį. Rafinuotas kokosų aliejus yra balta ar beveik balta, vientisa masė.
Forma, kurią įgyja kokosų aliejus, priklauso nuo temperatūros. Jis gali būti blyškiai geltonas ar bespalvis
skystis, esant 28 – 30 ºC temperatūrai; pusiau kietas, esant 20 ºC temperatūrai ir kietas, kristalinis esant
žemesnei nei 15 ºC temperatūrai. Įprastai kokosų aliejus naudojamas tepalų, su lengvai absorbuojamu
pagrindu, gamybai. Vartojant per burną, kokosų aliejus yra netoksiškas, tačiau dideli kiekiai gali
sudirginti virškinamąjį traktą. Užtepus ant odos, kokosų aliejus gali ją sudirginti, ir gali būti
absorbuojamas per odą. Kokosų aliejus gaunamas iš Riešutinės kokospalmės (Cocos nucifera L.) sėklų,
tuomet jis yra rafinuojamas ir gaunamas rafinuotas kokosų aliejus, kuris pramonėje dar žymimas RBD
(rafinuotas, balintas, dezodoruotas) kokosų aliejus. Šiame aliejuje randama kaproinės rūgšties (≤1,5
proc.), kaprilinės rūgšties (5,0 – 11,0 proc.), kaprinės rūgšties (4,0-9,0 proc.), laurino rūgšties (40,0-50,0
proc.), miristino rūgšties (15.0-20.0 proc.), palmitino rūgšties (7,0-12,0 proc.), stearilo rūgšties (1,5-5,0
proc.), arachidinės rūgšties (≤0.2 proc.), oleino rūgšties (4.0-10.0 proc.), linoleino rūgšties (1.0-3.0 proc.),
linoleno rūgšties (≤0,2 proc.). Virimo temperatūra >450 ºC, jodo skaičius 8-9.5, lydymosi temperatūra 23-
26 ºC. Aliejus praktiškai netirpsta vandenyje, gerai tirpsta dichlormetane, tirpsta eteryje, anglies disulfide
ir chloroforme, esant 60 ºC temperatūrai tirpsta dvejose dalyse etanolio (95 proc.), tačiau žemesnėje
temperatūroje tirpumas mažėja [27].
22
1.14. Bičių vaškas (Cera flava)
Geltonos ar rusvos spalvos plokštelės, nekristalinės struktūros, turi nestiprų charakteringą kvapą,
pašildžius tampa minkštas ir lankstus. Bičių vaškas naudojamas maisto bei kosmetikos produktuose.
Pagrindinis panaudojimas – farmaciniuose produktuose. Dažniausiai naudojamas tepaluose ir kremuose,
kaip kietinanti medžiaga, nuo 5 iki 20 proc. Geltonasis vaškas gali daryti įtaką prailginant vaistinės
medžiagos atpalaidavimo laiką. Bičių vaškas tirpsta esant 61 – 65 ºC temperatūrai, santykinis tankis 0.95
– 0.96 g/cm3, jodo skaičius 8-11. Vaškas tirpus chloroforme, eteryje, eteriniuose ir riebalų aliejuose,
šiltame anglies disulfide, praktiškai netirpus vandenyje. Bičių vaškas laikomas netoksišku ir
nedirginančiu, naudojamas išorinio vartojimo preparatuose, bei yra patvirtintas FDA (Federal Drug
Association) neaktyvių ingredientų duomenų bazėje, į kurią įtrauktos visos nepavojingos ir leistinos
naudoti pagalbinės medžiagos. Tačiau hyper jautrumo reakcijos gali pasireikšti žmonėms, kurie yra
alergiški bičių produktams. Bičių vaškas yra natūralus bičių sekretas, Vaškui leidžiama išvarvėti, arba
išimamas centrifuguojant. Vaškas plaunamas šaltu vandeniu, taip pašalinamos visos tirpios priemaišos,
pridedama karšto vandens, kuris vėliau nukošiamas, taip pašalinant pašalines medžiagas. Bičių vaške
randama 70 – 75 proc. įvairių tiesios grandinės monohidrinių alkoholių esterių, turinčių lyginio skaičiaus
anglies atomų grandines nuo C24 iki C36.pagrindinis esteris šioje sudėtyje yra miricilo palmitatas. Taip pat
randama laisvųjų rūgščių (~14 proc.), karbohidratų (~12 proc.) ir apytiksliai 1 proc. laisvųjų vaško
alkoholių ir sterinių esterių bei riebiųjų rūgščių [27].
1.15. Vilnų riebalai (Adeps lanae)
Vilnų riebalai (lanolinas) yra blyškiai geltonos spalvos, aliejinga, vaškinės struktūros medžiaga,
turinti charakteringą kvapą. Ištirpintas lanolinas yra skaidrus ar beveik skaidrus geltonas, aliejingas
skystis. Naudojamas kaip hidrofobinis pagrindas, tepalų gamyboje. Sumaišius su augaliniu aliejumi ar
skystu parafinu, gaminami emulsiniai kremai. Vilnų riebalai sugeria dvigubai didesnį vandens kiekį,
gaminant stabilias emulsijas, kurios laikant nesukietėja. Tai natūrali medžiaga, randama ir išgaunama iš
avių vilnų. Vilnų riebalai yra laikoma netoksiška ir nedirginančia medžiaga tačiau jautriems žmonėms gali
sukelti alergines reakcijas. Vilnų riebalų lydymosi temperatūra 38 – 44 ºC, jodo skaičius 18-36, lengvai
23
tirpus benzene, chloroforme, eteryje, dalinai tirpus etanolyje (95 proc.), verdančiame tirpsta geriau,
netirpus vandenyje [27].
1.16. Sorbitano monooleatas
Span 80 Tai geltonas, lakus, aliejingas skystis. Sorbitano esteriai yra plačiai naudojami
kosmetikoje, maisto produktuose bei farmaciniuose produktuose, kaip lipofiliniai, nejoniniai surfaktantai.
Dažniausiai naudojami farmacijoje, kaip emulsikliai, gaminant kremus, tepalus, emulsijas, skirtas
išoriniam vartojimui. Kai naudojami vieni sorbitano esteriai, gaunamos stabilios v/a emulsijos ir
mikroemulsijos, tačiau dažnai šie sorbitano esteriai naudojami įvairiomis proporcijomis su polisorbatais.
Sorbitano monooleato HLB reikšmė yra 4,3. Kaip emulsiklis yra netoksiškas, jis įtrauktas į FDA
neaktyvių ingridientų sąrašą. Jungtinėje Karalystėje naudojamas neparenteralinių vaistų sudėtyje,
Kanadoje įtrauktas į priimtinų nemedicininių ingredientų sąrašą [27;29].
1.17. Išgrynintas vanduo (Aqua purificata)
Vanduo yra bespalvis, bekvapis skaidrus skystis. Farmacijoje išgrynintas vanduo naudojamas
kaip tirpiklis ir ingredientas kuriant ir gaminant farmacinius preparatus. Norint naudoti vandenį
farmacinių produktų gamybai, jis turi būti išgryninamas. Geriamasis ,,žalias” vanduo turi daug priemaišų,
joms pašalinti yra įvairių metodikų. Išgrynintas vanduo, tinkamas naudoti farmacijai gali būti ruošiamas
keliais būdais: distiliacija, dejonizacija arba atvirkštiniu osmosu. Išgryninto vandens saugumas yra
neginčytinas, jei jis atitinka Europos farmokopėjos keliamus reikalavimus. Vandens virimo temperatūra
yra 100 ºC. Vanduo yra stabilus visose agregatinėse būsenose (kietas, skystas, garai). Išgrynintam
vandeniui paliekant gryninimo sistemą ir patenkant į laikymo talpą, būtina užtikrinti, kad vanduo būtų
apsaugotas nuo bet kokio joninio ir organinio užterštumo. Taip pat sistema turi būti apsaugota nuo fizinių
dalelių ir mikroorganizmų patekimo. Išgrynintas vanduo turi būti laikomas sandariai uždarytose talpose,
sąlygose kurios ribotų mikroorganizmų augimą [27].
24
1.18. 2-Fenoksietanolis (Phenoxyethanolum)
2-fenoksietanolis yra bespalvis, mažai lakus skystis,
turintis silpną, malonų kvapą ir deginantį skonį. Ši medžiaga
naudojama kaip antimikrobinis konservantas kosmetikoje ir
išorinio naudojimo farmaciniuose preparatuose, koncentracijomis
0,5 – 1,0 proc. Taip pat fenoksietanolį galima naudoti kaip
konservantą ir antimikrobinę medžiagą vakcinų gamyboje.
Terapiškai, 2,2 proc. tirpalas arba 2,0 proc. kremas buvo
naudojamas ,kaip dezinfektantas paviršinėms žaizdoms,
nudegimams ir mažoms odos, bei gleivinės infekcijoms gydyti. 2 -
fenoksietanolis yra antibakterinis konservantas, kuris veikia
plačiame pH reikšmių spektre, prieš Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Aspergillus niger,
Candida albicans, Escherichia coli. 2 – fenoksietanolis yra įtrauktas į FDA neaktyvių ingridientų sąrašą,
bei į Kanados priimtinų nemedicininių medžiagų sąrašą. Pagal Europos kosmetikos nuostatus
(76/768/EEC), maksimali leistina fenoksietanolio koncentracija, kosmetikoje ir išorinio naudojimo
preparatuose, yra 1,0 proc. 2-fenoksietanolio virimo temperatūra yra 245,2 ºC, o lydymosi temperatūra –
14 ºC. Medžiaga gerai tirpsta acetone, etanolyje (95 proc.), glicerolyje, o dalinai tirpsta izopropilo
palmitate, mineraliniuose aliejuose, alyvuogių, riešutų aliejuje ir vandenyje [31].
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas:
Bruknių lapų vandeninė ištrauka
Pusiau kietas odos preparatas su bruknių lapų ištrauka
2.1.1. Naudotos medžiagos:
Saulėgrąžų aliejus (Aceitera General Dehenza S.A.);
5 pav. 2-Fenoksietanolis [30]
25
Ricinų aliejus (Carl roth Gmbh, Vokietija);
Kakavos sviestas („Henry Lamotte GmbH“, Vokietija);
Kokosų aliejus (UAB EKO PIRK);
Karnaubo vaškas (Sigma – Aldrich chemie GmbH, Brazilija);
Bičių vaškas (bitininkų draugija ,,Bitutė”, Lietuva);
Bruknių lapai (gamintojas – “Acorus calamus”, Lietuva);
Sorbitano monooleatas (Span 80) (Alfa Aesar GmbH & Co KG, Vokietija);
Sorbitano trioleatas (Span 85) (Sigma – Aldrich chemie GmbH, Vokietija);
Polioksietilen (20)–sorbitano monostearatas (Tween 60) (Sharlab S.L., Ispanija);
Vilnų riebalai (Lanolinas) (Carl Roth GmbH & Co KG, Vokietija);
2-fenoksietanolis (Sigma – Aldrich chemie GmbH, Vokietija);
± -α – tokoferolis (Carl Roth GmbH & Co KG, Vokietija);
Gvazdikų et. al. (Sigma – Aldrich chemie GmbH, Vokietija);
Mandarinų et. al. (Sigma – Aldrich chemie GmbH, Vokietija);
Išgrynintas vanduo (Ph.Eur. 01/2008:0008, LSMU laboratorija);
Reagentai:
DPPH• reagentas (Sigma – Aldrich chemie GmbH, Vokietija);
Etilo acetatas (Sigma – Aldrich chemie GmbH, Vokietija);
Folin-Ciocalteu‘s phenol reagentas
2.1.2. Tyrime naudota įranga:
Analitinės svarstyklės (Mettler Toledo);
Termometras (LCD Digital Portable Multi – Thermometer, Kinija);
Vandens vonelė (J. P. selecta, s.a., Ispanija);
Kaitinimo plytelė (,,Farel”, Lenkija);
Centrifuga („SIGMA3-18KS“, Vokietija);
Spektrofotometras (Shimadzu Europa GmbH, Vokietija);
Drėgnomatis (Kern MLS, Vokietija);
26
Chromatografinė sistema „Waters 2695” su detektoriumi „Waters 996 PDA“
Kolonėlė ACE C18 5 μm, 4,6×250 mm (Waters, Milford, JAV)
Tekstūros analizatorius TA.XT.plus (Stable Micro Systems Ltd, Godalming, Surrey, Jungtinė Karalystė);
Maišyklė ,,Unguator 2100” (Unguator technologie, Vokietija);
Sietai (Retsch GmbH, Vokietija);
Automatinės pipetės (Ependorf, Didžioji Britanija);
pH-metras pH/mV meter Delta OHM HD 2105.1 (Delta OHM, Italija);
Klampomatis („ALPHA SERIES“ FUNGILAB, S.A., Ispanija);
Mikroskopas Motic® (Motic China Group Co., Ltd., Kinija);
Kiuvetės 1cm 4 ml talpos, kvarcinio stiklo (Vokietija)
27
2.2. Tyrimo metodai
2.2.1. Tyrimo atlikimo planas
Prieš pradedant modeliuoti pusiau kietą odos preparatą su arbutinu, buvo sudarytas planas,
kuriuo vadovaujantis buvo atliktas darbas. Planas susideda iš kelių etapų. Pirmas etapas – bruknių lapų
ištraukos gamyba ir arbutino kiekio joje nustatymas. Antrasis etapas – kuriamas pusiau kieto odos
6 pav. Tyrimo atlikimo planas
Bruknių lapų
žaliavos tyrimas Produkto sudėties modeliavimas
Pagrindo gamyba Ištraukos gamyba
Sumodeliuoto produkto gamyba
Kokybinė analizė
Arbutino kiekio
ištraukoje nustatymas
Pagrindo antioksidacinio
aktyvumo nustatymas
Centrifugavimas pH reikšmės nustatymas
Antioksidacinio
aktyvumo nustatymas
Vienalytiškumo
vertinimas Tekstūros
analizė
Stabilumo tyrimai
Statistinė analizė
28
preparato pagrindas. Siekiama sukurti stabilų pagrindą, į kurį būtų galima įterpti vandeninę ištrauką.
Trečiasis etapas – pagaminamas pusiau kietas odos preparatas su bruknių ištrauka ir atliekama kokybinė
analizė, kurios metu buvo vertintas emulsinės sistemos vienalytiškumas, stabilumas centrifuguojant,
atlikta tekstūros analizė, nustatytas antioksidacinis aktyvumas ir pH reikšmė, atlikti stabilumo tyrimai.
2.2.2. Bruknių lapų žaliavos tyrimai.
2.2.2.1. Drėgmės nustatymas
Nuodžiūvis nustatytas drėgnomačiu “KERN MLS”, (Vokietija). 1,0g tiriamosios žaliavos,
talpiname ant prietaiso lėkštelės ir džioviname 105 °C temperatūroje, džiovinama iki nekintamos masės
[30]. Įvertinama tiriamosios žaliavos drėgmė 0,01 proc. tikslumu. Tyrimas kartotas tris kartus,
apskaičiuotas rezultatų vidurkis. Drėgmės kiekis lapų žaliavoje neturi viršyti 13 proc. [14].
2.2.2.2. Žaliavos smulkumo nustatymas
Sietų analizė gali būti atliekama sijojant rankomis arba naudojant sijotuvus. Atliekant sietų
analizę rankomis, sietas judinamas vertikaliais judesiais, sukant. Mėginys turi nepertraukiamai judėti per
visą sieto paviršių. Sijojimo metu buvo naudotas sietas, kurio ø 500 μm ir sietas, kurio ø 300 μm Po
sijojimo sverta žaliava likusi ant sieto ir išbirusi pro ø 500 μm sietą, apskaičiuotas jų procentinis kiekis.
Prabyrėti pro ø 500 μm sietą turi ne mažiau kaip 90 proc. žaliavos masės, o pro sietą ø 300 prasijojamos
dulkės (Eur. Ph. 01/2011, 2.1.4)
2.2.3. Bruknių lapų vandeninės ištraukos gamyba
Bruknių lapų vandeninė ištrauka buvo gaminama masės – tūrio metodu, santykiu 1:10. Ištraukos
gamybai buvo naudota žaliava, kuri prabirėjo pro sietą ø 500 μm, bet neprabirėjo pro ø 300 μm (taip ji
buvo atskirta nuo dulkių). Atsverta 10 g paruoštos žaliavos. Skaičiuojamas ištraukai pagaminti reikalingas
išgryninto vandens kiekis. Bruknių lapų sugerties koeficientas Ks=1,4.
29
V vandens =100 ml + (10,0 x 1,4) = 114 ml. Paruošta žaliava dedama į pašildytą infundyrinį indą
užpilama reikiamu vandens kiekiu, uždengiama ir šildoma pamaišant 30 min. Kadangi bruknių lapai
kaupia raugus, nuoviras košiamas iškart po kaitinimo. Košiama pro dvigubą marlės sluoksnį. Ištrauka
aušinama 10 min., papildoma vandens iki 100 ml žymės.
2.2.4. Spektrofotometrija
UV-VIS spektrofotometrija, yra ekonomiškas ir greitas, todėl labai populiarus biocheminių
matavimų metodas. Fitochemijoje dažnai naudojamas kiekybiniams tyrimams bei priemaišų nustatymui.
kaip didelį atrankumą turintis metodas. Cheminės medžiagos turi savybę absorbuoti įvairios energijos
(bangos ilgio) matomosios šviesos fotonus. Dėl skirtingo įvairių bangos ilgių sugėrimo, junginiai būna
spalvoti, o savybė sugerti šviesą priklauso nuo cheminės struktūros. Spektrofotometru galima tiksliai
išmatuoti šviesos pralaidumą tirpaluose (T) tarp 10 ir 90 proc., t.y. nuo T=0,1 iki T=0,9, absorbcija
atitinkamai 0,046 ir 1,000. Geriausi rezultatai gaunami, kai T=0,5, o absorbcija – A=0,301.
Spektrofotometrinis tyrimo metodas yra grindžiamas – Bugero, Lamberto ir Bero dėsniu, juo nustatoma
šviesos sugerties priklausomybė nuo medžiagos ir jos koncentracijos tirpale. Tyrimų metu patogiausia
naudoti kalibracinės kreivės metodą [33;34].
2.2.4.1. Bendrojo polifenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu
metodu
Tyrimo metu bendrąjį polifenolinių junginių kiekį nustatėme spektrofotometriškai, naudojant
spektrofotometrą Shimadzu Europa GmbH, Vokietija. Atlikta reakcija su Folin-Ciocalteu‘s phenol
reagentu. Siekiant nustatyti bendrą polifenolinių junginių kiekį, buvo sudaryta kalibracinė kreivė.
Kalibracinei kreivei sudaryti, buvo pagaminti 0,07, 0,10, 0,13, 0,16, 0,19, 0,22 mg/ml vandeniniai
arbutino tirpalai. Analitinėmis svarstyklėmis atsverta 100,0 mg (0,001 mg tikslumu) arbutino ir ištirpinta
100 ml išgryninto vandens. Gauto pradinio tirpalo koncentracija – 1 mg/ml. Siekiant gauti reikiamos
koncentracijos tirpalus, kalibracinei kreivei sudaryti, buvo paimta atitinkamai: 0,7 ml, 1,0 ml, 1,3 ml, 1,6
ml, 0,19 ml, 2,2 ml pradinio tirpalo (1 mg/ml) ir matavimo kolbutėse praskiesta iki 10 ml žymos. Iš gautų
30
tirpalų paimta po 1 ml mėginio ir atlikta spalvinė reakcija, sumaišant su 3 ml išgryninto vandens ir 1 ml
Folin-Ciocalteu‘s phenol reagento. Pridedama 1,5 ml 20 proc. vandeninio Na2CO3 tirpalo, skiedžiama
išgrynintu vandeniu iki 10 ml. Tirpalai laikomi 30 min. 25 °C ± 2 °C temperatūroje, jų spalva kinta iš
žalsvos į melsvą. Absorbcija matuota esant 765 nm bangos ilgiui. Kiuvetės absorbuojančio sluoksnio
storis 1 cm, lyginamasis tirpalas – išgrynintas vanduo. Bandymas kartotas 3 kartus (n=3). Kalibracinė
kreivė sudaryta iš vidutinių reikšmių, naudojantis lygtimi C=K1*A; koeficientas K1—0,28110 mg/ml;
A—absorbcija; (koreliacijos koeficientas R2 = 0,99593). Gauta kalibracinė kreivė pateikta 7 pav.
7 pav. Kalibracinė kreivė pagal arbutiną bendram fenolinių junginių kiekiui nustatyti
Tiriamasis tirpalas paruoštas imant 1 ml tiriamojo tirpalo (bruknių lapų vandeninio ekstrakto) ir
praskiedžiant išgrynintu vandeniu iki 100 ml žymos, sumaišius 1 ml šio tirpalo matavimo kolbutėje
skiedžiamas 3 ml išgryninto vandens, pilama 1 ml Folin-Ciocalteu‘s phenol reagento ir 1,5 ml 20 proc.
Na2CO3 vandeninio tirpalo, išgryninto vandens iki 10 ml. Po 30 min. tirpalų spalva iš žalsvos pakinta į
melsvą. Naudojantis kalibracine kreive, UV-Vis spektrofotometru nustatyta paruošto tirpalo polifenolinių
junginių koncentracija pagal arbutiną. Matavimai pakartoti tris kartus (n = 3).
31
2.2.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) metodas
Šiuo metu ESC–dažniausiai taikomas metodas augalų cheminėms sudėtims tirti. Chromatografija
pagrįsta daugkartine medžiagų sorbcija ir desorbcija, joms judant judriosios fazės sraute per stacionariąją
fazę (sorbentą) [35]. Fitochemijos tyrimų metu daugiausiai taikoma atvirkštinių fazių chromatografija.
Šiam metodui būdinga didelė skiriamoji geba, didelis efektyvumas, atrankumas ir rezultatų atkūrimas
[34]. Arbutino kiekiui nustatyti taikytas Europos farmakopėjoje aprašytas efektyviosios skysčių
chromatografijos metodas (Eur. Ph. 01/2011:1054). ESC atlikimui naudotas “Waters 2695”
chromatografo ir detektoriaus 996 diodo matricos sistema. Naudota ACE C18 (4,6x250 mm, 5 µm)
kolonėlė. Judančioji fazė metanolio ir vandens mišinys santykiu 1:9. Arbutino nustatymui taikytas UV
spektro bangos ilgis 280 nm. Tekėjimo greitis 1 ml/min. Mėginių injekcijos tūris – 10 µl.
Chromatografinės analizės rezultatai apdoroti „Empower 2” programoje.
Standartinių arbutino tirpalų paruošimas. 50,0 mg arbutino miltelių tirpinama judančioje
fazėje (metanolio ir vandens mišinyje santykiu 1:9) ir praskiedžiama judančiąja faze iki 50 ml žymos.
Pagaminti 0,125; 0,25; 0,5; 1,0 mg/ml koncentracijos arbutino standartiniai tirpalai, kalibracinės kreivės
sudarymui (8 pav.).
8 pav. Kalibracinė kreivė arbutino kiekiui nustatyti
32
2.2.6. Pusiau kieto odos preparato su bruknių lapų vandenine ištrauka, gamyba
Pusiau kieta emulsinė sistema buvo gaminama rankiniu būdu ir panaudojant maišyklę. Aliejinė
fazė, kurią sudaro saulėgrąžų, ricinų, kokosų aliejai, kakavos sviestas, bičių vaškas ir emulsiklis Span 80,
kaitinama porcelianinėje lėkštelėje virš vandens vonelės. Aliejinės fazės sudedamosios dalys dedamos
lydymosi temperatūros mažėjimo tvarka. Bruknių lapų ištraukos temperatūra taip pat buvo palaikoma
70±5 ºC vonelės pagalba. Abi fazės, aliejinė ir vandeninė turėtų būti vienodos temperatūros (literatūroje
iki 66-80 ºC) [36]. Vandeninė fazė, mažais kiekiais, intensyviai maišant, įterpiama į aliejinę fazę,
sujungus fazes, maišoma kol sistema atvėsta.
Jei maišymas atliekamas maišyklės, UNGUATOR 2100, pagalba, abi fazės supilamos į maišymo
indą, jų temperatūra susilygina maišymo proceso metu. Emulsinimas vyksta maišant, todėl ši gamybos
stadija lemia produkto stabilumą. Jei emulsinė sistema nebus tinkamai maišoma, produkto struktūra
gaunama grubi, nevienalytė. Dispersinės sistemos gamybai svarbi ir aušinimo stadija. Naudojant greitą
vėsinimą emulsinė sistema gali išsisluoksniuoti. Vėsinimas turėtų būti vykdomas apie 2,0 ºC/min. [37].
2.2.7. Centrifugavimo testas
Vertinant pagamintos dispersinės sistemos stabilumą, taikomas centrifugavimo testas. Naudota
centrifuga („SIGMA3-18KS“, Vokietija). Šio testo metu tiriama ar pagamintas pusiau kietas odos
preparatas išlieka stabilus esant kritinėms sąlygoms. Testui naudoti 2 ml talpos vienkartiniai
mėgintuvėliai. Jie buvo užpildyti vienoda pusiau kieto prepaparato mase, sveriant po 2±0,02 g. Pasirinktas
rotorius 12131, centrifugavimo režimas 3000 aps/min, centrifuguojant 5 minutes, esant 25 ºC
temperatūrai. Fazių atsiskyrimas vertinamas vizualiai. Šiuo tyrimu buvo vertinti šviežiai pagaminti pusiau
kieti preparatai atliekant stabilumo tyrimus laikymo metu. Matavimai buvo atliekami centrifuguojant po
tris vienodus mėginius( n=3).
33
2.2.8. pH reikšmės nustatymas
pH reikšmė nustatyta kiekvienam mėginiui tik ką pagaminus ir stabilumo tyrimo metu, po 1, 2, 4
ir 6 mėnesių. 5,0 g. produkto, ištirpinama 45 ml išgryninto vandens, šildant. Pagamintas tirpalas pro
popierinį filtrą. Tirpalo pH reikšmės nustatytos esant 27 º C mėginio temperatūrai [38]. Tyrimo metu
naudotas pH-metras pH/mV meter Delta OHM HD 2105.1 (Delta OHM, Italija). Prieš matuojant ir po
matavimų pH-metro elektrodas plaunamas išgrynintu vandeniu iki pastovios pH reikšmės. Rezultatai
pateikiami išvedus gautų duomenų aritmetinį vidurkį su paklaida. Mėginių reikšmės buvo nustatytos
kartojant tyrimą 3 kartus (n=3).
2.2.9. Tekstūros analizė
Tekstūros analizė buvo atliekama tekstūros analizatoriumi TA.XT plus (Stable Micro Systems
Ltd, Godalming, Surrey, Jungtinė Karalystė). Tyrimo metu vertinta produkto kokybė nustatant kietumą,
konsistenciją, koheziją, klampos indeksą, ir jų pokyčius laikymo metu. Programoje “Exponent”
pasirinktas tyrimas, skirtas kosmetinių kremų vertinimui. Matavimai atlikti esant mėginio temperatūrai
24± 2 ºC. Matavimams atlikti naudotas organinio stiklo diskas 3,5 mm skersmens, pritaikytas atitinkamo
skersmens indui, į kurį talpinamas tiriamasis pusiau kietas preparatas. Analizatoriaus darbinis režimas:
atstumas 15,0 mm, greitis 3.0 mm/s. Prasidėjus darbui, prietaiso diskas leidžiasi į tiriamąjį mėginį
3.0mm/s greičiu. Matuojamas mėginių klampos indeksas, kohezija, konsistencija, kietumas. Rezultatus
programa pateikia grafikuose ir lentelėse. Tokio grafiko pavyzdys pateiktas 9 paveiksle. Bandymas
kartotas 3 kartus kiekvienam mėginiui kiekvieną kartą indas pakraunamas iš naujo.
34
2.2.10. Vienalytiškumo vertinimas
Tepalo vienalytiškumas buvo vertinamas optiškai, naudojant elektroninį mikroskopą Motic®
(Motic china Group Co., Ltd., Kinija), su integruota kamera ir Motic programine įranga. Vienalytiškumas
įvertintas vizualiai pagal produkto spalvą ir mikroskopinio vaizdo struktūrą. Vertinti švieži gaminiai ir
stabilumo tyrime dalyvavę mėginiai po 1, 2, 4 ir 6 mėnesių. Naudotas 40X didinantis lęšis, o objektyvas
didina l0 kartų, todėl vaizdas gaunamas padidintas 400 kartų.
2.2.11. Antioksidacinio aktyvumo vertinimas
Pusiau kieto odos preparato antioksidacinis aktyvumas nustatytas spektrofotometrijos metodu,
naudojant laisvojo DPPH radikalo surišimo metodiką. Laisvasis DPPH radikalas reaguoja su
antioksidacinių savybių turinčiais junginiais, šie junginiai mažina laisvojo DPPH radikalo aktyvumą ir
9 pav. Tekstūros analizatoriaus grafiko pavyzdys.
35
keičia tirpalo spalvą nuo violetinės iki blyškiai gelsvos, pokytis priklauso nuo antioksidaciniø aktyvumu
pasižyminčių junginių koncentracijos [39]. Antioksdaciniam aktyvumui nustatyti panaudota Amerikos
chemikų draugijos mokslininkų Sibel U. ir Nurhayat O. metodika. Tirpalo paruošimas: sveriama 0,0024 g
DPPH miltelių ir tirpinama 100 ml etilacetato. Paruoštas tirpalas laikomas 1 parą tamsoje. Paruošto
tirpalo absorbcija turi būti 0.700 ± 0.020 ties 520 nm bangos ilgiu.
Mėginio paruošimas: sveriama 20 mg mėginio, tirpinama 80 µl etilacetato ir 2,9 ml paruošto
DPPH tirpalo. Mėginys maišomas 20 s ir laikomas 30 min tamsoje. Absorbcija matuojama esant 520 nm
bangos ilgiui, palyginamuoju tirpalu naudojant etilo acetatą. [40] Antioksidacinis aktyvumas išreiškiamas
inaktyvuoto DPPH radikalo kiekiu, procentais, apskaičiuojant pagal formulę:
A0 – kontrolinio mėginio absorbcija (t = 0 min.)
Ax – tiriamojo mėginio absorbcija (t = 30 min.)[41]
Tyrimas kartojamas 3 kartus (n=3).
2.2.12. Stabilumo tyrimai
Paprastai galiojimo laikas nustatomas vadovaujantis dviem stabilumo tyrimų tipais: realaus laiko
stabilumo ir pagreitinto stabilumo. Realaus laiko stabilumo tyrimo metu, produktas laikomas esant
rekomenduojamoms sąlygoms ir stebimas kol pasikeis produkto kokybės parametrai. Tiriant produktą
pagreitintu metodu, jis yra patalpinamas į stresines sąlygas, tokias kaip, temperatūra, drėgmė. pH.
Degradacija rekomenduojamomis sąlygomis apsprendžiama vertinant stresinio faktoriaus ir degradacijos
greičio santykį [42]. Taigi stabilumo tyrimų tikslas – įsitikinti, kad naujas, ar pakeistas produktas išlaiko
numatytas fizikines ir chemines savybes, bei funkcionalumą ir estetinį vaizdą, kai jis yra patalpinamas
tinkamomis sąlygomis, numatytą laikotarpį. Tiek stresinių sąlygų, tiek realaus laiko testai turi būti
sudaryti taip, kad būtų galima patikimai įvertinti šiuos aspektus: 1) Stabilumą ir fizinį kosmetinių
produktų vientisumą, esant tinkamoms sandėliavimo, transportavimo ir naudojimo sąlygoms. 2) Cheminį
stabilumą. 3) Mikrobiologinį stabilumą. 4) Talpos ir turinio suderinamumą [43].
36
Kiekvienas gamintojas turi apspręsti jų produktui tinkamiausias sąlygas, kuriomis pagamintas
produktas turėtų būti laikomas, atsižvelgiant į panašių sudėčių produktų laikymą. Remiantis IFSCC
monografija, nr.2 “Stabilumo tyrimų pagrindai”, stabilumo tyrimams turėtų būti taikomi vertinimo
kriterijai pateikti 1-oje lentelėje.
Tyrimo metu stabilumas vertintas laikant mėginius 24 ± 2 ° C temperatūroje. Bandymai atlikti
šviežiai pagamintam mėginiui ir mėginiams laikytiems 1, 2, 4, ir 6 mėnesius.
2.2.13. Statistinė analizė
Tyrimų rezultatai statistiškai apdoroti ir susisteminti naudojant statistines duomenų analizės
programas: Microsoft® Office Excel 2007 ir Sigma Plot 20.0. Išvesti tyrimų aritmetiniai vidurkiai
pateikiami su vidutinėmis kvadratinėmis paklaidomis. Apskaičiuojamas vidurkių patikimumas.
Kriterijus Priimtinumo ribos
Išvaizda Produkto išvaizda - spalva, kvapas ir mikrospkopinis vaizdas turi išlikti
nepakitę visą testavimo laiką,
pH reikšmė pH reikšmė neturėtų būti didesnė ar mažesnė nei natūrali žmogaus pH,
numatomos ribos nuo 4.0 iki 7.0.
Tekstūra
Klampos indekso, kohezijos, konsistencijos ir kietumo ribos nustatomos
palyginant šviežiai pagaminto mėginio su stabilumo tyrimų metu
nustatytais.
Antioksidacinis
aktyvumas
Antioksidacinio aktyvumo ribas nustato gamintojas lygindamas pagrindo
be veikliųjų medžiagų bei pagaminto produkto antioksidacinį aktyvumą ir
jo pokyčius stabilumo tyrimų metu.
Centifugavimo
testas
Mėginiai laikomi stabiliais, jei centrifugavimo metu prie nurodyto režimo,
jie neišsisluoksniuoja.
1 lentelė. Vertinimo kriterijai ir priimtinumo ribos, atliekant stabilumo tyrimus
[9].
37
3. REZULTATAI
3.1. Bruknių lapų žaliavos kokybės tyrimai
Bruknių lapų žaliavos kokybė buvo vertinta nustatant nuodžiūvį drėgnomačiu KERN MLS ir
atliekant frakcijų smulkumo vertinimą sietų analizės metodu. Metodika aprašyta 7.2.2.1 ir 7.2.2.2
skyriuose. Gauti rezultatai pateikti 2 lentelėje.
2 lentelė. Bruknių lapų žaliavos tyrimo rezultatai
Tiriamasis rodiklis Žaliavos frakcijų smulkumas (%) Bruknių lapų
nuodžiūvis (%) Bandymo Nr. Sietas Nr. 500 Sietas Nr. 355
1. 95.00 2.00 6.05
2. 97.00 1.40 5.58
3. 96.00 1.70 5.48
Vidurkis 96.00 ± 1.00 1.70 ± 0.30 5.70 ± 0.30
± standartinis nuokrypis (Δ), n=3
Bruknių lapų nuodžiūvis matuotas tris kartus (n=3), apskaičiuotas rezulatų vidurkis. Nustatytas
bruknių lapų nuodžiūvis 5.70 ± 0.3 proc, kuris atitinka augalinei žaliavai keliamus reikalavimus ( < 13
proc.).
Atlikus žaliavos smulkumo tyrimus pro sietą Nr. 500 prabyrėjo 96.00 ± 1.00 proc susmulkintų
bruknių lapų (>90 proc. žaliavos), o pro sietą Nr. 355 – 1.70 ± 0.30 proc. (<30 proc. Žaliavos).
Bruknių lapų žaliavoje esanti drėgmė ir žaliavos smulkumas atitinka Europos farmakopėjoje
keliamus reikalavimus, todėl žaliava yra tinkama tolimesnių tyrimamų atlikimui.
3.2. Bruknių lapų vandeninės ištraukos tyrimai
3.2.1. Bendrojo polifenolinių junginių kiekio nustatymas
Bruknių lapų vandeninė ištrauka – nuoviras pagamintas pagal skyriuje 7.2.3 pateiktą metodiką.
Bendrasis polifenolinių junginių kiekis pagal arbutiną nustatytas spektrofotometriškai (skyrius 7.2.4),
naudojant kalibracinę kreivę (7 pav.). Tyrimas kartotas 3 kartus. Rezultatai pateikti 3 lentelėje.
38
Polifenolinių junginių
kiekis pagal arbutiną
(mg/ml)
Bruknių lapų nuoviras 21.48 ± 0.68
± standartinis nuokrypis (Δ), n=3
Vandeninėje bruknių lapų ištraukoje nustatytas bendrasis polifenolinių junginių kiekis ištraukoje
- 21.48 ± 0.68 mg/ml.
3.2.2. Arbutino kiekio ištraukoje nustatymas
Arbutino kiekiui nustatyti taikytas efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Metodika
pateikta skyriuje 7.2.5 Rezultatams apskaičiuoti naudotąsi kalibracine kreive (8 pav.) Gauta ES
chromatograma, pateikta 10 pav., rezultatai pateikti 4 lentelėje.
10 pav. ES chromatograma, arbutino nustatymas
3 lentelė. Polifenolinių junginių tyrimo bruknių lapų ištraukoje rezultatai
39
4 lentelė. Bruknių lapų ištraukos tyrimo, nustatant arbutino kiekį ESC metodu, rezultatai
Bandymo
numeris
Sulaikymo
laikas, min.
Plotas po smaile Arbutino
kiekis
ištraukoje
mg/ml
Arbutino
kekis
bruknių
lapuose
mg/g
Arbutino
kiekis
bruknių
lapuose (%)
Nr. 1 2.00 493001 0.422 42.2 4.22
Nr. 2 2.00 447594 0.384 38.4 3.84
Nr. 3 2.00 486059 0.417 41.7 4.17
Vidurkis 2.00 ±
0.00
475551.3 ±
24459.3
0.408 ±
0.02
40.77 ±
2.06
4.08 ±
0.21
± standartinis nuokrypis (Δ), n=3
Nustatyta arbutino sulaikymo trukmės vidurkis – 2.00 ± 0.00 min., plotų po smaile vidurkis
475551.3 ± 24459.3. Nustatyta arbutino koncentracija bruknių lapų vandeninėje ištraukoje 0.408 ± 0.02
mg/ml, tai atitinka 4.08 ± 0.21 proc. bruknių lapuose. Apskaičiuotas arbutino kiekis 1g žaliavos lygus
40.77 ± 2.06 mg.
3.3. Pusiau kieto preparato sudėties parinkimas
Atsižvelgiant į nustatytą arbutino kiekį ištraukoje apskaičiuota kiek ištraukos reikia panaudoti
pusiau kieto preparato gamybai, kad arbutino kiekis pagamintame produkte būtų saugus. Ieškant
priimtinos ir stabilios pusiau kieto odos preparato sudėties, buvo pagaminti 29 mėginiai, su skirtingomis
sudedamosiomis dalimis ar jų kiekiais, kol sumodeliuotas galutinis tinkamas variantas. Sudėtys pateiktos
1 priede. M 01 sudėtyje visos lipofilinės fazės sudedamosios dalys buvo minkštos konsistencijos, todėl
gautas produktas buvo takus, nepriimtinos konsistencijos. Produkto konsistencijai pagerinti buvo
nuspręsta į sudėtį įterpti kietinančios medžiagos, karnaubo vaško. Įterpus į sudėtį karnaubo vašką (sudėtis
M 02) gautas pusiau kietas preparatas buvo linkęs išsisluoksniuoti laikant, todėl mėginta keisti karnaubo
vaško kiekį kokosų aliejaus sąskaita. Pastebėta, kad didinant karnaubo vaško kiekį, produktas mažiau
sluoksniuojasi, tačiau, sutrinka vienalytiškumas, atsiranda grūdėtumas. Padidintas emulsiklio kiekis
visiškai grūdėtumo nepanaikino, dėl šios priežasties buvo nuspręsta pakeisti karnaubo vašką bičių vašku
(sudėtis M 09). Gauta vienalytė emulsinė sistema, stabili centrifuguojant. Konservuojančios medžiagos
40
parinkimui buvo išmėgintos sekančios galimybės: pagaminti keturių sudėčių mėginiai, į sudėtį įterpiant 1
proc. mandarinų eterinio aliejaus (M 10), 1 proc. 2- fenoksietanolio (M 11), 1 proc. α-tokoferolio (M 12)
ir 1,5 proc. gvazdikų eterinio aliejaus (M 13). Mėginiai laikyti 3 mėnesius, laboratorijos sąlygomis (
temp.18– 25 ºC) Po trijų mėnesių mėginiuose M 12 ir M 10 pastebėtas pelėsio augimas, o mėginiai M 11
ir M 13 išliko nepakitę. Konservantu nuspręsta naudoti 2-fenoksietanolį, mėginio su gvazdikų eteriniu
aliejumi kavapas buvo per ryškus. Po trijų mėnesių stebėjimo mėginiuose atsirado grūdėtumas. Išmėginus
kitus emulsiklių Tween ir Span mišinio santykius ir derinius, teigiamo rezultato sulaukta naudojant vieną
emulsiklį – Span 80. Pusiau kieto preparato grūdėtumo klausimą buvo bandoma spręsti modeliuojant
kokosų aliejaus kiekį. Pastebėta, kad mažinant kokosų aliejaus kiekį, bei didinant saulėgrąžų aliejaus kiekį
grūdėtumas mažėja. Sumažinus jo iki 19 dalių (sudėtis M 18) plika akimi grūdėtumo jau nesimatė, o
sudėtyje M 19 grūdėtumo nelieka ir stebint pro lupą (padidinus 10 kartų). Siekiant įsitikinti ar kokosų
aliejaus ar vaško kiekis sąlygoja gaminamo pusiau kieto preparato grūdėtumą, mėginta mažinti vaško
kiekį (sudėtis M 20), grūdėtumas pastebėtas. Pagaminti mėginiai (sudėtys M 21, M 23, M 24, M 25) ir
nustatytos kokosų aliejaus, vaško ir saulėgrąžų aliejaus santykių ribos, kuriose grūdėtumo nestebėta,
sistema gauta vienalytė ir išlieka stabili centrifugavimo metu. Tai sudėtys M 24 ir M 25. Tolimesniems
tyrimams pagaminti keturių sudėčių mėginiai M 26, M 27, M 28, M 29, kuriuose kokosų aliejaus kiekiai
atitinkamai: 24, 19, 14, 9 proc. Šių sudėčių pusiau kietos emulsinės sistemos stabilios ir homogeniškos.
3.4. Šviežiai pagaminto pusiau kieto preparato AA palyginimas su kontrolinėmis
grupėmis.
Siekiant įsitikinti, kad pagaminus preparatą išlieka arbutinas, atliktas antioksidacinio aktyvumo
tyrimas lyginant su mėginiu be arbutino (Mėg A) ir su mėginiu kuriame yra tokios pačios koncentracijos
arbutino substancijos tirpalas (Mėg B), preparatas su ištrauka – Mėg C. Šiam tyrimui pasirinktas M 26
sudėties pagrindas. Rezultatai pateikiami 11 pav. grafike. AA matavimui naudota metodika aprašyta
skyriuje 7.2.11.
41
11 pav. Pusiau kieto preparato AA palyginimas su kontrolinėmis grupėmis.
Nustačius antioksidacinį aktyvumą pastebėta, kad mėginys su bruknių lapų vandenine ištrauka
yra statistiškai reikšmingai aktyvesnis (p<0.05) už mėginį be arbutino, ir už mėginį su arbutino tirpalu.
Todėl galima manyti, kad į pusiau kieto preparato sudėtį įvesta bruknių lapų vandeninė ištrauka savo
savybes išlaikė.
3.5. Šviežiai pagaminto pusiau kieto preparato kokybės tyrimai.
Pagaminti mėginiai su bruknių lapų ištrauka M 26, M 27, M 28, M 29. Jų sudėtys pateiktos 5
lentelėje
5 lentelė. Pusiau kieto preparato mėginių sudėtys procentais
Mėginio Nr. M 26 M 27 M 28 M 29
Saulėgrąžų al. 14 19 24 29
Ricinų al. 5 5 5 5
Kakavos sviestas 5 5 5 5
Kokosų al. 24 19 14 9
Bičių vaškas 10 10 10 10
Bruknių lapų ištr. 33 33 33 33
Span 80 8 8 8 8
2-Fenoksietanolis 1 1 1 1
63.76%
41,24%
36,64%
42
Pagaminti mėginiai paliekami stabilumo tyrimams. Pagaminta po keturis kiekvienos sudėties
mėginius, kurie bus atidaromi po 1, 2, 4 ir 6 mėnesių.
3.6. Šviežiai pagamintų mėginių centrifugavimo testas
Centrifugavimo testas atliktas norint vertinti pagamintų pusiau kietų dispersinių sistemų
stabilumą. Naudota centrifuga SIGMA3-18KS, (Vokietija). Tyrimas atliktas pagal metodiką pateiktą
skyriuje 7.2.7. Tyrimo metu nustatyta, kad pagamintos pusiau kietos emulsinės sistemos v/a su bruknių
vandenine ištrauka išlieka stabilios centrifuguojant 3000 aps/min, 5 minutes, esant 25 ºC temperatūrai.
3.7. Šviežiai pagamintų mėginių pH reikšmės nustatymas
pH reikšmės nustatytos M 26, M 27, M 28, M 29, sudėčių mėginiuose pagal metodiką pateiktą
skyriuje 7.2.8. Naudotas pH-metras pH/mV meter Delta OHM HD 2105.1 (Delta OHM, Italija); Tyrimai
kartoti 3 kartus, rezultatai pateikti 6 lentelėje.
Mėginys M 26 M 27 M 28 M 29
pH vertė 6.9442 6.8791 6.9848 6.9246
Standartinis
nuokrypis 0.0112 0.0098 0.009 0.0072
Šviežiai pagaminto pusiau kieto odos preparato su vandenine bruknių lapų ištrauka, mėginių pH
reikšmė nustatyta tarp 6.8791 ± 0.0098 ir 6.9848 ± 0.0090. Tokia terpė yra neutrali, todėl produktas turėtų
nedirginti odos ir būti tinkamas visiems odos tipams, tačiau arbutinas išlieka stabilus terpėje, kurios pH
reikšmė 3.5 – 6.5.
6 lentelė Šviežiai pagamintų mėginių pH reikšmės.
43
3.8. Šviežiai pagamintų mėginių antioksidacinis aktyvumas
Antioksidacinis aktyvumas nustatytas pagal metodiką aprašyta skyriuje 7.2.11. Tyrimas kartotas
3 kartus, rezultatai pateikti 12 paveikslo grafike.
Šviežiai pagamintų pusiau kietų odos preparatų su vandenine bruknių lapų ištrauka,
antioksidacinis aktyvumas tarp mėginių gautas skirtingas, nuo 63.76 proc. ± 2.39 proc. iki 74.85proc. ±
1.59. Statistiškai reikšmingas antioksidacinio aktyvumo skirtumas matomas lyginant mėginius M 26 ir M
29. AA stipriai koreliuoja(r=0.979) su salėgrąžų aliejaus kiekiu.
3.9. Mikroskopinis šviežiai pagamintų mėginių vaizdas.
Pagamintų pusiau kietų sistemų vienalytiškumas buvo įvertinamas mikroskopu Motic® Mėginių
vaizdas, padidintas 400 kartų, tyrimas atliktas pagal metodiką pateiktą syriuje 7.2.10 pateiktas 13 pav.
12 pav. Šviežiai pagamintų pusiau kietų odos preparatų antioksidacinio aktyvumo tyrimo rezultatai
44
Visuose keturiuose mėginiuose matomas vienalytis mikroskopinis vaizdas, Grubesnė preparato
struktūra matoma mėginio M 28, tai galima paaiškinti skystos ir kietos lipofilinės dalies santykio
skirtumu.
3.10. Šviežiai pagamintų mėginių tekstūros analizė
Tekstūros analizė atlikta tekstūros analizatoriumi TA.XT.plus. Tyrimo metu vertintos šviežiai
pagamintų pusiau kietų preparatų tekstūros savybės nustatant kietumą, konsistenciją, koheziją, klampos
indeksą, metodika aprašyta skyriuje 7.2.9. Rezultatai pateikiami 7, 8, 9,10 lentelėse
Kietumas. Pagamintų pusiau kietų preparatų su bruknių ištrauka kietumas vertintas išmatavus
jėgą, kurią reikia panaudoti, norint išspausti pagamintą masę ir išreiškiama sunaudota jėga. Atlikti šviežiai
pagamintų mėginių kietumo tyrimo rezultatai pateikti 7 lentelėje.
13 pav. Mėginių mikroskopinis vaizdas (padidinta 400x )
45
Mėginys M26 M27 M28 M29
Vidurkis 678.08 791.69 852.65 956.14
Std. nuokrypis 19.88 9.63 9.64 21.34
Išmatuota jėga šviežiai pagamintų mėginių, kaip matyti iš lentelės, siekė nuo 678.08 ± 19.88 iki
956.14 ± 21.34 g. Išmatuotas dydis parodo, kad juo didesnės jėgos reikia norint paskleisti preparatą, juo
tepamumas vertinamas blogiau. Kietumas (matuojama jėga) gali priklausyti nuo skystosios ir kietosios
lipofilinių dalių santykio, sistemos vienalytiškumo, didelę įtaką gali daryti kietosios dalelės arba oro
intarpai.
Mėginys M26 M27 M28 M29
Vidurkis 4435.96 4715.53 5272.85 5449.08
Std.
nuokrypis 42.64 79.86 160.77 117.96
Šviežių mėginių konsistencijos rodiklis svyravo nuo 4435.96 ± 42.64 iki 5449.08 ± 117.96 g.sec.
Mėginys M 26 M 27 M 28 M 29
Vidurkis -579.68 -683.05 -744.55 -887.00
Std. nuokrypis 8.41 12.19 8.09 13.8
Iš pateiktų rezultatų matyti, kad šviežiai pagamintuose mėginiuose išmatuotos kohezijos
reikšmės nuo -579.68 ± 8.41 iki -887.00 ± 13.8 g. Galima manyti, kad pagamintuose pusiau kietuose
preparatuose medžiagų dalelių sukibimą, (koheziją) dėl molekulių sąveikos ar cheminio ryšio jėgų,
sąlygoja skystosios ir kietosios lipofilinių dalių santykis.
7 lentelė. Šviežiai pagamintų mėginių kietumo tyrimo rezultatai (g)
8 lentelė. Šviežiai pagamintų mėginių konsistencija (g.sec)
9 lentelė. Šviežiai pagamintų mėginių kohezijos tyrimo rezultatai (g)
46
Klampos indekso nustatymas.
Nustatyti klampos indeksai šviežiai pagamintuose mėginiuose. Juos paskaičiuoja prietaiso
programa ir pateikia grafike, kaip dydį neigiama reikšme.
Iš lentelėje pateiktų duomenų matyti, kad nustatyti šviežiai pagamintų mėginių klampos indeksai
yra skirtingi, ir išmatuoti intervale nuo -747.53 ± 13.84 iki -828.69 ± 12.09 g.sec.
4. PUSIAU KIETO PREPARATO STABILUMO TYRIMAI.
4.1. Centrifugavimo testas stabilumo tyrimų metu
Centrifugavimo testas atliktas norint vertinti pusiau kietų dispersinių sistemų stabilumą per 6
mėnesius. Naudota centrifuga SIGMA3-18KS, (Vokietija). Tyrimo metu nustatyta, kad pagamintos
pusiau kietos emulsinės sistemos v/a su bruknių vandenine ištrauka išlieka stabilios centrifuguojant 3000
aps/min, 5 minutes, esant 25 ºC temperatūrai, po 1, 2, 4, 6 mėnesių laikymo.
4.2. pH reikšmės pokyčio tyrimas
Stabilumo tyrimų metu nustatytos pH reikšmės mėginiuose po 1, 2, 4 ir 6 mėnesių. Tyrimo
rezultatai pateikti 14 paveiksle.
Mėginys M 26 M 27 M 28 M 29
Vidurkis -828.69 -764.93 -754.22 -747.53
Std. nuokrypis 12.09 7.72 8.99 13.84
10 lentelė. Šviežiai pagamintų mėginių klampos indekso nustatymo rezultatai (g.sec).
47
Per šešių mėnesių stebėjimo laiką, visų mėginių pH reikšmių pokyčiai nebuvo reikšmingi
(p>0.05). Atsižvelgiant į tai, produkto pH reikšmė laikoma pastovia, o produktas išlaiko neutralią terpę
per visą numatomą vartojimo laikotarpį. pH reikšmės mėginiose buvo 6.8113 – 6.9926.intervale.
4.3. Antioksidacinio aktyvumo pokyčio tyrimas
Nustatyti antioksidacinio aktyvumo pokyčiai pusiau kieto preparato su vandenine bruknių lapų
ištrauka mėginiuose laikymo metu, šešių mėnesių laikotarpyje. Rezultatai pateikti 15 pav.
15 pav. Antioksidacinio aktyvumo pokytis mėginiuose per 6 mėn.
14 pav. pH reikšmės pokyčiai mėginiuose per 6 mėn.
48
Iš pateikto grafiko matyti, kad antioksidacinis aktyvumas mėginiuose kito statistiškai
reikšmingai per 4 laikymo mėnesius (p<0.05), o nuo ketvirto iki šeštojo mėnesio, antioksidacinis
aktyvumo mažėja, tačiau pokyčiai jau nebuvo statistiškai reikšmingi (p>0.05).
4.4. Mikrskopinio vaizdo pokyčio tyrimas
Atlikti mėginių vienalytiškumo tyrimai, mikroskopuojant (didinimas 400x).16 paveiksle
pateikiami mėginių struktūros pokyčiai per 6 mėn..
Iš pateiktų mikrokopavimo nuotraukų matyti, kad mėginiai neišlaikė vienodos struktūros
stabilumo tyrimų metu. Kitimai mėginiuose stebimi po dviejų mėnesių. Po dviejų ir po keturių mėnesių
pradinę struktūra buvo išlaikę M 27, M 28 ir M 29 mėginiai, o po 6 mėnesių geriausiai išsilaikęs pasirodė
M 29 ir M 27 mėginys.
16 pav. Mikroskopinio mėginių vaizdo pokytis per 6 mėn.
49
4.5. Pusiau kieto preparato tekstūros pokyčių nustatymas stabilumo tyrimų metu
4.5.1. Kietumo pokyčių nustatymas
Tekstūros analizatoriumi nustatytas mėginių kietumo pokytis po 1, 2, 4 ir 6 mėnesių. Rezultatai
pateikiami 17 pav.
17 pav. Mėginių kietumo pokytis
Nustatyta, kad laikant mėginius jų kietumas mažėja, tačiau sumažėjimas per 6 mėnesius nėra
statistiškai reikšmingas (p<0.05).
4.5.2. Konsistencija
Tekstūros analizatoriumi nustatytas mėginių konsistencijos pokytis po 1, 2, 4 ir 6 mėnesių.
Rezultatai pateikiami 18 pav.
50
Per 6 mėnesius M 26, M 27 ir M 28 mėginių konsistencija kito nereikšmingai, reikšmingas
(p<0.05) pokytis užfiksuotas M 29 mėginyje kuriame konsistencijos reikšmė sumažėjo nuo 5449.08 ±
117.96 g.sec iki 3368.32 ± 115.09 g.sec.
4.5.3. Kohezija
Nustatytas mėginių kohezijos pokytis po 1, 2, 4 ir 6 mėnesių. Rezultatai pateikiami 19 pav.
18 pav. Mėginių konsistencijos pokytis
19 pav. Mėginių kohezijos pokytis
51
Per 6 mėnesius kohezijos rodiklis statistiškai reikšmingai nepakito (p>0.05)
4.5.4. Klampos indeksas
Tekstūros analizatoriumi nustatytas mėginių klampos indekso pokytis po 1, 2, 4 ir 6 mėnesių.
Rezultatai pateikiami 20 pav.
Per 6 mėnesius statistiškai reikšmingas (p<0.05) klampos indekso pokytis pastebėtas M 26
mėginyje, lyginant su šviežiai pagaminto mėginio klampos indeksu. Kituose mėginiuose klampos
indeksui statistiškai reikšmingo pokyčio nenustatyta (p>0.05).
20 pav. Mėginių klampos indekso pokytis
52
5. REZULTATŲ APTARIMAS
Europos farmakopėjoje aprašytais metodais buvo tirtos naudojamos žaliavos, bruknių lapų,
savybės. Nuodžiūvio tyrimai parodė, kad tyrime naudojamos žaliavos drėgmė yra 5.70 ± 0.30 proc. O
sietų analizė parodė, kad žaliava prabiro pro sietą ø 500 μm, bet neprabiro pro ø 300 μm sietą. Šiais
metodais buvo nustatyta, kad tyrime naudota žaliava yra kokybiška ir tinkamai paruošta.
Bendrasis polifenolinių junginių kiekis vandeninėje bruknių lapų ištraukoje (1:10) buvo
nustatytas spektrofotometriniu metodu, pagal arbutiną. Nustatyta, kad žaliavos bendrasis polifenolinių
junginių kiekis pagal arbutiną yra 21.48 ± 0.68 mg/ml. 2009 m. Samir C. Debanath ir Mathilde Sion rašė,
kad Lenkijoje augintų bruknių lapuose nustatytas polifenolinių junginių kiekis yra 27.01 ± 0.19 mg/ml
[44]. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu buvo nustatytas arbutino kiekis tiramojoje bruknių
lapų vandeninėje ištraukoje nustatytas kiekis buvo 4.08 ± 0.02 proc. Ragažinskienė O., ir kt. Vaistinių
augalų enciklopedijoje (2005 m.) nurodomas, arbutino kiekis bruknių lapuose yra 5-10 proc.[3].
Arbutinas bruknių lapų žaliavoje dažniausiai nustatomas etanolinėse ištraukose. A. Pyka ir kt. 2007
metais atliktame moksliniame tyrime, densitometrinio metodo pagalba, nustatė, kad arbutino kiekis
bruknių lapų ištraukoje svyruoja nuo 3.5 iki 4.7 proc., augalinė žaliava surinkta atitinkamai, 2005 ir 2006
metais [45]. Kitame moksliniame tyrime nustatytas arbutino kiekis – 5.1 proc. [46]. 2014 m. I. Jazbutytė
nustatė 3.38 proc. arbutino kiekį bruknių lapuose. Arbutino kiekis bruknių lapų žaliavoje gali skirtis
priklausomai nuo augimvietės, žaliavos surinkimo laiko, ekstrahento ir ištraukos gamybos metodo.
Tyrimo metu buvo pagaminti keturių sudėčių stabilūs pusiau kieto odos preparato su vandenine
bruknių lapų ištrauka, mėginiai, tiriant šiuos mėginius buvo nustatytos visų tiriamų rodiklių ribos pagal
šviežiai pagamintus mėginius. Atsižvelgiant į šias ribas buvo stebimas mėginių kokybės pokytis
stabilumo tyrimų laikotarpiu. Pastebėta, kad mėginiai M 27 ir M 28 išlieka stabilūs visą laikymo
laikotarpį tačiau vertinant vienalytiškumą vizualiai M 28 neatrodo vienalytis, mėginyje M 26 pastebėtas
statistiškai reikšmingas klampos indekso pokytis (nuo 828.69 ± 12.09 iki 597.95 ± 18.21 g.sec), o
mėginyje M 29 pastebėtas statistiškai reikšmingas konsistencijos rodiklio pokytis (nuo 5449.08 ± 117.96
iki 3368.32 ± 115.09 g). Kadangi šie mėginiai pakito statistiškai reikšmingai bent vienoje iš stabilumo
tyrimo sričių, jie nėra vertinami kaip tinkami. Tiriant mėginių antioksidacinį aktyvumą nustatyta, kad
antioksidacinis pusiau kieto preparato aktyvumas priklauso ne tik nuo bruknių lapų ištraukos. AA stipriai
(0.979) koreliuoja su saulėgrąžų aliejaus kiekiu, didėja didinant saulėgrąžų aliejaus kiekį ir mažinant
kokosų aliejaus kiekį. Stabilumo tyrimų metu pastebėta, kad antioksidacinis aktyvumas visuose
53
mėginiuose statistiškai reikšmingai mažėja iki 4-to mėnesio, o 4 – 6 laikymo mėnesį pokytis statistiškai
nereikšmingas. Produkto pH reikšmės svyruoja nuo 6.8113 iki 6.9926, todėl norint prailginti produkto
vartojimo laiką, reikia koreguoti pH reikšmę, kad ji būtų tarp 3.5 ir 6.5.
54
6. IŠVADOS
1. Vandeninė bruknių lapų ištrauka pagaminta pagal Eur.F. aprašą santykiu (1:10). Bendras fenolinių
junginių kiekis, pagal arbutiną, ištraukoje nustatytas spektrofotometriniu metodu (21.48 ± 0.68 mg/ml),
o ESC analizės metodu įrodytas veikliosios medžiagos arbutino, buvimas ištraukoje ir nustatytas jo
kiekis žaliavoje – 4.08 ± 0.02 proc.
2. Sumodeliuotos pusiau kietos, agregatyviai stabilios, emulsinės sistemos (v/a), kurių sudėtyje yra
33 proc. vandeninės bruknių lapų ištraukos, pasižymėjo stipriu AA pagal DPPH laisvojo radikalo
inaktyvinimą (63.76 proc.–74.85 proc.), tačiau skirtingam antioksidaciniam aktyvumui tarp skirtingos
sudėties mėginių darė įtaką lipofilinė sistemos dalis. Nustatyta stipri AA koreliacija su saulėgrąžų
aliejaus kiekiu (r=0.979).
3. Atlikus pagamintų pusiau kietų preparatų mėginių kokybės tyrimus nustatytos pH reikšmės
(6.8791 ± 0.0098 ir 6.9848 ± 0.0090) yra nežymiai didesnės nei nustatytos arbutino stabilumo ribinės
reikšmės, manoma, kad pakoregavus pH reikšmę ribose nuo 3.5 iki 6.5, produktas ilgiau išliktų
stabilus. Tekstūros analizės metu nustatyta, kad skystosios lipofilinės dalies kiekis daro stiprią įtaką
tekstūros parametrams: deformuojančiai jėgai (kietumui) (nuo 678.08 ± 19.88 iki 956.14 ± 21.34 g),
(r=0.994), klampos indeksui (-828.69 ± 12.09 iki -747.53 ± 13.84 g.sec.) (r= - 0.830), konsistencijai
(4435.96 ± 42.64 iki 5449.08 ± 117.96 g.sec.) (r=0.981), kohezijai (-579.68 ± 8.41 iki -887.00 ± 13.8)
(r=0.989).
4. Stabilumo tyrimai parodė, kad pusiau kieto preparato su bruknių vandenine ištrauka mėginių
mikroskopinis vaizdas išlieka nepakitęs 2 mėnesius, tekstūros pokyčiai nėra statistiškai reikšmingi
stebint 6 mėnesius, tačiau antioksidacinis aktyvumas, kito statistiškai reikšmingai, jau po 2 mėnesių.
Siūloma pusiau kieto preparato sudėtis M 27 ( procentais: saulėgrąžų aliejaus 19.0; ricinų aliejaus 5.0;
kakavos sviesto 5.0; kokosų aliejaus 19.0; bičių vaško 10.0; vandeninės bruknių lapų ištraukos 33.0;
Span-80 8.0; 2 – fenoksietanolio 1.0) gali būti naudojama 2 mėnesius.
55
7. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Pratęsiant šį tiriamąjį darbą siūlyčiau:
1) Stabilumo tyrimų metu panaudoti analizės metodą tinkantį arbutino kiekio pokyčiams sekti.
2) Atlikti juslinių savybių ir poveikio tyrimus.
56
8. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Thongchai W., Liawrungrath B., Liawrungrath S. ,,High – performance liquid chromatographic
determination of arbutin in skin whitening creams and medicinal plant extracts”, Departament of
Pharmaceutical /sciences, Faculty of Pharmacy (W.T., B.L.), and Departament of Chemistry, Faculty
of Science (S.I.), Chiang Mai University, Chiang Mai, 50200, Thailand. p. 36. Prieiga internete:
https://www.researchgate.net/publication/5361874_High-
performance_liquid_chromatographic_determination_of_arbutin_in_skin-
whitening_creams_and_medicinal_plant_extracts_Int_J_Cosmet_Sci_296488
2. Zhu W., Gao J., “The use of botanical extracts as topical skin-lightening agents for the improvement
of skin pigmentation disorders. 2008. Psl. 1 Prieiga internete:
http://www.nature.com/jidsp/journal/v13/n1/pdf/jidsymp20088a.pdf
3. Ragažinskienė O., Rimkienė S., Sasnauskas V., Vaistinių augalų enciklopedija. ISBN 9955-575-73-5,
leidykla “Lututė”, 2005, Kaunas.
4. Ertam I., Mutlu B., Unal I., Alper S., Kivçak B., Ozer O. ,, Efficiency of ellagic acid and arbutin in
melasma: A randomized, prospective, open-label study”, Department of Dermatology and Pharmacy,
Ege University School of Medicine, Izmir, Turkey. 2008. Prieiga internete:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18837701
5. Crocco E.I., MD; Veasey J.V., MD; Feitosa de Camargo Boin M.F., MD; Lellis R.F., MD; Alves
R.O., MD ,, A Novel Cream Formulation Containing Nicotinamide 4%, Arbutin 3%, Bisabolol 1%,
and Retinaldehyde 0.05% for Treatment of Epidermal Melasma”, Santa Casa de São Paulo Hospital
and Medical School, Brazil, 2015. Prieiga internete: http://www.cutis.com/view-
pdf.html?file=uploads/media/media_cc5d2fb_CT096011337
6. Klimas R., Drakšienė G., Briedis V., Inkėnienė M. A., ,,Biofarmacijos pagrindai ir laboratoriniai
darbai”. ISBN 978-9986-9132-7-6, KMU leidykla, 2007, Kaunas. p. 39 – 43
7. Kielholm J., Melching-Kollmuß S., Mangelsdorf I., ,,Dermal Absorbtion”. Fraunhofer Institute of
Toxicology and Experimental Medicine, Hanover, Germany. © World Health Organization 2006.
Prieiga internete: http://www.who.int/ipcs/publications/ehc/ehc235.pdf?ua=1
8. Klosterman L. What is skin? In: Skin. New York: Marshall Cavendish; 2008. p. 5 – 16.
9. Brummer R. ,,Reology essentials of cosmetic and food emulsions”. Germany: Springer; 2006. p. 15 –
16.
57
10. Lambers H, Piessens S, Bloem A, Pronk H, Finkel P, “Natural skin surface pH is on average below 5,
which is beneficial for its resident flora”, Int J Cosmet Sci. 2006 Oct 28. Prieiga internete:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18489300
11. Alpha arbutin technical data sheet. Prieiga internete: https://www.in-
cosmetics.com/__novadocuments/2883
12. Savickas A, Briedis V, Švambaris L, Drakšienė G, Klimas R, Ramanauskienė K. ir kt. Vaistų
technologija. V tomas. Kaunas; 2008. p. 35 – 60; 122 – 130.
13. J. A. Rees, I. Smith, J. Watson ,,Pharmaceutical practice fifth edition”, Churchhill livingstone,
Elsevier, 2014. p. 337 – 349.
14. European directorate for the quality of medicines and healthcare. European Pharmacopeia 7 th Ed.
Council of Europe Strasbourg. 2011.
15. Tadros TF. Emulsion Science and Technology. Veinheim: Wiley; 2009.
16. Thompson JE, Davidow L. A Practical Guide to Contemporary Pharmacy Practice, 3rd ed. Lippincott
Williams & Wilkins; 2009. p. 473 – 517.
17. Sarkar R. ,,Melasma a monograph”, 2015, Jaypee Brothers Medical Publishers. ISBN: 978 – 93 –
5152 – 543 – 1, Psl. 45 Prieiga internete:
https://books.google.lt/books?hl=lt&lr=&id=OJ8HCgAAQBAJ&oi=fnd&pg=PA44&dq=%22side+eff
ects%22++of+hydroquinone&ots=O74GMCDc2Z&sig=dd4qEHNOH58okSEgpgvQsxN3_zc&redir_
esc=y#v=onepage&q=%22side%20effects%22%20%20of%20hydroquinone&f=false
18. Rendon M.I., MD, Gaviria J.I., MD ,,Review of Skin-Lightening Agents”, Department of
Dermatology, Dermatology and Aesthetic Center, Boca Raton, Florida, and University of Miami,
Miami, 2006. Prieiga internete: https://www.researchgate.net/publication/7714708_Review_of_Skin-
Lightening_Agents
19. Pyka A., Bober K., Stolarczyk A.. Densitometric determination of arbutin cowberry leaves
(Vaccinium vitis idaeae). Acta Poloniae Pharmaceutican Drug Research. 2007. Prieiga internete:
http://ptf.content-manager.pl/pub/File/Acta_Poloniae/2007/5/395.pdf
20. Thongchai W., Wruangrath B., Wruangrath S. High-performance liquid chromatographic
determination of arbutin in skin-whitening creams and medicinal plant extract. International Journal
of Cosmetic Science. 2006 November. Prieiga internete:
http://journal.scconline.org/pdf/cc2007/cc058n01/p00035-p00044.pdf
58
21. Thongchai W.,. Liawruangrath B, Liawruangrath S.. Arbutin determination in medicinal plants and
creams. International Journal of Cosmetic Science. 2009. Prieiga internete:
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1468-2494.2008.00481.x/pdf
22. Sugimoto K., Nishimura T., Nomura K., Sugimoto K., Kurik T “Inhibitory Effects of a-Arbutin on
Melanin Synthesis in Cultured Human Melanoma Cells and a Three-Dimensional Human Skin
Model” Biol. Pharm. Bull. Vol. 27 No. 4 p. 510—514 (2004) Prieiga iternete:
http://apps.dermage.com.br/dermage/paginas/inibicao-da-sintese-de-melanina.pdf
23. Jacek E. Malecki N., G., Morag M., Nowak G., Ponikiewski L., Kusz J., Switlicka. A. Arbutin:
Isolation, X-ray structure and computional studines. Journal of Molecular Structure 2010. Prieiga
internete: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022286010005259
24. Kittipongpatana N., Chaiwan A., Pusod U., Kittipongpatana O. S. High-Performance Liquid
Chromatographic Method for Separation and Quantitative Analysis of Arbutin in Plant Tissue
Cultures. CMU. J. Nat. Sci. 2007. Prieiga internete:
https://www.researchgate.net/publication/242236565_High-
Performance_Liquid_Chromatographic_Method_for_Separation_and_Quantitative_Analysis_of_Arb
utin_in_Plant_Tissue_Cultures
25. Valstybinė vaistų kontrolės tarnyba prie Lietuvos Respublikos sveikatos apsaugos ministerijos ,, Europos
farmakopėjos straipsnių rinkinys, 2002”, Kaunas, 2002. p. 15 – 17.
26. Gunstone F.D. ,,Vegetable Oils in Food Technology: Composition, Properties and Uses”, John Wiley
& Sons, 2011, ISBN: 978-1-4443-3268-1.
27. R. C. Rowe, P. J. Sheskey, M. E. Quinn ,,Handbook of Pharmaceutical Excipients Sixth Edition”,
Pharmaceutical Press and American Pharmacists Association, 2009. p. 126, 184, 488, 675, 721, 764,
780.
28. Akpan U. G., Jimoh A., Mohammed A. D. ,, Extraction, Characterization and Modification of Castor
Seed Oil”, Department of Chemical Engineering, Federal University of Technology, Niger State.
Nigeria. Prieiga internete: http://ljs.utcluj.ro/A08/43_52.pdf
29. Andrés L., Márquez & Gonzalo G,. Palazolo & Jorge R. Wagner ,, Water in oil (w/o) and double
(w/o/w) emulsions prepared with spans: microstructure, stability, and rheology”, Springer-Verlag
2007. Prieiga internete: http://link.springer.com/article/10.1007/s00396-007-1663-3
30. Tae Hwan Kim, Min Gi Kim, Min Gyu Kim et. Al. ,,Simultaneous determination of phenoxyethanol
and its major metabolite, phenoxyacetic acid, in rat biological matrices by LC–MS/MS with polarity
59
switching: Application to ADME studies“, 2015 Prieiga internete:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003991401530031X
31. National Biochemicals Corp. 2-Phenoxyethanol. Prieiga internete:
http://www.nationalbiochem.com/pdf/pis/MP1126%20PS.pdf
32. P., Lindstedt A., Markkinen N., Sinkkonen J., Suomela JP., Yang B ,, Characterization of metabolite
profiles of leaves of bilberry (Vaccinium myrtillus L.) and lingonberry (Vaccinium vitis-idaea L.)“,
December 2014, University of Turku, Finland. Prieiga internete:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25408277
33. Matulis D. ,,Baltymų fizikinė chemija”. Kaunas, Technologija, 2008. Prieiga internete:
http://www.ibt.lt/uploads/file/bvtl-2/Mokymo/BFCh/skyrius4.html#2-2
34. Jakštas V., Janulis V., Trumbeckaitė S. ,,Cheminis fitopreparatų tyrimas”. Kaunas, KMU leidykla,
2009.
35. Liesienė J., Buika G. ,,Skysčių ir dujų chromatografijos pagrindai. Mokomoji Knyga”, Kaunas,
Technologija, 2012. Prieiga internete : https://www.ebooks.ktu.lt/eb/358/skysciu-ir-duju-
chromatografijos-pagrindai/
36. How to Make Water-in-Oil (W/O) Emulsions. Copyright by Makingcosmetics Inc., P.O. Box 3372,
Renton, WA 98056. Prieiga internete: http://spotidoc.com/doc/207301/how-to-make-water-in-oil--w-
o--emulsions
37. Xiaoming Xu, Manar Al-Ghabeish, Ziyaur Rahman, Yellela S.R. Krishnaiah, Firat Yerlikaya, Yang
Yang, Prashanth Manda, Robert L. Hunt, Mansoor A. Khan, “Formulation and process factors
influencing product quality and in vitro performance of ophthalmic ointments”, International Journal
of Pharmaceutics Volume 493, Issues 1–2, 30 September 2015, Psl. 412–425. Prieiga internete:
http://www.sciencedirect.com.ezproxy.dbazes.lsmuni.lt:2048/science/article/pii/S0378517315300843
?np=y
38. Purushotham Rao K, Khaliq K , Kharat S S, Sagare P, Patil Sk, “Preparation and evaluation o/w
cream for skin psoriasis”, International Journal of Pharma and Bio Sciences, Vol.1/Issue-3/Jul-
Sep.2010, ISSN 0975-6299. Prieiga internete: http://ijpbs.net/issue-3/86.pdf
39. Dr. Marsha J. Lewis, “Natural Product Screening: Anti-oxidant Screen for Extracts”, 5 November
2012. Prieiga internete: http://docslide.us/documents/153b-natural-product-screening-anti-oxidant-
screen-dpph-of-extract-crude-extract1.html
60
40. S. Uluata, N. Ozdemir, “Antioxidant Activities and Oxidative Stabilities of Some Unconventional
Oilseeds”, 27 October 2011. Prieiga internete:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3311859/pdf/11746_2011_Article_1955.pdf
41. Marinova G., Batchvarov V., “Evaluation of the methods for determination of the free radical
scavenging activity by DPPH” Bulg. J. Agric. Sci., 17 (No 1) 2011, p.11-24. Prieiga internete:
http://www.agrojournal.org/17/01-02-11.pdf
42. Robert T. Magari, Ph.D, “Assessing Shelf Life Using Real-Time and Accelerated Stability Tests”,
BioPharm International, Nov 01, 2003. Prieiga internete:
http://www.biopharminternational.com/assessing-shelf-life-using-real-time-and-accelerated-stability-
tests?id=&pageID=1&sk=&date=
43. Colipa guidelines “Guidelines on stability testing of cosmetic products”, 2004. Prieiga internete:
http://www.packagingconsultancy.com/pdf/cosmeticscolipa-testing-guidelines.pdf
44. Debanath S. C., Sion M. ,,Genetic Diversity, Antioxidant Activities and Anthocyanin Contents in
Lingonberry” Atlantic Cool Climate Crop Research Centre, Agriculture and Agri-Food Canada, St.
John’s, Newfoundland and Labrador, Canada 2 Institut Polytechnique LaSalle Beauvais, Beauvais
Cedex, France 2009. Prieiga internete:
http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/15538360903005061
45. Pyka A., Bober K., Stolarczyk A.. ,,Densitometric determination of arbutin cowberry leaves
(Vaccinium vitis idaeae”. Acta Poloniae Pharmaceutican Drug Research, 2007. Prieiga internete:
http://ptf.content-manager.pl/pub/File/Acta_Poloniae/2007/5/395.pdf
46. Krvavac J., Kovac-Besovic E, Toromanovic. J, Salihovic M, Tahirovic I, Duric K, Klepo L, Sapcanin
A., Sofic E. ,,Determination of arbutin, rutin, total content of phenols and antioxidant capacity in
fruits and leaves of lingonberry, Vaccinium vitis-idaea L. (Ericaceae)”. Planta Medica 2009. Prieiga
internete:https://www.researchgate.net/publication/240232268_Determination_of_arbutin_rutin_total
_content_of_phenols_and_antioxidant_capacity_in_fruits_and_leaves_of_lingonberry_Vaccinium_vit
is-idaea_L_Ericaceae
61
9. PRIEDAI
1 priedas
Visų gamintų produkto sudėčių lentelė.
62
2 priedas
Tarptautinės mokslinės konferencijos BaltPharm Forum 2016 dalyvio sertifikatas
