La replicazione del DNA in vivo

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INTERVENGONO PER LA FORMAZIONE DELLA FORCELLA = DENATURAZIONE

SINTETIZZA I PRIMER

La formazione del legame fosfo-di-estere

Affinchè il legame fosfodiestere possaessere formato dall’enzima DNApolimerasi , sono indispensabili un ossidrile(-OH) libero in posizione 3’ e un nucleotidetrifosfato (cioè in forma energizzata).

La polimerizzazione del DNA (cioè laformazione di un filamento di DNA)avviene perciò in direzione 5’ → 3’

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- Riproduce in vitro la reazione di replicazione del DNA(per chi non si ricordasse come avviene la replicazione del DNA in una cellula, si consiglia di ripassare l’argomento. C’è del materiale sul tema in una precedente lezione).

- Permette di replicare (riprodurre) indefinitamente una specificaregione di DNA

LA REAZIONE A CATENADELLA POLIMERASI

- Kary Mullis ideò e mise a punto la PCR (Polymerase Chain Reaction) tra il 1983 ed il 1985

- Affinché la PCR avvenga sono necessari:

Ve ne sono di diversi tipi (x es. Taq polimerasi)

▪ gli oligonucleotidi iniziatori (primer);

▪ desossinucleotidi trifosfato (dNTP);

▪ la DNA polimerasi

▪ il DNA templato (stampo);

3▪ un ciclizzatore termico (PCR termocycler)

Taq polimerasiÈ l’enzima DNA-polimerasi utilizzato per le reazioni di PCR

Si chiama in questo modo perché è stato originariamente isolato dal batterio termofilo Thermus aquaticus

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IL TERMOCICLATORE (detto anche ciclatore termico) per PCR

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LE TRE FASI DELLA PCR

1. DENATURAZIONE (94 – 96 °C per 30 s / 1 min)

A

B

2. APPAIAMENTO (tra 45 e 65 °C circa per 30 s / 1 min)(annealing)

A

B

DNA (cromosomale, plasmidico, etc…)

AB

B’

A’

3. ESTENSIONE (72 °C per 10 s / 10 min o più)(extension)

A

B 6

La costruzione dei primers5’ -3’ -

- 5’- 3’

Primer FORWARD: 5’- AAGATCTTCTTACTCAGT - 3’

Primer REVERSE: 5’- CATGGACCGGTACAGTAGGT- 3’

Primer per amplificazione specifica (solitamente di lunghezza da 18 a 22 mer)

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I CICLI DELLA PCR

- Da una singola molecola di templato, sono prodotti circa 1 miliardo di frammenti copia di DNA in 30 cicli:

N.B.: con la comune Taq polimerasi si riescono ad amplificare fino a circa 3000 – 3500 bp; con Ext-Taq fino anche a 40000 bp!

(Animazione: http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/pcr.html)

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LE APPLICAZIONI DELLA PCR

- Permette di raccogliere informazioni da campioni biologici contenenti anche scarsissime tracce di DNA � importanti applicazioni in campo giuridico o in archeologia, paleontologia e antropologia (x es. per lo studio delle migrazioni umane)

- Nelle biotecnologie: semplificazione del processo di clonaggio di geni singoli per le più dettagliate analisi biochimiche

- In microbiologia: di fondamentale importanza per la tassonomia e la tipizzazione molecolare di isolati microbici

- In medicina: per una rapida diagnosi di infezioni virali o per la diagnosi prenatale di malattie congenite

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RICAPITOLANDO:

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Verifica dell’avvenuta amplificazione:

• gel elettroforesi

• controllo negativo

MARKER di frammenti di DNA lineare a peso molecolare noto

C.N.

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La tassonomia e l’identificazione battericaLa tassonomia si occupa della classificazione, cioè dellaIDENTIFICAZIONE e della NOMENCLATURA degli organismi viventi.

L’unità tassonomica di base è la SPECIE, che è definibile nell’ambito dellebatteriologia come una collezione di ceppi simili che differiscono sufficiente menteda altri gruppi di ceppi da giustificare il riconoscimento c ome unità tassonomicaa se stante (si veda in seguito una definizione ‘’più concreta’’ di specie batterica).

Ogni specie batterica possiede un CEPPO TYPE, cioè un ceppo di riferimento cheriassume in se tutte le caratteristiche fenotipiche e genotipiche dei ceppi della specieche rappresenta. Dove posso trovare il ceppo type di ogni specie? I ceppi type sitrovano nelle «ceppoteche», cioè nelle collezioni di colture cellulari. Le collezioni di

colture di riferimento, in Europa e negli Stati Uniti, sono le seguenti:

(per es.: Bifidobacterium bifidum ATCC 11863T)

American Type Culture Collection (ATCC), centro di ricerca privato no-profit

Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures), organizzazione no-profit

(per es.: Bifidobacterium bifidum DSM 20456T) N.B.: SONO LO

STESSO CEPPO!

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Come si identifica un batterioL’identificazione tassonomica di un ceppo batterico si basa sullavalutazione di CARATTERISTICHE FENOTIPICHE e GENOTIPICHE esul confronto di queste caratteristiche con quelle dei ceppi type.

CARATTERISTICHE

FENOTIPICHE GENOTIPICHE1. Morfologiche2. Fisiologiche3. Colturali4. Nutritive5. Biochimiche6. Bio-strutturali

Analisi degli acidi nucleici(in particolare della loro sequenza nucleotidica)

Lo studio delle caratteristiche fenotipiche per l’identificazione di un batterio è la viatradizionale seguita da decenni da quella che è definita MICROBIOLOGIA CLASSICA.

Ad essa si è ora aggiunta (e in molti casi sostituita) la microbiologia basata sulletecniche di BIOLOGIA MOLECOLARE, che prevede lo studio di DNA e RNA.

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La caratterizzazione fenotipicaLe prime caratteristiche da considerare sono le più generali, al fine di ridurre subito il numero delle possibilità tra cui ricercare…

A. CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE1. micromorfologia: forma, dimensione, disposizione delle cellule (catenelli,

aggregati), presenza di endospore;2. macromorfologia: aspetto della colonia;3. reazione di Gram4. mobilità

B. METABOLISMO ENERGETICOOpera respirazione aerobia, oppure fermentazione; è anaerobio facoltativo…

C. CARATTERISTICHE COLTURALI E NUTRITIVEPrimariamente, viene considerata la TIPOLOGIA DI FONTE DI CARBONIO: organicao inorganica? Quali molecole possono essere usate? È importante ottenere un profilodi utilizzazione del carbonio. A tal fine, si prepara un TERRENO COLTURALE DIBASE, cioè un terreno in cui è stata completamente tolta la fonte dell’elemento inesame (in questo caso il carbonio). Trasferisco questo terreno di coltura in alcuneprovette e in ciascuna aggiungo una fonte di carbonio diversa (per esempio glucosio,ribosio, mannosio, etc…). Quindi inoculo ogni provetta con lo stesso numero di celluledel ceppo in esame e metto ad incubare. Se il batterio cresce significa che ha saputousare quella specifica fonte di carbonio.

N.B.: se, ad esempio, sto studiando un batterio lattico, posso valutare la capacità diutilizzare la fonte di carbonio da parte del ceppo in esame aggiungendo al terreno dicoltura un indicatore di pH. Se il ceppo utilizza la fonte di carbonio produce acido equindi il colore dell’indicatore di pH cambia.

N.B.: esistono in commercio kit per poter testare rapidamente numerose fonti dicarbonio in contemporanea, come ad esempio il sistema di gallerie API (AnalyticalProfile Index). Nello specifico, le gallerie API consistono in una serie di microtubicontenenti substrati disidratati x evidenziare attività enzimatiche o fermentazioni dizuccheri; i microtubi vengono inoculati con una sospensione batterica chericostituisce i substrati. Le reazioni prodotte durante il periodo di incubazione sitraducono in reazioni colorate immediate o rilevati dall’aggiunta di reattivi.

http://aulavirtual.usal.es/aulavirtual/demos/microbiologia/unidades/LabV/API/api.html

Controllo negativo Ribosio

= il batterio non utilizza il substrato

= il batterio è in grado di utilizzare il substrato

Esempio di uso del kit API 50 CHL

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C. CARATTERISTICHE COLTURALI E NUTRITIVEOltre alla tipologia di fonte di carbonio possono essere studiate: la fonte di azoto, ifattori di crescita (vitamine), i parametri ambientali (pH, temperatura).

D. CARATTERISTICHE FISIOLOGICHE E BIOCHIMICETipicamente, si studia il pattern enzimatico; per es.:1. catalasi;2. amilasi;3. proteasi;4. lipasi;5. ureasi.

E. CARATTERISTICHE CHIMICO-STRUTTURALITipicamente, si studiano:1. la composizione chimica della parete cellulare;2. gli acidi grassi nella membrana cellulare

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Identificazione preliminare di un ceppo batterico attraverso colorazione di Gram e morfologia cellulare

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Esempio di identificazione preliminare di bastoncini Gram positivi

Resistenza alla perdita di colore con acidi dopo colorazione

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C. CARATTERISTICHE COLTURALI E NUTRITIVEOltre alla tipologia di fonte di carbonio possono essere studiate: la fonte di azoto, ifattori di crescita (vitamine), i parametri ambientali (pH, temperatura).

D. CARATTERISTICHE FISIOLOGICHE E BIOCHIMICETipicamente, si studia il pattern enzimatico; per es.:1. catalasi;2. amilasi;3. proteasi;4. lipasi;5. Ureasi.

E. CARATTERISTICHE CHIMICO-STRUTTURALITipicamente, si studiano:1. la composizione chimica della parete cellulare;2. gli acidi grassi nella membrana cellulare

A questo punto si avrebbero già molte informazioni per determinare laspecie del ceppo batterico allo studio; spesso, però, non si riesce aottenere un risultato definitivo (non si riesce ad avere la certezza); sipassa allora allo studio del GENOTIPO � lo studio del genotipo è l’unicoche mi può dare la certezza in merito all’identificazione tassonomica dispecie di un ceppo batterico.

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“MANUALE DI BERGEY”: è il punto diriferimento per la tassonomia deiprocarioti

Contiene la lista completa delle specieprocariotiche e la loro classificazione enomenclatura

Bergey's manual of systematic bacteriology

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Nei batteri la SPECIE è definita come un insieme di ceppi isolatiin habitat diversi ed in tempi diversi che posseggono (questesono REGOLE PRATICHE!):

• una elevata similarità fenotipica, con almeno una proprietàdistintiva nei confronti delle altre specie

• una elevata omologia genetica (riassociazione molecolareDNA/DNA >70%)

• una elevata omologia filogenetica (omologia di sequenza delgene codificante per il 16S rRNA maggiore del 98%)

- Negli organismi superiori le SPECIE sono definite come gruppi di individui in gradodi accoppiarsi in natura o potenzialmente in grado di farlo (ovvero interfecondi, cioèindividui che si possono accoppiare e dare origine a prole fertile), e che sono bendistinti dagli altri gruppi per quanto concerne l’attività riproduttiva � NONAPPLICABILE AI BATTERI

Il concetto di specie batterica

DA RICORDARE!

La caratterizzazione genotipica

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La riassociazione molecolare DNA/DNA (detta anche omologia DNA/DNA oibridazione DNA/DNA) è una prova di laboratorio che prevede i seguenti passaggi:1. Isolamento del DNA totale del ceppo batterico allo studio;2. Isolamento del DNA totale estratto da un ceppo di riferimento (solitamente il

ceppo type di una specie);3. Rottura meccanica dei due DNA4. Miscela dei due DNA5. Denaturazione termica del campione con misura della densità ottica (a 260 nm)6. Lento raffreddamento del campione con misura della densità ottica (in questa fase

avvien l’ibridazione, cioè il DNA dei due campioni si riassociano fra di loro)

OD260

nm

h

% riassociazione

OD iniz.

OD Tr=0.

RISCALDAMENTO RAFFREDDAMENTO

curva di ipercromicità

La percentuale di omologia si stabilisce analizzando la curva di riassociazione (detta di ibridazione) che avviene durante il raffreddamento, fase in cui i DNA dei due ceppi riassociano fra di loro. Tale curva varia varia a seconda di quanto le sequenze di DNA sono simili tra loro

Al fine di identificare un ceppo batterico a livello di specie si utilizzano geni conservati(cioè presenti in tutti) dei procarioti che possono essere usati come orologi molecolariin grado di esprimere la filogenesi dei batteri, il più noto di questi geni è il:

gene codificanti per la subunità ribosomale 16S (16S rRNA)

I geni 16S, 23S e 5S rRNA codificano per le subunità di RNA costituenti i ribosomibatterici; l’operone ribosomale è posseduto da tutti gli organismi viventi:

16S 23S 5S(~1,5 kb) (tRNA)

regione spaziatrice intergenica (Internally Transcribed Spacer)

5’ - - 3’

Esso è un gene appartenente all’operone ribosomale batterico

Il gene che codifica per il 16s rRNA è una regione ALTAMENTE CONSERVATA trale differenti specie di procarioti (cioè subisce mutazioni di sequenza molto lentamentenel corso dell’evoluzione, poiché è di importanza primaria per la vita della cellula).È considerato un ottimale “MOLECULAR CLOCK”, un OROLOGIO MOLECOLARE,cioè è adatto per stabilire le distanze filogenetiche (evolutive) tra i diversi gruppitassonomici batterici.

Type Size Subunità più grande (rRNA) Subunità piccola (rRNA)

PROCARIOTA 70S 5S (120 nt), 23S (2906 nt) 16S (1542 nt)

EUCARIOTA 80S 5S (121 nt), 5.8S (156 nt), 28S (5070 nt) 18S (1869 nt)

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Il gene 16S rRNA nell’identificazione batterica

La determinazione della sequenza del gene 16S rRNA è diventata moltodiffusa in microbiologia come un’alternativa rapida ed accurata ai metodi diidentificazione batterica basati sul fenotipo

Oltre a regioni estremamente conservate, il gene 16S rRNA contiene regioniIPERVARIABILI che possono rappresentare delle sequenze diriconoscimento di tipo specie specifico, utili per l’identificazione dei batteri

L’analisi della sequenza del gene 16S rRNA, quindi, può fornireinformazioni per diversi livelli tassonomici, fino al livello di specie, epermette di tracciare relazioni filogenetiche tra i microrganismi

N.B.: diverse regioni del DNA possiedono una diversa predisposizione ad “accettare”le mutazioni… così, per avere un elevato potere discriminante, utile adistinguere tra due organismi strettamente correlati tra loro, sceglierò regioni apiù alta variabilità (meno conservate)

Sulla base delle sequenze note del gene 16S rRNA, sono stati disegnati deglioligonucleotidi definiti primer universali, che permettono di amplificare via PCRquesto gene virtualmente da tutti i batteri

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Il sequenziamento del gene 16SrDNA

Il sequenziamento viene generalmente condotto da tecnici specializzati e fornitosotto forma di cromatogramma. Una sequenza parziale delle prime 500 bp delgene, può essere sufficiente per determinare la specie di appartenenza del ceppoallo studio, tramite comparazione in banca dati con le sequenze note riportate(l’intero gene 16S rRNA è lungo circa 1500 bp). Però, talvolta, per unaidentificazione più sicura, è necessario sequenziare l’intero gene.

Ricordiamo che due ceppi appartenenti alla stessa specie devono possedere una% omologia 16S rDNA >97-98%

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Lo studio della filogenesi battericaConfrontando la sequenza del gene 16S rRNA dei diversi batteri è possibilequantificare la distanza filogenetica, cioè, determinare a che punto dell’evoluzione duespecie batteriche si sono differenziate

Algoritmi matematici allineano le sequenze dei geni 16S rRNA e ne determinano il grado di similarità, che viene espresso attraverso un DENDROGRAMMA DI SIMILARITÀ o ALBERO FILOGENETICO

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Albero filogenetico delle divisioni batteriche basato sull’analisi delle sequenze del 16S rRNA della maggior parte delle specie batteriche note

Batteri Enterici o Enterobatteri

Batteri Lattici e Batteri Sporigeni

BacillusClostridiumLactobacillus

StreptococcusLactococcusPediococcusLeuconostocOenococcus

EscherichiaSalmonellaShigellaYersiniaEnterobacter

Bifidobatteri

Firmicutes

Gram +

Gram -

Gram +

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I gruppi tassonomici

La tassonomia batterica è in continuo aggiornamento � per conoscere a lafilogenesi di un qualsiasi gruppo tassonomico e per ottenere informazioni sullatassonomia aggiornata e valida, si può fare riferimento alla National Center forBiotechnology Information (NCBI): http://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy

Vale per tutti gli organismi viventi, non solo per i batteri!

È sufficiente scrivere il nome di un qualsiasi gruppo tassonomico per conoscere lasua filogenesi aggiornata. Per esempio, se volessimo sapere di più della famigliaEnterobacteriaceae:

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Un altro interessante sito per ottenere informazioni su un qualsiasi gruppomicrobico è MicrobWiki: https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/MicrobeWiki

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FINE DEL CORSO

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