KROMATOGRAFIJADoc. dr. sc. Lidija Barii

1. D. A. Skoog, F. J. Holler, T. A. Nieman, Principles of Instrumental Analysis, ForthWorth, Saunders, 1997.

2. D. A. Skoog, D. M. West, F. J. Holler, Osnove analitike kemije (prijevod: N.Kujundi, V. ivi-Alegretti, A. ivkovi), kolska knjiga, Zagreb 1999.

3. F. Rouessac, A. Rouessac, A. Chemical Analysis, Modern Instrumental Methods andTechniques, 2nd Ed., Willey&Sons, New York, 2007.

Literatura:

Kromatografija: tehnika koja se koristi za razdvajanje i/li identifikaciju sastojaka smjese, temelji se na koncentracijskoj ravnotei sastojaka smjese izmeu dvije faze koje se

meusobno ne mijeaju, jedna je faza imobilizirana u koloni ili uvrena na vrstoj podlozi (stacionarna faza, SF),

dok se druga faza (mobilna, MF) giba kroz SF, kriterij za odabir MF je razliita topljivost sastojaka smjese u MF (osigurava razliito

gibanje sastojaka i njihovo razdjeljivanje),

kromatografske metode bazirane su na fenomenima adsorpcije, particije (razdiobe), ionskeizmjene ili iskljuenja molekula,

o adsorpcijska kromatografija: kruta SF itekua ili plinovita MF; sastojci smjeseuspostavljaju razliite ravnoteeizmeu adsorpcije na povrinu SF itopljivosti u MF; najmanje topljiv, odn.najvre adsorbiran sastojaknajsporije putuje,

o razdjelna (particijska) kromatografija:SF je nehlapiva tekuina koja se kaotanki sloj ili film dri za povrinuvrstog inertnog nosaa; sastojcismjese distribuiraju se izmeu SF i MF(tekuina ili plin); sastojak topljiviji uMF najbre putuje niz kolonu,

o ionsko-izmjenjivaka kromatografija: SFini smola koja je ionski izmjenjiva;eluiranjem MF (tekuina) kroz nosa dolazido izmjene iona,

o kromatografija iskljuenjem: neuspostavlja se ravnotea meu fazama;smjesa prolazi kroz porozni gel ije supore dizajnirane tako da omogueprolazak veih molekula, dok manjemolekule ulaze u gel (usporavaju se).

Kromatografija (gri chroma, boja; graphein, pisati): tehnika kojom se sastojci smjese odjeljujuovisno o brzinama kojima ih tekua ili plinovita mobilna faza (MF, mobile phase, eluens) nosikroz stacionarnu fazu (SF, stationary phase, adsorbens),

kromatografska analiza omoguuje odjeljivanje, identifikaciju i kvantifikaciju kemijskih spojevaprisutnih u sloenim smjesama.

KROMATOGRAFSKE METODE

KROMATOGRAFIJA NA STUPCU

SF ispunjava usku cijev kroz koju se, podutjecajem tlaka ili gravitacije, kree MF

PLONA KROMATOGRAFIJAkroz SF nanesenu na ravnu plohu ili papir, MFprolazi pod utjecajem kapilarnih sila ili gravitacijeutjecajem tlaka ili gravitacije, kree MF

(tekuina, plin, superkritina tekuina)prolazi pod utjecajem kapilarnih sila ili gravitacije

KROMATOGRAFIJA NA STUPCU

TEKUINSKA KROMATOGRAFIJA(LC, liquid chromatography)

MF tekuina

PLINSKA KROMATOGRAFIJA(GC, gas chromatography)

MF plin

TEKUE-TEKUE(SF tekuina adsorbirana

na vrstoj fazi)

TEKUA-VEZANA FAZA(SF organski spojevi vezani

PLINSKO-TEKUINSKA(SF tekuina adsorbirana

na vrstoj fazi)

PLINSKO-VEZANA FAZA(SF organski spojevi vezani

KROMATOGRAFIJA SA SUPERKRITINOM TEKUINOM (SFC, supercritical fluid) MF

superkritini fluid

(SF organski spojevi vezanina vrstu povrinu)

TEKUINA-KRUTINA(SF vrsta tvar)

IONSKA IZMJENA(SF ionski izmjenjiva)

ODJELJIVANJEPREMAVELIINI ESTICA

(SF tekuina u polimeru)

(SF organski spojevi vezanina vrstu povrinu)

PLINSKO-KRUTINA(SF vrsta tvar)

Eluacijska kromatografija eluacija: postupak kojim mobilna faza (MF) ispire analizirane sastojke sa stacionarne faze (SF), eluens: otapalo koje nosi sastojke smjese kroz SF

MF (eluens)

S

F

A

B

na vrh kolone

nanosi se smjesaA+B otopljena u MF

prolaskom krozkolonu sastojci Ai B raspodjeljuju

se izmeu SF i MF

dodavanjem MF (eluensa)molekule uzorka putuju nizkolonu (uspostavlja seravnotea izmeu MF iSF)

sastojak A jae jevezan za SF, asastojak B za MF;sastojak B bre putuje,te se du kolonestvaraju vrpce ili zone

protjecanjem dostatnekoliine MF sastojci Ai B se potpunoodjeljuju i eluiraju izkolone

eluat

kromatogram: niz simetrinih eluacijskih krivulja odnosno pikova koji se dobiva kad se na izlaziz kolone postavi detektor iji odziv ovisi o koncentraciji sastojaka u uzorku, a koji se biljei kaofunkcija vremena (ili volumena dodane MF),

o

d

z

i

v

d

e

t

e

k

t

o

r

a

B A

17,3

36,9 kromatogram omoguava kvalitativnu ikvantitativnu analizu,

poloaj pika na vremenskoj osi(retencijsko vrijeme) pomae uidentifikaciji sastojaka, a iz povrineispod pika moe se izraunati koliina

vrijeme (min)

SF jae vee sastojak A te sastojak B bre putuje; udaljenost izmeu njih se poveavakretanjem niz kolonu, a njihove se zone istovremeno ire ime se smanjuje djelotvornostodjeljivanja,

odjeljivanje se poboljava kontrolom veliina koje poveavaju brzinu razdvajanja zona ilismanjuju brzinu njihova irenja,

odjeljivanje je potpuno ako kromatogram pokazuje onoliko pikova koliko analizirana smjesa imasastojaka.

ispod pika moe se izraunati koliinasvakog odijeljenog sastojka,

Oblici kromatografskih pikova

idealan oblik kromatografskog pika odgovara normalnoj raspodjeli sluajne pogreke(Gaussova raspodjela); u realnoj kromatografiji pikovi esto imaju izgled ne-Gaussoveraspodjele.

Faktori koji utjeu na djelotvornost kromatografske kolone (brzinu gibanja sastojaka kroz SP)

molekule uzorka se niz kolonu gibaju razliitim putevima

123

12

3

1) omjeri raspodjele u kromatografiji (engl. Partition Coefficients)

AMF ASF kromatografska odjeljivanja temelje se na razliitoj raspodjelianaliziranog sastojka A izmeu MF i SF

omjer raspodjele ili koeficijent raspodjele odgovara konstantiravnotee K (c, molarna analitika koncentracija u MF i SF),

K =cSFcMF

u idealnim uvjetima, omjer raspodjele konstantan je pri irokom rasponu koncentracija (cSFproporcionalan je cMF),

u uvjetima priblino konstantnog K govorimo o linearnoj kromatografiji.

2) vrijeme zadravanja tR (engl. Retention Time, retencijsko vrijeme) vrijeme od unoenja uzorka u kolonu do pojave sastojka u detektoru (tR), vrijeme potrebno da tvar koju kolona ne zadrava stigne u detektor mrtvo vrijeme (tM),

vrijeme

o

d

z

i

v

d

e

t

e

k

t

o

r

a

tR

tM

prosjena linearna brzina gibanja analita(L, duljina punila u koloni)

=LtR

prosjena linearna brzina gibanja MF u u = LtM

3) odnos izmeu vremena zadravanja i omjera raspodjele: brzina gibanja analita ovisi onjegovom omjeru raspodjele te volumenu MF i SF

= u x1

1 + KVSF / VMF

4) brzina gibanja analita: faktor kapaciteta kA vaan je parametar kojim se opisuje brzina gibanjaanalita u koloni

k'A =KAVSF

VMF tR i tM lako se oitavaju iz kromatograma, k

Djelotvornost kromatografske kolone

definirana je veliinom irenja eluirane zone tokomgibanja sastojka niz kolonu,

to uzrokuje irenja zone eluiranog sastojka?

1) kinetika teorija kromatografije: koristi kvantitativne izraze temeljene na mehanizmu sluajnog1) kinetika teorija kromatografije: koristi kvantitativne izraze temeljene na mehanizmu sluajnoggibanja molekula tokom putovanja niz kolonu za opis oblika i otrine eluacijskih krivulja,o zona irenja izravno je razmjerna vremenu zadravanja u koloni, a obrnuto razmjerna

brzini MF,

2) kvantitativna definicija djelotvornosti kolone: izraava se (i) visinom tavana H i (ii) brojemteorijskih tavana N

N = LH

o kolona je djelotvorna kad suvrijednosti H niske, a vrijednosti Nvisoke

teorija tavana: moemo zamisliti da kromatografskakolona sadri velik broj odijeljenih slojeva (diskova ilitavana ) u kojima se uspostavljaju ravnotee izmeuSF i MF; analit se giba niz kolonu prijenosomuravnoteene MF s jednog tavana na drugi,

izrazi tavan i visina tavana koriste se u razmatranju djelotvornosti kolone, poeljan je to vei broj tavana N, te to manja visina tavana HEPT (Height Equivalent to a

Theoretical Plate) N se moe izraunati iz dva mjerenja vremena, tR i W ( W je duljina osnovice trokuta kojeg ine

tangente u tokama infleksije s obje strane pika produene do osnovice kromatograma-irina

N = 16 WtR

2

N = 5.54 W1/2tR

2

tangente u tokama infleksije s obje strane pika produene do osnovice kromatograma-irinapika, W1/2 je irina na polovici maksimalne visine pika),

proizvoai opreme parametrima N i Hizraavaju djelotvornost svojih kolona;usporeivanje dviju kolona na temelju tihparametara mogue je samo ukoliko seizraunati podaci odnose na isti spoj.

3) kinetike veliine koje utjeu na irenje zona irenje zona eluiranog sastojka posljedica je brzina prijenosa mase tokom gibanja sastojaka

smjese niz kolonu; neke od tih brzina mogu se kontrolirati podeavanjem sljedeiheksperimentalnih varijabli

VELIINE KOJE UTJEU NA DJELOTVORNOST KOLONE

Veliina Oznaka Uobiajene jedinice

Linearna brzina MF u cm s-1

Koeficijent difuzije u MF DM cm2 s-1

Koeficijent difuzije u SF DS cm2 s-1

Faktor kapaciteta k nema jedinice

Promjer zrna punila dp cm

Debljina tekueg sloja na SF df cm

veliina kinetikog utjecaja na djelotvornost kromatografske kolone ovisi o vremenu kojeg MFprovede u kontaktu sa SF (odnosno o brzini protoka MF); kako brzina MF direktno utjee navrijednosti H (visine tavana), upravo se H koristi u utvrivanju djelotvornosti kolone,

LC GC

minimum za krivulju visine tavana (ili maksimum djelotvornosti) u tekuinskoj se kromatografiji(LC) nalazi uz daleko manje protoke u odnosu na one dobivene plinskom kromatografijom(GC),

visine tavana za kolone u LC su 10-ak puta manje od kolona u GC kolone za LC ne bitrebale biti dulje od 50 cm, dok GC kolone mogu biti duge i preko 50 m ukupan broj tavana i

posljedina djelotvornost kolone uglavnom su vei za GC, zadnjih se tridesetak godina ulae veliki napor u pronalaenju kvantitativnih odnosa kojima se

izraava utjecaj eksperimentalnih veliina na visinu tavana za razliite vrste kromatografskihkolona,

H = B/u + CSu + CMu

djelotvornost najveeg broja kolonamoe se aproksimirati izrazom

o H, visina tavana u cm

o u, linearna brzina u cm s-1

o B, koeficijent longitudinalne difuzijeo CS i CM, koeficijenti prijenosa mase u SF i MF

o longitudinalna difuzija B/u uzrokovana jegibanjem analita od koncentriranog sreditazone prema razrijeenim podrujima u smjerugibanja MF kao i u suprotnom smjeru (vana jeza GC, manje vana za LC); doprinoslongitudinalne difuzije visini tavana obrnuto jeproporcionalan linearnoj brzini eluensa u,

o koeficijenti prijenosa mase: zbog sporoguspostavljanja ravnotee izmeu MF i SF,kolona uvijek radi pri neravnotenim uvjetima(molekule analita odlaze s prednjeg dijelavrpce ili zone prije uspostavljanja ravnoteesa SF koja bi ih mogla zadrati; ravnotea sene uspostavlja ni na razvuenom kraju vrpcepa molekule analita zaostaju za MF),

zakljuak o metodama koje smanjuju irenje zona: djelotvornost kolona moe se poveatiprimjenom uih kolona, smanjenjem promjera zrna punila te sniavanjem temperature (GC!).

Optimizacija rada kolone postie se (i) smanjenjem irenja zone eluiranog sastojka te (ii) promjenom relativnih brzina gibanja

sastojaka.1) Razluivanje kolone RS: kvantitativna mjera kojom se izraava

sposobnost odjeljivanja dvaju analita,RS =

2 [(tR)B - (tR)A]WA + WB

potpuno odjeljivanje analita A i B mogue je tek uz razluivanje od1.5,

produljenjem kolone mogue je postii bolje razluivanje (poveavase N), ali se i produljuje vrijeme potrebno za postizanje boljeg razluivanja.

BABA

BA BA

odnos izmeu razluivanja, svojstavakolone i svojstava analita definiran jejednadbom iz koje se moe izraunati brojtavana potrebnih za ostvarenje traenograzluivanja

N = 16 RS

12 1 + k'B

k'B

2 2

odnos izmeu razluivanja i vremenaeluacije: poeljno je postii to boljerazluivanje u to kraem roku

1

(1 + k'B)(k'B)2

3

(tR)B = 16 RS2 H

u

Primjer: vremena zadravanja spojeva A i B iznose 16,40 i 17,63 minute na koloni duljine 30cm. Nezadravana supstanca prolazi kroz kolonu za 1,30 minuta. irina pika u bazi za A iznosi1,11, min a za B 1,21 min. Izraunajte: (a) razluivanje kolone, (b) prosjeni broj tavana, (c)visinu tavana, (d) duljinu kolone potrebnu za postizanje razluivanja od 1,5, te (e) vrijeme

potrebno za eluaciju sastojka B na duoj koloni.

N = 16 WtR

2

(a) RS =2 [(tR)B - (tR)A]

WA + WB

(b)

(c)

(d) k i se ne mijenjaju s poveanjem N i L

(indeksi 1 i 2 odnose se nakrau i dulju kolonu)

(e) 1

(1 + k'B)(k'B)2

3

(tR)B = 16 RS2 H

u

Za poboljano razluivanje potrebno je udvostruiti vrijeme odjeljivanja!

2) Tehnike optimizacije smanjenje visine tavana: postie se smanjenjem dimenzija zrna punila, promjera kolone,

debljine tekueg sloja u LC, te snienjem temperature kolone u GC, poveanje faktora kapaciteta kB moe se postii mijenjanjem temperature, kao i

promjenom sastava otapala (male promjene u omjeru MeOH/H2O pretvarajunezadovoljavajue kromatograme (a i b) u kromatograme s dobro odijeljenim pikovima(c i d); optimalan je kromatogram (c) jer je odjeljivanje postignuto u minimalnomvremenu,

o poboljano razdjeljivanje smjese aromatskih ugljikovodika postie se poveanjemudjela H2O smjesi H2O/CH3CN (60/40)

poveanje koeficijenta selektivnosti uz istovremeno zadravanje faktora kapaciteta kizmeu 1 i 10 moe se postii (i) promjenom sastava MF, (ii) mijenjanjem temperature kolone,(iii) mijenjanjem sastava SF te (iv) primjenom posebnih kemijskih reakcija kojima se u SFugrauju spojevi koji kompleksiraju sa sastojcima uzorka,

3) opi problem eluacijea) k1 i k2 podeeni su izmeu 1 i 5, dok su faktori kapaciteta sastojaka 2-6 previsoki; pikovi

sastojaka 5 i 6 pojavljuju se nakon dosta vremena i ne mogu se identificirati jer su preiroki,b) ukupno vrijeme eluacije je bolje nego na kromatogramima (a) i (c), ali je razdvajanje pikova 1-

4 nezadovoljavajue,c) podeeni uvjeti optimalni su za sastojke 3 i 4, dok za preostale sastojke nisu zadovoljavajui

rjeenje: na poetku eluacije podesiti uvjete pod (a), nakon eluacije sastojaka 1 i 2 primijenitiuvjete s kromatograma (c) i razdvojiti 3 i 4, te pod istim uvjetima dovriti ispiranje s kolone

u LC se promjene k postiu mijenjanjemsastava MF tokom eluacije gradijentnaeluacija ili programiranje otapala,

u GC optimalni se uvjeti postiupovienjem temperature temperaturnoprogramiranje.

Primjena kromatografije

1) kvalitativna analiza: na temelju oitanog vremena zadravanja, a u usporedbi sastandardom mogue je utvrditi prisutnost ili odsutnost nekog sastojka u smjesi poznatogsastava,

uobiajeno se kromatografske tehnike kombiniraju s nekom drugom tehnikom veeidentifikacijske sposobnosti u cilju to preciznijeg utvrivanja sastava smjese (GC-MS,HPLC-MS, GC-IR, ...)

2) kvantitativna analiza: temelji se na usporedbi visine ili povrine analiziranog pika s visinom ilipovrinom pika standarda,povrinom pika standarda, analize koje se temelje na visini pika: visina pika je duljina okomice povuene od

maksimuma pika do osnovne crte pika; izraunata koliina sastojaka u uzorku je tonapod uvjetom da nije dolo do promjene irine pika u vremenu potrebnom za dobivanjekromatograma uzorka i standarda,

analize koje se temelje na povrini pika: u modernim ureajima povrina se mjerielektronikim integratorima,

badarenje primjenom standarda: pripravi se niz standardnih badarnih otopina kojesu po sastavu sline ispitivanom uzorku; standardnoj se otopini snimi kromatogram, avisine pikova ili njihove povrine prikau se u ovisnosti o koncentraciji dobivenipravac predstavlja temelj za kvantitativnu analizu ispitivanih uzoraka,

metoda unutranjeg standarda: u standardnu otopinu i uzorak dodaje se paljivoizvagana koliina unutranjeg standarda; analitiki parametar dobiva se omjerompovrine (visine) pika analiziranog sastojka i povrine (visine) pika unutranjegstandarda. Pik unutranjeg standarda mora biti dobro odijeljen od pikova ostalihsastojaka i mora se nalaziti u blizini pika analiziranog sastojka.sastojaka i mora se nalaziti u blizini pika analiziranog sastojka.

1. U fokusu istraivanja bioaktivne (nutraceutika) i funkcionalne hrane jest identifikacija ikarakterizacija njihovih bioaktivnih konstituenata,

opisana je TLC-analiza saponin ekstrahiranih iz razliitih biljaka (n-butanol : voda : octenakiselina = 84 : 14 : 7)

Lane 1: shatavarin IV.

Lane 2: Asparagus adscendens Roxb. (fruit).Lane 3: Asparagus adscendens Roxb. (root).

TLC u prehrambenoj tehnologiji, biotehnologiji i nutricionizmu

J. Sherma, Thin-layer chromatography in food and agricultural analysis, Journal of Chromatography A, 880 (2000) 129.O. P. Sharma, An improved method for thin layer chromatographic analysis of saponins, Food Chemistry 132 (2012) 671.

Lane 3: Asparagus adscendens Roxb. (root).Lane 4: Camellia sinensis [L.] O. Kuntze (seed).Lane 5: Aesculus indica (Wall. ex Camb.) Hook.f. (fruit).Lane 6: Lonicera japonica Thunb. (leaf).Lane 7: Silene inflata Sm. (root).Lane 8: Sapindus mukorossi Gaertn. (seed coat).Lane 9: Chlorophytum borivilianum Santapau &Fernandes (leaf).Lane 10: Asparagus racemosus Willd. (root).Lane11: Agave americana L. (leaf).

2. Plijesan prisutna u stonoj hrani moe dovesti do pojave aflatoksina, kancerogenih tvari, umlijeku, mesu i jajima,

http://www.fao.org/docrep/X5036E/x5036E0j.htm

3. TLC-analiza sastava lipida s povrine koe (SSL, skin surface lipid) ljudi i primata

C. de Luca et al, Surface Lipids as Multifunctional Mediators of Skin Responses to Environmental Stimuli. Mediators of Inflammation (2010) 1.

4. Proliferacija i diferencijacija normalnih stanica iz epitela prostate ovisi o aktivnosti androgenihhormona; pokazano je da stanice karcinoma prostate mogu sintetizirati testosteron izkolesterola iz ega se namee zakljuak da inhibicija proizvodnje testosterona u testisima neerezultirati deficijencijom toga hormona,

Paulette R. Dillard et al, Androgen-independent prostate cancer cells acquire the complete steroidogenic potential of synthesizing testosterone fromcholesterol, Molecular and Cellular Endocrinology 295 (2008) 115.

5. Prirodne arome od velikog su znaaja uindustriji aroma i mirisa,

izolirani su mikrobni sojevi koji proizvodevanilin biokonverzijom izoeugenola; soj B2 kojije proizveo najvie vanilina identificiran je kao

Bacillus subtilis sp.

6. TLC u forenzici: prisutnost narkotiku uzorku izuzetom na mjestu zloinaindicirana je rezultatima tankoslojnekromatografije

E. Shimoni et al, Isolation of a Bacillus sp. capable of transforming isoeugenol tovanillin, Journal of Biotechnology 78 (2000) 1.

vanilin standard

IOWA DIVISION OF CRIMINAL INVESTIGATION

kontrola bez bakterija