Kromatografi Lapis Tipis dan Kromatografi Kertas

BAB I

PENDAHULUAN

1.1    Latar Belakang

      Ada banyak teknik pemisahan tetapi kromatografi merupakan teknik paling banyak

digunakan. Kromatografi sangat diperlukan dalam kefarmasian dalam memisahkan suatu

campuran senyawa. Kromatografi merupakan metode pemisahan yang sederhana. Dalam

kromatografi, komponen-komponen terdistribusi dalam dua fase. Salah satu fase adalah fase

diam.

      Kromatografi mencakup berbagai proses yang berdasarkan pada perbedaan distribusi dari

penyusunan cuplikan antara dua fasa.

Satu fasa tetap tinggal pada system dan dinamakan fasa diam. Fasa lainnya dinamakan fasa gerak

menyebabkan perbedaan migrasi dari penyusun cuplikan. Prosedur kromatografi masih dapat

digunakan, jika metode klasik tidak dapat dilakukan karena jumlah cuplikan rendah,

kompleksitas campuranyang hendak dipisahkan atau sifat berkerabat zat yang dipisah

      Kromatografi dibagi menjadi beberapa macam, tetapi pada praktikum Farmakognosi II yang

digunakan hanya 2 jenis kromatografi yaitu kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis.

Oleh karena itu, pada makalah ini hanya akan dijelaskan kedua kromatografi tersebut.

1.2        Rumusan Masalah/Topik Bahasan

1.      Apakah pengertian dari kromatografi ?

2.      Apakah macam-macam dari kromatografi?

1.3        Tujuan

1.      Untuk mengetahui pengertian dan cara kerja dari kromatografi.

2.      Untuk mengetahui macam-macam dan cara kerja masing-masing kromatografi.

 

BAB II

PEMBAHASAN

2.1        Pengertian Kromatografi

Kromatografi adalah suatu nama yang diberikan untuk pemisahan tertentu. Cara ini

dikenalkan oleh TSWETT, ia telah menggunakan untuk pemisahan senyawa – senyawa yang

berwarna, dan nama kromatografi diambillkan dari senyawa yang berwarna. Meskipun demikian

pembatasan untuk  senyawa- senyawa yang berwarna tak lama dan hampir kebanyakan

pemisahan – pemisahan secara kromatografi sekarang diperuntukkan pada senyawa – senyawa

yang tak berwarna (Sastrohamidjojo, 1985).

Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan  yang mana analit – analit dalam

sampel terdistribusi antara dua fase yaitu fase diam dan gerak. Fase diam dapat berupa bahan

padat dalam bentuk molekul kecil atau dalam bentuk cairan yang dilapiskan pada pendukung

padat atau dilapiskan pada dinding kolom. Fase gerak dapat berupa  gas atau cairan. Jika gas

digunakan sebagai fase gerak maka prosesnya dikenal sebagai kromatografi gas.  Dalam

kromatografi cair dan juga kromatografi lapis tipis, fase gerak yang digunakan selalu cair

(Rohman, 2009).

   Kromatografi melibatkan pemisahan terhadap campuran berdasarkan perbedaan -

perbedaan tertentu yang dimiliki oleh senyawanya. Perbedaan yang dapat dimanfaatkan meliputi

kelarutan dalam berbagai pelarut serta sifat polar. Kromatografi biasanya terdiri dari fase diam

(fase stationer) dan fase gerak (fase mobil).Fase gerak membawa komponen suatu campuran

melalui fase diam, dan fase diam akan berikatan dengan komponen tersebut dengan afinitas yang

berbeda-beda. Jenis kromatografi yang berlainan bergantung pada perbedaan jenis fase, namun

semua jenis kromatografi tersebut berdasar pada asas yang sama (Bresnick, 2004).

Pemisahan yang terjadi dalam kromatografi dilaksanakan dengan memanipulasi sifat-

sifat dari senyawa, yaitu :

1) kecenderungan suatu molekul untuk larut dalam cairan (kelarutan)

2) kecenderungan suatu molekul untuk bertaut dengan suatu serbuk padat (absorbsi)

3) kecenderungan suatu molekul untuk menguap

Letak bercak yang diperoleh dari zat yang dikromatografi dapat ditetapkan dengan cara

berikut (Dirjen POM, 1979) :

1.      Pengamatan langsung, jika zat tampak dengan cahaya biasa atau dengan sinar ultraviolet.

2.      Pengamatan dengan cahaya biasa atau dengan sinar ultraviolet setelah kertas disemprotkan

dengan pereaksi yang dapat membuat bercak tersebut tampak.

3.      Menggunakan pencacah Geiger-Muller atau tekhnik otoradiografi, jika zat radioaktif.

4.      Menempatkan pita atau potongan kertas pada medium pembiakan yang tealh ditanami, untuk

melihat hasil stimulasi atau hambatan dari pertumbuhan bakteri.

2.2        Macam-macam Kromatografi

Pembagian ini selanjutnya dapat dibagi lagi seperti telihat pada skema berikut:

KROMATOGRAFI :

1. Kromatografi Gas

a. GLC

b. GSC

2. Kromatografi Cair

a. HPLC

b. LLC-PC

c. LSC-TLC, Kolom

d. Ion Excange

e. Ekslusi : - GP

                   - GF

Keterangan

GLC       = Gas Liquid Chromatography

GSC       = Gas Solid Chromatography

LLC       = Liquid Liquid Chromatography

LSC        = Liquid Solid Chromatography

PC          = Paper Chromatography

TLC        = Thin Layer Chromatography

GP          = Gel Permeation

GF          = Gel Filtration

HPLC     = High Performance Liguid Chromatography

1.      Liquid Liquid Chromatography (LLC)

LLC adalah kromatografi pembagian dimana partisi terjadi antara fase gerak dan fase diam

yang kedua-duanya zat cair. Dalam hal ini fase diam tidak boleh larut dalam fase gerak.

2.      Liquid Solid Chromatography (LSC)

LSC adalah kromatografi penyerapan. Sebagai adsorben digunakan silika gel, alumina,

penyaring molekul atau gelas berpori dipak dalam sebuah kolom dimana komponen-komponen

campuran dipisahkan dengan adanya fase gerak. Kromatografi kolom dan kromatografi lapis

tipis (TLC) merupakan teknik pemisahan yang masuk golongan ini.

3.      Ion-exchange chromatography

Teknik ini menggunakan zeolitas, resin organik atau anorganik sebagai penukar ion.

Senyawaan yang mempunyai ion-ion dengan afinitas yang berbeda terhadap resin yang

digunakan dapat dipisahkan.

4.      Exclusion chromatography

Dalam teknik ini, gel nonionik berpori banyak dengan ukuran yang sama digunakan untuk

memisahkan campuran berdasarkan perbedaan ukuran molekulnya (BM).

5.   HPLC ( High Performance Liquid Chromatography) atau KCKT (Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi)

            Dalam beberapa tahun ini teknologi HPLC dan pemakaiannya sangat berkembang dan

walaupun nisbi mahal, HPLC telah menjadi metode analisis rutin dan bahkan preparative pada

banyak laboratorium.

            Metode dalam kromatografi cair dibagi atas dua macam :dua macam

a)      Kromatografi Cair Retensif

Pemisahan dicapai melalui interaksi antara zat terlarut dengan fase diam. Tipe ini mencakup fase

normal, fase terbalik, dan kromatografi ion.

b)      Kromatografi Cair Non-retensif

Pemisahan yang dicapai tergantung kepada perbedaan besar molekul zat terlarut dimana terjadi

interaksi antara zat terlarut dengan pori yang terdapat di permukaan fase diam. Tipe.ini dikenal

sebagai kromatografi ekslusi.

6.   Teknik kromatografi yang umum digunakan dibidang farmasi yaitu kromatografi kolom,

kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi penukar ion, kromatografi

penyaringan gel, dan elektroforesis.

a.      Kromatografi Lapis Tipis.

               Yaitu kromatografi yang menggunakan lempeng gelas atau alumunium yang dilapisi

dengan lapisan tipis alumina, silika gel, atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi lapis tipis pada

umumnya dijadikan metode pilihan pertama pada pemisahan dengan kromatografi.

               Kromatografi lapis tipis digunakan untuk pemisahan senyawa secara cepat, dengan

menggunakan zat penjerap berupa serbuk halus yang dipaliskan serta rata pada lempeng kaca.

Lempeng yang dilapis, dapat dianggap sebagai “kolom kromatografi terbuka” dan pemisahan

dapat didasarkan pada penyerapan, pembagian atau gabungannya, tergantung dari jenis zat

penyerap dan cara pembuatan lapisan zat penyerap dan jenis pelarut. Kromatografi lapis tipis

dengan penyerap penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan senyawa polar. Harga Rf yang

diperoleh pada kromatografi lapis tipis tidak tetap, jika dibandingkan dengan yang diperoleh

pada kromatografi kertas. Oleh karena itu pada lempeng yang sama di samping kromatogram zat

yang di uji perlu dibuat kromatogram zat pembanding kimia, lebih baik dengan kadar yang

berbeda-beda (Dirjen POM, 1979, hal. 782).

               Kromatografi lapis tipis adalah metode pemisahan fisikokimia.  Lapisan yang

memisahkan, yang terdiri atas bahan  berbutir – butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga

berupa plat gelas, logam atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah berupa larutan ,

ditotolkan berupa berupa bercak atau pita (awal).  Setelah plat atau lapisan ditaruh didalam

bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok ( gambar 2).

               Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bahwa kondisi dalam

gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia

biasanya ditempatkan kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia

dengan uap mencegah penguapan pelarut. Pemisahan terjadi selama perambatan kapiler

(pengembangan) (gambar 2). Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-

komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda

dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna.

Gambar 1 .         Bejana berisi KLT sebelum pengembangan

Gambar   2     : bejana berisi plat KLT sebelum pengembanga.

            Untuk campuran yang tidak diketahui, lapisan pemisah (sifat penjerap) dan   sistem

larutan pengembang harus dipilih dengan tepat karena keduanya bekerjasama untuk mencapai

pemisahan.  Selain itu hal yang juga penting adalah memilih kondisi kerja yang optimum yang

meliputi sifat pengembangan, jarak pengembangan , atmosfer bejana  dan lain- lain . Jarak

pengembangan senyawa pada kromatogram biasanya dinyatakan dengan angka Rf atau hRf.

       Rf =  Jarak titik pusat bercak dari titik awal                Jarak garis depan dari titik awal

                        Angka Rf berjangka antara 0,00 dan 1,00 dan hanya dapat ditentukan dua

desimal. hRf  adalah angka Rf dikalikan faktor 100 (h), menghasilkan nilai berjangka 0 – 100.

Jika keadaan luar misalnya sifat penjerap yang agak menyimpang, menghasilkan kromatogram

yang agak menyimpang, menghasilkan kromatogram yang secara umum menunjukkan angka Rf

lebih rendah atau lebih tinggi, maka sistem pelarut harus diganti dengan yang lebih sesuai. Jika

angka hRf lebih tinggi dari hRf yang dinyatakan, kepolaran pelarut harus dikurangi, jika hRf

lebih rendah maka komponen polar pelarut harus dinaikkan (Stahl 1985).

                        Sifat – sifat umum dari penyerap-  penyerap untuk kromatografi lapis tipis adalah

mirip dengan sifat – sifat penyerap untuk kromatografi kolom. Dua sifat penting dar penyerap

adalah besar partikel dan homogenitasnya, karena adhesi terhadap penyokong sangat tergantung

pada mereka. Besar partikel yang biasa digunakan adalah 1 – 25 mikron . Partikel yang

butirannya sangat kasar tidak akan memberikan hasil yang memuaskan dan salah satu alasan

untuk menaikkan hasil pemisahan adalah menggunakan penyerap yang butirannya halus.

Kebanyakan penyerap yang digunakan adalah silika gel. Silika gel yang digunakan kebanyakan

diberi pengikat yang dimaksudkan untuk memberi kekuatan pada lapisan dan menambah adhesi

pada gelas penyokong. Pengikat yang digunakan kebanyakan kalsium sulfat. Tetapi biasanya

dalam perdagangan silika gel telah diberi pengikat. Jadi tidak perlu mencampur sendiri dan

diberi nama dengan kode silika gel G (Sastrohamijojo 1985).

                        Analisis dengan KLT dapat digunakan untuk mengidentifikasi simplisia yang

kelompok kandungan kimianya telah diketahui.

            Kelompok kandungan kimia tersebut antara lain :

             1. Alkaloid

             2. Antraglikosida

             3. Arbutin

             4. Glikosida Jantung

             5. Zat pahit

             6. Flavonoid

             7. Saponin

             8. Minyak atsiri

             9. Kumarin dan asam fenol karboksilat

           10. Valepotriat

Penyediaan larutan zat yang diperiksa

1.  Alkaloid

                        Ditimbang 1 g serbuk simplisia, kemudian dibasahi dengan 1 ml amonia encer P.

Bahan disari dengan 5 ml metanol P dilakukan dengan cara dikocok pada suhu 60°C selama 15

menit. Filtrat sebanyak 20 µl atau 100 µl digunakan untuk pemeriksaan KLT.

2.   Antraglikosida, Arbutin, zat pahit dan flavonoid

                        Ditimbang 1 g serbuk simplisia, kemudian disari dengan 5 ml metanol P.

penyarian dilakukan dengan cara dipanaskan di atas tangas air selama 15 menit. Filtrat sebanyak

20 µl atau 100 µl digunakan untuk pemeriksaan KLT.

3.   Saponin

                              Ditimbang 1 g serbuk simplisia, kemudian disari dengan 5 ml metanol P.

penyarian dilakukan dengan cara dipanaskan di atas tangas air selama 15 menit. Sari diuapkan

sampai diperoleh 1 ml, kemudian ditambah dengan 0,5 ml air dan 3 ml butanol P, sambil

dikocok. Filtrat sebanyak 20 µl atau 100 µl digunakan untuk pemeriksaan KLT.

4.   Glikosida Jantung

                        Ditimbang 1 g serbuk simplisia, kemudian disari dengan 5 ml metanol P 50 % dan

10 ml larutan timbal (II) asetat LP. Campuran dipanaskan di atas tangas air selama 10 menit.

Filtrat setelah dingin disari 2 kali, masing-masing dengan  10 ml diklormetana P. Sari

dikumpulkan, kemudian diuapkan. Sisa dilarutkan dalam campuran diklormetana P dan metanol

P. (1:1). Filtrat sebanyak 100 µl digunakan untuk pemeriksaan KLT.

5.   Minyak atsiri, Kumarin, asam fenol karboksilat dan valepotriat

                        Ditimbang 1 g serbuk simplisia, kemudian disari dengan 10 ml diklormetana P.

Penyarian dilakukan dengan cara direfluks 15 menit. Filtrat yang diperoleh kemudian diuapkan

sampai kering. Sisa dilarutkan dalam 1 ml toluena P. Filtrat sebanyak 20 µl atau 100 µl

digunakan untuk pemeriksaan KLT.

            Lempeng KLT

                                    Lempeng yang digunakan lempeng silikagel 254P dengan ukuran 10 cm x 10 cm.

Lempeng dapat berupa lempeng kaca atau lempeng lain yang cocok. Untuk menentukan

kelompok kandungan kimia suatu simplisia sekurang-kurangnya diperlukan 10 lempeng.

            Cairan elusi

1.      Dietil eter- toluene (1:1)

      Cairan elusi dijenuhkan dengan larutan asam setat P 10% digunakan untuk mengelusi

pemeriksaan KLT yang mengandung Kumarin.

2.      Kloroform- etanol-asam asetat glasial (94:5:1)

      Digunakan untuk mengelusi pemeriksaan KLT yang diduga mengandung minyak atsiri.

3.      Kloroform-metanol-air

      Digunakan untuk mengelusi pemeriksaan KLT yang mengandung saponin.

4.      Toluene-etil asetat-dietilamin (70:20:10)

      Digunakan untuk mengelusi pemeriksaan KLT yang mengandung alkaloid.

Pereaksi penampak

            Pereaksi penampak adalah larutan pereaksi yang digunakan untuk menyemprot lempeng

KLT agar bercak yang terjadi dapat jelas terlihat.

1.      Anisaldehid-asam sulfat P

      Untuk mengamati minyak atsiri, saponin, zat pedas dan lain-lain.

2.      Dragendroof

      Untuk mengamati alkaloid.

3.      Antimon (III) klorida

      Untuk mengamati glikosida jantung, saponin (Ditjen POM 1987).

b.      Kromatografi kertas

            Merupakan kromatografi cairan-cairan dimana sebagai fasa diam adalah lapisan tipis air

yang diserap dari lembab udara oleh kertas jenis fasa cair lainnya dapat digunakan. Teknik ini

sangat sederhana.

            Prinsip dasar kromatografi kertas adalah partisi multiplikatif suatu senyawa antara dua

cairan yang saling tidak bercampur. Jadi partisi suatu senyawa terjadi antara kompleks selulosa-

air dan fasa mobil yang melewatinya berupa pelarut organik yang sudah dijenuhkan dengan air

atau campuran pelarut.

            Cara melakukannya, ciplikan yang mengandung campuran yang akan dipisahkan

diteteskan/diletakkan pada daerah yang diberi tanda di atas sepotong kertas saring dimana ia

akan meluas membentuk noda yang bulat. Bila noda telah kering kertas dimasukkan dalam

bejana tertutup yang sesuai dengan satu ujung, dimana tetesan cuplikan ditempatkan, tercelup

dalam pelarut yang dipilih sebagai fasa bergerak (jangan sampai noda tercelup karena berarti

senyawa yang akan dipisahkan akan terlarut dari kertas).

            Pelarut bergerak melalui serat dari kertas oleh gaya kapiler dan menggerakkan komponen

dari campuran cuplikan pada perbedaan jarak dalam arah aliran pelarut. Bila permukaan pelarut

telah bergerak sampai jarak yang cukup jauhnya atau setelah waktu yang telah ditentukan, kertas

diambil dari bejana dan kedudukan dari permukaan pelarut diberi tanda dan lembaran kertas

dibiarkan kering. Jika senyawa-senyawa berwarna maka mereka akan terlihat sebagai pita atau

nodayang terpisah. Jika senyawa tidak berwarna harus dideteksi dengan cara fisika dan kimia.

Yaitu dengan menggunakan suatu pereaksi-pereaksiyang memberikan sebuah warna terhadap

beberapa atau semua dari senyawa-senyawa. Bila daerah dari noda yang terpisah telah dideteksi,

maka perlu mengidentifikasi tiap individu dari senyawa. Metoda identifikasi yang paling mudah

adalah berdasarkan pada kedudukan dari noda relatif terhadap permukaan pelarut, menggunakan

harga Rf.

            Harga Rf merupakan parameter karakteristik kromatografi kertas dan kromatografi lapis

tipis. Harga ini merupakan ukuran kecepatan migrasi suatu senyawa pada kromatogram dan pada

kondisi konstan merupakan besaran karakteristik dan reprodusibel.

            Harga Rf didefinisikan sebagai perbandingan antara jarak senyawa dari titik awal dan

jarak tepi muka pelarut dari titik awal.

Rf = Jarak titik tengah noda dari titik awal

Jarak tepi muka pelarut dari titik awal.

                  Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu:

1.      Pelarut, disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-perubahan yang sangat kecil

dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan-perubahan harga Rf.

2.      Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.

3.      Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi

mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika bejana

besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan komposisi pelarut

sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor yaitu penguapan dan

kompisisi mempengaruhi harga Rf.

4.      Kertas, pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan, yang

berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas mempengaruhi kecepatan aliran juga

mempengaruhi kesetimbangan partisi.

5.      Sifat dari campuran, berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-volume yang sama

dari fasa tetap dan bergerak. Mereka hampir selalu mempengaruhi karakteristik dari kelarutan

satu terhadap lainnya hingga terhadap harga Rf mereka.

c.       Kromatografi Penukar Ion

               Merupakan bidang khusus kromatografi cairan-cairan. Seperti namanya, system ini

khusus digunakan untuk spesies ion.

d.       Kromatografi Penyaringan Gel

               Merupakan proses pemisahan dengan gel yang terdiri dari modifikasi dekstran-molekul

polisakarida linier yang mempunyai ikatan silang.

e.        Elektroforesis

Merupakan kromatografi yang diberi medan listrik disisinya dan tegak lurus aliran fasa gerak.

Senyawa bermuatan positif akan menuju ke katode dan anion menuju ke anoda.

2.3        Peranan Kromatografi dalam Pembelajaran

      Di dalam pembelajaran sains, kromatografi berperan sebagai alat penunjang dalam

pembelajaran. Khususnya dalam hal, teknik pemisahan campuran yang didasarkan atas

perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut.

2.4        Penyimpanan Kromatografi

      Dalam hal ini, penyimpanan kromatografi sebaiknya ditempatkan pada tempat yang kering

tidak pada tempat yang lembab. Idealnya diletakkan pada posisi yang siap untuk digunakan

(tidak dipindah atau dipindah ditempat lain). Hal ini memungkinkan memperpanjang usia alat.

Pemindahan atau merakit ulang alat memungkinkan terjadinya kesalahan atau gangguan terhadap

fungsi alat.

BAB III

PENUTUP

3.1        Kesimpulan

1.      Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari

komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan

fase gerak (cair atau gas).

2.      Jenis-jenis kromatografi ialah

a. Liquid Liquid Chromatography (LLC)

b. Liquid Solid Chromatography (LSC)

c. Ion-exchange chromatography

d.      Exclusion chromatography

e.       HPLC ( High Performance Liquid Chromatography) atau KCKT (Kromatografi Cair Kinerja

Tinggi).

                                     i.            Kromatografi Cair Retensif

                                   ii.            Kromatografi Cair Non-retensif

3.      Teknik kromatografi yang umum digunakan dibidang farmasi yaitu kromatografi kolom,

kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis, kromatografi penukar ion, kromatografi

penyaringan gel, dan elektroforesis.

DAFTAR PUSTAKA

Dirjen POM, (1979), Farmakope Indonesia Edisi III, Departemen Kesehatan RI, JakartaKhopkar, S.M. 2002. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI-Press. Jakarta.

Rohman, (2009), Kromatografi untuk Analisis Obat, Graha Ilmu, Yogyakarta

Sastrohamidjojo Hardjono, (1985 ), Kromatografi, Edisi kedua, Liberty , Yogyakarta

Saifuddin Azis  et all.,(2011), Standarisasi Bahan Obat Alam Edisi Pertama, Graha Ilmu, Yogyakarta

Stahl Egon, (1985), Analisis Obat secara Kromatografi dan Mikroskopi, ITB, Bandung.

Underwood. 1999. Analisis Kimia Kuantitatif. Erlangga. Jakarta