KROMATOGRAFI

Tujuan :

Memisahkan molekul Hb dari molekul vitamin B12 dengan menggunakan butiran mikroskopis dekstran sebagai penyaring

Uraian :

Dalam percobaan ini digunakan butiran mikroskopis dekstran (suatu bentuk

polimer glukosa) dengan diameter dan ukuran pori-pori tertentu sebagai fasa

stationer. Vitamin B12 (berwarna merah muda) mempunyai ukuran molekul yang

lebih kecil dari pori-pori (BM 1350 dalton), sehingga akan terperangkap masuk

dalam pori-pori butiran, keluar lagi, terperangkap dalam butiran lain, demikian

seterusnya sehingga akan lebih lambat keluar dari kolom. Sebaliknya molekul

hemoglobin (berwarna coklat) dengan BM 65000 dalton tidak dapat masuk ke pori-

pori dan akan lewat disela-sela butiran sehingga akan keluar lebih dahulu dari kolom

pemisah.

Bahan :

Larutan yang mengandung hemoglobin dan vitamin B12

Kolom berisi gel penyaring molekul (Sephadex-G100)

Dapar NaCl 0,9% sebagai pelarut zat yang akan dipisahkan dan sebagai eluen

Kertas grafik

Cara Kerja :

Siapkan 19 tabung penampung, tandai tabung 1-17 secara berurutan dengan

angka. Tabung 18 ditandai dengan sisa dan tabung 19 dengan dapar. Pipetkan

4ml dapar ke dalam tabung bertanda dapar.

Buka penutup atas dan penutup ujung bawah kolom pemisah. Tampung dapar

dalam tabung bertanda sisa, sampai seluruh dapar keluar. Tutup kembali

ujung bawah kolom pemisah.

Dengan hati-hati tempatkan kolom tersebut pada tabung 1.

Dengan pipet, teteskan 2 tetes campuran Hb dan vitamin B12 tepat di atas

permukaan gel dengan sangat hati-hati supaya tidak mengganggu gel.

Bukalah penutup ujung bawah kolom dan biarkan 1-2 tetes larutan dapar

keluar, hingga campuran Hb dan vitamin B12 masuk ke dalam gel.

Dengan hati-hati tambahkan dapar setetes demi setetes, dengan cara

mengalirkannya perlahan-lahan melalui dinding kolom dekat permukaan gel.

Mulailah menampung dalam tabung 1 sebanyak 3 tetes.

Pindahkan kolom ke tabung 2 dan lanjutkan menampung fraksi 3 tetes dalam

tiap tabung penampung. Penampung gel tidak boleh kering, jadi sambil

menampung fraksi, dapar ditambahkan dengan cara hati-hati.

Setelah pemisahan selesai (gel sudah jernih), tutup kembali ujung bawah

kolom pemisah.

Catat warna dan intensitas tiap tabung (tabung 1-17)

Ukur serapan fraksi-fraksi pada panjang gelombang 540 nm yaitu dengan cara

menambahkan aquades 2,5 ml tiap fraksi. Gambarkan kurva serapan fraksi

dengan nomor tabung sebagai sumbu X dan nilai serapan sebagai sumbu Y.

Hasil pengamatan :

Tabung 1 2 3 4 5 6

Warna Bening Pekat Agak pekat Lebih

Cerah

Lebih

Cerah

Intensitas

(+++)

- + ++++ +++ ++ +

Tabung 7 8 9 10 11

Warna Orange Makin

bening

Makin

bening

Makin bening Makin bening

Intensitas

(+++)

++ ++ ++ ++ ++

Tabung 12 13 14 15

Warna Makin bening Samar Samar Samar

Intensitas

(+++)

++ + + +

Tabung 16 17

Warna Samar Samar

Intensitas (+++) + +

Tabung 18 19

Warna Samar Samar

Intensitas (+++) + +

Tabung 20 21

Warna Bening Bening

Intensitas (+++) - -

Tabung 22

Warna Bening

Intensitas (+++) +

GRAFIK :

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 220

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

Intensitas

Intensitas

KESIMPULAN : Setelah melakukan percobaan tersebut, dapat disimpulkan bahwa larutan hemoglobin dari vitamin B12 dapat dipisahkan dengan menggunakan tehnik penyaring molekuler (Molecular Sieve Chromatography).

Lampiran