La molécula de ADN, vista por un biólogo molecular Una molécula de ADN consta de dos polidesoxirribonucleótidos que se enrollan en torno a un eje imaginario común dando lugar a la famosa doble hélice, un modelo estructural propuesto en 1953 por James Watson y Francis Crick y que resultó ser correcto (figura inferior izquierda). Cada cadena de polidesoxirribonucleótido se denomina también hebra (strand) y está formada por desoxirribonucleótidos unidos entre sí mediante enlaces de tipo fosfodiéster que se forman entre el grupo fosfato en posición 5' de un desoxirribonucleótido y el grupo hidroxilo en posición 3' de otro. El orden en que se disponen cada una de las 4 bases posibles (A, C, T y G) determina su secuencia.

En cada una de las hebras se puede distinguir un extremo 5' que corresponde al desoxirribonucleótido que tiene un grupo fosfato libre (porque no ha reaccionado) en la posición 5' de la desoxirribosa y un extremo 3' que corresponde al desoxirribonucleótido que tiene un grupo OH libre (porque no ha reaccionado) en la posición 3' de la desoxirribosa (figura superior derecha). Por convención, la secuencia de un ADN o de un ARN se escribe siempre a partir del nucleótido que se encuentra en posición 5'. Consideremos, por ejemplo, la secuencia TGCGATAC. Como no se indica lo contrario, se asume que la secuencia está escrita en sentido 5'→3' (5'-TGCGATAC-3'). Si queremos escribir una secuencia en sentido contrario (3'→5'), hay que indicarlo específicamente: 3'-CATAGCGT-5'. Si no lo hacemos, todo el mundo considerará que está escrita en sentido 5'→3' (5'-CATAGCGT-3'). Las secuencias de las dos hebras de una doble hélice de ADN son complementarias y antiparalelas:

• Las bases complementarias (una de cada hebra) se unen entre sí mediante puentes de hidrógeno formando pares de bases. La A se empareja siempre con la T (y viceversa) y la C se empareja siempre con la G (y viceversa). La ruptura de estos débiles enlaces (por ejemplo, mediante calentamiento) hace que las dos hebras se separen. Se dice entonces que la molécula de ADN se encuentra desnaturalizada.

• Las dos hebras son antiparalelas porque una de ellas está orientada en sentido

5'→3' y la otra en sentido 3'→5'.

Guía para no perderse en una molécula de ADN El ADN es una molécula formada por dos hebras que son complementarias, antiparalelas y, sobre todo, muy muy largas. Como, además, contiene información resulta esencial describir la molécula con precisión para que no haya malos entendidos. Para representar una molécula de ADN de doble hebra basta con escribir la secuencia de una de sus hebras. Consideremos, por ejemplo, la secuencia TGCGATAC. Como no se indica lo contrario, se asume que la secuencia está escrita en sentido 5'→3' y, por lo tanto, se trata de la hebra directa (forward strand):

Hebra directa: 5'-TGCGATAC-3'

Análogamente, si decido escribir esta misma secuencia empezando por el extremo 3’ se obtiene la hebra inversa (reverse strand):

Hebra inversa: 3'-CATAGCGT-5' A partir de la hebra directa o de la hebra inversa se puede completar automáticamente el resto de la molécula teniendo en cuenta que la otra hebra es complementaria y antiparalela. Normalmente se representa la molécula escribiendo primero la hebra directa y debajo la hebra complementaria (complementary strand). La hebra complementaria se escribe en sentido 3'→5' para que las bases de ambas hebras queden emparejadas:

Hebra directa: 5'-TGCGATAC-3' Hebra complementaria: 3'-ACGCTATG-5'

Si escribimos la secuencia de la hebra complementaria en sentido inverso (5'→3') se obtiene la complementaria inversa (reverse-complement):

Hebra complementaria: 3'-ACGCTATG-5' Hebra complementaria inversa: 5'-GTATCGCA-3'

Estas designaciones han sido aceptadas por la comunidad científica internacional y es importante no olvidar nunca que, si no se indica lo contrario, se supone que cualquier secuencia de ADN o de ARN está escrita en sentido 5'→3'. En Internet existen muchas herramientas donde se introduce una secuencia de ADN se generan la secuencia inversa, la complementaria y la complementaria inversa. Por ejemplo, en el sitio web Sequence Manipulation Site, se puede encontrar la herramienta Reverse Complement. En algunos casos, las secuencias de la hebra directa y de la hebra complementaria inversa son idénticas. Se trata de una secuencia palindrómica:

Hebra directa: 5'-GAATTC-3' Hebra complementaria: 3'-CTTAAG-5'

Vistas así las secuencias, no parecen palindrómicas. Sin embargo, si escribimos la secuencia de la hebra complementaria inversa en sentido 5'→3' podemos comprobar que es igual que la secuencia de la hebra directa:

Hebra directa: 5'-GAATTC-3' Hebra complementaria: 3'-CTTAAG-5' Hebra complementaria inversa: 5'-GAATTC-3'

Los lugares de corte de la mayoría de las endonucleasas de restricción. Por ejemplo, el lugar de corte de la endonucleasa EcoR1 es: GAATTC (figura inferior izquierda). Por otro lado, muchas regiones del ADN a las que se unen proteínas reguladoras también son secuencias palindrómicas que dan lugar a estructuras atípicas como horquillas o estructuras cruciformes en el ADN (figura inferior derecha).

Lugar de corte de la enzima de restricción EcoR1 Estructura cruciforme en el ADN

Corriente arriba - corriente abajo En muchos casos es importante especificar la posición relativa de los distintos elementos presentes en una de las hebras del ADN. Supongamos una molécula de ADN que contiene un lugar de corte para la enzima de restricción EcoR1. Cualquier elemento que esté situado entre el extremo 5' y la secuencia diana está corriente arriba (upstream) y, análogamente, cualquier elemento que esté situado entre la secuencia diana y el extremo 3' está situado corriente abajo (downstream). Tal y como se observa en la figura inferior, lo que es corriente arriba en una de las hebras es corriente abajo en la complementaria.

Manipulaciones básicas de la molécula de ADN (de la célula a las BD) 1.- Extracción del ADN a partir de muestras biológicas Para extraer ADN a partir de muestras biológicas se utiliza una combinación de métodos físicos y químicos. Existen numerosos protocolos que varían, sobre todo, en función del tipo de células que estemos utilizando. Básicamente, en una primera etapa, se recolectan las células y se rompen sus membranas. A continuación se procede a la ruptura enzimática de lípidos, proteínas y ARN y a su separación del ADN intacto por centrifugación. Finalmente, el ADN se extrae haciéndolo precipitar con etanol frío o con isopropanol, mediante una separación de fases en fenol-cloroformo o haciéndolo pasar a través de una minicolumna (figura inferior).

Para llevar a cabo la extracción de plásmidos de un cultivo bacteriano (minipreps) o la extracción ADN amplificado mediante PCR (amplicón) se suelen utilizar kits comerciales que simplifican el trabajo y mejoran el rendimiento del proceso. 2.- Digestión del ADN mediante endonucleasas de restricción En muchas la molécula de ADN genómico es muy grande y hay que dividirla en fragmentos más pequeños. Se puede hacer con métodos mecánicos, pero lo más habitual es utilizar endonucleasas de restricción, que tienen la ventaja añadida de que cortan la molécula en lugares específicos y generan extremos cohesivos. Si queremos que los extremos de los fragmentos no sean iguales se hará la digestión con dos enzimas distintas. Las herramientas NEBcloner y Restriction Map sirven para encontrar dos enzimas que sean compatibles. Otras herramientas analizan una secuencia de ADN en busca de lugares de restricción. Nos indican qué enzimas pueden cortarlo, en qué lugar o lugares se producirán los cortes y el tamaño de los fragmentos generados. Podemos citar como ejemplo las herramientas Webcutter, Restriction Map y NEBcutter. 3.- Separación de los fragmentos y selección del fragmento de interés La digestión genera muchos fragmentos de diversos tamaños. La electroforesis en gel de agarosa permite separarlos en función de su tamaño y con ayuda de un transiluminador podemos visualizar las distintas bandas. La porción del gel que

contiene la banda que nos interesa se puede extraer con cuidado utilizando un bisturí y disolverla en un tampón apropiado. 4.- Clonación (Tecnología del ADN recombinante) Los fragmentos obtenidos tienen extremos cohesivos que pueden insertarse en un vector tratado con la misma enzima de restricción. El vector que hay que utilizar dependerá del tamaño del inserto que se quiere clonar. De este modo se genera una molécula de ADN recombinante. Las moléculas de ADN recombinante se introducen en el huésped apropiado para que se repliquen junto a él, dando lugar a un gran número de moléculas idénticas. Para separar el inserto del vector se vuelve a utilizar la misma enzima de restricción. Si utilizamos un vector que contiene un poliadaptador (polylinker) es importante comprobar que no se utilicen enzimas que puedan cortar el inserto. Dos programas gratuitos que pueden ayudar en el proceso de clonación en plásmidos son pDRAW32 y Serial Cloner. 5.- Amplificación por PCR Para amplificar una molécula o fragmento de ADN por PCR se necesitan dos cebadores (primers). A partir de uno de los cebadores (forward primer) se sintetiza la hebra directa en sentido 5'→3' utilizando la hebra complementaria como molde (figura inferior). A partir del otro cebador (reverse primer) se sintetiza la hebra complementaria, también en sentido 5'→3', utilizando la hebra directa como molde (figura inferior).

A la hora de encargar la síntesis de los cebadores a una empresa no hay que olvidar que las dos secuencias deben escribirse en sentido 5'→3'. Si no se escribe correctamente la secuencia, nos llegará un cebador que no funciona como queremos.

En Internet se pueden encontrar muchas herramientas on-line para el diseño de cebadores para PCR. Un ejemplo es el programa Primer3. 6.- Control de calidad Para estar seguro de que una reacción de PCR se ha llevado a cabo correctamente se suele hacer una serie de comprobaciones. La primera consiste en determinar el tamaño mediante una electroforesis en gel de agarosa. La banda correspondiente al amplicón se distingue inmediatamente por su gran tamaño y su posición permite hacer una estimación aproximada de su masa molecular (figura inferior izquierda). La segunda comprobación consiste en hacer un mapa de restricción. Se digiere el amplicón con distintas enzimas de restricción (solas o combinadas) y se hace una electroforesis para determinar si el tamaño de los fragmentos se corresponde con lo esperado. El mapa de restricción se puede considerar como una especie de “código de barras” que viene determinado por el tamaño de los fragmentos producidos tras la digestión (figura inferior derecha).

Estimación del tamaño de un amplicón

Mapa de restricción de un amplicón

En Internet se pueden encontrar muchas herramientas on-line que hacen una digestión virtual de la molécula con cualquiera de las endonucleasas de restricción conocidas y, además, representan la posición de cada uno de los fragmentos en un gel de agarosa. Un ejemplo de este tipo de programas es Webcutter. Para estar seguros de que el amplicón obtenido es correcto lo mejor es secuenciarlo. Las distintas metodologías que permiten secuenciar una molécula de ADN se tratarán en un capítulo aparte. Una vez secuenciada la molécula, el polímero lineal de nucleótidos se convierte en una serie de caracteres (A, C, G y T) con la que se pueden llevar a cabo todo tipo de análisis bioinformáticos. Una vez secuenciada la molécula de ADN se puede enviar a una base de datos (BD). Normalmente la BD será GenBank, pero antes de hacerlo es importante corregir los posibles errores que contenga la secuencia. Si una secuencia errónea llega a la BD es muy probable que se propague a otras BD sin que nadie lo controle y contamine cualquier análisis posterior.

El error más frecuente consiste en que la secuencia de ADN contenga fragmentos de la secuencia del vector utilizado para clonar la molécula. Afortunadamente, es muy sencillo corregir este tipo de errores utilizando la BD VecScreen. Esta BD contiene las secuencias de todos los vectores que se pueden utilizar para clonar moléculas de ADN y detecta rápidamente posibles contaminaciones. Secuencias codificantes Algunas regiones del ADN contienen la información necesaria para la síntesis de moléculas de ARN (mediante el proceso de transcripción) o de proteínas (mediante los proceso de transcripción y traducción). Estas regiones se conocen como secuencias codificantes. Estas secuencias, junto con los elementos que regulan su expresión constituyen los genes. Los genes pueden codificar ARN o proteínas y en una molécula de ADN los genes pueden encontrarse en cualquiera de las hebras.

Cuando un gen se expresa, una de las hebras sirve de molde para la síntesis de una molécula de ARN mensajero (ARNm) por parte de la ARN polimerasa. La secuencia del transcrito de ARN es idéntica a la secuencia de la hebra complementaria del ADN, salvo por la presencia de U en lugar de T (figura inferior).

En este contexto, la hebra del ADN que sirve de molde para la transcripción se llama hebra sin sentido (antisense), hebra no codificante (noncoding), hebra (-) o hebra minus y su secuencia es complementaria a la del transcrito de ARN. Por otro lado, la hebra de ADN complementaria a la que sirve de molde se llama hebra con sentido (sense), hebra codificante (coding), hebra (+) o hebra plus. Como los genes están repartidos entre las dos hebras del ADN, cualquiera de las dos hebras puede servir de molde para la ARN polimerasa y la hebra codificante de un gen podrá ser la hebra no codificante de otro. Cuando se va a depositar la secuencia de un gen en una base de datos (BD) se envía siempre la secuencia de la hebra codificante. Los programas que permiten buscar secuencias en las BD (como, por ejemplo, NCBI-BLAST) la denominan hebra plus. En

los resultados de una búsqueda, la secuencia problema (query) puede alinearse con la hebra plus (caso a de la figura inferior) o con la hebra minus (caso b de la figura inferior).

Marcos abiertos de lectura (ORF) Cualquier región del ADN (o ARN) comprendida entre un codón de inicio de la traducción (que normalmente es AUG) y un codón de parada (TAA, TAG o TGA) se denomina marco abierto de lectura (ORF, open reading frame) (figura inferior).

Un ORF puede codificar una proteína o no. Cuanto más largo sea, mayor será la probabilidad de que codifique una proteína. Cuando un ORF codifica una proteína se trata de una secuencia codificante (CDS, coding sequence). En organismos procariotas, las CDS son siempre ORF, ya que los ORF carecen de intrones (figura inferior). Sin embargo, los ORF no siempre son CDS.

La mayoría de los programas bioinformáticos que se utilizan para detectar genes en procariotas se limitan a identificar los ORF que superen una longitud determinada. Esta

sencilla estrategia es sorprendentemente precisa. Podemos citar como ejemplo las herramientas ORF Finder (NCBI) y ORF Finder (SMS). Cuando se analiza una secuencia de ADN en busca de secuencias codificantes se desconoce cuál es la pauta de lectura (reading frame) correcta. Por eso, los programas contemplan las seis pautas de lectura posibles: 3 pautas de lectura en la hebra directa (5'→3') y 3 pautas de lectura en la hebra complementaria inversa (también escrita en sentido 5'→3') (figura inferior).

6 posibles pautas de lectura Cada pauta se traduce de forma distinta

En organismos eucariotas, los ORF pueden incluir intrones. Cuando se eliminan los intrones y el ARNm queda listo para ser traducido a proteína, la secuencia comprendida el codón de inicio de la traducción y el codón de parada corresponde a la secuencia codificante (CDS, coding sequence). Por tanto, en eucariotas ORF y CDS no son lo mismo, salvo en los casos poco frecuentes de que el gen carezca de intrones (figura inferior).

La detección de genes en eucariotas es mucho más compleja porque hay que tener en cuenta la presencia de intrones y exones, los lugares de corte y empalme (splicing) y el procesamiento alternativo (alternative splicing). Los ORF se pueden encontrar tanto en la hebra directa (escrita en sentido 5'→3') como en la hebra complementaria (escrita en sentido 3'→5'), tal y como se aprecia en la figura inferior. En algunos casos, se pueden encontrar regiones del ADN en las que las dos hebras contienen secuencias codificantes pertenecientes a genes distintos y que se

encuentran solapadas. Estos genes solapados se denominan genes fantasma (shadow genes) y dan bastantes problemas a la hora de predecir la presencia de genes en una secuencia, ya que suelen confundir a los programas bioinformáticos de predicción.

El ADN en las bases de datos Una vez depositada en una BD, la molécula de ADN pasa del mundo real al mundo virtual. Lo que en la vida real era una serie de nucleótidos unidos entre sí mediante enlaces fosfodiéster se convierte en una serie caracteres más o menos larga formada únicamente por las letras A, C, G y T. Normalmente, las secuencias ocupan varias líneas de texto y cada línea contiene 60 caracteres. Cuando utilicemos el ordenador para ver las secuencias o cuando se vayan a imprimir en papel es una buena idea utilizar siempre la fuente Courier, ya que todos los caracteres tienen la misma anchura. Al principio, cada BD utilizaba su propio formato para escribir las secuencias y, en algunos casos, las herramientas bioinformáticas no las reconocían. Afortunadamente, hoy en día la situación ha cambiado y hay dos formatos que son reconocidos por cualquier programa bioinformático. Se trata de los formatos raw y FASTA. El formato raw (crudo) utiliza únicamente los caracteres A, C, G y T (o U) para describir una secuencia de nucleótidos. Cuando se trata de una secuencia de aminoácidos utiliza únicamente los 20 símbolos correspondientes. El formato FASTA consta de dos partes:

• La primera línea: comienza siempre por el símbolo > (mayor que) y después contiene una escueta definición de la secuencia. Esta línea es ignorada por los programas y herramientas bioinformáticas, pero es muy útil para los humanos que trabajan con múltiples secuencias a la vez y gracias a esta línea saben a qué corresponde cada una.

• El resto: A continuación se escribe la secuencia ininterrumpida de nucleótidos o

aminoácidos. Las secuencias de ADN almacenadas en las BD pueden ser de varios tipos:

• ADN genómico: es el que se extrae directamente del genoma y contiene los genes en su estado natural, es decir, que además de la secuencia que codifica una proteína también contiene intrones, elementos reguladores y grandes porciones de ADN intergénico. Estas secuencias se almacenan en GenBank. También existen BD especializadas que almacenan genomas completos como, por ejemplo, GOLD (Genomes Online Database), ENSEMBL y Genome.

• ADN sintético: son secuencias de los vectores (plásmidos, virus modificados u otros elementos genéticos) que se utilizan en el laboratorio para generar moléculas de ADN recombinante. Se almacenan en la división SYN del GenBank.

• ADN complementario (ADNc): es el que se obtiene a partir de un ARN mediante la transcriptasa inversa. Tiene la ventaja de que siempre corresponde a secuencias codificantes (de ARN o de proteínas). Cuando el ADNc se obtiene a partir de un ARNm, la secuencia resultante se denomina fragmento de secuencia expresada o, simplemente, EST (expressed sequence tags). Suelen ser secuencias incompletas, con una longitud de entre 400 y 600 nucleótidos (el máximo que permiten los métodos de secuenciación actuales) y pueden presentar hasta un 2% de errores, pero son tremendamente útiles a la hora de localizar los genes que codifican proteínas en el ADN genómico. En el NCBI hay una BD especializada que almacena este tipo de secuencias: EST).

La hebra de Watson y hebra de Crick En algunas publicaciones científicas hay quien distingue las dos hebras del ADN denominando a una hebra de Watson (Watson strand) y a la otra hebra de Crick (Crick strand). La hebra de Watson sería la hebra codificante (hebra con sentido o hebra plus) y la hebra de Crick sería la hebra no codificante (hebra sin sentido o hebra minus). Curiosamente, estos términos se han utilizan de forma contradictoria y no siempre queda claro cuál es cuál En 2011 se publicó un artículo (PMID 21303550) que sugiere utilizar esta terminología únicamente en un contexto genómico, en el que cada molécula de ADN es un cromosoma completo. En estas condiciones, la hebra de Watson sería aquélla que presenta su extremo 5’ en el telómero del brazo corto y, lógicamente, la hebra de Crick sería la complementaria, es decir, la que presenta su extremo 5’ en el telómero del brazo largo (figura inferior).

Caja de herramientas Random Sequence Generator: http://www.molbiotools.com/randomsequencegenerator.html Random DNA sequence: http://www.bioinformatics.org/sms2/random_dna.html Random Sequence Generator: http://www.faculty.ucr.edu/~mmaduro/random.htm Random Sequence Generator: http://users-birc.au.dk/biopv/php/fabox/random_sequence_generator.php Reverse Complement (SMS): http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_comp.html Reverse complement: http://arep.med.harvard.edu/labgc/adnan/projects/Utilities/revcomp.html Webcutter: http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/ Restriction Map: http://www.bioinformatics.org/sms2/rest_map.html NEBcloner: https://nebcloner.neb.com/#!/redigest Restriction Digest: http://www.bioinformatics.org/sms2/rest_digest.html NEBcutter: http://nc2.neb.com/NEBcutter2/ Primer3 (Simgene): http://simgene.com/Primer3 Primer3: http://bioinfo.ut.ee/primer3/ REBsites: http://tools.neb.com/REBsites/index.php Translate (ExPASy): https://web.expasy.org/translate/ ORFfinder (NCBI): https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/ ORFfinder (SMS): http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html BLAST (NCBI): https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Software gratuito pDRAW32: http://www.acaclone.com/ Serial Cloner: http://serialbasics.free.fr/Serial_Cloner.html Bases de datos GenBank )(NCBI): https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore EST (NCBI): https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/ VecScreen (NCBI): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html GOLD: https://gold.jgi.doe.gov/ Genome (NCBI): https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ Ensembl: http://www.ensembl.org/index.html