Upload
ottilia-genn
View
105
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
Kursteil D:DNA-Sequenzierung
Bestimmung der Nukleotidsequenz der
cDNA VfNDS-A
Molekularbiologische Arbeitstechniken
WS 2004/05
von Jennifer Wetzel
Gliederung D1: Extraktion der Plasmid-DNA
► Animpfen der Bakterienkulturen► DNA-Gewinnung
D2: Agarose-Gelelektrophorese D3: Sequenzierung der Plasmid-DNA
► Cycle-Sequencing► Reaktionsaufreinigung► Kapillarelektrophorese
D4: DNA-Sequenzauswertung► Vorprozessierung (Basecalling, Vector-clipping)► Assembly
D1: Extraktion von Plasmid-DNA
Animpfen der Bakterienkulturen (unterschiedliche E. coli-Stämme, die alle das selbe Insert tragen > cDNA VfNDS-A)
Gruppe Stamm 1 Stamm 2 Stamm 3 Stamm 4
1 176-1i 176-2i 176-3 176-4i
2 176-81 176-6 176-8i 176-82
3 176-1 176-2i 176-3 176-4i
4 176-81 176-8i 176-6a 176-6b
5 176-1i 176-2i 176-3 176-4i
6 176-6 176-81 176-82 176-8i
► Lysat mittels Puffer3 (sauer) neutralisieren und abzentrifugieren
Plasmid-DNA renaturiert und gelöst, chromosomale DNA und Proteine pelletiert
► Zellen durch Zugabe von Puffer2 (alkalisch) lysieren Denaturierung der chromosomalen und
Plasmid-DNA
► Angezogene Zellen abzentrifugieren und in Puffer1 (RNAse-haltig) resuspendieren
RNA wird hydrolisiert
D1: Extraktion von Plasmid-DNA
DNA-Gewinnung
► Säule mit Elutionspuffer EB (1,4 M NaCl) eluierenPlasmid-DNA wird aus der Säule in Eppi
gewonnen
► Säule mit PE-Puffer (1,2 M NaCl) waschen und zentrifugieren
alle Moleküle < Plasmid-DNA werden ausgewaschen
► Überstand auf QIAprep Spinsäule (Kationenaustauscher) geben und zentrifugieren
gelöste Zellbestandteile ordnen sich ihrer Größe entsprechend an
D1: Extraktion von Plasmid-DNA
D2: Agarose-Gelelektrophorese
Überprüfung der Reinheit und Konzentration der gewonnenen Plasmid-DNA
► Taschenbelegung: - 2 µl Aliquots der extrahierten Plasmide (mit Bromphenolblau angefärbt)
- 5 µl DNA-Ladepuffer
► pro Gel zwei Konzentrationsstandarts bekannter Plasmid-DNA (=Marker)
D2: Agarose-Gelelektrophorese
M1= 50ng-Marker M2= 100ng-Marker M3= 200ng-Marker
St.1 - 4.= E. coli-Stämme 1 bis 4 siehe Tabelle
D3: Sequenzierung der DNA
Cycle-Sequencing
► In PCR-Streifen werden pro Gruppe 8 Ansätze pipettiert - 400 ng Plasmid-DNA - 3 µl Reaktionsmix (Polymerase, dNTPs, Terminatoren) - 1 µl Primer (pro Stamm je einmal M13 universal und M13 reverse) - 1 µl Betain - add 10 µl H2O
► Temperatur-Profil - 60 sec 96°C - 10 sec 96°C - 60 sec 60°C - Lagerung bei 4 -10°C
x 30
Reaktionsaufreinigung
D3: Sequenzierung der DNA
► Entfernen von nicht eingebauten Terminatoren, die DNA-Sequenzierung stören
► Gelfiltration mit Sephadex-G50 - Sephadex auf Mikrotiterplatte mit Wasser quellen - Sequenzierreaktionsprodukte werden aufgetragen und können bei Zentrifugation mit einer zweiten Mikrotiterplatte aufgefangen werden.
Kapillarelektrophorese
D3: Sequenzierung der DNA
► Laseroptik am Ende der Kapillare detektiert die floureszierenden Terminatoren
► Injektion der DNA-Fragmente in die Kapillare - 9 V für 45 sec - DNA wandert ein
► Elektrophorese - 1500 V für 200 min (3,3 h) - DNA-Fragmente werden ihrer Molekulargröße entsprechend aufgetrennt
D4: DNA-Sequenzauswertung
► primäres Basecalling (Herausrechnen der Effekte der Farbstoffe; Qualität der Sequenzierung)
Vorprozessierung
ScoreCard (Basensequenzlänge/Qualität [%])
D4: DNA-Sequenzauswertung
► sekundäres Basecalling (erneute Datenprozessierung, aber mit anderem Programm >objektiver)
Darstellung der Basensequenz mit dem trev.editor
(blaue Balken = Qualitätsangabe)
► Vector-clipping mit VecScreen
D4: DNA-Sequenzauswertung
Vergleich der gewonnenen Datensequenz mit Vektor-Datenbanken in VecScreen
► Probleme: - (teilweise) schlechte Sequenz-Qualität - verwendeter Vektor existiert nicht in Datenbank
D4: DNA-Sequenzauswertung
► manuelles Vector-clipping - Suche nach Enzym-Schnittstellen GAATTC und CACCTC - Vergleich mit Angaben aus VecScreen - Markierung des Vektors
Markierung des Vektorbereichs (rosa)
D4: DNA-Sequenzauswertung
► Template Display der überlappenden Stränge
Contig 1 Contig 2
Assembly mit GAP4 ► nur Basen mit Qualität > 20
D4: DNA-Sequenzauswertung
► Template Display der einzelnen Basen des Contigs
► Parameter: - Grauabstufung: Qualität der Sequenzierung dieser Base (je heller, desto besser) - grüne Markierungen: abweichende und fehlende Basen oder Basen mit Qualität < 20
D4: DNA-Sequenzauswertung Ergebnis:
Nukleotidsequenz der cDNA VfNDS-A
Contig 1:cggcacgaggccaatttatctcatcctcctttcacattgtcaaaatgtctaaacctgtctttcgagaatatattggtgtgaagccagactcaaaaagtttggctgattttccacaaatcacccaaacagaaaccat
Contig 2:aattcggcacgagcactgatataaattccataagaaaaagaaaacaagaacttattatattgatactaagagaagtaattctccacacttttaacataatacaaaaacacatgaaaaatacaatgggtcttatttaatatttaaaggctaatgcatatagagcttatagtctttgatagatgacccatatcacgaaagatttattactgactagatatagccagttagtcatcatttggcgaggagctcttccaagacatgctctactttgaaaggttcatccccattattggagtcattagcgttccagaaaaaaacaccgggtagtgatgaggtttgtttgagttttgtgcagccaccaatgaatatatcccgtgtaattttaatatttatgtggtcaagcgggtcggtgctaaatcctggaaggactttacgaggatggtagtcatttactaccctttcatagatgtctacaaaagcatcatctgtggatacaggatttagttgattgctgaactgataatcaaccaaattgatatagtctgggtttgcattatacaaattcaggtaggaggatgcgttgttttcagatggagcaatggacaccacatggatgtttaggtcacgttcttttttgagttctgttataagttggcctatcaacctaggaaacgcctcatcccatttgatgtgctcataattaatgtcaatgccatcaatcaagttgccgctttcatttttgtatttttgaatgatcagtttgagtgactttacagcgttcgaaacccatacattttgctcagctggatcgaatggagtttcaacgccacgacctccaatgcttattaccacctttacctctggatgttttgttttcaaaattctcactttatctggaccgaagaactcatccttccaagattcctcgaaatttcccgaaccttttctgctttcgttatacttttcagtggcaaagcccaaaatgaagt