Técnica de Extracción de Adn Por Salting

Laboratorio de Biología Molecular UNIVERSIDAD DEL ATLÁNTICO

04/06/2015

TÉCNICA DE EXTRACCIÓN DE ADN SALTING-OUT EN CELULAS NUCLEADAS Y ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA

Martínez villa Katleen1.1. Estudiante del programa de Biología, Facultad de Ciencias Básicas,

Universidad Del Atlántico, Barranquilla, Colombia._______________________________________________________________

RESUMEN

En la experiencia, se utilizó una muestra de sangre de 10 ml, la cual fue depositada en 10 tubos eppendorf con el fin de realizar la respectiva extracción de ADN, con lo cual se utilizaron diferentes reactivos para lograr la lisis celular, separación precipitación del ADN. Posterior a esto se llevó a cabo la confirmación de la muestra de ADN mediante la técnica de electroforesis en gel de agarosa cuyos resultados no fueron los esperados, debido a que no hubo un corrimiento adecuado a través del gel y por lo tanto no se pudo cuantificar la muestra, se concluyó que dicho resultado fue producto posiblemente de errores metodológicos que pueden involucrar la concentración del gel, el número de voltios, la preparación del tampón, etc.

Palabras clave: Extracción de ADN, electroforesis, ácidos nucleicos.

INTRODUCCION

En la mayoría de células eucariotas, los ácidos nucléicos se encuentran presentes en el nucleo celular, por ello para comparar patrones de bandas provenientes de diferentes muestras biológicas por ejemplo, es necesario extraer este ADN del núcleo en el que se encuentra y posteriormente visusalizarlo. Para esta extracción se han implementado diversas técnicas, donde la mayoría de ellas presentan etapas fundamentales como la lisis celular, precipitación de proteínas y otras sustancias no deseadas, precipitación del ADN e hidratación del mismo, utilizando diversas sustancias que permiten la purificación de la muestra de manera efectiva. Sin embargo, las técnicas para la extracción de ADN pueden variar de acuerdo a la especificidad y complejidad de la muestra y a la eficiencia que requiera el investigador.


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En la extracción de ácidos nucleicos se empieza por lisar la célula mediante el uso de una solución de lisis, en este, sustancias como detergentes y la enzima proteinasa K, actúan disolviendo las membranas y desestabilizando componentes proteicos, donde el detergente se encarga de dispersar las lipoproteínas de las membranas y desnaturalizar complejos proteínicos. Por su parte la proteinasa k interactúa con las proteínas histonas del ADN desestabilizando la estructura del mismo. Sin embargo parar asegurarse de proteger los ácidos nucleicos de la acción de enzimas, se utiliza una sustancia inhibidora de DNAsas conocida como EDTA en la solución de lisis, además de un buffer para mantener estable el pH de la solución. Luego por centrifugación se separa la muestra en fases para desechar aquellas sustancias no deseables, luego se precipita el ADN mediante la adición de una sal y alcohol frio, finalizando con la hidratación del mismo.

En la presente practica la técnica usada en extracción de ácidos nucleicos fue salting-out, el cual utiliza un buffer que contiene (Tris-HCl, pH 8.3, Proteinasa K), con lo que es posible destruir las membranas nucleares, liberando a la solución los ácidos nucleicos. Quienes luego son precipitados mediante altas concentraciones de sales como acetato de sodio (AcONa) y con la adición de un alcohol. Por lo tanto utiliza el aumento de la fuerza iónica del medio respecto de soluciones acuosas.

Por último, el ADN debe ser observado con el fin de comparar patrones, verificar la calidad del mismo, etc, según el objetivo del investigador, para ello se utiliza la técnica conocida como electroforesis en gel de agarosa, fundamentada en la migración de ácidos nucléicos a través de un campo eléctrico en función de su tamaño y carga elélctrica, utilizando una matriz gelatinosa como sustrato, donde la detección del ADN se hace posible mediante el uso de una sustancia sensible a la luz ultravioleta, el bromuro de etidio (Sambrook et al. 2002), dicha sustancia se intercala entre la molécula.

OBJETIVOS

Identificar las diferentes fases en la purificación de ácidos nucléicos.

Comprender y relacionar el uso de los diferentes reactivos en el proceso de extracción y purificación con lo aprendido en torno a las propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucleicos y proteínas

Comprender la aplicación de la técnica de electroforesis en el proceso de separación de ácidos nucleicos.


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MATERIALES Y METODOLOGIA

Materiales y reactivos:

Los materiales mencionados a continuación serán utilizados tanto para la extracción de ADN comprendiendo la solución de lisis de glóbulos rojos y glóbulos blancos, como para la electroforesis en gel de agarosa.

Materiales: Micropipetas de volúmenes variables. Tubos Eppendorf. Centrifuga. Incubadora. Cámara electroforética. Beaker. Pipeta.

Reactivos: Acetato de amonio 7.5 M. SDS al 10%. Solución Proteinasa K (20mg/ml) Tris HCL 1M. MgCl2 1M. Na2 Cl 5M. EDTA 0.5M. TE 100 X(Tris-EDTA). Etanol Absoluto. Isopropanol. Agarosa 0.7 %. TBE 0.5 X. Bromuro de etidio. Buffer de Carga. Tris-base. Ácido acético glacial. EDTA PH 8,0.


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Agua. Marcador de peso molecular.

Metodología:

Parte 1: Extracción de ADN:

a. Preparación de células a partir de sangre periférica: 7 ml de una muestra sanguínea fueron llevados a un tubo vacutainer con EDTA, la que posteriormente se repartió en 9 tubos eppendorff conteniendo cada un 5 ml de sangre por tubo. A cada tubo se le adiciono solución de lisis de glóbulos rojos (LGR) hasta completar 15 ml, mezclando la solución por suave inversión. Dicha solución se llevó a refrigeración por 10 minutos a 4°C. a continuación la mezcla se llevó a centrifugación (3000 rpm por 15 minutos). Una vez la centrifugación culmino, la separación de fases fue evidente, permitiendo descartar el sobrenadante (eritrocitos lisados). Luego se repitió el procedimiento anterior agregando nuevamente solución de lisis de glóbulos rojos, esta vez 1.0 ml, golpeando el tubo con el fin de desprender el pellet. Se llevó la mezcla a centrifugación a 2000 rpm por 15 minutos. (Este último paso se realiza las veces necesarias hasta que el pellet sea de color blanco).

b. Lisis de glóbulos blancos y digestión proteica: el botón celular proveniente del paso a, fue resuspendido en 0.3 ml de lisis de glóbulos blancos, adicionando a la mezcla 5 microlitros de SDS al 10%, 2.5 microlitros de solución de proteinasa K (20mg/ml) e incubado toda la noche a 37°C.

c. Precipitación con isopropanol: luego de que fue completada la digestión de glóbulos blancos, se obtuvo una solución gomosa, la cual contiene el ADN. A esta le fue agregada 80 microlitros de acetato de amonio (7.5 M) por tubo eppendorf, los cuales fueron agitados, esta vez vigorosamente por 15 segundos y luego llevados a la centrifuga por 25 minutos a 300 rpm. El sobrenadante que se observa en los 10 tubos eppendorf contiene el ADN, por lo que se transfirió a un tubo falcon de polipropileno de 15 ml, descartando el botón proteico que constituye el precipitado. Posteriormente se adiciono un volumen igual al contenido en el tubo falcon de isopropanol frio y se mezcló por suave inversión hasta observar el precipitado de ADN. El isopropanol fue


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descartado y el precipitado transferido a un tubo eppendorf. El ADN precipitado se lavó con etanol al 70% y se llevó a centrifugación a 13000 rpm por un minuto con el fin de eliminar el isopropanol. Como tanto el isopropanol y el etanol son volátiles se dejó secar el ADN al aire. El ADN fue resuspendido en 100 microlitros de buffer TE 1X y se incubo a 65°C por una hora. El ADN fue almacenado a 4°C para la posterior electroforesis.

Parte 2: electroforesis en gel de agarosa:

Inicialmente la base de corrida fue nivelada con cinta de enmascarar. Luego se preparó el gel de agarosa y se vertió en caliente en la base de corrida. Luego se introdujo el peine en la ranura correspondiente a la cámara del gel, este último se dejó enfriar por 30 minutos. Se retiró posteriormente el peine del gel solidificado al igual que la cinta de enmascarar, sumergiendo la base de corrida con el gel en 240 ml de buffer TAE 1X. La muestra se cargó en los posillos del gel y se tapó la cámara verificando que los polos correspondieran a negativo y positivo respectivamente, encendiendo a continuación la fuente de poder. En este punto se programó el tiempo de corrida y el voltaje que en este caso fue de 60 V por 90 minutos poniendo a correr la electroforesis. Una vez transcurrió el tiempo de corrida se verifico que el ADN haya corrido lo suficiente, retirando entonces el gel de la cámara y trasladándolo al transiluminador UV para observar así la corrida y por ende las condiciones del ADN.

RESULTADOS, CONCLUSIÓN Y DISCUSIÓN.

La metodología descrita en la práctica se siguió casi correctamente, teniendo en cuenta los volúmenes, concentraciones, intervalos de tiempo etc., señalados en la guía de laboratorio, a continuación se describirán los resultados del proceso seguido además de los posibles errores obtenidos.

La lisis celular fue exitosa, en este procedimiento, la lisis de glóbulos rojos arrojó como resultado el precipitado de un botón de color blanco en el fondo del tubo eppendorf, la adición de la solución de lisis y la centrifugación solo se realizó dos veces debido a que la decoloración de la muestra se produjo en la segunda centrifugación (fig. 1), lo que en ocasiones resulta en la repetición del procedimiento ya que la coloración del botón sigue siendo oscura y no se tiene certeza de la


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completa lisis de glóbulos rojos. Luego el procedimiento para glóbulos blancos solo se realiza una vez.

Figura 1. Primer precipitado en lisis celular y centrifugación (Izq.). Segundo precipitado en lisis celular y centifugación, se observa botón blanco precipitado

(Der.).

La lisis celular es un proceso de vital importancia en la extraccion de ácidos nucléicos, ésta permite romper las membranas plasmática y nuclear. En otros casos, se tienen tejidos que deben separarse de modo que se tengan células diferenciadas. Sin embargo en este caso la muestra fue de tipo sanguínea, por lo tanto no fue necesaria una separación celular debido a que las células se encuentran libres en el torrente. Los glóbulos rojos primero deben lisarse, éstos no contienen núcleo ú organelos, por lo que sólo es necesario romper la membrana plasmática, por su parte los glóbulos blancos si tienen núcleo, sitio donde aguarda el material genético.

Para esta practica se utilizaron 5 microlitros de SDS al 10%, el SDS o duodecil sulfato de sodio, éste es un detergente cuya función es disolver los componentes lipídicos en las membranas, además de descontaminar la muestra. Al disolver las membranas, el ADN está libre en la solución extraído de los núcleos de los glóbulos blancos, sin embargo se encuentra aún empaquetado por lo que necesita ser expuesto a la acción de la enzima proteinasa K, éstas degradan las histonas, responsables del empaquetamiento del ADN, además de romper los enlaces peptídicos de otros componentes protéicos, actúan también en la inhibición de las DNAsas, quienes pueden actuar degradando el ADN. Para la digestión de estas proteínas, se dejó la solución en incubación a 37°C toda la noche.


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Los componentes protéicos y demás sustancias descartables en el procedimiento fueron aisladas del ADN por separación de fases, mediante centrifugación y el uso de isopropanol, quién además contribuye fuertemente en la precipitación. Una vez se logró la precipitación y el ADN se encontró aislado y purificado, se llevó a cabo su observación y confirmación mediente electroforesis en gel de agarosa.

En la electroforesis es ultilizado un gel, en este caso agarosa, con el fin de reducir el movimiento de las moléculas, debido a que este es poroso, de modo que actúa como un tamiz en el que las moléculas son separadas. Con esto, aquellas moléculas de menor tamaño se mueven mas rápidamente a través del gel que aquellas de mayor tamaño. Ahora, el movimiento de las moléculas ocurre debido a que estas tienen una polaridad, por esto, estas moléculas colocadas en un campo eléctrico experimentan una fuerza de atracción hacía el polo que posea la carga opuesta. Así, el conjunto de factores como el voltaje, concentración del gel entre otras, permitieronn el despazamiento del ADN, dando como resultado la presencia de bandas corridas a través del gel (fig. 2).

Figura 2. Resultados electroforesis. De izquierda a derecha: M (marcador de peso molecular), A, B, C, D, E, F, G.


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Se observa que no se obtuvo un tamaño definido de las bandas, quienes se presentan de manera curvada y no demanera definida como normalmente aparecen en este tipo de pruebas (fig. 3). Esto puede deberse a alguna falencia en el procediminto seguido, ya sea el número de voltios que según la guía de laboratorio debió ser de 70 V y se utilizaron 60 V, la concentración del gel, el tiempo de corrida o la concentración del buffer, el cual pudo haber sido distinto en el gel y en el tampón de electroforesis, también puede deberse a que la temperatura es desigual a lo largo del gel. Además de esto se observa la formación de pozos, debido a que el ADN se encontraba fuertemente impregnado en el gel al momento de depositar el ADN en este.

Además de esto, no se observa migración de las bandas hacia el polo positivo como se debia esperar, migrando unicamente el marcador molecular. Adicional a las falencias mencionadas anteriormente, también puede que la muestra de ADN se encontrara contaminada con proteínas.

Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa utilizando ADN molde. Imagen tomada de un artículo de investigacíon: identificación y tipificación de leishmania. Instituto

de Medicina Tropical, Amberes, Bélgica.


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En contraste a la figura 2, en la figura 3 se observan bandas definidas al igual que las pertenecientes al marcador molecular, donde el tamaño de las bases es apreciable. Ocurió una correcta migración de la molécula cargada positivamente hacia el polo negativo en un pH estable.

Como conclusión, podemos señalar que una electroforesis exitosa depende en gran medida tanto del protocolo usado en la extracción, como de aquel usado en el momtaje de la electroforesis. Así, es necesario respetar los intérvalos de tiempo, concetraciones adecuadas, además del delicado cuidado del manejo manual de las muestras quienes pueden proporcionar contaminación por error. Esto con el fin de obtener una cantidad y calidad de ADN apreciable ademas de puro. Por lo tanto es necesario manterner la integridad del ADN al realizar un método de extracción. Con todo lo anterior, los objetivos propuestos fueron cumplidos en gran medida, debido a la capacidad de comprender las reacciones llevadas a cabo en loas diversas técnicas de extracción , ya que estos cuentan con similitudes, además de esto relacionar la interacción de los compuestos utilizados con lo aprendido anteriormente en cuanto a las propiedades fisicoquímicas de los ácidos nucléicos y proteínas y por último el entndimiento de la cuantificación y observación del ADN y su uiltidad en el campo de la ciencia.

BIBLIOGRAFIA

Cariaga Martínez A. E., Zapata P. D. El laboratorio de Biología Molecular. Una guía práctica. Colección: cuadernos de Cátedra. Editorial Universitaria de Misiones. Año 2005

Electroforesis de ácidos nucleicos en geles de agarosa. Aislamiento y caracterización electroforética de DNA plasmídico. Carmen Alicia Padilla Peña, Jesús Diez Dapena, Emilia Martínez Galisteo, José Antonio Bárcena Ruiz, Concepción García Alfonso. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales-Córdoba.

Protocolo para la extracción de ADN de plantago major dirigida a la tipificación molecular. Julio cesar Gómez gonzalez.2005.


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Sambrook J, Russell DW, 2002, ‘Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

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