“La ingeniería genética de

levaduras como herramienta

para el desarrollo

Biotecnológico del vino”

Ivan Ciklic, Laura Mercado y Mariana Combina

Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA) EEA Mendoza

Resumen de la presentación

1) Importancia de Saccharomyces cerevisiae

Historica

Biotecnología

Organismo Modelo

2) Definición y aclaración de conceptos biotecnológicos

4) Ejemplificación: Reducción del nivel de alcohol en vinos

Estrategias previas

Nuestro proyecto en INTA

3) Principales areas de aplicación de la ingeniería genética de levaduras de vino

5) Conclusiones

Importancia de Saccharomyces cerevisiae

Biotecnología Tradicional

Uso extensivo en la industria debido a su larga historia en la producción De bebidas alcoholicas y en panaderías

Biotecnología Moderna

Mejoramiento génetico de levaduras para uso industrial. Producción deenzimas, hormonas y compuestos quimicos en Farmaceutica

Importancia de Saccharomyces cerevisiae

✱ Microorganismo con tiempos breves de generaión (1,5 h), alta densidad (108 cel/ml) y eleveda proporción superficie/volumen

✱ Génetica Mendeliana (ciclo de vida sexual, análisis de tetradas)

✱ Gran eficiencia de recombinación homologa

✱Colección de cepas delecionadas para cada uno de los 6000 genes

Organismo modelo

✱ Eucariota unicelular con todas las características típicas (e.g. organelas, regulación del ciclo celular, envejecimiento, apoptosis)

✱ Primer organismo eucariota en contar con la secuencia completa del genoma (1996)

Definición y aclaración de algunos

conceptos importantes

Biotecnología

Cualquier aplicación tecnologica que utilice sistemas biológicos, organismos vivientes o derivados de ellos para fabricar o

modificar productos o procesos para un uso específico

Organismo modificado geneticamente (GMO)

Un GMO es un organismo cuya composición genética ha sido alterada mediante la aplicación de técnicas de ingenieria génetica.Estas alteraciones generalmente implican la incorporación de un

nuevo gen/genes o el reemplazo de un gen/genes prexistente por uno diferente

Transgénico

Es un caso particular de GMO en el cual el gen/genes incorporado

proviene de una especie distinta de la del organismo receptor

Aceptación de productos derivados de

GMOs en la industria de alimentos

Aceptación de GMOs

Percepción de riesgo

Europa aceptaciónUSA aceptación

- Desconfianza en

entes reguladores

- Gran influencia de

ONGs conservadoras

- Credibilidad en los

entes reguladores

- Desconfianza en las

ONGs conservadoras

Ventajas para

el consumidor

- Productos más saludables

- Menor impacto en el ambiente

“Iniciativa

intragénica”

- Variabilidad intraespecie

- Transgénico de especie familiar

Areas de aplicación de ingeniería

genética de levaduras de vino

Mejoramiento de la performance durante la fermentación

(Adaptado de I. Pretorius y F. Bauer, 2002)

Areas de aplicación de ingeniería

genética de levaduras de vino

Mejoramiento de la eficienciade procesamiento

(Adaptado de I. Pretorius y F. Bauer, 2002)

Aplicación de ingeniería genética en

levaduras de vino

Mejoramiento del control biológico de microorganismos contaminantes

(Adaptado de I. Pretorius y F. Bauer, 2002)

Aplicación de ingeniería genética en

levaduras de vino

Mejoramiento del sabor y otras características sensoriales

(Adaptado de I. Pretorius y F. Bauer, 2002)

Aplicación de ingeniería genética en

levaduras de vino

Mejoramiento de las propiedades saludables del vino

(Adaptado de I. Pretorius y F. Bauer, 2002)

Problema abordado y principales

estrategias para solucionarlo

_ Uvas cosechadas con madurez azucarina muy avanzada

_ Veranos cálidos con un aumento en la incidencia solar

Problema

“Vinos con alta concentración dealcohol, indeseable para el Mercado de exportación“

Causas

Principales estrategias biológicas

1) Desarrollo de una levadura genéticamente modificada (GMO) conun redireccionamiento del metabolismo de glucosa hacia glicerol

2) Redireccionamiento del metabolismo de glucosa hacia glicerol sinutilizar técnicas de ingeniería genética (sin GMOs)

Metabolismo anaerobico de glucosa en

S. cerevisiae y disponibilidad de NADH/NAD+

Ad

ap

tad

o d

e D

. K

uti

na e

t al.,

2010

Sobre-expresión de la glicerol fosfato

dehidrogenasa GPD1/2A

dap

tad

o d

e D

. K

uti

na e

t al.

, 2010

- Reducción de hasta 45 % etanol y aumento

de hasta 700 % en glicerol

-Alta producción deacido acético

Deleción de Piruvato descarboxilasas

PDC1, PDC2, PDC5 y PDC6

Ad

ap

tad

o d

e D

. K

uti

na e

t al.,

2010

Hipotesis de trabajo

PDC2 = factor de transcripción que

regula positivamente la expresión de las

piruvato decarboxilasas PDC1 y PDC5

PDC2

Mutagénesis

pdc2

Reducción de regulación

positiva de PDC1 y PDC5

Reducción nivel de expresión

de PDC1 y PDC5

Selección

Redución en la producciónde etanol

PDC1 y PDC5 = Dos

isoformas de la piruvatodecarboxilasa que

cataliza la conversiónde piruvato enacetaldehído

Mutagénesis de PDC2 y reducción de la

producción de etanol

Deleción Δpdc2

Reducción actividad de Pdc - 80%

Nevoigt y Stahl 1996

Reducción etanol - 30%

Proyecto Actual

Mutagenesis de PDC2

1°Selección: mutantes pdc2con actividad Pdc reducida

2°Selección: mutantes pdc2con etanol reducido

Fermentación a escala pilotocon mutantes seleccionados

Proyecto actual vs. estrategias anteriores

para reducir niveles de etanol

Sobreexpresión de genes GPD1/2 de la vía de glicerol

(Remize et al., 1999; Lopes Barros

et al., 2000; Eglinton et al.,2002)

Sobreexpresión del gen de laLa glucosa oxidasa de A. Niger(Malherbe et al., 2003)

Deleción del gen PDC2(Nevoigt y Stahl 1996)

Mutagénesis de PDC2 y selección

de variantes mutantes apropiadas

Estrategia y autores Desventajas asociadas

Proyecto actual Ventajas asociadas

-Causa un severo efecto en el metabolismo del

Etanol con reducciones de hasta un 30 %.

-Los mutantes no pueden crecer en glucosa

-Aumento en la producción de acidoacético,

a consecuencia del desequilibrio redox.

-Problemas asociados con plásmidos de

multicopia: número variable de copias p/célula,

es necesario mantener una presión selectiva

-Problemas asociados al uso de plásmidos de

multicopia.

-Producto transgénico, poca acepta-

ción por la industria y consumidores

-Variabilidad genética intraespecie. -Mutación

integrada establemente en el genoma.

-Efectos moderados sobre el metabolismo.

Estrategias alternativas sin alteración directa de

un componente de la via metabolica de glucosa

NADH oxidasa - Fermentación incompleta- Reducción hasta 7 % etanol

- Bajas tasas de consumo de azucar y altaproducción de acetaldehído, acetona y acetoina

Transportadoresde glicerol

- Elevada producción de glicerol- 30 % reducción en la producción de biomasa

Glucosa oxidasa - Reducción en etanol de hasta 2 % v/v- Requiere oxigeno para funcionar

Transportadoresde hexosas

- Fermentación incompleta- Reducción hasta 7 % etanol

- Bajas tasas de consumo de azucar y altaproducción de acetaldehído, acetona y acetoina

Estrategias biológicas sin uso de

GMOs

✱ Sondeo de variantes naturales con baja producción de etanol-Poco probable de hayar ya que la levadura esta altamente

adaptada para producir etanol por selección natural

✱ Generación de híbridos interespecíficos-Hasta el momento no se ha encontrado ningún hibrido ya sea

artificial o natural que produzca menos etanol

✱ Evolución adaptativa -Es muy difícil generar condiciones de presión selectiva que

favorezcan un redireccionamiento del metabolismo de etanol

Conclusiones

✱ La biotecnología de levaduras es una herramienta poderosa paraobtener mejoras en el proceso de elaboración del vino, especialmente

en la etapa de fermentación

✱ Como ejemplo hemos visto que en el problema de la reducción de los niveles de alcohol, distintas estrategias de GMOs han logrado

reducir en menor o mayor proporción la producción de etanol asociado casi siempre a un aumento en la producción de glicerol

✱ Las principales limitaciones de las estrategias con GMOs derivan en muchos casos de factores intrínsecos como un aumento de productosindeseados como el ácido acético, o de factores externos como la baja

aceptación particularmente de los productos transgénicos

✱ El proyecto que desarrollamos en el INTA potencialmente posee varias ventajas sobre trabajos anteriores ya que se busca un

alteración moderada del metabolismo y se obtendría una cepa nativa GMO pero que no es transgénica lo cual aumenta la aceptación