Labaratornaya Diagnostika Narushyeniy Gyemostaza. v.v. Dolgov

Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Российская медицинская академия последипломного образования

В.В. ДОЛГОВ, П.В. СВИРИН

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАНАРУШЕНИЙ ГЕМОСТАЗА

К А Ф Е Д Р А

КЛДМосква 2005

долговВладимир

ВладимировичЗаведующий

кафедройклинической

лабораторнойдиагностики

РМАПО,профессор.

доктормедицинских наук

УДК 616.151.5ББК 54.11

Д 64

ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКАНАРУШЕНИЙ ГЕМОСТАЗА

Д64 Долгов В.В., Свирин П.В. Лабораторная диагностика нару-шений гемостаза. - М.-Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2005. -227 с, 150 ил. ISBN 5-94789-114-Х

СВИРИНПавелВячеславовичВрач МосковскогогородскогогематологическогоцентраИзмайловскойдетскойклиническойбольницы,старший научныйсотрудникНИИ детскойгематологии

Книга подготовлена в качестве руководства по исследова-нию системы гемостаза в клинико-диагностических лаборатори-ях. Оценка состояния свертывающей системы крови - одна из са-мых сложных диагностических задач. В настоящем пособии этотвопрос рассматривается с различных точек зрения: общих биоло-гических закономерностей функционирования многокомпонентныхсистем организма, патофизиологических механизмов нарушенийпроцесса свертывания крови, строения и функции отдельных струк-тур и компонентов системы гемостаза, методологических подходов,приборного обеспечения, стандартизации, контроля качества идругих аспектов. Изложение материала сопровождается большимколичеством иллюстраций. Материал подобран на основе много-летнего опыта преподавания вопросов лабораторной диагности-ки нарушений гемостаза на кафедре клинической лабораторнойдиагностики Российской медицинской академии последипломно-го образования.

Книга предназначена для специалистов клинической лабо-раторной диагностики, врачей клинических отделений, заинтересо-ванных в лабораторной диагностике системы гемостаза, и студен-тов медицинских вузов.

Основным спонсором издания книги является компания «Эко-Мед-СМ» (генеральный директор Н.А. Ворошилов), Авторы искрен-не благодарны компании за поддержку данного издания.

© В.В. Долгов, П.В. Свирин, 2005

© Оформление, изданиеООО «Издательство «Триада», 2005

ООО «Издательство «Триада»ИД №06059 от 16.10.01 г,

170034, г. Тверь, пр. Чайковского, д. 9, оф. 504,тел./факс (0822) 42-90-22, 35-41-30

E-mail: [email protected]

Подписано к печати 11.08.2005Формат 62x94 1/8, обрезной

Бумага мелованнаяГарнитура Times New Roman. Печать офсетная

Усл. печ. л. 29. Тираж 3000 экз.

Заказ 1717Отпечатано в ООО «Тверская фабрика печати»

г. Тверь, Беляковский пер., 46

Авторы признательны сотрудникам кафедры клинической ла-бораторной диагностики РМАПО и сотрудникам Измайловской дет-ской больницы и НИИ детской гематологии за заинтересованное со-трудничество и помощь в подготовке этого издания.

ББК 54.11

ISBN 5-94789-114-Х

Список сокращений

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

α2-АП - α2-антиплазминβ - β-тромбоглобулин

(синоним (3-TG)Cl-Ing - ингибитор 1-го компонента

комплементаС4-СП - С4-связывающий протеинELISA - Enzyme-Linked

ImmunoSorbent AssayFl+2 - фрагменты протромбинаMCV - средний объем эритроцитаPAI - ингибитор активатора

плазминогенаPDGF - фактор роста тромбоцитовPF4 - фактор 4 тромбоцитовPIVKA - Proteins Induced by Vitamin К

Absence or Antagonists(синоним - ПИВКА)

pNA - паранитроанилинRDW - red cell distribution width

(показатель анизоцитозатромбоцитов)

TAFI - тромбин-активируемыйингибитор фибринолиза

ТХА2 - тромбоксанt-PA - активатор плазминогена

тканевого типаu-РА - урокиназный активатор

плазминогенаu-PAR - рецептор урокиназного

активатора плазминогенаvWF - фактор ВиллебрандаvWF:RCo - ристоцетин-кофакторная

активность фактораВиллебранда

vWF:Ag - антиген фактора ВиллебрандаvWF:CB - коллаген-связывающая


vWF:F.VIIIB - фактор VIII связывающаяактивность фактораВиллебранда

АПС - активированный протеин САТШ - антитромбин IIIАФА - антифосфолипидные антителаАФС - антифосфолипидный синдромАЧТВ - активированное частичное

тромбопластиновое время(синоним - АПТВ)

БВ - болезнь ВиллебрандаВА - волчаночный антикоагулянтВМК - высокомолекулярный

кининогенГГЦ - гипергомоцистеинемияГИТ - гепарин-индуцированная

тромбоцитопенияГМК - гладкие мышечные клеткиГП - гликопротеин (синоним - GP)ДВС - диссеминированное

внутрисосудистоесвертывание

ИВП - ингибитор внутреннего пути(синоним - TFPI)

ИЛ - интерлейкинИТП - иммунная

тромбоцитопеническаяпурпура

ИФА - иммуноферментный анализКК - калликреинЛВС - локализованное

внутрисосудистое свертываниекрови

ЛПНП - липопротеиды низкойплотности ЛПОНП -

липопротеиды очень низкойплотности

ME - международные единицы

Список сокращений

МИЧ - международный индексчувствительности

MHO - международноенормализованное отношение

НМГ - низкомолекулярные гепарины(синоним - LMWH)

ПS - протеин SПС - протеин СПСИ - ингибитор протеина С

(синоним - PCI)ПАП - плазмин-антиплазмин-

комплексПВ - протромбиновое времяПГ - простагландиныПДФ - продукты деградации

фибрина/фибриногенаПИ - протромбиновый индексПК - прекалликреинПО - протромбиновое отношениеПТ - протромбиновый тестРАПС - резистентность

к активированномупротеину С

РФМК - растворимыефибрин-мономерныекомплексы

СКВ - системная краснаяволчанка (синоним - SLE)

СФ - сфингомиелинТАТ - комплекс

тромбин-антитромбинТВ - тромбиновое времяТМ - тромбомодулинТФ - тканевой факторТЭЛА - тромбоэмболия легочной

артерииф. - факторф.VIII:С - коагуляционная активность

фактора VIIIф.VII - фактор коагуляции VIIф.VIIа - активированный фактор

коагуляции VII ФВ:RСо- ристомицин-опосредованная


ФЛ - фосфолипидыФМ - фибрин-мономерыФНО - фактор некроза опухолиФПА - фибринопептид АФПВ - фибринопептид ВЭДТА - этилендиаминтетраацетат

Введение

Кровь - важнейшая интегрирующая систе-ма, которая обеспечивает обмен метаболитамии информацией между тканями и клетками, пла-стическую и защитную функции организма. Про-текая по закрытому контуру, кровь контактиру-ет со всеми органами. Общая поверхность капил-ляров человеческого организма составляет око-ло 1000 м2. Многообразие и важность функций,огромная протяженность приводят к значитель-ной уязвимости системы кровообращения. Ге-мостаз призван поддерживать нормальное аг-регатное состояние крови. Изменения в систе-ме гемостаза могут стать причиной развитиякак геморрагических, так и тромботических со-стояний, которые возникают у пациентов с са-мыми разными заболеваниями. Огромное зна-чение системы гемостаза в патогенезе заболе-ваний современного человека доказывается ста-тистикой: такие гемостатические нарушения,как атеротромбоз и ДВС, являются причинойсмерти более чем в половине всех случаев. Не-правильно и несвоевременно диагностирован-ные геморрагические заболевания также вносятсвою печальную лепту в смертность, особенно впрактике акушеров-гинекологов и педиатров.Неконтролируемое применение препаратов, пря-мо или косвенно воздействующих на гемостаз,может оказаться опаснее самого заболевания. Извышесказанного следует, что лабораторная ди-агностика состояния системы гемостаза - важ-

нейший фактор эффективности лечения многихзаболеваний и снижения смертности населения.В свою очередь, современная лабораторная ди-агностика основана на понимании общебиоло-гических закономерностей функционированиясистемы гемостаза и выбора адекватных мето-дов их оценки.

Исследованию гемостаза в последние годыуделяется большое внимание. Появляются новыедиагностические методы, лекарственные препа-раты, схемы лечения больных. В то же время ру-тинная лабораторная практика в изучении систе-мы гемостаза в нашей стране развивается недо-статочно динамично. Необходима качественнаяподготовка как специалистов клинической лабо-раторной диагностики, так и клиницистов, длякоторых проблемы свертывания крови зачастуюостаются «камнем преткновения».

Настоящая книга подготовлена совместноспециалистом по клинической лабораторной ди-агностике и врачом-гемостазиологом. Надеемся,что изложенный материал, который во многомвключил собственные навыки, умения, клиничес-кий опыт лечения детей с гемостазиологическойпатологией и многолетние навыки преподаваниявопросов нарушения свертывания крови, будетполезен как врачам клинической лабораторнойдиагностики, так и врачам-клиницистам.

Ваши мнения о книге просим присылать поэлектронному адресу [email protected].

Характеристика системы гемостаза

ХАРАКТЕРИСТИКА СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА

Общее представление о гемостазе, гемостатический баланс

Гемостаз - это функция организма, обеспе-чивающая, с одной стороны, сохранение крови вкровеносном русле в жидком агрегатном состоя-нии, а с другой стороны - остановку кровотече-ния и предотвращение кровопотери при повреж-дении кровеносных сосудов. Органы и ткани, уча-ствующие в выполнении этих функций, образу-ют систему гемостаза. Органы и ткани, участву-ющие в выполнении этих функций образуют сис-тему гемостаза. Элементы системы гемостаза уча-ствуют также в таких важных процессах жизне-деятельности, как воспаление, репарация тканей,поддержание гомеостаза и др. Система гемоста-за активно реагирует на различные экзогенные иэндогенные воздействия, может иметь врожден-ные и приобретенные функциональные наруше-ния - «болезни системы гемостаза».

Составляющие систему гемостаза компонен-ты условно можно разделить на морфологическиеи функциональные.

Морфологические компоненты системы гемо-стаза:• Сосудистая стенка.• Тромбоциты и клеточные элементы крови.• Плазменные компоненты - белки, пептиды и

небелковые медиаторы гемостаза, цитокины,гормоны.

• Костный мозг, печень, селезенка тоже могутрассматриваться как компоненты системы гемостаза, поскольку в них синтезируются ипулируются тромбоциты и плазменные компоненты системы гемостаза.Функциональные компоненты системы гемостаза:• Прокоагулянты.• Ингибиторы коагуляции, антикоагулянты.• Профибринолитики.• Ингибиторы фибринолиза.

На гемостаз могут оказывать влияние какфизиологические, так и нефизиологические (па-тологические) факторы. К последним относятсябактериальные токсины, яды животных, соб-ственные протеолитические ферменты, в физио-логических условиях отсутствующие или имею-щиеся в крови в незначительных концентрациях,лекарственные препараты.

Активность разных компонентов системы ге-мостаза может изменяться в широких пределахиз-за генетических особенностей или экзогенныхвоздействий на организм. Взаимодействие ком-понентов гемостаза организовано серией меха-низмов «прямой» и «обратной» связи, которыеобеспечивают несвертываемость крови и цирку-ляцию ее в сосудах в течение всей жизни челове-ка. При относительно низкой или высокой ак-тивности какого-либо элемента общая интегри-рующая активность гемостаза может оставатьсясреднефизиологической за счет компенсатор-ного изменения других компонентов системы.Сохранение общей активности гемостаза в фи-зиологических пределах можно определить какподдержание гемостатического баланса (рис. 1).При смещении гемостатического баланса за рам-ки физиологических норм возникают условиядля развития патологических кровотечений илитромбозов.

Хотя механизмы работы системы гемостазасложны, итог нормальной ее работы прост. Приотсутствии повреждения система препятствуетсвертыванию крови. Часто говорят, что она ин-тактна, однако на сохранение жидкого состояниякрови затрачивается много энергии. При возник-новении повреждения запускается процесс оста-новки кровотечения: происходит спазм сосуда, взоне повреждения начинается процесс свертыва-ния крови. Через короткое время сформирован-

Характеристика системы гемостаза

Рис. 1. Гемостатический баланс: за счет компенсатор-ного взаимодействия система гемостаза поддерживаеткровь в жидком состоянии в течение всей жизни, в то жевремя при повреждении кровь быстро сворачивается, ку-пируя кровотечение. При смещении гемостатического ба-ланса за рамки физиологических норм возникают условиядля развития патологических кровотечений или тромбозов

ный гемостатический тромб закрывает повреж-дение и прекращает кровопотерю. На поврежден-ном участке, защищенном тромбом, происходятпроцессы репарации. По мере восстановленияповреждения тромб лизируется. Система гемо-стаза возвращается в исходное состояние.

Знакомство с физиологией и патологией сис-темы гемостаза на первый взгляд создает впечат-ление излишней перегруженности различнымиэлементами. Однако система гемостаза велико-лепно отрегулирована и способна эффективнофункционировать в самых различных физиоло-гических и патологических условиях. Система ге-мостаза изменяется в процессе онтогенеза, и приее исследовании необходимо учитывать возрастчеловека.

Поскольку в организме различные мелкиеповреждения возникают часто, в системе практи-чески постоянно происходят локальные процес-сы. При нормальном гемостатическом балансечувствительная для организма кровопотеря про-исходит лишь при массивном повреждении. Од-нако при нарушении гемостатического балансазначимая кровопотеря может возникнуть при не-значительных повреждениях. Либо, наоборот,патологическое тромбообразование или неконт-

ролируемое распространение процесса ростатромба приводят к нарушению кровообращенияв жизненно важных органах. Возможно такжевозникновение смешанной проблемы: неконтро-лируемое тромбообразование приводит к потреб-лению прокоагулянтов и развитию ишемии и од-новременно патологического кровотечения.

Система гемостаза регулируется не толькосвоими внутренними механизмами. Она тесносвязана с функционированием организма в целоми меняет свое функциональное состояние в зави-симости от состояния макроорганизма. Кровоте-чение и особенно тромбоз могут быть смертель-но опасны для организма. Эти состояния легчепредотвратить, чем лечить. Все это диктует необ-ходимость лабораторной оценки состояний сис-темы гемостаза.

Представление о нормальном функциониро-вании системы гемостаза очень условно и не име-ет четких рамок. Клинически трудно определитьнормальную кровопотерю при каждой конкрет-ной травме. А резистентность к протромботичес-ким воздействиям вообще клинически оценитьнельзя. Человек, не имевший в течение своей жиз-ни ни одной тяжелой травмы, может никогда неузнать, что у него легкая форма коагулопатии.Относительно низкий уровень ингибитора свер-тывания крови может клинически проявитьсятромбозом в старости или во время тяжелого за-болевания, и развившийся тромбоз не будет оце-нен врачом правильно.

Поскольку лабораторные нормы определяютпри исследовании здоровых лиц, врачи, как пра-вило, не имеют четких границ нормальных пока-зателей гемостаза. В сложных случаях диагнозстроится на анализе лабораторных и клиничес-ких данных. Многие компоненты системы гемо-стаза лабильны, а на результаты анализа влияетцелый ряд факторов. Поэтому для решения воп-роса о диагнозе в сомнительных случаях необхо-димо проводить неоднократные исследования сиспользованием различных методов и реактивовдля определения одного и того же показателя.

Ниже мы рассмотрим отдельно разные эле-менты гемостаза, их взаимодействие и патологи-ческие процессы, являющиеся следствием нару-шения гемостатического баланса.

Сосудистая стенка

СОСУДИСТАЯ СТЕНКА

Структура и функции сосудистой стенки

Кровь в организме человека протекает позамкнутой системе кровеносных сосудов. Сосу-ды не только пассивно ограничивают объем цир-куляции и механически предотвращают кровопо-терю, но и обладают целым спектром активныхфункций в гемостазе. В физиологических услови-ях неповрежденная сосудистая стенка способству-ет поддержанию жидкого состояния крови. Не-поврежденный эндотелий, контактирующий скровью, не обладает свойствами инициироватьпроцесс свертывания. Кроме того, он содержитна своей поверхности и выделяет в кровоток ве-щества, которые препятствуют свертыванию. Этосвойство предотвращает образование тромба наинтактном эндотелии и ограничивает рост тром-ба за пределы повреждения. При поврежденииили воспалении стенка сосуда принимает участиев образовании тромба. Во-первых, субэндотели-альные структуры, контактирующие с кровьютолько при повреждении или развитии патоло-гического процесса, обладают мощным тромбо-генным потенциалом. Во-вторых, эндотелий взоне повреждения активируется и у него появля-

ются прокоагулянтные свойства. Строение сосу-дов показано на рис. 2.

Сосудистая стенка у всех сосудов, кроме пре-капилляров, капилляров и посткапилляров, со-стоит из трех слоев: внутренней оболочки (инти-мы), средней оболочки (медии) и наружной обо-лочки (адвентиции).

Интима. На всем протяжении кровеносно-го русла в физиологических условиях кровь кон-тактирует с эндотелием, образующим внутрен-ний слой интимы. Эндотелий, который состоитиз монослоя клеток эндотелиоцитов, играет наи-более активную роль в гемостазе. Свойства эн-дотелия несколько различаются на разных учас-тках кровеносной системы, определяя разный ге-мостатический статус артерий, вен и капилляров.Под эндотелием находится аморфное межкле-точное вещество с гладкими мышечными клет-ками, фибробластами и макрофагами. Такжевстречаются вкрапления липидов в виде капель,чаще расположенных внеклеточно. На границеинтимы и медии находится внутренняя эластич-ная мембрана.

Рис. 2. Сосудистая стенка состоит из интимы, луминальная поверхность которой покрыта однослойным эндотелием, медии(гладкомышечные клетки) и адвентиции (соединительно-тканный каркас): А - крупная мышечно-эластичная артерия(схематическое изображение), Б - артериолы (гистологический препарат), В - коронарная артерия в поперечном разрезе


Медия состоит из гладких мышечных клетоки межклеточного вещества. Ее толщина значи-тельно варьирует в различных сосудах, обуслав-ливая их разную способность к сокращению,прочность и эластичность.

Адвентиция состоит из соединительной тка-ни, содержащей коллаген и эластин.

Артериолы (артериальные сосуды с общимдиаметром менее 100 мкм) представляют собойпереходные сосуды от артерий к капиллярам.Толщина стенок артериол немногим меньше ши-рины их просвета. Сосудистая стенка самых круп-ных артериол состоит из трех слоев. По мере вет-вления артериол их стенки становятся тоньше, апросвет уже, однако сохраняется соотношениеширины просвета и толщины стенки. В самыхмелких артериолах на поперечном срезе видныодин-два слоя гладких мышечных клеток, эндо-телиоциты и тонкая, состоящая из коллагеновыхволокон наружная оболочка.

Капилляры состоят из монослоя эндотелио-цитов, окруженных базальной пластиной. Кро-ме того, в капиллярах вокруг эндотелиоцитовнаходят другой тип клеток - перициты, роль ко-торых изучена недостаточно.

Капилляры открываются на своем венозномконце в посткапиллярные венулы (диаметр 8-30 мкм), для которых характерно увеличение ко-личества перицитов в сосудистой стенке. Пост-капиллярные венулы, в свою очередь, впадают в

собирательные венулы (диаметр 30-50 мкм), стен-ка которых, помимо перицитов, имеет наружнуюоболочку, состоящую из фибробластов и колла-геновых волокон. Собирательные венулы впада-ют в мышечные венулы, имеющие один-два слоягладких мышечных волокон в средней оболочке.В целом венулы состоят из эндотелиальной выс-тилки, базальной мембраны, непосредственноприлегающей снаружи к эндотелиоцитам, пери-цитов, также окруженных базальной мембраной;кнаружи от базальной мембраны имеется слойколлагена. Вены снабжены клапанами, которыеориентированы таким образом, чтобы пропус-кать кровь по направлению к сердцу. Больше все-го клапанов в венах конечностей, а в венах груд-ной клетки и органов брюшной полости они от-сутствуют.

Функция сосудов в гемостазе:• Механическое ограничение кровотока.• Регуляция кровотока по сосудам, в том чис

ле спастическая реакция поврежденных сосудов.

• Регуляция гемостатических реакций путемсинтеза и представления на поверхности эндотелия и в субэндотелиальном слое белков,пептидов и небелковых веществ, непосредственно участвующих в гемостазе.

• Представление на поверхности клеток рецепторов для энзиматических комплексов, вовлеченных в коагуляцию и фибринолиз.

Эндотелий

Характеристика энлотелиального покрова

Сосудистая стенка имеет активную поверхность, с внутренней стороны выстланную эндо-телиальными клетками. Целостность эндотели-ального покрова является основой нормальногофункционирования кровеносных сосудов. Площадь поверхности эндотелиального покрова в сосудахвзрослого человека сопоставима с площадью футбольного поля. Клеточная мембрана эндотелиоцитовобладает высокой текучестью, что является важным условием антитромбоген-ных свойств сосудистойстенки. Высокая текучесть обеспечивает гладкую внутреннюю поверхность эндотелия (рис. 3), которыйфункционирует как целостный пласт и исключает контакт про-коагулянтов плазмы крови ссубэндотелиальны-ми структурами.

Эндотелиоциты синтезируют, представляют на своей поверхности и выделяют в кровь исубэндотелиальное пространство целый спектр биологически активных веществ. Это белки, пептидыи небелковые вещества, регулирующие гемостаз. В табл. 1 перечислены основные продуктыэндотелиоцитов, участвующие в гемостазе.


Рис. 3. Эндотелиальный покров сосудов. Гладкая поверх-ность покрыта одним слоем эндотелиальных клеток. Целос-тность эндотелиального покрова - важнейшее условие со-хранения жидкого состояния крови

Антикоагулянтная активность интактного эндотелия

Антикоагулянтные свойства эндотелия обес-печиваются несколькими механизмами.• Интактный эндотелий не обладает прокоагу-

лянтной активностью.• Эндотелий пассивно предотвращает контакт

крови с субэндотелиальными структурами,обладающими выраженными прокоагулянт-ными свойствами.

• Интактный эндотелий синтезирует, выделяет в кровь или представляет на своей поверхности вещества, препятствующие коагуляции,адгезии, агрегации и спазму сосудов.

Гликокаликс

Со стороны просвета сосуда на поверхностиэндотелиальных клеток сформирован слой глико-

каликса (прежнее название - мукополисахарид),состоящий из протеогликанов, гликопротеидов,гликолипидов (рис. 4).

Основу гликокаликса образуют молекулыпротеогликанов (рис. 5). Стержнем протеогли-канов служит очень длинный филамент гиалу-роновой кислоты. К гиалуронату с помощьюконтактных белков крепятся внутренние (ядер-ные) белки. Основными элементами протеогли-канов являются цепочки глюкозаминогликанов,в частности гепарансульфата и хондроитинсуль-фата, расположенные на внутреннем (ядерном)белке. На одной молекуле ядерного белка дли-ной около 300 нм размещается до 200 молекулглюкозаминогликанов. На долю гепарансульфа-та в некоторых зонах эндотелиального покроваприходится до 80% глюкозаминогликанов.

Таблица 1Продукты эндотелиоцитов, участвующие в гемостазе

Антикоагулянты Прокоагулянты

Гепарансульфат Тканевой фактор*Тромбомодулин Ингибитор активатора плазминогена 1-го типаАденозиндифосфатаза Фактор ВиллебрандаПростациклин, ПГЕ2, ПГБ2 Рецептор для фактора ХаОксид азота Коллаген IV (рецептор для фактора IX iТканевой активатор плазминогена Индуцированный гипоксией активатор фактора XУрокиназный активатор плазминогена Липополисахарид-индуцированный активатор протромбинаИнгибитор пути тканевого фактора Эндотелиальный рецептор протеина САннексии VАннексии IIПротеин SЭндотелий-продуцируемый фактор релаксации

* Доказано в экспериментах in vitro, in vivo имеются лишь единичные данные.


Рис. 4. Гликокаликс эндотелиального покрова представ-ляет собой молекулярный слой, состоящий из протеоглика-нов, гликопротеидов, гликолипидов, именно в нем осуществ-ляются пристеночные метаболические процессы. Слой гли-кокаликса практически предупреждает прямой контакт кле-ток крови с поверхностью эндотелиальных клеток Рис. 5. Протеогликан - основной элемент гликокалик-

са, сформированного на поверхности сосудистой стенки

Гепарансульфат обладает мощным антикоагу-лянтным действием, являясь кофактором антитром-бина. Именно гепарансульфат служит основой ге-парина, когда последний получают вытяжкой избиологических тканей. Комплекс гепарансульфат-антитромбин является самым активным ингибито-ром свертывания. На его долю приходится около80% антикоагулянтной активности крови.

Крайними молекулами глюкозаминогликанов,как правило, являются сиаловые кислоты, которыеформируют отрицательный поверхностный заряд.Клетки крови также имеют на поверхности сиало-вые кислоты, поэтому между поверхностью сосу-дистой стенки и клетками крови формируютсясилы электростатического отталкивания.

Внутренние пространства протеогликанов гид-ратированы и формируют вязкий гель, устойчивыйк компрессионному давлению. В результате обра-зуется пристеночный молекулярный слой, куда, содной стороны, не проникают крупные клеточныеэлементы, с другой стороны, именно в этом слоефункционируют такие ферменты, как липопроте-инлипаза, целый ряд АДФаз, ферменты, разруша-ющие кинины, серотонин, норадреналин и другиебиологически активные вещества, в том числе об-ладающие прокоагулянтной активностью.

Контроль активности тромбоцитовСпособность интактного эндотелия контро-

лировать активность тромбоцитов связана с по-

стоянным синтезом простациклина, эктоадено-зиндифосфатазы и оксида азота (NO), которыепрепятствуют активации, адгезии и агрегациитромбоцитов.

Оксид азота (N0) - мощный антиагрегант ивазодилататор. NO образуется из аргинина подвлиянием постоянно экспрессированной на эндо-телии NO-синтетазы. Прежде чем N0 был иден-тифицирован как вазоактивный метаболит, егоэффект приписывали релаксирующему факторуэндотелия (EDRF - endothelium-derived relaxingfactor). Брадикинин, гистамин, ацетилхолин по-вышают образование и освобождение N0 из эн-дотелиальных клеток. Все эти вещества стимули-руют гуанилатциклазу, которая переводит ГТФв цикло-ГМФ. Циклический ГМФ в свою очередьактивирует NO-синтетазу.

В местах спонтанной репарации эндотелиякратковременно образуются участки деэндотели-зации. Этот процесс не сопровождается присте-ночным тромбообразованием. Видимо, адгезиютромбоцитов к субэндотелию блокирует облакопростациклина, формирующееся над эндотели-альным покровом (рис. 6).

Антиагрегационное действие простациклинасвязано со способностью усиливать действие аде-нилатциклазы тромбоцитов. Это ведет к увели-чению синтеза цАМФ, удалению ионов Са2+ впулы хранения из плазмы и снижению способно-сти тромбоцитов к агрегации (рис. 7).


Другие простагландины, образующиеся в эн-дотелиальных клетках и отчасти в тромбоцитах,оказывают эффекты по типу обратной связи.ПГD2 является ингибитором агрегации, причемантиагрегационный эффект он оказывает в оченьнизких концентрациях (50 нмоль). Тем не менееингибиторный эффект ПГD2 в 10 раз слабее, чему простациклина. ПГЕ, в малых дозах (10-8 моль)потенцирует тромбоцитарную агрегацию, а вбольших (10-5 моль) - является ингибитором аг-регации. Кроме того, ПГЕ, оказывает ингибиру-ющий эффект на лимфоциты и другие клетки,принимающие участие в воспалительных и аллер-гических реакциях.

Рис. 6. Деэндотелизация при спонтанной репарации эн-дотелия не сопровождается адгезией тромбоцитов к со-судистой стенке, по-видимому, из-за облака простацикли-на, формирующегося пристеночно в зоне гликокаликса

Молекулярный каскад образованияпростациклина и тромбоксана

В эндотелиальных клетках, активированныхтромбоцитах и других клетках из мембранныхфосфолипидов под действием фосфолипаз осво-бождается арахидоновая кислота, которая в своюочередь является предшественником эйкозанои-дов - кислородсодержащих производных. В эн-дотелиальных клетках из полиненасыщенной ара-хидоновой кислоты при участии специфическогомультиферментного комплекса циклооксигеназысинтезируются простациклин и ряд активных про-стагландинов (рис. 8).

В тромбоцитах при активации фосфолипаз изобразующейся арахидоновой кислоты синтезирует-ся в основном тромбоксан (ТХА,), он оказываетвыраженный сосудосуживающий эффект и являет-ся мощным стимулятором адгезии тромбоцитов.Механизм действия ТХА связан с активацией фос-фоинозитольного механизма и с прямым эффектомпо увеличению проницаемости плазматическоймембраны для ионов Са2+. ТХА2, связывая Са2+ сво-ими гидрофобными группами, обеспечивает пере-нос его через мембраны, тем самым оказываетсявыраженный прямой эффект на гладкомышечныеклетки сосудов и бронхов. Его вазоконстрикторныйэффект такой же, как у ангиотензина II, что делаетТХА2 важнейшим местным регулятором распреде-ления крови и стимулятором гемостаза.

В лейкоцитах арахидоновая кислота являет-ся предшественником липоксигеназного пути об-разования лейкотриенов (ЛТА4, ЛТВ4, ЛТС4,ЛТD4, ЛТЕ4).

Рис. 7. Эндотелий ингибирует активацию тромбоцитов за счет выработки простациклина


Рис. 8. Каскад метаболитов, образующихся из арахидоновой кислоты. Арахидоновая кислота освобождается изфосфолипидов клеточных мембран за счет ферментов фосфолипизы А2 или фосфолипазы С. В эндотелиальных клеткахи тромбоцитах с участием циклооксигеназы синтезируются эндоперекиси ПГG2 и ПГН2, в лейкоцитах под влиянием липок-сигеназы образуются лейкотриены, Из эндоперекисей в эндотелии образуется антиагрегант простациклин (ПП2) и ряддругих простагландинов, в тромбоцитах - проагрегант тромбоксан (ТХА2)

На молекулярный каскад образования про-стациклина и тромбоксана влияет ряд лекарствен-ных препаратов, часто применяемых в терапии(рис. 9). Стероидные гормоны, используемые какпротивовоспалительные средства, ингибируютфосфолипазы, при этом угнетается образованиеширокого спектра медиаторов из фосфолипидовклеточных мембран, в том числе медиаторов вос-паления и продуктов каскада арахидоновой кис-лоты. Поэтому наряду с противовоспалительнымстероидные гормоны оказывают ряд эффектов, втом числе и на систему гемостаза. Ацетилсалици-ловая кислота (аспирин) ацетилирует и ингиби-рует фермент циклооксигеназу в тромбоцитах иэндотелиальных клетках, что способствует инги-бированию синтеза в них соответственно тром-боксана (ТХА) и простациклина (ПГI2). Инак-тивация происходит очень быстро и практичес-ки необратимо. Тромбоциты не способны ресин-тезировать циклооксигеназу (они получают ее из

мегакариоцитов), тогда как метаболически актив-ные эндотелиальные клетки вновь ресинтезиру-ют циклооксигеназу и восстанавливают образо-вание ПГI2 Поэтому ацетилсалициловая кислотав низких дозах широко используется для леченияи как профилактическое средство артериальныхтромбозов. Однако не следует применять ее в вы-соких дозах, так как при этом тормозится образо-вание простациклина, что блокирует ее антитром-ботическое действие и может привести к тромбозу.

Тромбомодулин

Антикоагулянтная активность эндотелия свя-зана также с наличием специфического мембран-ного белка - тромбомодулина. На поверхности ин-тактного эндотелия содержится значительное ко-личество ТМ. Тромбомодулин с высокой аффин-ностью связывает тромбин, меняя «направлен-ность» его действия. Комплекс тромбин-тромбо-


Рис. 9. Механизм влияния стероидных и нестероидныхпротивовоспалительных препаратов на ферменты кас-када образования тромбоксана и простациклина. Стеро-иды, подавляя активность фосфолипаз, угнетают образо-вание широкого спектра медиаторов воспаления и про-дуктов каскада арахидоновой кислоты, Ацетилсалициловаякислота и ее аналоги ингибируют циклооксигеназу: в ма-лых дозах влияют в основном на тромбоциты и оказываютантиагрегантный эффект, а в высоких концентрациях по-давляют образование простациклина в эндотелии и оказы-вают проагрегантное действие

модулин активирует протеин С (рис. 10). После-дний в комплексе с протеином S ингибирует ак-тивные факторы каскада коагуляции Va и Villa.Кроме того, комплекс тромбин-тромбомодулинподвергается эндоцитозу эндотелиальными клет-ками с последующей деградацией тромбина в эн-дотелиоците и рециркуляцией тромбомодулинана клеточную поверхность.

Другой функцией комплекса тромбин-тром-бомодулин является активация прокарбоксипеп-тидазы Y до активного ингибитора - карбокси-пептидазы Y или тромбин-активируемого инги-битора фибринолиза (TAFI), который замедляетфибринолиз.

В норме ТМ связан с мембраной эндотелио-цитов и практически отсутствует в циркуляции.Появление сколько-нибудь значимой концентра-ции ТМ в токе крови свидетельствует о повреж-дении эндотелиальных клеток. Повышение ТМнаблюдается при системной красной волчанке,ДВС-синдроме, респираторном дистресс-синдро-ме взрослых, эмболии легочной артерии, инфар-кте миокарда, после использования тромболити-ков при инфаркте миокарда, при диабетическоймикроангиопатии, после транслюминальной ан-гиопластики коронарных артерий. Значение ТМдля регуляции гемостаза имеет клинические под-

Рис. 10. Прокоагулянтный и антикоагулянтный эффекты тромбина. Тромбин оказывает прямой активирующий эф-фект на факторы V и VIII и инактивирующее действие на факторы Va и VIIIa. Фактор VIII может быть активирован высоки-ми концентрациями фактора IXa или следовыми концентрациями тромбина. В то же время тромбин в комплексе с тром-бомодулином стимулирует антикоагулянтный эффект протеина С. Эти формы регуляции существенны для эффективногоучастия факторов Va и Villa в процессах свертывания крови


тверждения. Некоторые мутации гена ТМ сопро-вождаются артериальными тромбозами, опреде-ленный полиморфизм ТМ имеет значение в раз-витии инфаркта миокарда.

Другие антикоагулянты. Эндотелий синтези-рует и постоянно высвобождает в плазму инги-

битор пути тканевого фактора (ИПТФ), роль ко-торого в гемостазе будет описана ниже.

Фибринолиз. Роль эндотелиоцитов в фибри-нолизе связана с синтезом тканевого и урокиназ-ного активаторов плазминогена (см. ниже).

Прокоагулянтная роль эндотелия, регуляция сосудистого тонуса

В ответ на различные стимулы эндотелиоци-ты отвечают активацией и изменением направлен-ности воздействия на гемостаз. Наиболее значи-мыми стимулами, активирующими эндотелиоци-ты, являются воспалительные цитокины, эндоток-сины, тромбин, гистамин, гипоксия, свободныерадикалы кислорода, турбулентные потоки кро-ви, внутриклеточные инфекционные агенты, меха-нические повреждения, иммунные комплексы и др.

У стимулированных эндотелиальных клетокпоявляются прокоагулянтные и провоспалитель-ные свойства:• Стимулированные эндотелиоциты могут

представлять на своей поверхности тканевойфактор (ТФ). Этот процесс был исследованin vitro и частично подтвержден in vivo в сосудах некоторых злокачественных опухолей.

• На стимулированных эндотелиальных клетках снижается количество тромбомодулина.

• Они начинают секретировать ингибитор активатора плазминогена.

• Из пула хранения эндотелиоцитов (тельцаВейбла-Паллада) высвобождается факторВиллебранда. Наиболее активными стимулами высвобождения фактора Виллебранда являются тромбин и гистамин.

• Происходит изменение фосфолипидного состава наружной поверхности мембраны эндотелиальных клеток с появлением рецепторовдля ферментных комплексов коагуляционно-го каскада.

• В дополнение к ферментам классическогокоагуляционного каскада эндотелиальныеклетки вырабатывают ряд дополнительныхэнзимов, в том числе гипоксия-индуцирован-ный активатор фактора X, липополисахарид-индуцируемый активатор протромбина.Помимо прямого влияния активированных

эндотелиальных клеток на гемостаз, существует

обратное влияние белков гемостаза наэндотелиальные клетки. Комплекс фактор VIIa -ТФ, тромбин, фактор Ха, возможно, и другиефакторы передают сигналы на эндотелиоциты,вызывающие различные реакции со стороныклетки и выработку медиаторов, влияющих наглубокие слои сосудистой стенки, в частностина гладкомышечные клетки медии.

Роль эндотелия в регуляции сосудистого тонуса

В течение нескольких секунд после повреж-дения сосудистой стенки происходит сокращениеповрежденного и соседних кровеносных сосудов,свободные края сосуда вокруг повреждения вво-рачиваются внутрь кровеносного русла, при этомкровоток в месте повреждения частично перекры-вается. Ведущую роль в модуляции этих измене-ний выполняет эндотелии.

Эндотелии (ЕТ) - пептидный гормон, состо-ящий из 21 аминокислоты, относится к группе ци-токинов, имеет 3 изоформы (ЕТ-1, ЕТ-2 и ЕТ-3).Образуется эндотелии из предшественника пре-про-ЕТ (который иногда обозначается как боль-шой эндотелии) при участии металлопептида-зы - эндотелинпревращающего фермента.

В низких концентрациях эндотелии действу-ет на эндотелиальные рецепторы, вызывая выс-вобождение факторов релаксации, а в более вы-соких - активирует рецепторы на гладких мы-шечных клетках, стимулируя стойкую вазокон-стрикцию.

ЕТ-1 - наиболее сильный вазоконстриктор извсех известных факторов, доминирует в эндоте-лиальных клетках сосудов человека. Он такжеприсутствует в небольших количествах в гладкихмышечных клетках (ГМК) и кардиомиоцитах. ЕТне хранится в клетках, а постоянно синтезирует-ся de novo. Синтез ЕТ и освобождение его из эн-


дотелиальных клеток стимулируют тромбин, ад-реналин, ангиотензин, вазопрессин, некоторыецитокины.

Большая часть ЕТ секретируется внутрь со-судистой стенки, где расположены специфичныевысокоаффинные рецепторы. ЕТ, секретируе-мый наружу, взаимодействует с собственнымирецепторами на клеточной мембране, а такжестимулирует ангиотензинпревращающий фер-мент (АПФ), который переводит неактивный ан-гиотензин I в вазоконстриктор ангиотензин II(рис. 11).

Рецепторы для эндотелина сопряжены с G-бел-ками, присутствуют в 2 формах: ЕТ-А и ЕТ-В. Ре-цепторы ЕТ-А характеризуются высокой аффин-ностью и постоянно экспрессированы в мио-карде на ГМК сосудов. Они обеспечивают пря-мое вазоконстрикторное действие эндотелиназа счет активации поступления Са2+ в клеткучерез неселективные ионные каналы. Рецепто-ры ЕТ-В экспрессированы на эндотелиальныхклетках и ГМК в отдельных сосудистых бассей-нах. Стимуляция ЕТ-В сопровождается освобож-дением N0 (вазодилататор), тромбоксана (ва-зоконстриктор) и PGI2 (вазодилататор). Такимобразом, один и тот же фактор реализует двепротивоположные сосудистые реакции (сокра-щение и расслабление), вызываемые различны-ми химическими механизмами.

Доказано, что дисбаланс эндотелий-зависи-мой сократимости и релаксации сосудов при ар-териальной гипертензии может способствоватьповышению общего периферического сопротив-ления сосудов (ОПС) и появлению сердечно-со-судистых осложнений. Характерно увеличениеэндотелина крови с возрастом. Наиболее высо-кий уровень эндотелина отмечен при атероскле-розе, неспецифическом аортоартериите, облите-рирующем тромбангиите, т. е. при заболеваниях,протекающих с повреждением эндотелия. По-скольку эндотелии действует преимущественноместно, естественно предположить, что повышен-ное образование и поступление его в кровь мо-жет быть причиной возникновения и усугублениятяжести течения ИБС.

Мы исследовали чувствительность лабора-торных тестов повреждения сердечно-сосудистойсистемы у пациентов с нестабильной стенокарди-ей (п = 11, возраст 60,7 ± 9,9 года) в состояниикомпенсации. Все пациенты в течение, по крайнеймере, 1 года находились на низкокалорийной дие-те и корригирующей терапии гиполипидемически-ми препаратами, в том числе статинами. В группусравнения входили практические здоровые люди(п = 13), средний возраст которых был 27,4 ±1,5 года. Результаты измерений уровня эндотели-на-1 и липидных показателей сыворотки пред-ставлены в табл. 2.

Рис. 11. Эндотелин - основной вазоконстриктор сосудистой стенки, вырабатывается и реализуетсясосудистым эндотелием. ЕТ - эндотелии, AI и АII - ангиотензин I и II, АПФ - ангиотензинпревращающий фермент,ЕТ-А и ЕТ-В - рецепторы к эндотелину


Таблица 2Сравнительная характеристика эндотелина и липидов у пациентов с нестабильнойстенокардией

Значения приведены из инструкции к набору Parameter-Human Endothelin-1 Assay производстваR&D System Inc., США.

У пациентов с нестабильной стенокардиейпосле длительного срока наблюдения и интен-сивной терапии (более 1 года приема статинов)удалось достичь целевых уровней основных по-казателей липидограммы для вторичной профи-лактики сердечно-сосудистых заболеваний, хотяэти показатели были выше, чем у здоровых мо-лодых людей. В то же время уровень ЕТ-1 у па-циентов был выше не только показателей груп-пы сравнения, но и рекомендуемого референт-ного значения. Это расценивается как свиде-

тельство того, что, несмотря на интенсивную те-рапию, у больных сохраняется активный про-цесс дисфункции эндотелия. Поэтому пациен-ты с нестабильной стенокардией, даже при ус-ловии нормализации показателей липидногообмена, должны быть под наблюдением карди-олога. В свою очередь, определение ЕТ-1 мож-но рекомендовать в качестве лабораторноготеста активности процесса повреждения сосу-дистой стенки и, следовательно, прогноза тече-ния болезни.

Субэндотелий

В состав субэндотелиальной базальной мем-браны (рис. 12) входят различные типы колла-гена, фибронектин, витронектин, ламинин, про-теогликаны, гликозаминогликаны, тромбо-спондин, фактор Виллебранда, а в местах по-вреждения и воспаления - фибрин. Большаячасть этих компонентов синтезируется и секре-тируется эндотелиальными клетками, однакоперициты и ГМК также вносят свой вклад вформирование внеклеточного матрикса. Вне-клеточные белки субэндотелия играют важнуюроль в межклеточном взаимодействии, форми-ровании скелета сосуда, процессе клеточнойадгезии, репарации и росте сосудов.

Субэндотелий является стимулятором адге-зии тромбоцитов и активации каскадной систе-мы свертывания крови.

Прокоагулянтные свойства клеток субэндо-телия (макрофагов, фибробластов, лейкоцитов игладких мышечных клеток) обусловлены наличиемна их поверхности тканевого фактора. Колла-

Рис. 12. Субэндотелий сосудистой стенки организованполимерными белками: коллагеном, эластином и другими,Субэндотелий обладает выраженным тромбогенным эффектом,стимулируя процессы свертывания крови

ген субэндотелия является субстратом для адгезиитромбоцитов. Связь коллагена с рецепторамитромбоцитов вызывает активацию последних.Помимо этого, коллаген, видимо, обладает свой-ством активировать белки системы контактнойактивации.


Тканевой фактор

Тканевой фактор (ТФ) - трансмембранный белок(рис. 13), локализованный на клетках субэндотелия(фибробластах, макрофагах, гладких 18 мышечныхклетках). Предположительно ТФ есть на базальноймембране эндотелиоцитов, а на апикальноймембране он может появляться после активацииклеток. ТФ в норме нет на поверхностициркулирующих лейкоцитов или эритроцитов.

Роль ТФ в процессе свертывания крови оченьвелика. При связывании фактора VIla с ТФ фор-мируется активный комплекс, который в присут-ствии ионов Са2+ активирует фактор X. По совре-менным представлениям этот процесс являетсяосновным физиологическим путем запуска про-цесса свертывания крови.

ТФ обладает очень большой тромбогеннойактивностью. При патологии он выявлен на не-которых опухолевых клетках. Это является однимиз факторов риска развития тромбоза при онко-логических заболеваниях.

Изначально ТФ классифицировали как одиниз плазменных факторов свертывания (тканевойтромбопластин, ф.Ш). Исследования показали,что ТФ фиксирован на клеточной мембране и вфизиологических условиях не поступает в крово-ток, поэтому он был исключен из классификацииплазменных факторов гемостаза.

ТФ присутствует практически во всех тканях,кроме сухожилий. Атеросклеротические бляшкии моноциты после стимуляции липополисахари-дами (например, клеточной мембраной бактерий)

Рис. 13. Формирование активного комплекса внешнегопути активации свертывания на тканевом факторе, ТФ -тканевой фактор, VIIa - активный фактор VII свертываниякрови (протеолитический фермент), X - неактивный фак-тор X свертывания крови (субстрат)

или ИЛ-1 могут генерировать ТФ. После повреж-дения или после стимуляции клеток ТФ можетэкспонироваться или вновь синтезироваться.Физиологическими стимуляторами синтеза ТФявляются такие цитокины, в том числе ИЛ-1, фак-тор некроза опухоли (ФНО), фрагмент компле-мента С5а и др. Повышение экспрессии ТФ на мо-ноцитах обнаружено при воспалении, сепсисе,опухолях, при сердечно-сосудистой патологии,особенно у больных, перенесших инфаркт мио-карда, после экстраваскулярной циркуляции кро-ви. Имеются отдельные сообщения, что стероид-ные контрацептивы, принимаемые внутрь, куре-ние вызывают повышение ТФ в системе цирку-ляции, что увеличивает риск тромбоза.

Определение экспрессии ТФ на моноцитахпроводят методом проточной цитометрии. Естьпредположения, что этот метод для оценки состо-яния гиперкоагуляции в будущем может заменитькоагулометрические методы, проводимые нацельной крови.

Коллаген

Коллагены - наиболее распространенные бел-ки в организме животных. Они составляют 25%от общего количества белка. Коллагены образу-ют нерастворимые нити (фибриллы), которыевходят в состав межклеточного матрикса и соеди-нительных тканей.

Типичная молекула коллагена состоит изтрех полипептидных цепей разных типов (а-спи-ралей), скрученных в виде правой тройнойспирали. В свою очередь полипептидные цепипостроены из часто повторяющихся фрагмен-тов, имеющих характерную последователь-ность -Gly-X-Y-. Каждым третьим аминокис-лотным остатком является глицин. Пролин (Pro)часто встречается в положениях X, положение Yможет быть занято как пролином, так и 4-гидрокси-пролином (4Нур). Кроме того, молекула колла-гена содержит остатки 3-гидроксипролина (ЗНур)и 5-гидроксилизина (5Ну1). Присутствие в по-липептидной цепи остатков гидроксиаминокис-лот является характерной особенностью колла-гена. Остатки пролина и лизина гидроксилиру-ются посттрансляционно, т. е. после включенияв полипептидную цепь. На одном из концов мо-лекула коллагена сшита поперечными связями,


образованными боковыми цепями остатков ли-зина. Количество поперечных связей возраста-ет по мере старения организма. Известно, покрайней мере, 12 вариантов коллагена, харак-теризующихся различным сочетанием полипеп-тидных ос-цепей. Молекулы коллагенов облада-ют свойством спонтанно агрегировать с обра-зованием более сложных структур, микрофиб-рилл и фибрилл. Большинство коллагенов об-разуют фибриллы цилиндрической формы (диа-метром 20-500 нм) с характерными поперечны-ми полосами, повторяющимися через каждые64-67 нм.

В гемостазе коллагены выполняют несколь-ко важных функций: • Они образуютэластичный «каркас» сосуда и

во многом определяют его прочность, устой-

чивость к нагрузкам и реологические харак-теристики.Типы III и VI коллагена обладают высокойпрокоагулянтной активностью, связывая свысокой аффинностью фактор Виллебранда,и тем самым обеспечивают адгезию тромбо-цитов.Типы I и IV коллагена непосредственно вза-имодействуют с тромбоцитарным рецепто-ром GPIa-IIa, следствием чего также являет-ся адгезия тромбоцитов. Типы I, III, IV и Vколлагена активируют тромбоциты,воздействуя непосредственно натромбоцитарные рецепторы или опосредо-ванно через фактор Виллебранда. Это влечетза собой изменение формы тромбоцитов, ихадгезию и дегрануляцию.

К А Ф Е Д Р Аклд

ЦИКЛЫ ТЕМАТИЧЕСКОГОУСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ

«МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯСИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА»

Циклы тематического усовершенствования «Методы исследования системы гемостаза» более20 лет систематически проводятся на кафедре клинической лабораторной диагностики Российскоймедицинской академии последипломного образования для заведующих и врачей клинической ла-бораторной диагностики.

В программу циклов включены лекции по наиболее актуальным проблемам гемостаза, семина-ры по вопросам организации исследований гемостаза, разбору клинических случаев, интерпрета-ции коагулограммы. На практических занятиях в малых группах осваиваются и отрабатываютсялабораторные методы исследования гемостаза. К работе цикла привлекаются производители обо-рудования и реагентов с информацией о новейших разработках в этой области, организуются посе-щения ведущих лабораторий Москвы.

Продолжительность циклов 2 недели, иногородним предоставляется общежитие гостиничноготипа, по окончании выдаются свидетельства о повышении квалификации государственного образца.

Заявки для участия в циклах усовершенствования принимаются:• по почте: 125424, Москва, а/я 32 (кафедра КЛД)• по факсу (095) 945-84-00 или телефону (095) 945-82-22• по электронной почте: [email protected]

Тромбоциты

ТРОМБОЦИТЫ

Тромбоцитопоэз

Дифференцировка и созревание клеток мега-кариоцитопоэза происходят в костном мозге, гдеиз коммитированных, морфологически неиденти-фицируемых клеток-предшественников (КОЕ-Мгкц) формируются колонии мегакариоцитар-ных клеточных элементов. При созревании клет-ки проходят три морфологически дифференциру-емые стадии: мегакариобласт, который не превы-шает 10% всей популяции, промегакариоцит (око-ло 15%) и мегакариоцит (рис. 14) - на его долюприходится от 75 до 85%.

Процесс дифференцировки мегакариоцитар-ных элементов продолжается около 25 часов, такоеже примерно время (около 25 часов) составляет со-зревание, а весь жизненный цикл - около 10 суток.Отличительной чертой клеточных элементов мега-кариоцитопоэза является их способность к эндоми-тозу (полиплоидизации) - делению ядра без разде-

Рис. 14. Мегакариоцит, диаметр 30-40 мкм. Ядро темно-фиолетового цвета, лопастное, с бухтообразными вдавле-ниями, фрагментированное. Хроматин распределен не-равномерно, Цитоплазма обильная, содержит обильнуюзернистость

ления цитоплазмы, что приводит к появлению ги-гантского размера клеток (мегакариоцитов). В про-цессе мегакариоцитопоэза (рис. 15) клетки проде-лывают от 3 до 6 эндомитозов, что соответствуетплоидности мегакариоцита от 8 п до 64 п.

Регуляция мегакариоцитопоэза осуществляет-ся по принципу обратной связи: избыток тромбо-цитов в крови тормозит тромбоцитопоэз, а тром-боцитопения его стимулирует. Основными регу-ляторами, стимулирующими мегакариоцитопоэз,являются ИЛ-1, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-11, факторстволовых клеток, лейкоз-ингибирующий фактор,гранулоцитарно-макрофагальный колониестиму-лирующий фактор (ГМ-КСФ), гранулоцитарныйколониестимулирующий фактор (Г-КСФ), эритро-поэтин, тромбопоэтин. К факторам, ингибирую-щим тромбоцитопоэз, относят тромбоцитарныйфактор 4, трансформирующий фактор роста Рр ин-терфероны-а и -у и другие ингибиторы.

В а-гранулах мегакариоцитов содержитсязначительное количество белков: фактор Вилле-бранда, тромбоцитарный фактор 4, тромбоспон-дин, фибриноген, фибронектин, тромбоцитарныйростовой фактор, трансформирующие ростовыефакторы, тромбоцитарный ингибитор коллагена-зы. Основная масса их синтезируется в мегакарио-цитах, некоторые белки, такие, как альбумин,фибриноген, IgG, поступают в клетку путем эн-доцитоза. Способность зрелых мегакариоцитовк эндоцитозу проявляется в явлении эмпириопо-лезиса, суть которого заключается в захвате ге-мопоэтических клеток. Частота его возрастаетпри злокачественных новообразованиях. Тромбо-цитарная пероксидаза присутствует на всех ста-диях созревания клеток мегакариоцитарной ли-нии, включая тромбоциты. Мегакариоциты, син-тезируя трансформирующий ростовой фактор (3,


Рис. 15. Схема регуляции мегакариоцитопоэза. Внизу рисунка показаны периоды стимулирующего действия на мега-кариоцитоз основных стимуляторов. LIF - лейкоз-ингибирующий фактор, ТРО - тромбопоэтин

участвуют в накоплении коллагена и развитиифиброза.

Основная функция мегакариоцитопоэза -репопуляция тромбоцитов, поддержание их ко-личества в кровотоке на постоянном уровне.Мегакариоциты располагаются в костном моз-ге вблизи костно-мозговых синусов и по мересозревания внутрь клетки врастают раздели-

тельные мембраны, по которым в дальнейшемпроисходит деление цитоплазмы на тромбоци-ты. Существует точка зрения, что цитоплазма-тические отростки мегакариоцита (в виде лентдиаметром 2-4 мкм) через миграционные порыпроникают в синусы костного мозга, где и про-исходит отшнуровка тромбоцитов (тромбоци-тообразование).

Жизненный цикл тромбоцитов

ОКОЛО 1/3 всей массы тромбоцитов находитсяв селезенке (селезеночный пул): при спленомегалииэтот пул возрастает, что может приводить к пере-распределительной тромбоцитопении. При стиму-ляции адренорецепторов (физическая нагрузка,стресс) происходит выброс тромбоцитов в цирку-ляцию, что приводит к кратковременному тромбо-цитозу (рис. 16). После спленэктомии также в тече-ние некоторого времени наблюдается тромбоцитоз,который иногда достигает очень больших величин(до 800-1200 х 107л). Остальные 2/3 тромбоцитовциркулируют в крови. Средняя продолжительностьжизни тромбоцитов составляет 9-10 суток.

Референтные значения. У здорового человекаколичество тромбоцитов может несколько менять-

ся в течение суток. Нормальное содержание тром-боцитов в крови колеблется в пределах 150-320 х109/л. (В последнее время в связи с поступлениемна отечественный рынок зарубежных гематологи-ческих счетчиков и анализаторов, в инструкции ккоторым даются зарубежные нормы, стали при-водить значения нормального содержания тром-боцитов в диапазоне от 150 до 450 х 109/л.)

При отсутствии в крови гемопоэтическихстимулов общий объем циркулирующих тром-боцитов довольно постоянен. В патологическихусловиях количество и объем тромбоцитов мо-гут меняться (рис. 17). При снижении продук-ции тромбоцитов гемостатический потенциалможет быть частично компенсирован за счет


Рис. 16. Жизненный цикл тромбоцитов. Тромбоциты об-разуются в костном мозге из мегакариоцитов, примерно2/3 периферического пула находится постоянно в систе-ме циркуляции, 1/3 - в селезенке. При стимуляции адрено-рецепторов может возникнуть временный тромбоцитоз из-за выброса тромбоцитов в систему циркуляции из костно-го мозга и селезенки, Опустошение тромбоцитов в селе-зенке происходит и при ДВС-синдроме при тромбоцитопе-нии потребления, в последнем случае могут появляться мак-ротромбоциты с недостаточными функциональными свой-ствами адгезии и агрегации - возникает тромбоцитопатия

Рис. 17. Тромбоциты в периферической крови: А - нормальные тромбоциты, Б - анизоцитоз тромбоцитов при хрони-ческом моноцитарном лейкозе (нарушение дифференцировки на уровне полипотентных коммитированных предшествен-ников мегакариоцитопоэза), В - гигантские тромбоциты (макротромбоциты) при аутоиммунной тромбоцитопении

повышения их объема. В обратной ситуации, приповышении количества тромбоцитов выше 450 х109/л, объем тромбоцитов не снижается ниже оп-ределенного физиологического уровня. Соот-ветственно общий объем тромбоцитарногопула в крови возрастает пропорционально уве-личению количества тромбоцитов. Это может

приводить к увеличению тромбогенного потен-циала.

С помощью автоматических гематологичес-ких анализаторов можно измерить средний объемтромбоцитов (MPV), дисперсию распределениятромбоцитов по объему (RDW) и оценить гисто-грамму распределения тромбоцитов по объему.

Структура тромбоцитов

Тромбоцит - безъядерная сферическая клеткадиаметром 2-4 мкм, средний объем 7,5 мкм3 (от3 до 10 мкм3, или фл-фемтолитры). Микрофор-мы тромбоцитов имеют диаметр менее 1,5 мкм,

макроформы могут достигать 6-10 мкм. Интакт-ные тромбоциты имеют форму диска или пласти-ны диаметром 2,8-3,4 мкм, толщиной 0,8-1,2 мкми объемом от 5,7 до 8,9 мкм3 (рис. 18). В циркули-

Тромбоцит

Рис. 18. Тромбоцит (рисунок и микрофотография). Интактные тромбоциты имеют форму диска, В цитоплазме распо-ложены митохондрии, пероксисомы (содержат каталазу), включения гликогена, лизосомы и гранулы, содержащие пулыхранения различных веществ

рующем пуле преобладают зрелые пластинки ди- ляют 1-10%, а «старые» - микротромбоциты ме-аметром 2-3 мкм (80-95%), «молодые» формы - нее 2 мкм - 3-15%. макротромбоциты размером свыше3 мкм - состав-

Мембрана и цитоскелет тромбоцитов

Структура поверхностной мембраны тром-боцита сложна. Наружная поверхность тромбо-цита покрыта гликокаликсом, богатым глико-протеинами. В пространствах многослойноймембраны расположены микротрубочки, форми-рующие цитоскелет тромбоцита. Цитоплазмати-ческая мембрана тромбоцитов внедряетсявнутрь клетки с образованием многочисленныхпереплетенных канальцев, связанных с внекле-точным пространством. Эта система называет-ся «связанной с поверхностью канальцевой сис-темой», или «открытой канальцевой системой»(ОКС). Обнаружено, что на поверхности мемб-раны ОКС имеются те же гликопротеиды, что ина внешней мембране тромбоцитов. Таким об-разом, ОКС значительно увеличивает активнуютромбоцитарную поверхность, что важно приизменении формы тромбоцита во время его ак-тивации.

Непосредственно в подмембранном про-странстве расположены плотные микротрубоч-ки, образующие особую плотную микротубуляр-ную систему (ПМТС), не связанную с внеклеточ-ным пространством. ПМТС развивается из ме-гакариоцитарного эндоплазматического ретику-лума. Эта система является местом депонирова-ния кальция и синтеза простагландинов. Крометого, образуя концентрические субмембранныеструктуры, ПМТС является частью цитоскелетатромбоцитов.

Важное свойство мембраны интактных тром-боцитов - это разный фосфолипидный составнаружной и внутренней поверхности. Основныефосфолипиды, входящие в состав тромбоцитов,можно разделить на 2 группы: 1) не обладающиепрокоагулянтной активностью холиновые: фос-фатидилхолин (ФХ) и сфингомиелин (СФ), 2) об-ладающие прокоагулянтными свойствами кис-


лые: фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилэтано-ламин (ФЭ) и фосфатидилинозитол (ФИ). Фос-фолипиды первой группы распределены как нанаружней, так и на внутренней поверхности кле-точной мембраны неактивированных тромбо-цитов. Фосфолипиды второй группы в неакти-вированных тромбоцитах локализованы пре-имущественно на внутренней поверхности кле-точной мембраны. В процессе активации тром-боцита концентрация ФС, ФЭ и ФИ на наруж-ной поверхности значительно возрастает и об-разует прокоагулянтную поверхность, необхо-димую для фиксации, активации и взаимодей-ствия плазменных белков гемостаза. Крометого, это перераспределение меняет вязкостьклеточной мембраны, что тоже важно для про-текания гемостатических реакций. Кислыефосфолипиды мембраны тромбоцитов - ФС,ФИ и ФЭ называют фактором 3 тромбоцитов(ф.З, PF3), или тромбоцитарным тромбоплас-тином.

Помимо ПМТС, цитоскелет тромбоцитов об-разуют нити актина, спектрина и других протеи-нов, связанные с мембраной и пронизывающиетромбоцит во всех направлениях.

Функциями белков цитоскелета тромбоцитовявляются:• поддержание формы интактных тромбоци

тов;• изменение формы при активации тромбоци

тов;• «фиксация» плазматической части трансмем

бранных гликопротеидов;• передача сигнала от внутренних структур к

рецепторам;• участие в «направленном» внутритромбоци-

тарном движении органелл, белков;• передача внутриклеточных сигналов.

Рецепторы мембраны тромбоцитов

Специфические функции тромбоцитов в ге-мостазе требуют активного взаимодействия сдругими клетками, плазменными белками и не-белковыми веществами. Роль посредника меж-ду тромбоцитом и различными факторами внеш-ней среды, в том числе другими участникамипроцесса гемостаза, играют рецепторы тромбо-цитов.

На поверхности каждого тромбоцита распо-ложено значительное количество различных ре-цепторов. В самом тромбоците имеется сложнаясистема передачи и обработки сигналов, посту-пающих извне.

Большинство рецепторов являются гликопро-теинами (ГП), фиксированными на цитоплазмати-ческой мембране тромбоцита. Один конец моле-кулы рецепторных ГП находится во внеклеточ-ном пространстве, а другой «пронизывает» мем-брану и контактирует со структурами тромбоци-та, расположенными на внутренней стороне ци-топлазматической мембраны. На наружных час-тях ГП молекул располагаются рецепторные ло-кусы (рис. 19), специфичные для разных веществ(лигандов). Лиганды - вещества, которые могутспецифически взаимодействовать с рецептором,вызывать его конформационные изменения и та-ким образом модулировать функциональную ак-тивность тромбоцита.

Каждый рецептор имеет один или несколькофизиологических агонистов и может связывать ихс высокой или с низкой аффинностью.

В табл. 3 представлены данные об основныхрецепторах на поверхности тромбоцитов и ихагонистах.

Рис. 19. Поверхностные гликопротеиновые (GP) рецеп-торы тромбоцита. На наружных частях молекул гликопро-теинов располагаются рецепторные локусы. Молекула ре-цепторного гликопротеина «пронизывает» мембрану. Послесоединения рецепторных локусов с лигандами создаетсясигнал активации, передающийся к внутренним частямтромбоцитов


Рецепторы на тромбоцитарной мембранеТаблица 3

Мембранные рецепторы Агонисты (лиганды) Число рецепторовна 1 тромбоците

GPIb-V-IX Фактор Виллебранда, тромбин 50 000GPIIb-IIIa Фибриноген, фактор Виллебранда, фибрин,

фибронектин, витронектин, тромбоспондин50 000

GPIc-IIa Фибронектин, ламинин 1000VN-R Витронектин, тромбоспондин 100GPIa-IIa Коллаген 1000GPIIIb Тромбоспондин

Рецепторы длявысокомолеку-лярных белков

GPVI КоллагенP2-R АДФ Выc. афф. 600

Низ. афф. 60 000α2-adr-R Адреналин 3005-HT2-R Серотонин 50HrR ГистаминV,-R ВазопрессинThr-R (STDR) Тромбин 1700-2000

Рецепторы дляфизиологиче-ских стимуля-торов

TP-R Тромбоксан 1000-1700

Выс. афф. - высокоаффинные места связи, низ. афф. - низкоаффинные места связи.

Рецепторы для высокомолекулярных белков

Гликопротеиновый комплекс GPIb-V-IX тром-боцитов участвует в опосредованной факторомВиллебранда адгезии тромбоцитов к субэндотели-альным структурам и активации тромбоцитов.

Полипептидные цепи GPIba, GPIb(3, GPV,GPIX полностью расшифрованы по аминокис-лотной последовательности, известны их кодиру-ющие гены. Характерной особенностью комплек-са является включение в пептидные цепи 24 ами-нокислотных остатков с лейцином, которые на-ходятся в строго определенных местах. Эти бел-ки получили название богатых лейцином глико-протеинов (LRG - leucine rich glycoproteins).

Связывание фактора Виллебранда с GPIb-V-IX интактных тромбоцитов незначительно.Контакт молекулы фактора Виллебранда с субэн-дотелиальным слоем, особенно при воздействиивысокой скорости кровотока, приводит к конфор-мационным изменениям в молекуле, что значи-тельно повышает сродство фактора Виллебран-да к GPIb-V-IX.

Нефизиологическими стимуляторами процес-са взаимодействия фактора Виллебранда и GPIb-V-IX являются антибиотик ристомицин и проте-ин змеиного яда - ботроцетин. Ристомицин свя-

зывается с богатым пролином участком молеку-лы фактора Виллебранда и с одним или болеедоменами GPIb на тромбоцитах, а ботроцетин -только с фактором Виллебранда. Эти воздействияприводят к аналогичным физиологическим кон-формационным изменениям молекулы фактораВиллебранда и GPIb-V-IX и резко увеличиваютсродство между фактором Виллебранда и тром-боцитарной мембраной.

Тромбоцитарный GPIb-V-IX также являетсявысокоаффинным местом связывания тромбина.Взаимодействие GPIb-V-IX с фактором Вилле-бранда и тромбином приводит к активации тром-боцитов.

При врожденной недостаточности рецептор-ного комплекса не происходит связывания с фак-тором Виллебранда (vWF), что характерно дляболезни Бернара-Сулье.

Интегрины

Кроме богатых лейцином гликопротеинов, намембране тромбоцитов находится большое коли-чество адгезивных рецепторов, относящихся к се-мейству иншегринов. Интегрины - трансмембран-ные гликопротеины, характеризующиеся общно-


стью протеиновых цепей, антигенных свойств ифункции. Они принимают участие во взаимодействииклетки с клеткой и клетки с субэндотелиаль-нымматриксом. Благодаря способности образовыватьсвязи со многими белками интегрины участвуют впроцессах распознавания, адгезии, миграции клетокна матриксе, репаративных, иммунных и другихреакциях. К семейству интегринов относятсярецепторы к фибриногену, витронекти-ну,фибронектину, коллагену и другим белкам. Интегриныспособны распознавать характерную аминокислотнуюпоследовательность RGD (трипеп-тид Arg-Gly-Asp),имеющуюся в лигандах. Эта последовательностьприсутствует во всех адгезивных белках крови, белкахα-гранул тромбоцитов, фибриногене, фактореВиллебранда, фибронектине, витронектине, ламинине.Для соединения интегринов с лигандами типичназависимость от двухвалентных катионов Са2+ и Mg2+.

Комплекс GPIIb-IIIa является интегриновымрецептором тромбоцитов, который взаимодей-ствует в первую очередь с фибриногеном (фиб-риногеновый рецептор). Это взаимодействиеобеспечивает основной путь агрегации тромбоцитовдруг с другом через «фибриновые мостики». Приврожденном дефиците этого рецептора -тромбостении Гланцмана - резко нарушена или

отсутствует агрегация тромбоцитов с большинствоминдукторов агрегации, в том числе коллагеном,тромбином, АДФ. Агрегация тромбоцитов с этимииндукторами также отсутствует в плазме пациентовс афибриногенемией, если фибриноген отсутствуеттакже и в пулах хранения самих тромбоцитов.

Наличие в комплексе GPIIb-IIIa мест распоз-навания RGD объясняет способность этого ин-тегрина соединяться с фактором Виллебранда,фибронектином, витронектином. Показано, чтосвязь GPIIb-IIIa с фактором Виллебранда важна дляэффективной агрегации тромбоцитов в условияхвоздействия высоких скоростей кровотока.Ключевой особенностью комплекса GPIIb-IIIaявляется способность исполнять роль рецепторатолько на поверхности активированных тромбо-цитов. Аффинность этого комплекса на поверх-ности неактивированных клеток очень низкая, а егоантигенная характеристика отличается от таковойна активных тромбоцитах. Активациятромбоцитов приводит к значительному повышениюаффинности и изменению антигенной харак-теристики GPIIb-IIIa.

Активированные тромбоциты могут связыватьна своей поверхности более 40 000 молекулфибриногена посредством GPIIb-IIIa. Это взаимо-

Рис. 20. Тромбиновый рецептор тромбоцитарной мембраны, Схожее строение имеют рецепторы к АДФ, адреналину,серотонину, эйкозаноидам и другим низкомолекулярным соединениям. За счет нескольких петель рецептор имеет мно-гофункциональный характер. Внутриклеточный С-конец взаимодействует с цАМФ-зависимой протеинкиназой, гидрофильные петлирецептора активируют опосредуемые G-белками внутриклеточные функциональные перестройки. Со стороны N-конца тромбинвызывает частичный протеолиз и тем самым активирует рецептор


действие происходит в присутствии двухвалентныхкатионов (Са2+) и поначалу является обратимым.Далее, по мере образования дополнительных кон-тактов, происходит стабилизация агрегата.

У 25% жителей Северной Европы в связи с по-лиморфизмом аллелей в GPIIIa имеется ассоциацияВ развитием ишемической болезни сердца и инфар-кта миокарда в относительно молодом возрасте.

Использование ингибиторов для комплексаGPIIb-IIIa на ранних стадиях тромбоза приводитк быстрому восстановлению кровотока по тром-бированному сосуду и позволяет избежать инфар-кта тромбированного органа.

Рецепторы для физиологических стимуляторов

Рецепторы для физиологических стимулято-ров (тромбина, АДФ, адреналина, серотонина,

эйкозаноидов и др.) представляют собой транс-мембранные пептиды с 7 гидрофобными повто-рами, которые 7 раз пересекают плазматическуюмембрану (рис. 20). Между ними расположеныкрупные гидрофильные участки, обращенныенаружу и внутрь клетки. ЦитоплазматическийС-конец может фосфорилироваться протеинки-назами, прежде всего цАМФ-зависимой кина-зой. В цитоплазматических петлях находятсяместа связывания с системой G-белков, которыев качестве внутриклеточных посредников обес-печивают разнообразные физиологические реак-ции, в первую очередь освобождение внутрен-него пула Са2+. Каждый активированный тром-биновый рецептор приводит к образованию не-скольких внутриклеточных мессенджеров акти-вации тромбоцитов.

Органеллы тромбоцитов

В цитоплазме тромбоцитов расположенымитохондрии, пероксисомы (содержат катала-зу), включения гликогена, лизосомы и гранулы,содержащие пулы хранения различных веществ.В тромбоцитах выделяют 3 вида органелл хра-нения: а-гранулы, электронно-плотные тельца(8-гранулы) и лизосомы (у-гранулы). На рис. 21представлены основные компоненты, которыемогут освобождаться из гранул и цитозола тром-боцитов при действии разных стимуляторов.

В а-гранулах хранится до 30 различных бел-ков, большинство из которых были синтезирова-ны еще в мегакариоцитах: β-тромбоглобулин,фактор 4 тромбоцитов, фактор V, фактор Виллеб-ранда, фибриноген, тромбоспондин, фибронек-тин, витронектин, оц-макроглобулин, Р-селектин,фактор роста тромбоцитов (PDGF), ингибитор тка-невого активатора плазминогена типа 1 (PAI-1),α2-антиплазмин, α1-антитрипсин, протеин S,лейкоцитарный хемотаксический фактор, высо-комолекулярный кининоген и др. Участие бел-ков α-гранул в физиологических и патологичес-ких процессах многостороннее: а) митогенный ихемотаксический эффекты; б) адгезивное действие,модулирование агрегации тромбоцитов; в) учас-тие в пламенном гемостазе; г) вазоактивное дей-ствие; д) иммунные и другие эффекты.

В плотных тельцах (5-гранулы) хранятся суб-станции, вызывающие, прежде всего, сосудистыереакции и агрегацию тромбоцитов: адениловые

Рис. 21. Секретируемые факторы тромбоцитов присут-ствуют в тромбоцитах в 3 видах гранул хранения. Разныестимуляторы приводят к освобождению содержимого гра-нул тромбоцитов


нуклеотиды (АТФ, АДФ, АМФ, ц-АМФ, ГДФ),серотонин, адреналин, норадреналин, дофамин,гистамин, Са2+ и др. Высвобождающиеся из пулахранения АТФ и АДФ быстро метаболизируют-ся в плазме до АМФ и аденозина; последние об-ладают прямым коронарорасширяющим действи-ем. АДФ является важнейшим физиологическимметаболитом, обеспечивающим первичный гемо-стаз, стимулируя агрегацию тромбоцитов.

В лизосомах (γ-гранулы) находятся гидроли-тические ферменты - пероксидаза, глюкозидазы,галактозидаза или β-глицерофосфатаза, кислаяфосфатаза, неспецифическая эстераза. Лизосомысекретируют хранящийся в них секрет только принеобратимой активации.

Тромбоциты способны секретировать содер-жимое гранул как частично при обратимой ак-

тивации и в процессе трофических взаимодей-ствий с органной капиллярной сетью, так и пол-ностью при реакции освобождения, связанной снеобратимой активацией. После дегрануляциицитоплазма тромбоцитов «опустошена». В неак-тивированных тромбоцитах цитоплазма можетвыглядеть «опустошенной» при врожденном де-фекте заполнения гранул, приводящем к дефи-циту пула хранения - синдрому «серых» тромбо-цитов.

После секреции большинство гранулярныхмембран деградирует, гранулы не восстанавлива-ются, и тромбоциты теряют свою физиологичес-кую активность. Если они находятся в токе кро-ви, измененная форма способствует их быстройэлиминации в селезенке.

Тромбоцитарные факторы

Антигепариновый фактор тромбоцитов(фактор 4 тромбоцитов, ф.4, PF4)

PF4 является специфическим тромбоцитар-ным белком. PF4 синтезируется в мегакариоци-тах, хранится в α-гранулах, высвобождаетсяпосле стимуляции тромбоцитов агонистами аг-регации.

Физиологическая роль PF4:• Нейтрализация гепарина. Связывая с высо

ким сродством гепарин, PF4 препятствуетвзаимодействию гепарина с антитромбином.Следствием этого является повышение про-коагулянтного потенциала и усиление процесса образования тромбина.

• Хемотаксис нейтрофилов и моноцитов.• Активация фибробластов.• Проагрегантная функция.• Нейтрализация коллагеназы.

На С-конце PF4 находятся две пары лизино-вых остатков, которые важны для соединения фак-тора с гепарином и нейтрализации последнего.Один тетрамер PF4 может соединяться с 1 моле-кулой гепарина низкой молекулярной массы(<10 кДа) и с 2 и более молекулами гепарансуль-фатов высокой молекулярной массы. Конкурент-ное связывание гепарансульфатов с PF4 наруша-ет его взаимодействие с антитромбином, ингиби-

рует стимуляцию антитромбина PF4. Это ведет кснижению активности антитромбина и способ-ствует формированию тромба.

PF4 способен подавлять коллагеназу. Приврожденной недостаточности ос-гранул тромбо-цитов и мегакариоцитов - синдроме серых тром-боцитов - на поздних стадиях этого заболеванияпроисходит развитие фиброза. Это, вероятно, яв-ляется следствием избыточной активности кол-лагеназы.

b--тром6оглобулин b-ТГ,

b-TG - белок a-гранул тромбоцитов, обла-дает выраженной хемотаксическои активностьюпо отношению к лейкоцитам. Его освобождениеиз тромбоцитов опосредовано циклооксигеназ-ной реакцией и происходит до секреции другихбелков.

После активации тромбоцитов освобождениеиз них β-TG и PF4 происходит в эквимолярныхконцентрациях. Однако PF4 быстро элиминиру-ется из плазмы, связываясь с гликозаминоглика-нами, а β-TG относительно долго циркулирует,выделяясь через почки. Поэтому уровень в плаз-ме β-TG в 3-6 раз выше, чем PF4. Влияние быс-трой элиминации PF4 сохраняется и в патоло-гических ситуациях, когда наблюдается значи-


гельное повышение β-TG и увеличение отноше-ния b-TG/PF4 (табл. 4).

Таблица 4Содержание β-тромбоглобулина и фактора 4

тромбоцитов в плазме при патологии

Здесь и далее: Н - норма, t - увеличено, Tt - значи-тельно увеличено, I - снижено.

У больных с тромбоцитопенией итромбоцитозом необходимо рассматриватьуровень b-TG и PF4 с учетом количествациркулирующих тромбоцитов. По отношению кчислу тромбоцитов концентрациятромбоцитарных факторов в плазме повышенапри ДВС-синдроме и при тромбо-тическойтромбоцитопенической пурпуре, хотяабсолютные значения этих показателей могутбыть в пределах нормальных значений.

Фактор роста тромбоцитов (PDGF)

PDGF синтезируется мегакариоцитами, втромбоцитах содержится в α-гранулах. Каждаяклетка содержит порядка 1000 молекул PDGF.Фактор является сильным стимулятором репара-ции поврежденных тканей.

В сосудистой стенке рецепторы к PDGF при-сутствуют на фибробластах и гладких мышечныхклетках; PDGF стимулирует пролиферацию этихклеток, а также усиливает продукцию гликозами-ногликанов, коллагена и других элементов соеди-нительной ткани. В настоящее время установлено,что рецепторы к PDGF имеются в клетках лимфо-идной (Т-лимфоциты) и миелоидной линии.

Нарушение хранения PDGF в мегакариоци-тах костного мозга может быть причиной разви-тия фиброза, в том числе сопровождающего мие-лопролиферативные заболевания. Некоторыеопухолевые клеточные линии могут продуциро-вать PDGF, в частности остеосаркома, гепатома,некоторые карциномы, опухоли костного мозга.b-цепь PDGF имеет характерные черты для ос-новной структуры вируса саркомы. В связи с этимPDGF является важной составляющей сложныхвлияний тромбоцитов на онкогенез.

Фибриноген

Фибриноген α-гранул тромбоцитов составля-ет примерно 3% от плазменного пула, однако рольего в агрегации тромбоцитов, по-видимому, со-поставима со значением плазменного фибрино-гена. Тромбоциты получают фибриноген из ме-гакариоцитов, которые, в свою очередь, захваты-вают плазменный фибриноген, синтезированныйгепатоцитами, или синтезируют определенноеколичество фибриногена de novo. Поэтому дажеотмытые тромбоциты образуют агрегаты, вклю-чающие молекулы фибриногена. У больных с се-мейной афибриногенемией основным источни-ком фибриногена являются тромбоциты.

Фактор V

Фактор V α-гранул тромбоцитов -коагуляционный белок, синтезируемый вмегакариоцитах. Иммунологически фактор Vтромбоцитов схож с фактором V плазмы,формирующим с фактором X протромбиназныйкомплекс. На долю фактора V тромбоцитовприходится 18-25% этого белка крови человека,однако его влияние на формированиепротромбиназного комплекса весьмасущественно. Описан врожденный гемор-рагический диатез, при котором единственнымнарушением было наличие неактивной формытромбоцитарного фактора V. Введение протром-биназного комплекса, сформированного из плаз-менных факторов, не корригировало геморраги-ческих проявлений.

Фактор XIIIФактор XIII - трансглютаминаза, участву-

ющая в стабилизации фибринового сгустка и


формировании соединительной ткани. Все коли-чество ф.ХШ распределяется примерно поров-ну между плазмой и тромбоцитами. Большаячасть тромбоцитарного пула находится в цитоп-

лазме клеток. Тромбоцитарный ф.ХШ синтези-руется мегакариоцитами, плазменный пул - тка-невыми макрофагами печени и гемопоэтическихтканей.

Функция тромбоцитов

Основными функциями тромбоцитов являются:• формирование первичной тромбоцитарной

пробки в зоне повреждения сосуда за счет адгезии и последующей агрегации;

• катализ гуморальных реакций гемостаза засчет:а) предоставления фосфолипидной поверх

ности (фактор 3 тромбоцитов или тром-боцитарный тромбопластин), необходимой для взаимодействия большинстваплазменных белков гемостаза;

б) выброса прокоагулянтов из пулов хранения;

• ретракция сгустка крови;

• стимуляция локальной вазоконстрикции, репарации тканей, регулирование местной воспалительной реакции за счет высвобождениясоответствующих медиаторов из пулов хранения тромбоцитов.Формирование первичной тромбоцитарной

пробки в зоне повреждения сосудов возникаетвследствие процесса, который можно условноразделить на 3 стадии:• 1 - адгезия тромбоцитов к субэндотелиаль-

ным структурам;• 2 - активация этих тромбоцитов с выбросом

медиаторов из гранул хранения;• 3 - агрегация тромбоцитов.

Адгезия тромбоцитов

На рис. 22 показаны адгезированные тром-боциты на участке деэндотелизации. Через не-сколько минут после повреждения сосудистойстенки формируется сплошной слой адгезиро-ванных и агрегированных тромбоцитов, кото-рые являются основой тромбоцитарного тром-ба (рис. 23).

В процессе адгезии важную роль играют 2 ме-ханизма. Один из них - непосредственная адге-зия тромбоцитов через рецепторы GPIa-IIa иGPVI к коллагену субэндотелия. Однако это вза-имодействие недостаточно для удержания тром-боцитов в местах воздействия высоких скоростейкровотока - артериях и артериолах. Другой ме-

Рис. 22. Адгезированные тромбоциты на поврежденной(деэндотелизированной) сосудистой стенке

Рис. 23. Тромбоцитарный тромб, сформированный наповрежденной сосудистой стенке


ханизм, эффективно удерживающий тромбоцитыпри высокой скорости кровотока, включает ад-гезию тромбоцитов, опосредованную молекула-

ми адгезии - фактором Виллебранда, фибронек-тином, витронектином, ламинином, тромбоспон-дином и др. In vivo оба эти механизма работаютпараллельно. Возможно, что первичный контакттромбоцитов с субэндотелием осуществляетсяблагодаря первому механизму, тогда как окон-

чательная фиксация тромбоцитов происходит засчет формирования связей субэндотелий - фак-тор Виллебранда - GPIb-V-IX и связей, опосре-

дованных другими молекулами адгезии.

Молекулы адгезии

Фактор Виллебранда (vWF) - один из самыхбольших гликопротеидов плазмы, имеет молеку-лярную массу от 540 до нескольких тысяч кДа,содержит в цепочке более 2000 аминокислот.

Ген фактора Виллебранда находится на корот-ком плече 12-й хромосомы. Синтез фактора Вил-лебранда происходит в эндотелиоцитах и мегака-риоцитах. Фактор Виллебранда из эндотелиоци-гов секретируется или в плазму, или в субэндоте-лиальное пространство; кроме того, он может со-держаться в тельцах Вейбла-Палада эндотелиоци-тов (пулы хранения) и секретироваться после сти-муляции эндотелиальных клеток. Фактор Вилле-бранда, синтезированный мегакариоцитами, со-держится в альфа-гранулах тромбоцитов.

Информация о синтезе фактора Виллебран-да получена в основном при изучении его в куль-турах эндотелиальных клеток. Первичный про-дукт синтеза, обозначаемый как пpe-пpo-vWF,найден в эндотелии и тромбоцитах, он иммуно-логически отличается от зрелого фактора Вилле-бранда. Его уровень снижен у пациентов с болез-нью Виллебранда.

Пре-про-vWF содержит 2813 аминокислот-ных остатков. В эндоплазматическом ретикулу-ме после гликозилирования npe-npo-vWF преоб-разуется в пpo-vWF, который превращается в зре-лый vWF после отщепления пептида, состоящегоиз 741 аминокислотного остатка. Этот полипеп-тид идентифицируется как антиген II vWF(vWF:AgII).

Процесс димеризации и полимеризации vWFпроисходит одновременно. Зрелая субъединица

vWF содержит 2050 аминокислотных остатков,169 из которых - цистеин, сгруппированный вобластях, расположенных в амино- и карбокси-концах молекулы (N- и С-концы). Процесс диме-ризации связан с образованием дисульфидныхмостиков между С-концами молекулы, а дальней-шая полимеризация происходит за счет образо-вания дисульфидных связей между N-концами.Конечный продукт накапливается в тельцах Вей-бла-Палада в эндотелиоцитах и в α-гранулахтромбоцитов.

Фактор Виллебранда состоит из ряда полиме-ров прогрессивно увеличивающейся молекулярноймассы: разделяют легкие, средние, тяжелые и сверх-тяжелые мультимеры. Молекулярная масса vWFварьирует от 540 кДа у димеров до 20 тысяч кДа усамых крупных мультимеров, содержащих от 50до 100 субъединиц. Самым большим тромбоген-ным потенциалом обладают молекулы vWF с наи-большей молекулярной массой.

В плазме нет мономеров фактора Виллебран-да, он всегда образует комплексы. КонцентрацияvWF в плазме составляет примерно 10 мкг/мл.

При исследовании vWF, содержащегося впулах хранения, было выявлено, что его молеку-лярная масса, а следовательно, и тромбогенныйпотенциал существенно выше, чем у vWF, содер-жащегося в плазме, и наиболее высок в а-грану-лах тромбоцитов (так называемый сверхвысоко-молекулярный фактор Виллебранда). После силь-ной стимуляции тромбоцитов и эндотелиоцитовсверхвысокомолекулярный фактор Виллебранданекоторое время обнаруживается в плазме. Од-нако потом в сосудистом русле молекулярнаямасса vWF довольно быстро снижается до «нор-мальной» под воздействием кальпаиновых про-теаз плазмы. Такое распределение позволяет со-здавать высокий тромбогенный потенциал в ме-стах повреждения эндотелия при выбросе vWF изпулов хранения, в то же время сохраняя тромбо-генный потенциал на «обычном» уровне в интак-тном сосудистом русле.

Фактор Виллебранда имеет два пути секре-ции: непосредственная секреция после синтеза иполимеризации, которая создает определенныйуровень vWF в крови, и регуляторная секрецияиз пулов хранения в ответ на различную стиму-ляцию. Фоновая активность vWF в крови у каж-дого человека может меняться в значительных


пределах. Реализация vWF из тромбоцитарныхгранул возникает при активации тромбоцитовпод воздействием различных физиологических инефизиологических индукторов (АДФ, коллаген,адреналин, вазопрессин, серотонин, тромбин,простагландин Е1, тромбоксан А2 и др.), и в томчисле плазменного vWF. Уровень vWF в кровивозрастает при воспалении различного генеза,повреждении эндотелия сосудов при васкулитах,стрессе, у женщин во время беременности. По-вышение активности vWF в патологических си-туациях может способствовать развитию тром-бозов.

Вторичные изменения структуры vWF и егоактивности являются следствием иммунных про-цессов, тромботической тромбоцитопеническойпурпуры, гемолитико-уремического синдрома идр. Описаны заболевания (болезнь Виллебран-да, тип Виченза; врожденная тромботическаятромбоцитопеническая пурпура), при которыхдефект этих ферментов приводит к накоплениюсверхвысокомолекулярных мультимеров vWF ипреждевременной секвестрации тромбоцитов изкровотока.

Основными функциями фактора Виллебрандаявляются:• опосредование адгезии тромбоцитов к субэн-

дотелиальным структурам, в первую очередьк коллагену, и последующей агрегации тромбоцитов (участие в первичном сосудисто-тромбоцитарном гемостазе);

• связывание свободного фактора VIII и защита его молекулы от преждевременной инактивации (участие во вторичном плазменномгемостазе).Опосредование адгезии и агрегации тромбоци-

тов. Роль фактора Виллебранда в адгезии и агре-гации тромбоцитов наиболее велика в условияхвоздействия высоких скоростей кровотока. Мо-лекулы vWF специфически связываются с рецеп-торами тромбоцитов GPIb-V-IX и коллагеном су-бэндотелия. Это обеспечивает прочную фикса-цию тромбоцитов к субэндотелиальным структу-рам в тех участках сосудистого русла, где силапотока крови существенно мешает формирова-нию гемостатической пробки и другие механиз-мы адгезии не могут обеспечить надежной фик-сации тромбоцитов. В частности, известно, чтоvWF является ключевым при формировании

тромба в мелких артериях, артериолах и артери-альных капиллярах. В местах, где интенсивностькровотока невелика, роль vWF уменьшается, пре-обладающим становится взаимодействие, опос-редованное другими молекулами, в том числепрямая адгезия тромбоцитов к коллагену посред-ством GPIa-IIa.

Агрегация тромбоцитов в условиях воздей-ствия активного тока крови тоже происходит с уча-стием фактора Виллебранда. Помимо GPIb-V-IX,с фактором Виллебранда также связывается GPIIb-IIIа. Возможно, что это взаимодействие являетсяключевым в процессе агрегации в местах сосудис-того русла с высокой скоростью тока крови.

Тест агрегации, опосредованный факторомВиллебранда, в лабораторных условиях можетбыть выполнен с использованием фиксированныхтромбоцитов. Видимо, эта реакция не требуетэнергетических затрат. Однако стимуляция рецеп-тора Ib-V-IX приводит к активации тромбоцита.

Учитывая особенности фактора Виллебран-да, можно сказать, что он выполняет функцию«биологического клея», фиксируя тромбоциты наповрежденной сосудистой стенке (рис. 24).

Другая функция фактора Виллебранда - за-щита ф.VIII от протеолитической деградации си-стемой протеин С - протеин S. В плазме vWF яв-ляется белком-носителем фактора VIII.

Рис. 24. Фактор Виллебранда (vWF) выполняет роль «био-логического клея», прикрепляя к коллагену субэндотелияадгезированные тромбоциты через гликопротеиновый ком-плекс GPIb-V-IX, Тромб увеличивается в размерах по мереадгезии и агрегации новых тромбоцитов, скрепление кото-рых в агрегат обеспечивает фибриноген, имеющий дива-лентную структуру и взаимодействующий с рецепторамиGPIIb-llla


Молярная концентрация vWF примерно в50 раз выше, чем молярная концентрация фак-тора VIII. Фактор VIII практически весь связанс vWF (рис. 25). Это предупреждает быструю дег-радацию ф.VШ под влиянием протеина С. Свя-занный с vWF фактор VIII защищен от протео-литической инактивации в плазме, поскольку унего заблокированы сайты связывания с фос-фолипидной матрицей и заблокированы сайтысвязывания с протеином С. Поэтому недостатокvWF часто вызывает вторичный дефицит ф.VIII.

В области повреждения сосуда, в процессеvWF-опосредованной адгезии тромбоцитов про-исходит контакт комплекса vWF-ф.VIII и тром-бина (ф.Па), который активирует ф.III, освобож-дая его из комплекса с фактором Виллебранда.

Фибронектин (плазматический, субэндоте-лиальный и тромбоцитарный) - гранулярныйконтактный белок, который способен образовы-вать комплексы с GPIc-Па-рецепторами тромбо-цитов и коллагеном. Сродство фибронектина кколлагену и тромбоцитам меньше, чем у фак-тора Виллебранда, однако молекулярная кон-центрация его выше. Видимо, фибронектин яв-ляется основной молекулой адгезии в венознойи капиллярной сети, образуя ось: тромбоцитар-ный рецептор GPIc-IIa - фибронектин - колла-ген. Гликопротеиновый комплекс GPIc-IIa рас-познает в фибронектине RGD последователь-ность и осуществляет рецепторную функциюкак в интактных, так и в активированных тром-боцитах. Характерная аминокислотная последо-вательность RGD - трипептид Arg-Gly-Asp име-ется во всех адгезивных белках крови, белкаха-гранул тромбоцитов, фибриногене, фактореВиллебранда, фибронектине, витронектине идругих белках. Наличие RGD-последовательно-сти на фибронектине определяет зависимостьпроцесса его взаимодействия со своим рецеп-тором на тромбоцитах от двухвалентных катио-нов Са2+ и Mg2+.

Витронектин - гликопротеин плазмы, суб-эндотелия и а-гранул тромбоцитов. Имеет зна-чение в гемостатических реакциях и в восста-новлении поврежденных тканей сосудистойстенки. Витронектин, как и другие адгезивныебелки, содержит трипептид RGD, распознаю-щийся интегриновыми рецепторами эндотели-альных клеток и тромбоцитов. Витронектино-

Рис. 25. Комплекс фактор VIII - фактор Виллебранда(ф.Vlll—vWF) состоит из 2 отдельных белков, которые выполняютв гемостазе разные функции, имеют разную химическуюи иммунологическую структуру. Фактор VIII необходимдля активации фактора X в каскаде свертывания крови,его дефицит вызывает гемофилию А. Фактор Вилле-бранда (vWF) - полимерный белок, который составляет ос-новную массу комплекса. Он необходим для адгезии тром-боцитов к поврежденной стенке сосудов, обеспечивая вза-имодействие коллагена с гликопротеиновым комплексомтромбоцитов GPIb-V-IX. Кроме того, он участвует в агрега-ции тромбоцитов, взаимодействуя с интегринами GPIIb-llla.Недостаток vWF приводит к болезни Виллебранда


вый рецептор на тромбоцитах функционируетпостоянно, что отличает его от рецептора фиб-риногена, который работает только на активи-рованных клетках. У витронектинового рецеп-тора р-цепь аналогична фибриногеновому ре-цептору (GPIIIa), но а-цепь специфична. Принекоторых формах тромбостении Гланцмана натромбоцитах экспонируется нормальное коли-чество витронектиновых рецепторов, что до-казывает, что у этих больных имеет место де-фект синтеза а-цепи фибриногенового рецеп-тора, т. е. GPIIb.

Ламинин - один из главных компонентов эк-страцеллюлярного матрикса стенки сосудов,плотный субстрат, вызывает адгезию тромбоци-тов. Из-за низкой аффинности между этим бел-ком и рецептором тромбоцитов он лишь содей-ствует адгезивному процессу, причем только принизких скоростях кровотока.

Тромбоспондин - гликопротеин, принимаю-щий участие в адгезии и агрегации тромбоцитов.Он широко распространен в тканях, содержитсяв α-гранулах тромбоцитов и в небольшом коли-честве в плазме крови. На поверхности интакт-ных тромбоцитов очень мало тромбоспондина,но после их активации количество экспонирован-ного на мембране тромбоцитов тромбоспондинарезко увеличивается.

Одна из функций тромбоспондина - стабили-зация комплекса фибриноген-GPIIb-IIIa в процес-се агрегации тромбоцитов. Тромбоспондин увели-

чивает его прочность и переводит агрегацию тром-боцитов из обратимой в необратимую (рис. 26).

Помимо этого, тромбоспондин связываетсяс рядом коагуляционных факторов (тромбином,факторами IХа, Ха), что приводит к повышениюих локальной концентрации и защищает от дей-ствия ингибиторов.

Активация тромбоцитовПри контакте рецепторов адгезии тромбо-

цитов с субстратом и под воздействием синтези-рованного в области повреждения сосуда тром-бина начинается процесс активации тромбоци-тов. Видимо, основную роль в первичной акти-вации тромбоцитов играет сигнал с рецепторовGPIa-IIa, GPIb-V-IX и GPVI, которые контак-тируют со своими агонистами, в первую очередьс коллагеном, фактором Виллебранда и тромби-ном. Помимо коллагена, свойством активиро-вать тромбоциты обладают и другие субэндоте-лиальные структуры.

Активация тромбоцитов лежит в основе вы-полнения ими своих функций. В табл. 5 приведенсписок основных веществ, активирующих тром-боциты. Почти все эти вещества взаимодейству-ют с тромбоцитами через специфические рецеп-торы, которые были описаны выше. Несмотря намногообразие активаторов и большое количестворецепторов к ним, клетка имеет ограниченное ко-личество путей передачи сигнала и эффекторных

Рис. 26. Взаимодействие рецепторов к фибриногену и тромбоспондину с соответствующими лигандами. Привзаимодействии тромбоцитов с фибриногеном на первой фазе происходит их обратимая активация, При стабилизациикомплекса тромбоспондином процесс переходит в необратимую стадию агрегации


Субстанции, стимулирующие тромбоцитыТаблица 5

Данные приведены по: Kinlough-Rathbone R.L.D.E. MacJntyre, J.L. Gordon. Amsterdam, 1987.

Mustard J.F. // Platelets in biology and pathology, III / Eds

механизмов. Реакция тромбоцита на активирую-щие воздействия однотипна:• Тромбоцит меняет форму (рис. 27): у него по

являются псевдоподии, он «распластывается»,за счет открытой канальцевой системы (ОКС)увеличивается площадь его поверхности.

• Меняются соотношения различных фосфоли-пидов между наружным и внутренним листками клеточной мембраны. Это приводит кпоявлению на наружной поверхности тромбоцита большого количества кислых фосфо-липидов с прокоагулянтными свойствами -фактор 3 тромбоцитов (PF3).

• На мембране тромбоцитов экспрессируютсяили повышают аффинность интегрины.

• Происходит секреция содержимого пуловхранения тромбоцитов во внешнюю среду.

• Тромбоциты фиксируются на поверхностях(субэндотелиальном матриксе и др.) и (или)соединяются друг с другом и другими клетками крови (происходит адгезия и агрегация).Активация тромбоцитов может быть обратимой: происходят лишь частичные конформацион-ные изменения, обратимое соединение с другимиклетками и частичная секреция гранул. Спустянебольшое время тромбоцит возвращается в ин-тактное состояние и поступает в ток крови. После обратимой активации и возвращения в неак-

тивное состояние тромбоцит снова может акти-вироваться и вступать во взаимодействие с дру-гими клетками и структурами. Обратимая агре-гация возникает при кратковременном воздей-ствии слабого стимула.

Если стимуляция длительная или сильная, про-исходит необратимая активация тромбоцита. В этомслучае тромбоцит прочно фиксируется к другимклеткам или внеклеточным структурам, происхо-дит полная дегрануляция и секреция содержимогопулов хранения. Если тромбоцит после необрати-мой активации поступает в ток крови, он не можетв дальнейшем вступать во взаимодействие с други-ми клетками и быстро элиминируется из кровооб-ращения. В случае массивного поступления в токкрови необратимо активированных тромбоцитоввыявляется достоверное снижение агрегации тром-боцитов со всеми индукторами. Микроскопия вэтом случае позволяет выявить большое количестводеформированных тромбоцитов.

Стимуляторы тромбоцитов можно разделитьна слабые и сильные.

К слабым стимуляторам относятся АДФ, ад-реналин, вазопрессин, серотонин. Передача сиг-нала от рецепторов этих веществ проходит ста-дию усиления внутри клетки через дополнитель-ный этап образования продуктов тромбоксано-вого завершения и секреции хранимых в грану-

Рис. 27. Стадии контактной активации тромбоцитов: А - неактивный тромбоцит (дискоцит, пластинка); Б - тромбоцитыв обратимой стадии контактной активации (шаровидные формы с псевдоподиями); В - тромбоцит в необратимой стадииадгезии (распластанная форма без внутреннего содержимого - «тень тромбоцита»)

лах активных компонентов. При исследованииагрегации тромбоцитов в присутствии слабыхстимуляторов на агрегатограммах кривая имеетдвухступенчатую форму, что обусловлено усиле-нием агрегации после выделения содержимогопулов хранения (рис. 28).

Сильные стимуляторы тромбоцитов - колла-ген, тромбин, большие дозы АДФ - непосред-ственно после мембранной стимуляции приводятк необратимой активации.

В табл. 5 представлены наиболее важные ак-тиваторы тромбоцитов. Часть из них присутству-ет в подпороговых концентрациях в интактнойплазме и избирательно накапливается в зоне по-вреждения сосудов; другие появляются в системециркуляции при активации системы свертываниякрови в физиологических или патологических ус-ловиях. Некоторые факторы выделяются из са-мих тромбоцитов (АДФ, серотонин, адреналино-подобные субстанции, фактор Виллебранда).

Рис. 28. Типы агрегатограмм. V пациентов при стимуля-ции агрегации адреналином в дозе 10 мкмоль/л в 83% слу-чаев наблюдается двухфазная агрегация тромбоцитов, в13% случаев - необратимая агрегация и в 4% - посленачальной агрегации наблюдается дезагрегация (соб-ственные данные)

Агрегация тромбоцитов

Процесс агрегации заключается в присоедине-нии активированных тромбоцитов, находящих-ся в токе крови, друг к другу и ранее фиксиро-ванным в области повреждения. Основным ре-цептором агрегации является GPIIb-IIIa (интег-рин αIIbβ3). После активации тромбоцита GPIIb-IIIaзначительно повышает свою аффинность по от-ношению к фибрину и меняет антигенную струк-туру (что свидетельствует о значительных кон-

формационных изменениях). После этого проис-ходит соединение тромбоцитов, опосредованноефибрином и фактором Виллебранда (рис. 24).

Вследствие распространения активирующегосигнала на агрегированные тромбоциты, удален-ные от места повреждения, образуется толстыйслой тромбоцитов, армированный фибрином.Этот процесс лежит в основе образования тром-боцитарного тромба. По мере удаления от зоны


повреждения концентрация агонистов активациии агрегации тромбоцитов снижается и соответ-ственно уменьшается активация тромбоцитов.Дистально расположенные частично активиро-ванные тромбоциты отрываются от сгустка и воз-вращаются в кровоток. Таким образом, перифе-рическая дезагрегация тромбоцитов предотвра-щает неограниченный рост сгустка.

Ретракция сгустка крови

Ретракцией сгустка крови называют уплот-нение сгустка с выделением из него избытка сы-воротки. Ретракция способствует улучшению ме-ханических характеристик сгустка и снижению ак-

тивности фибринолиза внутри него. Ретракциясгустка связана с контрактильными свойствамитромбоцитов. Фибриллы миозина, расположен-ные в цитоплазме тромбоцитов, фиксированы кмембранному гликопротеину GPIIb-IIIa. В акти-вированных тромбоцитах за счет миозина про-исходит процесс постепенного «сжимания» ци-топлазмы, что приводит к уплотнению всего сгу-стка крови.

При врожденной недостаточности GPIIb-IIIa -тромбастении Гланцмана - грубо нарушается рет-ракция сгустка крови. Следствием этого являет-ся не только грубый дефект тромбоцитарного ге-мостаза, но и качественный дефект образовавше-гося сгустка крови.

Роль лейкоцитов в гемостазе

РОЛЬ ЛЕЙКОЦИТОВ В ГЕМОСТАЗЕ

Лейкоциты (нейтрофилы и моноциты) в зоне повреждения сосуда участвуют в гемостатическихреакциях.

Участие нейтрофилов в пристеночном тромбообразовании

Агрегация тромбоцитов сопровождается осво-бождением из α-гранул активаторного рецептораР-селектина (CD62), который остается ассоцииро-ванным с плазматической мембраной тромбоци-тов. Экспрессия на мембране лейкоцитов Р-селек-тин-связывающего гликопротеина-1 (PSGL-1) по-зволяет нейтрофилам присоединять тромбоциты(рис. 29). Связь нейтрофилов с тромбоцитами обес-печивает репаративные и воспалительные реакции,возникающие в ответ на повреждение.

Нейтрофилы после связывания на мембра-нах способны секретировать адгезивные моле-кулы и интерлейкины. Некоторые из интерлей-кинов, в частности интерлейкин-1 (ИЛ-1) и фак-тор некроза опухоли-ос (ФНО-а), активируютэндотелиальные клетки. Первичный контактгранулоцитов приводит к перемещению ихвдоль сосудистой стенки с последующей транс-эндотелиальной миграцией в субэндотелий. Придействии повреждающих факторов, таких, какиммунные комплексы, эндотоксин, гранулоци-

ты могут дегранулироваться и освобождатьИЛ-1, ФНО-α, протеолитические ферменты,такие, как эластаза и катепсин, активные фор-мы кислорода (О2

-, О2+), что в свою очередь ве-

дет к повреждению сосудистой стенки. Этотпроцесс доминирует при воспалительных реак-циях. Протеолитические ферменты, которые ос-вобождаются из лейкоцитов, в участках воспа-ления вызывают нарушения структуры и функ-ции эндотелия, это является условием развитияпетехий.

Роль нейтрофилов в модуляции реакций ге-мостаза требует уточнения. С одной стороны,экспрессия тканевого фактора на мембраненейтрофилов происходит либо при длительнойстимуляции различными провоспалительнымицитокинами, либо после длительного взаимодей-ствия с Р-селектином активированных тромбо-цитов. К этому времени на активированных тром-боцитах уже образуется сгусток крови. С дру-гой стороны, экспериментально доказано моду-

Рис. 29. Участие активных нейтрофилов в повреждении сосудистого эндотелия


лирующее воздействие лейкоцитов крови нафункцию тромбоцитов при исследовании аг-регации тромбоцитов в цельной крови. Крометого, исследования показали возможность

сборки на нейтрофилах протромбиназногокомплекса.

В последнее время описан феномен агрега-ции лейкоцитов (нейтрофилов) при ишемиитканей. Этот феномен особенно значим для по-вреждения легких при шоке. В развитии гемор-рагического шока он играет ведущую роль. Нарис. 30 представлен агрегат из нейтрофилов,сформированный на поверхности сосудистойстенки.

Рис. 30. Агрегат из нейтрофилов, выделенный из сосу-дов легких, в которых формируются агрегаты при развитииреспираторного дистресс-синдрома (РДС). Сканирующаяэлектронная микроскопия

Участие моноцитов в свертывании крови

Уникальными свойствами обладают моноци-ты. Это единственные клетки, способные созда-вать на своей поверхности условия для сборки иуспешного функционирования всех ферментатив-ных комплексов системы свертывания крови.Стимулированные моноциты экспрессируют око-ло 16 000 сайтов связывания протромбиназногокомплекса. Эффективность синтеза тромбина наих поверхности сопоставима с эффективностьюсинтеза тромбина на поверхности активирован-ных тромбоцитов.

Синтез и экспрессия тканевого фактора, эф-фективно связывающего ф.VIIа, происходит намоноцитах под воздействием различных физио-логических и патологических стимулов, в томчисле бактериальных липополисахаридов, факто-ра некроза опухоли, интерлейкина-1, С-реактив-ного белка, иммунных комплексов. Сборка теназ-ного комплекса на моноцитарной мембране -ключевой момент в развитии процесса коагуля-ции. Комплекс тканевой фактор - ф.VIIа подав-ляется ингибитором пути тканевого фактора (ин-гибитором внутреннего пути - ИВП), также син-тезируемым и экспрессируемым моноцитами.

Реакции свертывания крови, протекающие намоноцитарной мембране, усиливаются специфи-ческими для моноцитов механизмами. Фиксиро-ванные на поверхности моноцитов эластаза и ка-тепсин G активируют ф.V до ф.Vа, поэтому ф.Vне поступает в кровоток, а остается тут же на мем-бране моноцитов и формирует протромбиназный

комплекс с ф.Ха. Причем этот комплекс защищенот протеолиза активированным протеином С(АПС), поэтому активность протромбиназы намоноцитарной мембране длительно сохраняетсяна высоком уровне. Помимо ф.Vа, катепсин Gактивирует ф.Х. В отличие от катепсина G дей-ствие эластазы дозозависимо. В малых концент-рациях она активирует ф.V, а в больших - рас-щепляет ф.Vа. Эластаза, видимо, не обладает спо-собностью инактивировать ф.Ха. Однако воздей-ствие ее высоких концентраций на ф.Х изменяетпоследний так, что его в дальнейшем невозмож-но активировать.

Другим альтернативным путем, специфич-ным для моноцитов, является активация ф.Х пос-ле его соединения с мембранным рецепторомМас-1 (CDllb/CD18). Связавшись с Мас-1, ф.Хачастично активирует моноциты и вызывает экс-прессию специфического моноцитарного рецеп-тора EPR-1. Комплекс ф.Ха-EPR-l способен эф-фективно активировать протромбин в присут-ствии Са2+ без участия ф.Уа. Таким образом, наповерхности моноцита может собираться полно-ценный протромбиназный комплекс.

Прокоагулянтная активность моноцитов зави-сит от их микроокружения. Коллагены I и IV ти-пов, фибронектин - активные субстраты для ад-гезии моноцитов в отличие от ламинина. Послед-ний адгезирует моноциты в 6-10 раз хуже. Од-нако именно на моноцитах, адгезированных кламинину, процессы коагуляции развиваются


в 3-5 раз быстрее, чем на мембранах моноцитов,адгезировавшихся на других субстратах.

Помимо катализа гуморальных реакцийсвертывания крови, моноциты обладают про-агрегантной активностью. Катепсин G облада-ет свойством вызывать агрегацию тромбоци-тов, изменение их формы, мобилизацию каль-ция, экзоцитоз α-гранул и плотных гранул, уси-

ление адгезии тромбоцитов к лейкоцитам.Часть этих реакций катализируется моноцитар-ной эластазой.

В отличие от моноцитов нейтрофилы и лим-фоциты не экспрессируют PAR-1, однако иссле-дования показали, что на изолированных попу-ляциях этих клеток происходит сборка протром-биназных комплексов.

К А Ф Е Д Р Аклд

ЦИКЛЫ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯКАФЕДРЫ КЛИНИЧЕСКОЙ

ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИРМАПО (Москва)

1. Клиническая лабораторная диагностика (врачи и биологи, стажировка,профессиональная переподготовка, общее усовершенствование)

Очное, ПП В течение4 месяцев

2. Лабораторная цитология (цитологи) Очное СУ, выездной Месячный3. Контроль качества лабораторных исследований

(зав. КДЛ и врачи клинич. лаб. диагностики)Очное ТУ 2 недели

4. Клинико-лабораторное исследование эякулята(зав. КДЛ и врачи клинич. лаб. диагностики)

Очное ТУ 2 недели

5. Методы исследования системы гемостаза(зав. КДЛ и врачи клинич. лаб. диагностики)


6. Лабораторная диагностика урогенитальных инфекций(врачи клинич. лаб. диагностики)


7. Иммуноферментный анализ в КДЛ (зав. КДЛи врачи клинич. лаб. диагностики)


8. Изоиммунологические методы исследований(врачи станций переливания крови)

Очное ОУ Месячный

9. Клиническая лабораторная диагностика. Гематолог, и общеклинич. иссле-дования (зав. КДЛ и врачи клинич. лаб. диагностики)

Очное ОУ Месячный

10. ПЦР в КДЛ (врачи и биологи клинич. лаб. диагностики) Очное ТУ 2 недели11. Определение алкоголя в биологических жидкостях Очное ТУ 2 недели12. Лабораторная диагностика лимфопролиферативных заболеваний Очное ТУ 2 недели

Все циклы длительностью 1 месяц и более дают право сдавать сертификационный экзамен. Поокончании более коротких циклов выдаются свидетельства о повышении квалификации государ-ственного образца.

Заявки для участия в циклах усовершенствования принимаются:• по почте: 125424, Москва, а/я 32 (кафедра КЛД)• по факсу (095) 945-84-00 или телефону (095) 945-82-22• по электронной почте: [email protected]

Плазменные белки гемостаза

ПЛАЗМЕННЫЕ БЕЛКИ ГЕМОСТАЗА

Плазменные белки гемостаза образуют 2 фер-ментативные системы крови, имеющие своей цельюподдержание гемостатического баланса (рис. 31):1. Система свертывания плазмы. Система со

стоит из ферментов, неферментативных белковых катализаторов (кофакторов) и ингибиторов свертывания. Конечной целью этойсистемы является образование важнейшегофермента тромбина, а в конечном итоге -фибринового сгустка, составляющего основу гемостатического тромба.

2. Система фибринолиза. Конечной целью этойсистемы является образование главного фермента фибринолиза плазмина и лизис фибринового сгустка. Эту систему составляют плаз-миноген и его активаторы и ингибиторы.Обе эти системы имеют сходные черты:

• В обеих системах происходит много-этапный ферментативный процесс актива-

ции, в котором участвует ряд белков - про-теаз.

• По крайней мере, in vitro имеется несколькопутей запуска каждого процесса, а в итоге образуется один конечный продукт.

• Многие реакции нуждаются в наличии специфической поверхности и ионов кальция.In vivo твердой фазой для фиксации реагирующих белков служат кислые фосфолипи-ды клеточных мембран, в частности мембран тромбоцитов, фибробластов, возможнолейкоцитов.Кроме каскадных систем свертывания плаз-

мы и фибринолиза, к плазменным белкам гемо-стаза относятся многочисленные ингибиторы иактиваторы, эффекты которых проявляются какдействие антикоагулянтов или прокоагулянтов исоответственно ингибиторов или активаторовфибринолиза.

Рис. 31. Система свертывания крови и система фибринолиза - каскадные протеолитические ферментативные системы,обеспечивающие гемостатический баланс крови


Система свертывания плазмы

Система свертывания плазмы - фермента-тивная система, осуществляющая каскад протео-литических реакций, в результате которых про-исходит образование фибриновой пробки в мес-те повреждения сосуда. Система свертываниятесно связана с другими протеолитическими си-стемами плазмы, в том числе с системой фибри-нолиза. Белки свертывания плазмы, входящие вкаскад свертывания крови, принято называтьтермином «фактор». В соответствии с международ-ной номенклатурой факторы свертывания плазмыобозначаются римскими цифрами (табл. 6). Актив-ные формы факторов обозначаются теми жеримскими цифрами, но с добавлением аббреви-атуры «а».

Практически все факторы системы сверты-вания крови циркулируют в кровотоке в форменеактивных проэнзимов или в форме неактив-ных кофакторов. Исключение составляет фак-

тор VII, примерно 1-2% которого в норме цир-кулируют в активной форме. При запуске свер-тывания крови происходит каскадная актива-ция проэнзимов и кофакторов (рис. 32). Про-цесс активации представляет собой ограничен-ный протеолиз неактивных предшественниковдо активных энзимов и кофакторов. Активиро-ванные энзимы являются сериновыми протеа-зами (за исключением фактора XIII). Активи-рованные кофакторы, не обладая самостоятель-ной ферментативной активностью, играют ролькоферментов.

Сериновыми протеазами являются активиро-ванные факторы II, VII, IX, X, XI, XII, ПК.

Трансглютаминаза - фактор XIII.Кофакторы - факторы V, VIII, ВМК.Содержание компонентов гемостаза, в том чис-

ле плазменных факторов свертывания, в системециркуляции существенно больше, чем необходимо

При разработке первой номенклатуры были использованы римские символы факторов от I до XIII. Для обо-значения участия в свертывании плазмы тканевого фактора и ионов кальция им были приданы символы соот-ветственно III и IV. Однако в настоящее время римская нумерация для них не используется, так как они неотносятся к плазменным факторам свертывания (тканевой фактор - это тканевой компонент вне сосудистойсистемы, ионы Са не являются белком). Фактор VI в классификации не употребляется, так этим символомошибочно был назван фактор Va.

Таблица 6Плазменные факторы свертывания крови


Рис. 32. Протеолитическая активация факторов гемо-стаза. Путем ограниченного протеолиза из неактивногопредшественника образуются активный пептид и активиро-ванный фермент

для формирования фибринового сгустка. Процесссвертывания происходит в условиях насыщениясубстратами (рис. 33). Вследствие этого образова-ние гемостатического тромба может быть достиг-нуто при значительном диапазоне концентрации иактивности конкретного фактора свертывания.Клинические проявления недостаточности компо-нентов свертывания возникают при их существен-ном уменьшении, если обратиться к рис. 33 - то этоначальный диапазон, при котором скорость реак-ции зависит от концентрации фактора.

Для эффективного взаимодействия и акти-вации белков свертывания крови необходимо об-разование комплексов этих белков, их кофакто-ров и субстрата (рис. 34). Эти условия не могутвозникнуть в жидкой фазе. Поэтому большин-ство процессов активации промежуточных фак-торов свертывания протекают на фосфолипидахклеточных мембран. В месте сборки комплексовпроисходит концентрация факторов свертыва-ния. Здесь же присутствуют кофакторы, которыесущественно ускоряют процесс формирования сгу-стка. В создании активного комплекса участвуют:• Фермент (активный плазменный фактор -

протеолитический фермент).• Субстрат (профермент).• Активированный кофактор.• Ионы Са (Са2+).• Кислые фосфолипиды и специфические ре

цепторы на поверхности клеток.Все белки системы свертывания крови мож-

но разделить на две группы. Одни белки для пол-ноценного формирования требуют наличия ви-тамина К (витамин-К-зависимые белки), а дру-гие - нет.

Рис. 33. Соотношение между концентрацией факторови скоростью процесса свертывания. В норме скоростькоагуляции практически не определяется концентрациейфакторов, так как они присутствуют в избытке и процессидет в состоянии насыщения. Только после значительногоистощения фактора его концентрация будет влиять на ско-рость реакции и соответственно на скорость свертыванияплазмы

Рис. 34. Модель сборки комплекса факторов сверты-вания крови. На поверхность твердой фазы (фосфолипи-ды фибробластов, макрофагов, активированных тромбо-цитов либо, в патологических ситуациях, мембраны повреж-денных клеток, бактерий и др,) прикрепляется (интернали-зуется) крупный кофакторный белок, который организуетместо контакта факторов свертывания , те в свою очередьвзаимодействуют друг с другом по принципу комплемен-тарности


Витамин-К-зависимые белки

Витамин-К-зависимыми белками являютсяф.II, -VII, -IX, -X, протеины С и S. Эти белки син-тезируются в печени и имеют сходную структурумолекулы (рис. 35). Характерной их особенностьюявляется наличие уникальной аминокислоты -у-карбоксиглутамина. Эта аминокислота образу-ется во время синтеза витамин-К-зависимых бел-ков в печени путем у-карбоксилирования глута-мина ферментом у-карбоксиглутаминпептидазой,в работе которого принимают участие активиро-ванные формы витамина К (рис. 142). у-карбок-сиглутамин дает возможность витамин-К-зависи-мым белкам с помощью ионов Са2+ образовыватькомплексы с кислыми фосфолипидами.

Рис. 35. Структурная организация некоторых плазмен-ных белков системы гемостаза. Стрелками показаныместа протеолитического гидролиза, в результате которо-го происходит переход неактивных проферментов в актив-ные ферменты - сериновые протеазы каскада коагуляции.Двузубцем обозначены витамин-К-зависимые факторы ,имеющие в своей структуре карбоксилированную глюта-миновую кислоту

Неферментные активаторы свертывания крови

К неферментным активаторам свертываниякрови (коферментам) относятся факторы V и VIII.Оба - высокомолекулярные белки, имеющие сход-ную структуру. Они циркулируют в плазме в неак-тивной форме и активируются тромбином. ф.VIII вплазме связан с фактором Виллебранда (vWF), ко-торый защищает его от преждевременной инакти-вации. Диссоциация фVIII из комплекса с vWF про-исходит под воздействием тромбина (рис. 25).

ф.Va и -Villa образуют на фосфолипидныхмембранах комплексы с ф.Ха и -IХа соответствен-но. Специфическая активность ф.Ха и -IХа в ком-плексах с кофакторами в десятки тысяч раз боль-ше, чем изолированных. Основным ингибиторомф.Va и -VIIIa является комплекс протеин С - про-теин S.

Классический коагуляционный каскад активации тромбина

Изучение процесса свертывания крови донастоящего времени происходит в основном invitro в смоделированных условиях.Исследование взаимодействия плазменныхбелков гемостаза в отрыве от другихкомпонентов привело к созданию такназываемой «классической» теории коагуля-ционного каскада активации тромбина. Внасто-

ящее время эта теория пересмотрена сучетом вновь полученной информации овзаимодействии различных компонентовгемостаза. Однако базовые принципыизложенной ниже классической каскаднойтеории считаются верными до настоящеговремени. Кроме того, знание классическогокаскада свертывания крови необходимо дляпра-


вильнои интерпретации результатов коагулоло-гических тестов.

Активация протромбина - многостадийныйпроцесс, который происходит по механизму про-ферментно-ферментного преобразования. С однойстороны, это обеспечивает нарастание сигнала:активация одной молекулы предшествующегоуровня в системе свертывания приводит к акти-вации от нескольких десятков до нескольких со-тен тысяч последующих молекул (рис. 36). С дру-гой стороны, многостадийность позволяет бо-лее гибко регулировать процесс.

В классическом каскаде свертывания кровивыделяют 2 пути активации процесса:• Активация тканевым фактором (ТФ). Так как

ТФ не относится к плазменным факторам иконтактирует с кровью только при повреждении сосуда, то активация с его участиемобозначается как внешний путь свертывания.

• Активация ф.ХII при контакте с отрицательно заряженной поверхностью твердого тела,или контактная активация. Поскольку фактор XII в норме присутствует в плазме, активация с его участием обозначается как внут-

ренний путь свертывания (все факторы при-сутствуют в плазме в норме). Внешний ивнутренний пути взаимодействуют между собой, аих разделение достаточно условно. Внешний ивнутренний пути сходятся на факторе X.Последний со своим кофактором ф.Vа образуетпротромбиназу - ферментативный комплекс,который активирует протромбин с образованиемтромбина. Образовавшийся тромбин поступает вток крови и активирует фибриноген до фибрин-мо-номеров. Последние спонтанно соединяются, обра-зуя полимеры фибрина. Условно свертывание плаз-мы (крови) делится на 2 основные фазы:1) многоступенчатый этап, приводящий к акти

вации протромбина и превращению его в активный фермент - тромбин;

2) конечный этап, в котором под влиянием тромбина из фибриногена образуется фибрин.Схема коагуляционного каскада плазменного гемостаза представлена на рис. 37.

Внешний путь образования протромбиназы

Внешний путь образования протромбиназыкороткий, что ведет к быстрому образованиютромбина.

При контакте ТФ и ф.VIIа формируется комп-лекс, который активирует ф.Х. Фактор Ха при уча-стии фактора Va, в присутствии ионов Са2+, на от-рицательно заряженной фосфолипидной поверхно-

сти формирует протромбиназу. В настоящее времяполагают, что внешний путь - основной физиоло-гический путь запуска процесса свертывания кро-ви. Подробно его значение будет описано в разделе«Современная теория свертывания крови».

Активность внешнего пути поддерживаетсяза счет механизма положительной обратной свя-

Рис. 36. Каскадный принцип усиления сигнала. Каждыйпредыдущий компонент системы свертывания активирует многопоследующих Рис. 37. Каскад активации плазменного гемостаза


зи (рис. 38). Положительная обратная связь вклю-чается на нескольких этапах каскада свертывания.Наиболее существенными являются активациятромбином факторов VII и V.

Рис. 38. Внешний каскад свертывания крови. Начина-ется с контакта крови с тканевым фактором (ТФ), который,взаимодействуя с ф.VIIа, образует комплекс, активирую-щий ф,Х, Усиление активности внешнего каскада сверты-вания крови обеспечивается 2 механизмами положитель-ной обратной связи

Внутренний путь образования протромбиназы. Факторы контактной активации

Внутренний путь активации свертывания на-чинается с активации контактных факторов коа-гуляционного каскада: ф.ХII, прекалликреина ивысокомолекулярного кининогена.

Факторы контактной активации - ф.ХII, пре-калликреин, высокомолекулярный кининоген,С1-ингибитор - синтезируются в печени. In vitroэти белки участвуют в активации внутреннегокаскада свертывания.

В лабораторных условиях активация проис-ходит на некоторых небиологических отрицатель-но заряженных поверхностях, например на стек-ле, каолине, кремнии, сульфате декстрана, а так-же в присутствии эллаговой кислоты. Имеютсяданные, что важным механизмом активации кон-тактных факторов является их взаимодействие споверхностью, характеризующейся свойствамитвердой фазы. В патологических условиях кон-тактная активация, вероятно, происходит на мем-бранах клеток крови и эндотелия, а также приконтакте с коллагеном субэндотелия.

Схематично взаимодействие белков приконтактной активации показано на рис. 39. Ви-димо, в «подходящих условиях» происходитаутоактивация и взаимоактивация ф.ХII, ПК доактивных ферментов. In vitro активация контакт-ной системы приводит к активации ф.ХI, кото-рый в свою очередь активирует ф.IХ, образую-щий с ф.VIII теназный комплекс. Теназный ком-плекс (название комплекса происходит от анг-лийского слова ten - десять) активирует ф.Х, адалее процесс свертывания идет по уже описан-

ному пути. Поскольку сборка теназного комп-лекса происходит на фосфолипидной поверхно-сти, для нее необходимо присутствие ионов каль-ция. Контактная фаза активации поддерживает-ся положительной обратной связью. Тромбинактивирует ф.VIII и -XI.

Физиологическое значение контактной акти-вации, роль факторов контактной активации впроцессе свертывания крови, физиологическиеактиваторы и условия активации этих факторовв организме требуют дальнейшего изучения.

Рис. 39. Контактная фаза активации плазменных фак-торов. Контакт с поверхностью твердого тела вызывает ак-тивацию фактора XII, который запускает каскад свертыва-ния плазмы, каскад активации фибринолиза, активациюкалликреин-кининовой системы (положительная обратнаясвязь) и активацию системы комплемента (отрицательнаяобратная связь)


Классическая теория свертывания крови ос-тавляла слишком много вопросов и противоре-чила клиническим данным. Например, с однойстороны, было неясно, какая поверхность в фи-зиологических условиях является активатором,с другой стороны, почему дефицит фактороввнутреннего пути (ф.VIII, -IX, -XI) приводит квыраженной кровоточивости при нормальнойактивности факторов внешнего пути, а глубокийдефицит факторов контактной активации, какправило, не сопровождается геморрагическимсиндромом. В современной каскадно-матричнойтеории гемостаза эти противоречия разрешены.

С современной точки зрения, контактная ак-тивация играет большую роль во взаимодействиисистемы свертывания крови с другими протеоли-тическими системами крови (фибринолитичес-кой, ангиотензин-рениновой, калликреин-кини-новой, системой комплемента и др.).

В настоящее время изучены следующие функ-ции белков контактной активации:1. Брадикинин стимулирует повышение внутри

клеточной концентрации цАМФ и приводит к:• Вазодилатации и снижению артериально

го давления.• Активации системы фибринолиза путем

стимуляции секреции тканевого активатора плазминогена.

• Ингибированию активации тромбоцитов.• Стимуляции репарации и росту гладкомы-

шечной ткани в поврежденных сосудах.2. Прямое ингибирование тромбин-индуциро-

ванной активации тромбоцитов.3. Активация фибринолиза.

• Непосредственная активация плазминогена калликреином и ф.ХIIа. Однако обаэтих белка значительно менее активны,чем тканевой активатор и урокиназа.

• Активация калликреином проурокиназыдо активной сериновой протеазы - двух-цепочечной урокиназы.

4. Блокада клеточной адгезии.5. Антиангиогенное действие.6. По-видимому, контактная активация играет

важную роль в активации свертывания крови при взаимодействии крови с нефизиологическими поверхностями, в частности приустановке искусственных протезов или искусственных клапанов сердца.

Внутренний путь образования протромбиназы(рис. 40) включает активирующее действие ф.ХПана ф.Х1, который в свою очередь активирует ф.1Х.Поскольку значение контактной активации в про-цессе свертывания крови переосмыслено, физиоло-гическая роль ф.Х1 изучается. Видимо, в физиоло-гических условиях ф.Х1 в основном активируетсятромбином. ф.Х1 довольно устойчив к инактива-ции ингибиторами и имеет длительный период по-лувыведения. Образовавшись в достаточном коли-честве, ф.Х1 увеличивает количество активногоф.1Х, за счет чего соответственно значительно воз-растает концентрация тромбина, который в своюочередь активирует по механизму положительнойобратной связи ф.1Х, -VIII и -V. В то же время из-быток тромбина тормозит начало процесса фибри-

Рис. 40. Внутренний каскад активации плазменного ге-мостаза. Начинается с взаимной активации контактныхфакторов системы гемостаза, Фактор XIIа переводит фак-тор XI в ХIа. Фактор ХIа активирует фактор IX. Все после-дующие этапы активации свертывания по внутреннему путитребуют ионов Са2+ и зависят от присутствия фосфоли-пидов. Фактор IХа активирует фактор X, но эта реакцияне очень эффективная. Однако появившийся тромбин ак-тивирует фактор VIII. Активный фактор Villa вместе с фак-тором IХа, ионами Са2+ и фосфолипидами очень эффек-тивно активирует фактор Ха, Обратная связь поддержи-вает развитие процесса за счет активации тромбиномф.VIII, -IX и -V


нолиза за счет активируемого тромбином ингиби-тора фибринолиза (TAFI).

Ингибитор С1-компонента комплемента(С1-ингибитор) является элементом системыконтактной активации. Помимо комплемента,он ингибирует ф.ХIIа (см. раздел «Ингибито-ры системы свертывания крови»).

Другим ингибитором процесса контактнойактивации в физиологических условиях являетсяапротинин.

Рис. 41. Теназный и протромбиназный комплексы. Об-разование этих комплексов сопровождается резким уве-личением активации соответственно фактора X и протром-бина (фактор II)

Конечный этап свертывания плазмы - образование фибринового сгустка

Конечная стадия каскада свертывания плаз-мы заключается в образовании из растворимогоплазменного белка фибриногена нерастворимо-го фибрина под воздействием тромбина и ф.ХIII(рис. 42).

Рис. 42. Последовательные стадии образования нераст-воримого фибрина из растворимого фибриногена

Тромбин

Тромбин - ключевой фермент гемостаза.Тромбин - витамин-К-зависимый белок - явля-ется сериновой протеазой. В печени происходитсинтез неактивного предшественника протромби-на, который в дальнейшем циркулирует в плаз-ме. В комплексе ф.Ха-Va-II на фосфолипиднойповерхности происходит ограниченный протео-лиз протромбина. Образуется несколько актив-ных структур с уменьшающейся молекулярноймассой - мезотромбин, α-тромбин, β-тромбин,γ-тромбин. Наиболее значимым продуктом яв-ляется сериновая протеаза - α-тромбин. На мо-

лекуле тромбина имеется, по крайней мере, 4 сай-та связывания для субстратов, ингибиторов, ко-факторов и иона кальция. Это, а также способ-ность тромбина активно функционировать нетолько на твердой фазе, но и в токе крови позво-ляет ему выполнять многочисленные функции.Важнейшие функции тромбина в гемостазе:• Ограниченный протеолиз фибриногена до

фибрин-мономеров (происходит в жидкойфазе - кровотоке).

• Активация ф.V, -VIII, -VII, -XI.• Активация тромбоцитов.• В комплексе с тромбомодулином тромбин

активирует протеин С.• Активация ф.ХIII.• Ограниченный протеолиз плазматической

карбоксипептидазы В до активной формы -активируемого тромбином ингибитора фибринолиза (TAFI).

• Стимуляция выброса из эндотелиоцитов тканевого активатора плазминогена.Однако роль тромбина в организме не ограничивается вышеперечисленными функциями.Ключевая роль в процессе свертывания крови,активация сосудистого эндотелия, клеточныйрост и процессы репарации, активация периферических клеток крови, активация фибринолиза - это наиболее изученные функции тромбина. Видимо, со временем этот список значительно увеличится.


Косвенным подтверждением важности тром-бина для организма может служить тот факт, чтоизвестны лишь единичные описания пациентовс гомозиготным дефектом молекулы тромбина, апациенты с гипопротромбинемией встречаютсячрезвычайно редко.

Важнейшим ингибитором тромбина являет-ся антитромбин III. Несколько меньшую рольиграет кофактор гепарина П.

Фактор XIIIФактор XIII - трансглютаминаза. В плазме

большая часть неактивного ф.ХIII связана с фиб-риногеном. Активация ф.ХIII происходит путем ог-раниченного протеолиза неактивного ф.ХIII тром-бином одновременно с отщеплением пептида А отфибриногена. Как и большинство других фермен-тов, он выполняет несколько функций в гемостазе:• Стабилизирует фибриновый сгусток путем

образования ковалентных связей между у-це-пями мономеров фибрина.

• Участвует в связывании, α-ингибитора плаз-мина с фибрином, что способствует предотвращению преждевременного лизиса фибрино-вого сгустка.

• Значительную роль ф.ХIII играет в процессах полимеризации актина, миозина и другихкомпонентов цитоскелета тромбоцитов, чточрезвычайно важно для активации тромбоцитов и ретракции образовавшегося фибри-нового сгустка. Это объясняет наличие ф.ХIIIв цитоплазме тромбоцитов.

• Обнаружены перекрестные реакции ф.ХIII сф.V, фон Виллебранд протеином.Помимо непосредственно реакций гемостаза,

ф.ХIII участвует в процессах образования соеди-нительной ткани, репаративных реакциях:• Участвует в связывании молекул фибронек-

тина между собой и с молекулами фибрина.Вероятно, это важно для направленной миграции клеток и процессов репарации.

• Играет роль в биосинтезе коллагена, катализируя образование связей между молекуламиколлагена типов I, II, III и V.

крови и образовывать прочную объемную струк-туру, которая эффективно закрывает поврежде-ние сосуда и предотвращает потерю крови. Кон-центрация фибриногена в крови здорового чело-века значительно выше, чем концентрация дру-гих белков гемостаза, что связано с его уникаль-ной ролью.

Синтез фибриногена происходит в печени ине зависит от витамина К. Некоторое количествофибриногена синтезируется в мегакариоцитах исодержится в тромбоцитах. Этот фибриноген не-сколько отличается от фибриногена, синтезиро-ванного в печени.

Помимо гепатоцитов и мегакариоцитов, ак-тивность гена γ-цепей фибриногена обнаруженав некоторых других тканях - головном мозге, лег-ких, костном мозге, где γ-цепи фибриногена, ви-димо, выступают в роли молекул адгезии.

Фибриноген - большой многокомпонентныйбелок, который состоит из трех пар полипептид-ных цепей - 2α, 2β, 2γ, связанных между собойдисульфидными мостиками и переплетенных друготносительно друга (рис. 43).

Пространственная структура молекулыфибриногена состоит из центрального Е-доме-на и 2 периферических D-доменов. α- и β-цепиформируют глобулярные структуры - фибрино-пептиды А и В (ФПА и ФПВ), которые закры-вают комплементарные участки в фибриногенеи не позволяют этой молекуле полимеризовать-ся. Процесс взаимодействия фибриногена и тром-бина происходит в жидкой фазе - кровотоке.Тромбин соединяется с фибриногеном и отщеп-ляет конечные последовательности от α- и β-це-пей - 2 ФПА и 2 ФПВ (рис. 44). Образуются ра-

Фибриноген.Формирование гемостатического тромба

Фибриноген - уникальная молекула, облада-ющая свойством быстро полимеризоваться в токе

Рис. 43. Фибриноген состоит из 3 парных белковых мо-лекул α, β и γ, Фибринопептиды А и В (ФПА и ФПВ) отщеп-ляются тромбином от фибриногена, инициируя тем самымпроцесс полимеризации и превращение фибриногена вфибрин


Рис. 44. Формирование фибрин-мономеров из фибри-ногена. Тромбин отщепляет фибринопептиды ФПА и ФПВот молекулы фибриногена, тем самым образуются раство-римые мономеры фибрина, которые способны полимери-зоваться до линейного полимера, или «растворимого фиб-рина»

створимые мономеры фибрина. В дальнейшемпроисходит спонтанное соединение комплимен-тарных участков фибрин-мономеров. Сначалаобразуются димеры, далее олигомеры и в ко-нечном итоге собираются мононити полимери-зованного фибрина. Таким образом, фибрино-вая цепь формируется спонтанной, конец в ко-нец полимеризацией фибрин-мономеров, прикоторой концевая часть одного мономера вза-имодействует с центральной частью другого мо-номера в месте отщепления ФПА. Результатомтакой полимеризации является линейный поли-мер шириной в 2 молекулы (рис. 44). На этомэтапе фибрин легко растворим в 5-молярной

мочевине, поэтому он получил название раство-римого фибрина.

Соединяясь с фибриногеном, тромбин не толь-ко отщепляет фибринопептиды. но и активируетсвязанный с ним фактор XIII. Фактор ХIIIа обра-зует ковалентные связи между γ-цепями (D-доме-нами) нитей растворимого фибрина (рис. 45), ко-торые соединяются за счет образования пептид-ных мостиков между боковыми радикалами ли-зина и глютамина. Сшитые между собой моно-нити фибрина образуют прочную сеть, менее под-верженную фибринолизу и более устойчивую кмеханическим воздействиям. В такой форме фиб-рин не растворяется в 5-молярной мочевине и на-зывается нерастворимым фибрином.

Образовавшийся фибриновый сгусток - трех-мерная молекулярная сеть, в которую включенытромбоциты, эритроциты и лейкоциты (рис. 46).Активированные тромбоциты, связанные с нитямифибрина через рецепторы GPIIb-IIIa, сокращают-

Рис. 45. Образование нерастворимого фибрина под влиянием фактора ХIIIа

Рис. 46. Организованный тромб, в котором в фибрино-вую сеть включены клетки крови


ся под действием тромбостенина (тромбоцитарно-го актомиозина) вследствие присущих им контрак-тильных свойств (см. главу «Тромбоциты»). Про-исходит ретракция сгустка крови. Сгусток уплот-няется, из него выдавливается часть сыворотки.Формирование окончательного тромба наступаетна 10-15-й минуте после полимеризации фибрина.

Если тромбоциты отсутствуют или имеютдефект GPIIb-IIIa, то ретракции кровяного сгуст-ка не происходит и он быстро лизируется в про-цессе фибринолиза. При отсутствии ретракциитромба в сосудистом русле возможен отрыв тром-ботических масс и эмболия удаленных сосудов(тромбоэмболия).

Роль кофакторов и микроокружения в процессе свертывания крови

Плазменные ферменты и ингибиторы системыгемостаза эффективно функционируют только вопределенном микроокружении. Эффективностьфункционирования факторов IX, X, протеина С,антитромбина III в присутствии своих кофакто-ров (факторы VIII, V, протеин S, гепарансульфатсоответственно) возрастает в десятки тысяч раз.Большинство реакций протеолитической актива-ции предшественников ферментов эффективнопротекают только на «твердой фазе», роль кото-рой играют отрицательно заряженные фосфоли-пиды. Для всех реакций, протекающих на поверх-ностях, необходимы ионы кальция. На рис. 47 по-казана степень активации тромбина фактором Хав различных условиях микроокружения. Комплексфактора Ха, фактора Va, фосфолипидов и Са2+

(протромбиназный комплекс) значительно эффек-тивнее активирует тромбин, нежели один фактор Ха,причем в комплексе с кофакторами фактор Ха за-щищен от деградации антитромбином.

Рис. 47. Влияние условий микроокружения на образо-вание тромбина фактором Ха. Комплекс фактора Ха,фактора Va, фосфолипидов и Са2+ (протромбиназный ком-плекс) значительно эффективнее активирует тромбин, нежелифактор Ха один или в комбинации только с фосфо-липидамии/или Са2+

Роль кальция в гемостатических реакциях

Роль кальция в гемостазе огромна. Большинство белков гемостаза имеют сайты связывания кальция.При удалении кальция из плазмы (например, при смешивании крови с цитратом натрия) активироватьгемостатические реакции практически невозможно. Наиболее важные из известных функций кальция вгемостазе:• Участие в образовании связей витамин-К-за-

висимых факторов (II, VII, IX, X, протеин С,протеин S) с фосфолипидной поверхностью.

• Участие в активации фактора XIII.• Участие в образовании связи ф.VII и ткане

вого фактора.• Ускорение процесса роста фибринового сгу

стка, участие в стабилизации фибриновогосгустка, ограничение протеолиза фибрина ифибриногена плазмином, защита фибриноге-на и фибрина от температурной и щелочнойденатурации.

• Стабилизация структуры многих белков гемостаза и опосредование взаимодействиямежду ними.

• Участие в процессах активации тромбоцитови других клеток.

• Кальций необходим для формирования цитос-

келета и возбуждения клетки. Он участвует вполимеризации актина и миозина и формировании актин-миозиновых волокон. Без негоневозможны процессы изменения формы активированных клеток, их движение, секреция.

• Кальций участвует в регуляции большинствавнутриклеточных процессов как внутриклеточный мессенджер (посредник) перемещениямолекул.

Плазменные белки гемостазаИнгибиторы системы свертывания плазмы кровиИнгибиторы системы свертывания крови представлены в табл. 7.

Ингибиторы системы свертывания плазмы кровиТаблица 7

Ингибиторы системы свертывания крови условно можно разделить на три группы - ингибиторы ферментов,ингибиторы коферментов и ингибиторы активных комплексов.

Ингибиторы ферментов системы гемостаза

Среди ингибиторов ферментов системы ге-мостаза, в свою очередь, можно условно выде-лить 2 группы - ингибиторы сериновых проте-аз и неспецифические ингибиторы протеаз, к ко-торым относится α2-макроглобулин.

Ингибиторы сериновых протеаз, или серпи-ны. Большинство ферментов каскада свертыва-ния крови составляют сериновые протеазы. Се-риновыми протеазами также являются фермен-ты фибринолитической системы, некоторыеферменты системы комплемента, эластаза,трипсин, химотрипсин и многие другие. Все ониимеют гомологичную структуру. Существуетгруппа ингибиторов, специфичных для серино-вых протеаз, - серпины. Механизм их ингиби-рующего действия изучен довольно хорошо.Серпины имеют строение, похожее на строениесубстрата сериновых протеаз. Однако, охотносоединяясь с ферментами, серпины не подвер-гаются немедленному расщеплению. Это соеди-

нение блокирует ферментативную активностьсериновой протеазы (рис. 48). Различные сер-пины несколько отличаются по строению, мо-гут быть более или менее специфично ингиби-ровать разные ферменты. Кроме того, на актив-

Рис. 48. Ингибирование активных сериновых протеазсерпинами за счет образования стабильного неактивно-го фермент-субстратного комплекса


ность и специфичность серпинов может влиятьмикроокружение.

Антитромбин и гепарин

Антитромбин (синоним - антитромбин III,AT) - гликопротеин, состоит из 432 аминокислот иимеет 4 участка гликолизации с разным количе-ством сиаловых кислот. Этот ингибитор формиру-ет стабильный 1:1 комплекс с сериновыми протеа-зами плазменного гемостаза. Кроме того, AT свя-зывается со специфическими сульфатными группа-ми на пентасахаридных структурах гепарина.

AT синтезируется в печени и является наиболеезначимым ингибитором системы свертывания кро-ви. Активности находящегося в крови здоровогочеловека антитромбина достаточно, чтобы ингиби-ровать в три раза больше тромбина, чем может об-разоваться из циркулирующего протромбина. Не-смотря на это, уже при снижении активности AT вплазме ниже 60% возрастает риск патологическихтромбозов. При изолированном дефиците активно-сти AT риск тромботических проявлений возраста-ет пропорционально степени снижения активнос-ти. Помимо тромбина, AT ингибирует фактор Ха,а также факторы IХа, ХIа, ХIIа и калликреин.

Антитромбин по структуре гомологичен α1 -ан-титрипсину. В его активном центре присутствуетспецифическая связь Arg-Ser, которая и взаимодей-ствует с сериновыми протеазами.

Активность AT в десятки тысяч раз усилива-ется в присутствии отрицательно заряженных гли-козаминогликанов, таких, как гепарансульфат, вхо-дящих в структуру гликокаликса на поверхностиэндотелиальных клеток. Аналогичное потенциру-

ющее действие на AT оказывает гепарин (рис. 49),вырабатываемый тучными клетками. Антикоагу-лянтное действие гепарина связано с его способ-ностью вызывать конформационные измененияAT. Функция гепарина каталитическая. После об-разования эквимолярного 1:1 комплекса тромбин-антитромбин (ТАТ) гепарин может освобождать-ся для организации других комплексов.

Нефракционированный гепарин представляетсобой смесь гепаринов различной молекулярноймассы. До последнего времени он широко применял-ся в клинической практике как антикоагулянт. В на-стоящее время большее распространение получилипрепараты низкомолекулярного гепарина (НМГ,английская аббревиатура - LMWH), который полу-чается из гепарина химической или энзиматическойобработкой. Гепарин не только значительно усили-вает активность AT, но и модулирует его ингиби-торную активность. Для стабилизации комплексаТАТ гепарин должен быть представлен структурой,имеющей, по крайней мере, 18 моносахаридных ос-нований. Нефракционированный гепарин связыва-ется одновременно как с ферментом, так и с AT, тог-да как НМГ связывается только с молекулой AT(рис. 50). Нефракционированный гепарин усиливаетактивность AT в отношении всех сериновых про-теаз каскада свертывания крови, тогда как низкомо-лекулярный - в основном в отношении ф.Ха.

Наиболее эффективно AT «работает» в токекрови. В составе протромбиназного комплекса(рис. 41), содержащем также фосфолипиды, Са иф.Vа, фактор Ха лучше защищен от ингибирова-ния комплексом АТ-гепарин.

Рис. 50. Эффект нефракционированного гепарина(молекулярная масса до 30 кДа) по стабилизации комп-лекса тромбин-антитромбин и низкомолекулярного гепа-рина (молекулярная масса 3 кДа), предпочтительно влия-ющего в качестве кофактора на образование комплексафактор Ха - антитромбин, ТАТ - тромбин-антитромбино-вый комплекс

Рис. 49. Влияние гепарина на активность фактора Ха вплазме. Гепарин существенно усиливает ингибирующийэффект антитромбина на фактор Ха


Гепарин и НМГ широко используются для про-филактики и лечения тромбозов.

Антикоагулянтное действие гепарина можнобыстро и обратимо снять внутривенным введени-ем протаминсульфата - основного белка, содер-жащегося в сперме рыб и ковалентно связываю-щегося с гепарином. Гепарин, помимо активацииAT, обладает дополнительными антикоагулянтны-ми эффектами. Очень важной функцией являетсянейтрализация гепарином тромбоцитарного фак-тора 4, который освобождается из а-гранул, а так-же стимуляция гепарином освобождения из сосу-дистой стенки ингибитора внешнего пути (TFPI)и кофактора гепарина П.

Серьезным осложнением гепаринотерапииможет быть развитие гепариновой тромбоцито-пении и рикошетных тромбозов (см. раздел«Тромбоцитопения, вызванная гепарином»).

Комплекс тромбин-антитромбин

Продукт взаимодействия тромбина и AT(ТАТ) - неактивный комплекс, в нем тромбин иAT быстро теряют свою активность. ТАТ удаля-ется из системы циркуляции печенью в течение не-скольких минут. Увеличение ТАТ в системе цирку-ляции свидетельствует о развитии гиперкоагуля-ции с увеличением образования тромбина. В част-ности, ТАТ повышен у пациентов с гипергомоцис-теинемией, которая вызывает, по-видимому, вос-палительную реакцию на уровне эндотелиальныхклеток. У таких больных увеличен риск тромбо-эмболической болезни и окклюзии артериальныхсосудов. После лечения фолиевой кислотой и ви-тамином В6 ТАТ значительно снижается.

Кофактор гепарина II

Другим серпином, инактивирующим тром-бин, является кофактор гепарина П. Однако, вотличие от антитромбина, кофактор гепарина IIболее избирателен и не ингибирует активностьдругих сериновых протеаз системы свертываниякрови. Помимо тромбина, субстратом инактива-ции для кофактора гепарина II являются химо-трипсин и катепсин Н.

С1-ингибитор

С1-ингибитор (Cl-Ing) - наиболее важный ин-гибитор факторов контактной активации (см. раз-

дел «Внутренний путь образования протромби-назы. Факторы контактной активации»). С1-ин-гибитор-высокогликозилированный серпин, ин-гибирующий факторы ХПа, ХIа, калликреин,плазмин и субкомпоненты Clr и Cls первого ком-понента системы комплемента.

Вклад С1-ингибитора в систему гемостаза, ве-роятно, не очень велик, так как его дефицит непроявляется ни кровоточивостью, ни тромбозами.Основное проявление дефицита С1-ингибитора -рецидивирующие ангионевротические отеки.

α2-макроглобулин

α2-макроглобулин - гликопротеид, неспецифи-ческий ингибитор протеаз. Это крупный белок смолекулярной массой 725 000 Да. Механизм егодействия отличается от такового у серпинов. Ондействует по принципу мышеловки, у которойдверца захлопывается после попадания объектавнутрь (рис. 51). Образуя связи с внутренними пеп-тидами α2-макроглобулина, протеазы не могутрасщепить такой высокомолекулярный субстрат.α2-макроглобулин имеет большую емкость по свя-зыванию протеиназ, но относительно низкое срод-ство. Он включается в физиологическую инакти-вацию протеиназ после истощения других инги-биторов, обладающих высоким сродством, но от-носительно низкой емкостью. Он инактивируетбольшинство протеаз, включая ферменты системысвертывания крови и фибринолиза. Потреблениеα2-макроглобулина обычно обнаруживают в со-стояниях повышенной протеолитической активно-сти, в частности при панкреатитах. У новорож-денных содержание α2-макроглобулина пример-но в 2 раза выше, чем у взрослых.

Рис. 51. Ингибирование активных протеаз за счет по-гружения фермента внутрь макромолекулы α2-макрогло-булина


Ингибиторы коферментов

Наиболее значимым ингибитором в этойгруппе является система протеина С.

Система протеина С

Система протеина С включает непосредствен-но сам протеин С (ПС) и его кофактор протеин S(ITS). Другими компонентами системы являютсямембранный белок тромбомодулин (ТМ), рецеп-тор протеина С на эндотелиальных клетках(РПСЭК) и С4-связывающий протеин. Системапротеина С вместе с антитромбином и ингибито-ром внешнего пути - наиболее важные и эффек-тивные компоненты, очищающие плазму от акти-вированных кофакторов плазменного гемостаза иограничивающие процесс свертывания крови.

Протеин С

Протеин С (ПС) - витамин-К-зависимый бе-лок плазмы, синтезируется в печени. Активиро-ванный протеин С (АПС) является специфичес-кой сериновой протеазой, сходной по структурес другими витамин-К-зависимыми сериновымипротеазами. Основная функция его в гемостазе -инактивация факторов Va и VIIIa. Помимо это-

го, он ингибирует PAI, что приводит к усилениюфибринолиза.

Активация ПС происходит на поверхностиэндотелиальных клеток. ПС связывается с РПСЭКна эндотелиальной мембране и контактирует скомплексом тромбин-тромбомодулин. Проис-ходит ограниченный протеолиз неактивногоПС с образованием активной сериновой про-теазы.

АПС способен инактивировать факторы Vaи Villa, расположенные на мембране активиро-ванных тромбоцитов или других клеток, в при-сутствии ионов Са2+. Протеин S является кофак-тором этой реакции (рис. 52). Механизм инакти-вации факторов Va и VIII протеином С заклю-чается в их лизисе. Время полувыведения АПС изплазмы примерно 15 мин.

Фактор Виллебранда (vWF) защищает ф.VШот протеолитического воздействия протеина С.При типе 2N болезни Виллебранда мутация зат-рагивает сайт vWF, связывающий ф.VIII. Пос-ледний лишается защиты и подвергается уско-ренному разрушению АПС, что приводит к сни-жению его активности в крови. ф.VIII в комплек-се с ф.IХ и ф.V в комплексе с ф.Х также относи-тельно защищены от инактивации. Основным ин-

Рис. 52. Деградация активных факторов Va и Villa активированным протеином С (АПС), Транспортный С4-связыва-ющий протеин (С4-СП) доставляет протеин S (F1S), участвующий как кофактор в формировании комплексов на фосфоли-пидной мембране


гибитором АПС является PAI-3, который иног-да обозначают как протеин С ингибитор (ПСИ,в английской аббревиатуре PCI), другим ингиби-тором АПС является α2-макроглобулин.

Значение протеина С в системе гемостазачрезвычайно велико. Пациенты с дефицитом про-теина С страдают венозными и артериальнымитромбозами. Выраженность тромбофилии корре-лирует с тяжестью дефицита этого белка. Паци-енты с гомозиготным дефицитом протеина С неописаны, видимо, это состояние не совместимо сжизнью.

Протеин SПротеин S (ПS) - витамин-К-зависимый бе-

лок, синтезируемый в печени. Протеин S присут-ствует в плазме частично в свободном состоянии,частично в комплексе с С4-связывающим проте-ином (С4-СП), который доставляет протеин S нафосфолипидную мембрану. Это важно учиты-вать, так как комплекс протеин S - С4-СП не об-ладает кофакторной активностью по отношениюк протеину С. Только свободный протеин S явля-ется кофактором АПС. Активность АПС в коо-перации со свободным протеином S значительновыше, чем без него.

Дефицит nS, так же как и дефицит ПС, при-водит к развитию тромбозов. Тяжесть течениятромбофилии при дефиците nS также пропорци-ональна степени снижения его активности, а го-мозиготные формы дефицита nS неизвестны.

На рис. 53 схематично представлена последо-вательность взаимодействий компонентов систе-мы протеин С - протеин S при инактивации фак-тора Va.

С4-связывающий протеин

С4-связывающий протеин (С4-СП) - острофаз-ный белок, синтезируется в печени. В плазме при-сутствует в виде молекулы, содержащей 7 идентич-ных ос-цепей и одну β-цепь (рис. 54). Сниженныйуровень С4-СП имеет место у новорожденных илиц, принимающих непрямые антикоагулянты.Повышение С4-СП наблюдается при воспалении,активации аутоиммунных реакций, при беремен-ности, у женщин, принимающих стероидныеконтрацептивы; при этом происходит избыточноесвязывание протеина S. Дефицит свободной фор-мы протеина S рассматривается как фактор рис-ка тромбофилии. С4-СП способен также регули-ровать активность системы комплемента, обра-зовывать Са-зависимые комплексы с амилоидным

Рис. 53. Система протеина С. Активированный протеин С (АПС), сопрягаясь с теназным комплексом на фосфолипид-ной поверхности (активированный тромбоцит), вызывает деградацию фактора V. ТМ - тромбомодулин, С4-СП - связыва-ющий протеин, F1S - протеин S, ПС - протеин С, На, Va - активированные плазменные факторы, Vi - деградированныйфактор V


Рис. 54. Схематическое изображение α- и β-цепейС4-cвязывающего протеина и участок связыванияпротеина S

Р-белком сыворотки. Определение С4-СП возмож-но методом иммунотурбидиметрии или ELISA.Концентрация С4-СП в сыворотке составляет внорме около 200 мкг/мл.

Тромбомодулин был описан ранее в разделе,посвященном функции эндотелия.

Нарушения в системе протеина С (рис. 55),среди которых выделяют дефицит протеина С,дефицит тромбомодулина, дефицит протеина Sи особенно резистентность к активированномупротеину С (РАПС), - наиболее изученная па-тоология, значительно увеличивающая рискпа-тоологического тромбообразования -тромбо-филии.

Рис. 55. Нарушения в системе протеина С, способству-ющие развитию тромбофилий: 1 -дефицит протеина С, 2 -дефицит тромбомодулина, 3 - дефицит протеина S, 4 - ре-зистентность к активированному протеину С

Система протеина С активно реагирует на раз-витие воспаления в организме. Известно, что раз-витие воспаления, особенно в условиях грамнега-тивного сепсиса значительно воздействует на гемо-статический баланс, вызывая гиперкоагуляцию. Этосвязано с несколькими эффектами в системе проте-ина С. Во-первых, медиаторы воспаления подавля-ют синтез тромбомодулина, что ведет к уменьше-нию активации протеина С. Во-вторых, в кровиповышается активность комплемента, следствиемэтого является относительное увеличение количе-ства связанного и уменьшение активного несвязан-ного протеина S. В-третьих, фагоцитарные фер-менты могут отщеплять тромбомодулин от эндо-телиальной поверхности. Он появляется в свобод-ной циркуляции, но его активность в этих условияхзначительно ниже, чем у фиксированного на мемб-ране. В-четвертых, стимуляция синтеза и экспрес-сии тканевого фактора на мембране клеток в зоневоспаления ведет к усилению синтеза факторов IХаи Ха и нарастанию дисбаланса.

Ингибиторы активных комплексов

Ингибитор пути тканевого фактора, или ин-гибитор внешнего пути

Открытие в последнее десятилетие ингиби-тора пути тканевого фактора (ИПТФ, ИВП,TFPI) стало важным шагом в пересмотре клас-сического каскада свертывания крови и созда-ния современной каскадно-матричной теориигемостаза.

ИВП ограничивает синтез тромбина комп-лексом ТФ-ф.VII-ф.Ха, блокируя его вскоре пос-ле образования. Один из ингибирующих доменовИВП связывается с ф.Ха, после чего другой до-мен реагирует с активным центром ф.VII, когдапоследний связан с тканевым фактором. Аффин-ность ИВП к ф.VIIа значительно повышается вприсутствии гепарина (рис. 56). Образуется пол-


Рис. 56. Механизм действия ингибитора внешнего пути (ИВП) за счет образования комплекса с фактором Ха иформирования четырехкомпонентного комплекса - фактор Vila + тканевой фактор + ИВП + фактор Ха

ностью неактивный тетрамолекулярный комп-лекс ТФ-ф.VII-ИВП ф.Х. Помимо ингибирова-ния, ИВП способствует поглощению и деграда-ции этого комплекса. Таким образом, во внеш-нем каскаде плазменного гемостаза формирует-ся отрицательная обратная связь.

ИВП, по-видимому, ответственен при лече-нии гепарином за удлинение ряда тестов коагу-лограммы, в частности АЧТВ. ИВП в плазме ча-стично связан с липопротеидами низкой и оченьнизкой плотности (ЛПНП и ЛПОНП). В такомкомплексе ИВП более устойчив к инактивации.Появились сообщения, что тромбин способенстимулировать освобождение ИВП из эндотелияи ЛПНП, тем самым формируется обратная от-

рицательная связь для снижения образованиятромбина.

Определение ИВП в плазме проводят мето-дом ELISA или методом с образованием факто-ра Ха, который определяется в тесте с хромоген-ным субстратом. Определение ИВП в плазме вы-являет не более 5-10% общего количества ИВП всосудистой системе, так как основное его коли-чество депонируется в сосудистой стенке. Повы-шение ИВП в плазме обнаружено после лечениянефракционированным или низкомолекулярнымгепарином, при диабете и у больных с инфарк-том миокарда. Есть сообщения о снижении ИВПпри тромботической тромбопенической пурпуреи ишемическом инсульте.

Система фибринолиза

СИСТЕМА ФИБРИНОЛИЗА

В процессе формирования гемостатическойпробки активизируются механизмы, направлен-ные на ограничение роста сгустка, постепенноерастворение тромба и создание условий для нор-мального кровообращения. Осуществляется этафункция благодаря системе фибринолиза.

Система фибринолиза - протеолитическаясистема плазмы крови, ответственная за лизисфибринового сгустка, а также вовлеченная в дег-радацию коллагена, ангиогенез, апоптоз и связан-ная с другими протеолитическими системами.Центральным ферментом системы фибринолизаявляется плазмин, на регуляцию активации кото-

рого направлены все реакции системы фибрино-лиза. В рамках настоящего изложения будет рас-сматриваться роль компонентов системы фибри-нолиза в гемостазе.

Фибринолиз локализует образование фибри-на в месте повреждения, сдерживает избыточноефибринообразование, препятствуя окклюзии про-света сосуда. Баланс между фибринообразовани-ем и фибринолизом (рис. 31) способствует сохра-нению окончательного тромба на весь период вос-становления целостности сосудистой стенки,после чего равновесие сдвигается в сторону фиб-ринолиза и, став ненужным, тромб растворяется.

Компоненты фибринолиза

Система фибринолиза, так же как и система активаторы, ингибиторы и конечный ферментсвертывания крови, - многокомпонентная про- (табл. 8). теолитическая система, в состав которойвходят

Таблица 8Основные компоненты системы фибринолиза

Фактор Концентрация(мг/л)

Периодполувыведения

Функция

1 2 3 4Плазминоген 200 2,2 дня Профермент (предшественник плазмина)Активатор плазминогена тканевоготипа (t-PA)

0,005 4 мин Протеаза, активирует плазминоген

Урокиназный активатор плазми-ногена (и-РА)

0,002 7 мин Протеаза, активирует плазминоген

Ингибитор активатора плазмино-гена 1-го типа (PAI-1)

0,01 8 мин Ингибитор t-PA и и-РА

Фактор XII 30 2-3 дня Профермент. Участвует в реакции актива-ции плазминогена

Прекалликреин 40 — Профермент. Участвует в реакции актива-ции плазминогена

Высокомолекулярный кининоген 70 5 дней Кофактор. Участвует в реакции активацииплазминогена

Витронектин 350 - Кофактор PAI-1


Окончание табл. 8

1 2 3 4С1-ингибитор 180 70 ч Ингибитор ф.ХПа. калликреина, плазминаа2-антиплазмин 70 3 дня Ингибитор плазминаа2-макроглобулин 2500 — Ингибитор плазмина. калликреина,

урокиназы, t-PA и др.Богатый гистидином гликопротеин 100 3 дня Ингибитор плазминаАполипопротеин(а) <70 - Снижает фибринолизАктивируемый тромбином инги-битор фибринолиза

5 10 мин Предшественник ингибитора (зимоген)

Рецептор урокиназного активатораплазминогена (u-PAR)

— — Рецептор u-PAR, модулирующийего активность

Аннексии II — — Рецептор t-PA, активирующийего функцию

Рецептор LRP/o^-макроглобулина — — Рецептор t-PA, способствующийего элиминации

Рецептор маннозы — — Рецептор t-PA, способствующийего элиминации

Плазминоген

Плазминоген - одноцепочечный гликопроте-ин. Концентрация его составляет примерно 2 мик-ромоля в литре плазмы. У женщин в последнемтриместре беременности активность плазминоге-на повышается. Основное место синтеза плазми-ногена - печень, однако он обнаруживается и вэозинофилах, клетках почек, роговице. Возмож-но, в этих тканях он также синтезируется. В сис-теме циркуляции плазминоген связан с богатымгистидином гликопротеином.

Активация плазминогена осуществляется, восновном, 2 специфическими протеазами - акти-ватором плазминогена тканевого типа и уроки-назой. Кроме того, плазминоген может связывать-ся с фибрином и активироваться в комплексе сним. Связанный с фибрином плазмин относитель-но защищен от инактивации. В токе же кровиплазмин очень быстро (примерно за 0,1 с) инак-тивируется ингибиторами.

Активатор плазминогена тканевого типа

Активатор плазминогена тканевого типа(t-PA) является сериновой протеазой. Он высо-коспецифичен; его единственным доказаннымсубстратом является плазминоген. Видимо, t-PA -основной физиологический активатор фибрино-лиза в просвете сосуда. Основным местом син-теза t-PA является эндотелий. Помимо эндоте-лия, t-PA синтезируется во многих других клет-ках: моноцитах, мегакариоцитах, мезотелиаль-ных клетках, мышечных клетках сосудов, фиб-робластах сердца и др. Большая часть плазмен-ного t-PA связана с его основным ингибиторомPAI-1. Как связанный, так и свободный актива-тор быстро удаляются из тока крови клеткамипечени.

Помимо активации фибринолиза, t-PA уча-ствует в противовоспалительных реакциях, сти-муляции пролиферации эндотелия. Есть данные,что t-PA может активировать ф.VII.

Функция t-PA связана с наличием ряда рецеп-торов. Рецепторы t-PA делятся на 2 большие груп-пы - активирующие и удаляющие.

Активирующие t-PA-рецепторы располага-ются на клеточных поверхностях и усиливают ак-тивацию плазминогена t-PA. Наиболее изучен-ным активирующим t-PA-рецептором являетсяаннексин II. Избыточная экспрессия аннексина IIу пациентов с промиелоцитарным лейкозом ве-дет к гиперфибринолизу с геморрагическими про-явлениями.


В группе рецепторов, способствующих элиминацииt-PA, изучены маннозный рецептор и рецепторLRP/α2-макроглобулина. Первый располо-

Урокиназный активаторплазминогена (уро-киназа, u-РА) найден вбольших количествах в моче человека.Предшественником u-РА является белокпроурокиназа, или scu-PA. Проуроки-назасинтезируется в различных клетках. Особенноактивно scu-PA синтезируется эпителиальнымиклетками почечных протоков, а также обкла-дочными клетками практически всех протоков,включая протоки потовых, слезных и других же-лез. В протоках урокиназа необходима для дег-радации белковых компонентов секретов. Основ-ную работу урокиназа выполняет в тканях, спо-собствуя деградации внеклеточного матрикса,что облегчает процессы миграции клеток. Рольурокиназы значительна во многих физиологичес-

жен на мембране эндотелиоцитов печени и куп-феровских клеток, второй работает на мембранегепатоцитов.

ких и патологическихпроцессах - заживлении ран, воспалении,эмбриогенезе, метастазирова-нии опухолевыхклеток.

Известен еще ряд функций урокиназы поми-мо активации плазминогена. Наиболее важные изних - активация ростовых факторов, модуляциямиграции и инвазии клеток, оказание митоген-ного эффекта на клетки меланомы.

Рецептор урокиназы (u-PAR) обнаружен намоноцитах. Он способствует активации плазми-ногена урокиназой, что необходимо для участиямоноцитов в деградации фибринового тромба.Такой же рецептор найден на тромбоцитах. Опи-саны 2 рецептора, элиминирующие урокиназу икомплекс урокиназа-серпин из кровотока.

Другие активаторы плазминогена

Помимо указанных выше основных физиологи-ческих активаторов плазминогена, описаны другиефизиологические и нефизиологические активаторы.

Есть данные, что ф.ХIIа может напрямуюактивировать плазминоген. Скорость активацииплазминогена ф.ХIIа в сравнении с эквимоляр-ным количеством t-PA в 10 раз ниже, однако его

молярная концентрация в циркулирующей кро-ви в 5000 раз выше. Таким образом, роль прямойактивации плазминогена ф.ХIIа может быть дос-таточно высока. Другими известными активато-рами плазминогена являются стрептокиназа, ста-филокиназа, активатор плазминогена, выделен-ный из слюны летучих мышей-вампиров.

Механизм активации фибринолиза

В фибринолизе, так же как в системе коагуля-ции, имеется 2 пути: внешний и внутренний путьактивации плазминогена (рис. 57). Внешний путь

активации плазминогена обеспечивается в основ-ном тканевым активатором, внутренний путь -урокиназой.

Рис. 57. Основные звенья фибринолиза. Образованиеосновного фермента фибринолиза плазмина происходитпод влиянием факторов внутреннего или внешнего пути ак-тивации фибринолиза, Внутренний путь начинается с акти-вации проурокиназы. Внешний путь определяется влияни-ем тканевого активатора плазминогена (t-PA). Накоплениесвободного плазмина в системном кровотоке предотвра-щается группой острофазных белков, КК - калликреин,ВМК - высокомолекулярный кининоген, u-РА - урокиназа,Cl-Ing - ингибитор 1-го компонента комплемента, PAI-1 -ингибитор тканевого активатора плазминогена типа 1, ПДФ -продукты деградации фибрина

Урокиназный активатор плазминогена


Внутренний путь активации фибринолиза

Внутренний путь активации фибринолизаначинается в комплексе реакций контактной ак-тивации свертывания крови. Калликреин активи-рует проурокиназу с образованием активногофермента урокиназы. Кроме калликреина, акти-вация проурокиназы до активной двухцепочеч-ной формы u-РА происходит под воздействиемф.ХIIа и -ХIа, плазмина (положительная обрат-ная связь) и усиливается при связывании с уроки-назным рецептором. В связи с этим у пациентов сдефицитом прекалликреина, XII фактора (бо-лезнь Хагемана) или высокомолекулярного кини-ногена (ВМК), у которых, казалось бы, из-за не-

достатка плазменных факторов должна бытьсклонность к кровотечениям, наоборот, в резуль-тате неполноценной активации фибринолиза име-ется тенденция к тромбозам.

Определение u-РА для диагностики наруше-ний гемостаза практически не проводится, так какдиагностическое значение этого фермента поканедостаточно ясно. Однако u-РА является опухо-левым маркером карциномы яичника и, вероят-но, других опухолей, поэтому имеются коммер-ческие ELISA-наборы, которые используются дляопределения u-РА как опухолевого маркера.

Внешний путь активации фибринолиза

Плазминоген имеет высокое сродство к вы-павшему фибрину за счет присутствия на фибри-не специфических лизин-связывающих участков(сайтов). Эндотелиальные клетки синтезируют иосвобождают в систему циркуляции тканевойактиватор плазминогена (t-PA). Изучение процессавысвобождения t-PA из клеток показало, чтоосновным стимулятором этого является брадики-нин, который отщепляется от высокомолекуляр-ного кининогена калликреином. Таким образом,процесс активации факторов контактной фазыявляется основным физиологическим пусковыммеханизмом фибринолиза. Этот процесс резко уси-ливается при остановке кровотока и образованиифибрина. t-PA обладает высоким сродством к фиб-рину. На фибрине формируется комплекс фибрин -тканевой активатор - плазминоген (рис. 58) - наи-более специфическое и эффективное действующееначало фибринолиза. Фибрин, особенно частич-но деградированный фибрин, служит кофакторомt-PA-индуцированной протеолитической актива-ции плазминогена. В результате образования это-

го комплекса плазминоген переходит в активныйплазмин, который разрушает пептидные связи вфибрине/фибриногене.

Рис. 58. Активация плазминогена при формированиикомплекса фибрин - тканевой активатор - плазминоген нафибрине. Фибрин служит кофактором t-PA-индуцирован-ной протеолитической активации плазминогена. На поверх-ности фибрина присутствует лизин-связывающий сайт, не-обходимый для активации плазминогена тканевым актива-тором


Ингибиторы фибринолиза

Участки действия основных ингибиторовфибринолиза представлены на рис. 59.

Рис. 59. Ингибиторы фибринолиза, показаны участкиосновного ингибирующего эффекта , Практически всеингибиторы фибринолиза являются белками остройфазы. TAFI - тромбин-активируемый ингибитор фибри-нолиза, t-PA- тканевой активатор плазминогена, Cl-Ing -ингибитор 1-го компонента комплемента , AT - антитром-бин III, PAI-1, PAI-2 - ингибиторы тканевого активатора плаз-миногена (тип 1 и 2), ПДФ - продукты деградации фибри-на/фибриногена

αг-антиплазмин, αг-макрогло6улин, αгантитрипсин

αг-антиплазмин (αг-АП) в физиологическихусловиях быстро инактивирует плазмин, образуянеактивные комплексы. оц-АП имеет высокоесродство к плазмину, взаимодействует с ним, уда-ляя свободный плазмин из системы циркуляции.В результате время полужизни свободного плаз-мина составляет всего 0,1 секунды. Если же плаз-мин успевает соединиться с выпавшим фибрином,то взаимодействие плазмин-αг-АП резко снижа-ется (примерно в 50 раз). Недостаточность αг-АПпроявляется кровотечениями, так как накаплива-ющийся активный плазмин ускоренно разруша-ет фибрин и фибриноген. αг-АП - белок остройфазы, однако при массивной активации фибри-нолиза, в частности при ДВС-синдроме, может на-блюдаться истощение αг-АП. Приобретенная не-достаточность αг-АП встречается значительночаще, чем врожденная.

αг-макроглобулин. Этот ингибитор былописан в разделе «Ингибиторы системысвертывания крови». Это неспецифическийингибитор. При активации фибринолизаобразующийся из плазминогена (концентрация вплазме свыше 1,5 мкмоль) плазмин в первуюочередь связывается αг-антиплазми-ном(концентрация в плазме около 1 мкмоль). Послеполного насыщения αг-антиплазмина дальнейшаянейтрализация плазмина осуществляется за счетαг-макроглобулина. Кроме того, αг-макро-глобулин инактивирует другие ферменты систе-

мы фибринолиза: урокиназу (u-РА), тканевой ак-тиватор плазминогена (t-PA), плазменный каллик-реин, компоненты комплемента, бактериальные илейкоцитарные протеазы, такие, как эластаза и ка-тепсины.

α1-aHmumpuncuH. На его долю приходится более80% антипротеазной активности крови. В сы-воротке α1 -антитрипсин содержится в концентра-ции 1,4-3,2 г/л, или около 52 ммоль/л. Это основ-ной ингибитор сериновых протеаз: трипсина, хи-мотрипсина. Помимо этого, он принимает учас-тие в инактивации плазмина, калликреина, рени-на, урокиназы. Благодаря небольшим размерам онможет проникать и функционировать в тканях(легкие, бронхи). α1-антитрипсин - белок остройфазы, его выработка увеличивается при реакциях,запускаемых через фактор некроза опухолей, ин-терлейкин-1, интерлейкин-6, а также при высокойконцентрации эстрогена в сыворотке в последнемтриместре беременности, при приеме эстроген-со-держащих противозачаточных препаратов.

Все 3 описанных ингибитора совместно пре-дупреждают появление плазмина в системе цир-куляции в свободном виде, исключая его дегра-дирующий эффект на фибриноген, а также нафакторы свертывания VIII, V и другие плазмен-ные белки. Деятельность этих ингибиторов явля-ется важным условием поддержания гемостати-ческого баланса.


Ингибиторы тканевого активатора плазминогена (PAI)

Ингибитор активатора плазминогена 1-го типа(PAI-1). Это специфический ингибитор тканевогоактиватора плазминогена (t-PA) и урокиназы (u-РА). Помимо этого он подавляет активацию фиб-ринолиза стрептокиназой.

PAI-1 обнаружен в плазме и тромбоцитах.В плазме он связан с витронектином. PAI-1 син-тезируется в эндотелиальных клетках. Синтезусиливается при их стимуляции липополисаха-ридами плазматических мембран бактерий (эн-дотоксином), провоспалительными цитокина-ми, такими, как ИЛ-1 или ФНО-α, а также тром-бином. Наиболее значительная стимуляцияпроисходит в условиях сепсиса и при обширныхтромбозах.

PAI-1 ингибируется протеином С. Таким об-разом, протеин С ингибирует не только активи-рованные факторы Va и VIIIa, но и PAI-1, прояв-ляя, следовательно, профибринолитическую ак-тивность.

Ингибитор тканевого активатора плазминоге-на 2-го типа (PAI-2) обнаружен в очень низкихконцентрациях в плазме, но может существенноповышаться при беременности. Он в большей сте-пени ингибирует активность u-РА, чем t-PA.

Ингибитор тканевого активатора плазминоге-на 3-го типа (PAI-3). Это, по-видимому, относитель-но слабый ингибитор. Он подавляет активациюплазминогена протеином С. Диагностического зна-чения определение PAI-2 и PAI-3 пока не имеют.

Активируемый тромбином ингибитор фибринолиза (TAFI)

TAFI (карбоксипептидаза Y, или плазменнаякарбоксипептидаза В) - один из наиболее важныхингибиторов фибринолиза. Его неактивная фор-ма - прокарбоксипептидаза Y - активируетсятромбином, связанным с тромбомодулином, и, ве-роятно, трипсином, калликреином, плазмином доактивной карбоксипептидазы Y или TAFI.

Механизм ингибирования фибринолиза кар-боксипептидазой Y отличается от описанныхвыше. TAFI разрушает каталитическую поверх-ность фибрина (лизин-связывающий сайт), необ-ходимую для активации плазминогена t-PA. Кро-ме того, в более высокой концентрации TAFIобладает прямой ингибирующей активностью поотношению к плазминогену.

TAFI играет большую роль в формированиигемостатического тромба, предотвращая егопреждевременный лизис. Однако для активизациидостаточного количества ингибитора необходимзначительный избыток тромбина, превышающийколичество, необходимое для образования фиб-ринового сгустка. Видимо, этим объясняется по-вышение фибринолиза у лиц с гемофилией и де-фицитом фактора XI.

Определение TAFI проводится методом ELISA.Повышение TAFI зарегистрировано при тромбо-зах и при применении тромболитических препара-тов. Обнаружена корреляция между концентраци-ей и активностью TAFI, с одной стороны, и време-нем, в течение которого лизируется сгусток крови.

Другие элементы системы фибринолиза

Аполипопротеин (а). Аполипопротеин (а) кон-курирует с плазминогеном и t-PA за связь с фибри-ном, что приводит к снижению активности процес-са фибринолиза. Кроме того, было показано, что вприсутствии аполипопротеина (а) уменьшается ак-тивация плазминогена на поверхности фибрина.

Витронектин. Витронектин стабилизируетPAI-1 в его активной конформации, являясь, посути, его кофактором, и повышает период полу-распада последнего. Кроме того, он способству-ет клиренсу PAI-1 липопротеинами низкой плот-ности.


Лизис фибринового сгустка. Продуктыдеградации фибрина/фибриногена и D-димеры

Плазмин является очень активной и в то жевремя относительно неспецифичной сериновойпротеазой, которая разрушает фибрин и фибри-ноген. Образующиеся вследствие этого молеку-лы, имеющие разную молекулярную массу, обо-значаются как продукты деградации фибрина/фибриногена (ПДФ).

Продуктами деградации фибрина в основномявляются комплексы DDE и D-димеры (рис. 60).

Помимо фибрина, плазмин способен актив-но деградировать фибриноген, особенно в тех слу-чаях, когда вводятся активаторы фибринолиза(фибринолитики). В результате лизиса фибрино-гена образуются меньшие фрагменты X, Y, D и Е(рис. 61), а D-димеры не образуются.

Некоторые фрагменты ПДФ обладают выра-женной физиологической активностью. Они сни-жают агрегацию тромбоцитов и нарушают поли-

Рис. 60. Образование фибрина из фибриногена и формирование D-димеров при деградации фибрина плазмином


Рис. 61. Образование ПДФ при деградации фибриноге-на плазмином. Свободный плазмин является неспецифи-ческой протеазой, он разрушает фибриноген до мелкихпродуктов деградации. При этом D-димеров не формиру-ется. D-димеры образуются при разрушении плазминомфибрина. Определяя ПДФ, выявляем продукты деградациифибрина/фибриногена, которые могут формироваться какпри фибринолизе тромба, так и после введения фибрино-литиков, Определяя D-димеры, определяем продукты раз-рушения фибринового тромба (если он имел место у па-циента)

меризацию фибрин-мономеров, являясь, в сущно-сти, антикоагулянтами.

ПДФ способны нарушать целостность илиповышать проницаемость сосудистой стенки.Поэтому при некоторых клинических ситуациях

кровотечения могут быть вызваны не уменьше-нием концентрации фибриногена, а присутстви-ем большого количества ПДФ, формирующихсяпри активном фибринолизе.

Плазмин-независимый фибринолиз

В сгустке фибрин связан с активированнымитромбоцитами. Те, в свою очередь, экспрессиру-ют на поверхности Р-селектин, CD154 и другиерецепторы для лейкоцитов. Лейкоциты могут ос-вобождать несколько протеаз, которые способныдеградировать фибрин: гранулоцитарную эласта-зу, катепсин G, моноцитарный катепсин D и др.

При протеолитическом расщеплении фибри-на лейкоцитарными ферментами, так же как и прирасщеплении плазмином, образуются D-димеры,которые идентифицируются коммерческими ди-агностикумами.

Интересно, что эластаза может модифициро-вать плазминоген, делая его более восприимчи-вым к активации u-РА и t-PA и менее чувстви-тельным к α2-антиплазмину.

Фибрин, который частично деградировалпод влиянием эластазы, обладает меньшей ко-факторной активностью для t-PA, чем в случаедеградации фибрина плазмином. Очевидно, чтоэластаза имеет достаточно большое значение врегуляции фибринолиза, особенно при воспа-лении.

Реологические аспекты гемостаза

РЕОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ГЕМОСТАЗА

Кровь - динамичная система. Силы, возни-кающие в результате взаимодействия текущейкрови и сосудистой стенки, оказывают суще-ственное регуляторное влияние на систему ге-мостаза и на всю систему кровообращения. За-пуск процесса тромбообразования, скорость ихарактер образующегося тромба зависят от ло-кальных гемодинамических условий. Взаимо-действие клеток, плазматических белков и ре-

цепторов системы гемостаза, экспрессия генови метаболизм клеток, участвующих в гемоста-тических реакциях, модулируются локальнымиреологическими условиями, а те, в свою очередь,изменяются при образовании тромба. Учет ге-модинамических особенностей, возникающих вместе потенциального тромбообразования, по-зволяет лучше оценить наблюдаемые гемоста-тические феномены.

Особенности реологии крови

В норме в сосудах кровь течет ламинарнымтоком, скорость потока неоднородна и нарас-тает по направлению от стенок сосудов к цент-ру. Трение одного слоя жидкости относитель-но другого называется вязкостью. Вязкость кро-зи зависит от скорости тока: чем выше ско-рость, тем меньше вязкость. Влияние одногослоя на другой в потоке жидкости определяетсясилой сдвига. В стоячей жидкости сила сдвигаравна нулю, чем выше скорость движенияжидкости, тем сильнее силы бокового сдвига.Для ламинарного тока (рис. 62, А) силы боко-вого сдвига уменьшаются в направлении к стен-ке сосуда.

В области атеросклеротических бляшек(рис. 62, Б), разветвлений сосудов (рис. 62, В), вподклапанном пространстве (рис. 62, Г) или прикомпрессии сосуда извне ламинарное движениекрови нарушается, возникает турбулентность (за-вихрения). В местах сужения скорость потока воз-растает. В областях, находящихся дистальнее, по-являются турбулентные потоки и разнонаправ-ленное изменение скорости потока. При измене-нии направления тока крови и возникновениитурбулентных потоков появляются силы боково-го сдвига, которые ударяют по поверхности со-судистой стенки. Поэтому турбулентные потоки

являются причиной повреждения слоя гликока-ликса и эндотелиальных клеток. Это приводит кповреждению сосудистой стенки, что влечет засобой изменения реактивности со стороны эле-ментов системы гемостаза (рис. 150).

Рис. 62. Характер потока крови в различных условияхсосудистого русла: А - характер потока крови в неизме-ненном сосуде - ламинарный ток, Б - характер потока кро-ви в сосуде, имеющем сужение, в том числе при развитииатеросклеротических бляшек или при формировании при-стеночного тромба, В - характер потока крови в областибифуркации крупных сосудов, Г - характер потока крови вобласти клапанов сердца и сосудов


Функция тромбоцитов в различных гемодинамических условиях

В норме в кровотоке большинство тромбо-цитов находятся в неактивной форме на всех уча-стках кровеносного русла. Однако, в условияхвоздействия сил сдвига, превышающих нормаль-ные, тромбоциты могут спонтанно активиро-ваться без контакта с субэндотелием. Предполо-жительный механизм этого процесса связан сособенностями функционирования фактора Вил-лебранда (vWF). В условиях нормального кро-вотока vWF мало связывается со своими рецеп-торами на интактных тромбоцитах. Однако, ког-да воздействие сил тока крови превышает обыч-ное, например в области атеросклеротическогосужения артерии, аффинность vWF к рецепторамповышается. Он связывается с GPIb и GPIIb-IIIaодновременно. Следствием этого становится ак-тивация тромбоцитов с образованием мобиль-ных тромбоцитарных агрегатов. АДФ и эпинеф-рин (адреналин) - агонисты этого процесса, ониувеличивают процесс тромбообразования. Ме-ханизм этого действия неясен. Исследования по-казали, что ингибирование циклооксигеназы ас-пирином оказывает небольшое влияние на агре-гацию тромбоцитов под воздействием напряже-ния сдвига, а агенты, повышающие уровеньвнутриклеточной цАМФ, такие, как простацик-лин (ПГ1), ингибируют механически индуциро-

ванную агрегацию. Природа чувствительных кмеханическому воздействию компонентов этойсистемы неизвестна.

Интенсивность воздействия потока крови натромбоциты влияет на адгезию к субэндотели-альным структурам и агрегацию. В условиях сла-бого воздействия тока крови адгезия тромбоци-тов происходит за счет прямой фиксации к кол-лагену через рецептор GPIa-IIa и посредствоммолекулы адгезии фибронектина, а агрегацияпроисходит за счет фибриновых мостиков. В ус-ловиях интенсивного кровотока для надежнойфиксации тромбоцитов к субэндотелию и проч-ной агрегации необходим vWF. У пациентов сколичественным и качественным дефектом vWFнарушение адгезии и агрегации тромбоцитовприводит к геморрагическим проявлениям раз-личной тяжести.

В медленно текущей и сгущенной крови на-ступает агрегация клеток крови (рис. 63). Эрит-роциты собираются в монетные столбики, обра-зуются агрегаты тромбоцитов, в легких форми-руются агрегаты нейтрофилов. Повышается вяз-кость крови.

Проводились экспериментальные исследова-ния роста тромба в зависимости от интенсивно-сти кровотока. Процесс тромбообразования

Рис. 63. Кровоток в венулах в норме характеризуется центральным расположением эритроцитов и краевым движени-ем лейкоцитов. При низкой скорости эритроциты собираются в монетные столбики и придавливают лейкоциты к стенке,способствуя их выходу в ткань


проходил на компонентах, выделенных из эндо-телия. Установлено, что повышение скороститока, а следовательно, увеличение напряжениясдвига, увеличивало отложение тромбоцитов.Однако в этих условиях снижался рост тромба.Возможные объяснения этому: 1) связи тромбо-цитов с компонентами эндотелия недостаточносильны, чтобы удержать их на поверхности по

мере нарастания воздействия сил сдвига; 2) приуменьшении времени контакта тромбоцитов споверхностью прочные связи не успевают обра-зовываться; 3) при увеличении скорости токакрови происходит интенсивное вымывание ак-тивированных компонентов гемостаза из зоныреакции.

Влияние сил потока крови на процесс коагуляции

Процесс свертывания крови связан с фиксаци-ей комплекса плазменных белков на поверхностяхв области повреждения сосуда. Интенсивность это-го процесса зависит от доставки белков плазмы кместу реакции. В условиях ламинарного течениякрови белки поступают к месту повреждения в ос-новном путем радиальной диффузии. Повышениескорости тока крови, возникновение турбулентныхпотоков увеличивают доставку протеаз к месту ре-акции. Экспериментальные исследования показа-ли, что в условиях стандартной ограниченной кон-центрации ф.Va, фиксированного на поверх-ности, и циркулирующего в жидкой фазе ф.Х ста-

бильный уровень продукции тромбина ограниченколичеством фиксированного ф.Vа. В условияхлимитированного количества ф.Vа увеличениециркулирующего ф.Ха или скорости циркуляциине меняет конечный уровень продукции тромби-на, однако ускоряет этот процесс. Таким образом,увеличение интенсивности тока крови сокращаетвремя тромбообразования.

Однако, индуцированный механическим воз-действием выброс из эндотелия тканевого акти-ватора плазминогена приводит к сокращению от-ложения фибрина и ограничению роста сгустказа пределы повреждения.

Гемодинамическое воздействие на функцию сосудистой стенки

Ток крови оказывает на сосудистую стенкумеханическое воздействие, растягивая ее, оказы-вая давление с внутренней стороны и воздействуясилами напряжения сдвига. Эндотелиоциты реа-гируют на условия тока крови:• изменяется активность синтеза различных

белков;• изменяется концентрация циклических нукле-

отидов в цитоплазме;• происходят количественные и качественные

изменения рецепторов и фосфолипидов мембраны. Эти процессы в том числе влияют наактивность эндотелиоцитов в гемостазе. Имеется два типа реакции эндотелиоцитов на механические воздействия тока крови - быстрые и медленные реакции.Быстрые реакции (в течение секунды) являют-

ся следствием прямого воздействия сил тока кро-ви на текучую мембрану клеток. Медленные реак-ции опосредованы рецепторами. Ионные каналы,

тромбиновые рецепторы с G-протеинами, рецеп-торы тирозинкиназы и интегрины реагируют намеханическое воздействие. Время реакции эндоте-лиоцита при механическом воздействии на рецеп-торы составляет от 10 с до нескольких минут.

Различные механические воздействия вызы-вают разные реакции со стороны эндотелия. Нарастяжение эндотелиоциты реагируют деполяри-зацией мембраны и активацией, а на сдвиговоевоздействие - гиперполяризацией. В табл. 9 при-ведены эффекты различных видов механическо-го воздействия на эндотелиоциты.

Гладкие мышечные клетки сосудов, так же каки эндотелиоциты, отвечают на механические воз-действия. Например, длительное воздействие рас-тяжения вызывает снижение их пролиферативнойактивности. Воздействие повышенного напряже-ния сдвига приводит к усилению секреции ткане-вого активатора плазминогена, оксида азота, про-стациклина, ПГI2, некоторых ростовых факторов.


Таблица 9Физиологические и патологические эффекты механического воздействия на эндотелиоциты

Современная теория свертывания крови

СОВРЕМЕННАЯ ТЕОРИЯ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

Разработанная и дополненная в начале - се-редине XX века теория гемостаза базироваласьна исследованиях, выполненных in vitro, и не учи-тывала реальные условия в системе кровообра-щения. В последнее десятилетие под давлением на-копившихся фактов взгляд на механизмы гемос-татических реакций изменился. Наиболее значи-мым шагом явилась разработка каскадно-матрич-ной теории свертывания крови, в которой учте-ны не только реакции взаимодействия белковплазмы и тромбоцитов, но влияние компонентовсосудистой стенки и других клеток крови. Реак-ции гемостаза привязали к конкретным структу-рам на мембранах клеток и субэндотелия. Былиучтены особенности мембранных рецепторов кле-точных компонентов гемостаза и микроокруже-ния, в котором происходят реакции.

На рис. 64 представлена последовательностьгемостатических реакций. Однако эта схема от-ражает проблему на феноменологическом уров-не. Видимо, в организме запуск всех процессовпроисходит в течение нескольких секунд послевозникновения травмы, но каждый процесс име-

ет различную скорость развития. При этом раз-личные внешние воздействия и особенности орга-низма могут менять соотношение скоростей раз-ных гемостатических реакций.

Сложно подробно описать весь комплекс ре-акций гемостаза, привязываясь к динамике про-цесса, поэтому мы опишем лишь важнейшие мо-менты. Более подробная информация была данаранее в разделах, посвященных конкретным сис-темам. Тем не менее целостное представление не-обходимо для правильной клинической интерпре-тации лабораторных тестов.

В первый момент после повреждения сосударазвиваются следующие реакции:• Вазоконстрикция (в сосудах, имеющих мы

шечный слой). Она механически ограничивает кровопотерю, создает условия для болееэффективного тромбоцитарного гемостаза ипозволяет теснее сопрягать гемостатическиереакции в зоне повреждения.

• Активация эндотелиоцитов с последующимэкзоцитозом под воздействием стимуляторов:тромбина, гистамина, фибрина, компонентов

Рис. 64. Последовательность развития гемостатических реакций в системе кровотока после повреждения сосудистойстенки


комплемента, гипоксии. Экзоцитоз содержимо-го пулов хранения эндотелиоцитов приводит клокальному повышению концентрации про-коагулянтов, в первую очередь фактора Вил-лебранда. Видимо, на поверхности активиро-ванных эндотелиоцитов появляется тканевойфактор. Таким образом, антикоагулянтныесвойства эндотелия сменяются на прокоагулянт-

ные в зоне повреждения. Однако прокоагулянт-ныйпотенциал уменьшается по мере удаления от

области повреждения и меняется на анти-коагулянтный в области интактного эндотелия.Немедленно после повреждения происходит

контакт крови с субэндотелиальными структура-ми и развиваются события, которые описываеткаскадно-матричная теория свертывания крови.

Каскадно-матричная теория свертывания крови

В настоящее время имеются доказательстватого, что в условиях in vivo внутренний и внешнийпути активации протромбиназы взаимосвязаны.Комплекс ТФ-ф.VIIа активирует фактор IX, а фак-торы ХIIа и Ха могут активировать фактор VII.Кроме того, оказалось, что, несмотря на сходнуюструктуру мембранных липидов, клетки, несущиетканевой фактор, и активированные тромбоци-ты экспрессируют рецепторы, которые локализу-ют на их поверхности различные компонентысвертывающей системы крови.

Условно процесс свертывания крови можноразделить на три перекрывающих друг друга фазы.

1-я фаза - инициация процесса свертываниякрови. Сразу же после повреждения эндотелиякровь контактирует с матриксом субэндотелия иклетками субэндотелия (фибробластами, макро-фагами, гладкими мышечными клетками). ТФ,фиксированный на мембране этих клеток, обра-зует комплекс с плазменным ф.VII. Посколькуоколо 1% ф.VII присутствует в кровотоке в ак-тивной форме, сразу после повреждения эндоте-лия образуется некоторое количество активныхкомплексов ТФ-ф.VIIа, которые активируют ф.Хдо ф.Ха. ф.Ха на поверхности субэндотелия об-разует комплекс со своим кофактором ф.Vа. Приэтом превращение фактора V в активную формуосуществляется фактором Ха на поверхности кле-ток, несущих ТФ. Сформировавшийся протром-биназный комплекс приводит к образованию не-значительного стартового количества тромбина.

Одновременно с ф.Ха комплекс ТФ-ф.VIIаактивирует ф.IХ.

Большинство ТФ образует комплекс с неак-тивным ф.VII и не способно активировать ф.Х.Однако этот процесс имеет положительную обрат-ную связь за счет следующих механизмов: 1) акти-

вации фактора VII в комплексе с ТФ образовав-шимся фактором Ха; 2) активации ф.VII тромби-ном. Активированного на этом этапе тромбинанедостаточно для образования фибринового сгу-стка, поскольку активация протромбина на мем-бранах субэндотелиальных клеток ограничивает-ся целым рядом механизмов:• Комплекс ТФ-ф.VIIа-ф.Ха быстро подавля

ется ингибитором пути тканевого фактора(ИВП).

• ф.Ха, поступающий в плазму с поверхностимембраны, также очень быстро ингибирует-ся антитромбином III.

• Неактивированный фактор VII, который конкурирует с фактором VIIa за места связывания на ТФ, также вносит вклад в ограничение процесса образования тромбина . Егоингибиторный эффект наиболее значителенпри минимальной концентрации ТФ.2-я фаза - усиление процесса свертывания кро-

ви. Образовавшееся в первой фазе небольшое ко-личество тромбина не приводит к интенсивномуобразованию фибрина, однако это количествоважно для активизации других компонентов сис-темы гемостаза. Тромбин более устойчив к инак-тивации, чем фактор Ха. Он сохраняет свою ак-тивность в токе крови и играет ключевую роль вусилении процесса свертывания крови.

ф.IХ, активизированный на клетках субэндо-телия в 1-й фазе процесса свертывания крови, также как и тромбин, имеет относительно высокуюустойчивость к ингибированию AT. Он преодо-левает расстояние между мембраной клеток суб-эндотелия и мембраной активированного и адге-зированного тромбоцита. Там он фиксируется натромбоцитарном ф.З и образует с ф.VIIIа теназ-ный комплекс.


Адгезированные к субэндотелию в областиповреждения сосуда тромбоциты активируютсяза счет сигнала с рецепторов адгезии. Однако наи-более сильным стимулом является тромбин. Не-активированные и активированные тромбоцитыимеют несколько рецепторов для тромбина: ре-цептор, активируемый протеазой (PAR1), глико-протеин Ib-V-IX (GPIb-V-IX) и, возможно, дру-гие. Активированные тромбоциты экспонируютна своей поверхности тромбоцитарный фактор 3,или тромбоцитарный тромбопластин, и специфи-ческие рецепторы к различным факторам сверты-вания крови. Помимо изменений клеточной по-верхности, тромбоциты секретируют содержимоепулов хранения, увеличивая локальную концент-рацию прокоагулянтов.

GPIb-V-IX является рецептором не толькотромбина, но и фактора Виллебранда, оба этихбелка реагируют с различными частями рецепто-ра, поэтому они могут связываться с одним ре-цептором одновременно. Тромбин, связанный срецептором GPIb-V-IX, вычленяет ф.VIII из ком-плекса с фактором Виллебранда и активирует его.ф.VIIIa остается на тромбоцитарной поверхнос-ти, формируя теназный комплекс. Тромбин ак-тивирует фактор V, который выделяется в про-цессе секреции из альфа-гранул тромбоцитов;ф. Va также остается на поверхности активирован-ных тромбоцитов, формируя протромбиназныйкомплекс.

Еще одним фактором свертывания, активи-руемым тромбином, образовавшимся под воз-действием комплекса ТФ-ф.VIIа, является ф.ХIа,который связывается с поверхностью активиро-ванных тромбоцитов через цепь GPlba комплек-са GPlb-V-IX.

Таким образом, небольшие количестватромбина, образовавшиеся в ходе первой фазы,обеспечивают в течение второй фазы свертыва-ния крови распространение процесса активациисвертывания крови на активированную тромбо-цитарную поверхность с одновременной транс-формацией в активную форму факторов XI, IX,VIII и V.

3-я фаза - распространение процесса сверты-вания крови. Активированные тромбоциты име-ют на своей поверхности рецепторы для факто-ров XI, ХIа, IX, IХа, X, VIII, VIIIa, V, Va, Xa,протромбина и тромбина. В 3-й фазе на их по-

верхности происходит формирование теназногои протромбиназного комплексов.

ф.VIIIa/IХа начинают ограниченный проте-олиз ф.Х до ф.Ха, последний с ф.Va образует про-тромбиназный комплекс и наращивает количе-ство тромбина в зоне повреждения. Однако ак-тивированного на этом этапе тромбина еще не-достаточно для образования полноценного фиб-ринового сгустка. Критическое количество актив-ного фактора IХа, которое необходимо для оста-новки кровотечения, образуется под влияниемфактора ХIа. Показано, что ф.ХI связывается сGPIba тромбоцитов и активируется образовав-шимся тромбином. Эта положительная обратнаясвязь усиливает коагуляционный потенциал в5000-10 000 раз.

Образование теназного комплекса, состояще-го из энзима IХа и кофактора VIII, на поверх-ности тромбоцитов приводит к активации фак-тора X со скоростью, превышающей в 50-100 разактивацию фактора X под влиянием комплексаТФ-ф.VIIа. Кроме того, факторы в этом комп-лексе относительно защищены от инактивации.Вследствие этого процесса образуется значитель-ное количество тромбина, которого достаточнодля формирования гемостатического тромба.

Одновременно с фибриногеном тромбин ак-тивирует фактор XIII (фибрин-стабилизирующийфактор). Параллельно тромбин активирует тром-бин-активируемый ингибитор фибринолиза(TAFI), который тормозит развитие фибринолизаи позволяет сформироваться плотному гемо-статическому тромбу, достаточному для надеж-ной остановки кровотечения и развития репара-тивных реакций сосудистой стенки. Таким обра-зом, в зоне повреждения возникают условия дляформирования и стабилизации адекватного гемо-статического тромба.

В нормальных условиях процесс развития тром-ба ограничивается несколькими механизмами:• Тромбин в токе крови ингибируется анти

тромбином III.• На интактных эндотелиальных клетках тром

бин связывается с тромбомодулином (ТМ), приэтом тромбин теряет свои коагуляционныесвойства и одновременно приобретает способность активировать антикоагулянт протеин С.

• Эндотелиальные клетки усиливают инактивацию коагуляционных факторов антитром-


бином и TFPI, преимущественно за счет на-личия на своей поверхности гепариноподоб-ных гликозаминогликанов.

• По мере удаления от места повреждения сни-жается прокоагулянтный стимул и возраста-ет антикоагулянтный. В зоне неповрежденно-го эндотелия он преобладает и ограничиваетрост сгустка.Параллельно с развитием реакций коагуля-

ции адгезированные активированные тромбоци-ты выбрасывают содержимое своих гранул. След-ствием этого является местное нарастание концен-трации прокоагулянтов, в первую очередь фак-торов V, XIII, vWF, фибриногена. Тромбоцитар-ный фактор 4 (ТФ4) локально ингибирует гепа-рин и гепарансульфаты, усиливая процесс свер-тывания крови. Поступающие в кровь стимуля-торы агрегации тромбоцитов активируют и ре-крутируют из тока крови новые тромбоциты.

Полноценный гемостатический тромб фор-мируется через 10-15 минут после начала поли-меризации фибрина за счет стабилизации фибри-нового скелета ф.ХIII и ретракции.

Активация фибринолиза, видимо, происхо-дит в первые секунды повреждения сосуда. Одна-ко нарастание процесса фибринолиза в областиформирования сгустка происходит медленнее,чем реакции свертывания, вследствие «работы»ингибиторов фибринолиза. Это необходимо дляэффективной остановки кровотечения и репара-ции поврежденных тканей. Однако на периферии,в области неповрежденного эндотелия, фибрино-лиз значительно более выражен и ограничиваетраспространение сгустка. Постепенно, по мере ре-парации сосудистой стенки, интенсивность воз-действия прокоагулянтных стимулов снижаетсяи нарастает активность фибринолитических ре-акций, что приводит в конечном итоге к лизисусгустка и восстановлению кровотока в сосуде.

В процессе развития ответной реакции наповреждение сосудистой стенки эндотелий итромбоциты выбрасывают не только вещества,обладающие гемостатической активностью, но истимуляторы репарации, хемотаксические веще-ства для фагоцитов, иммуномодуляторы, чтообеспечивает комплексный ответ на повреждение.

Особенности физиологии и исследования гемостаза у плодов и детей

ОСОБЕННОСТИ ФИЗИОЛОГИИ И ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕМОСТАЗА УПЛОДОВ, НОВОРОЖДЕННЫХ И ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА

Система гемостаза, как и все остальные систе-мы организма, претерпевает изменения в процес-се роста и развития человека. К сожалению, нашизнания об особенностях гемостаза плода и ново-рожденного малы по сравнению с информацией огемостазе детей после года и взрослых. Для этогоесть несколько причин: во-первых, оценка гемос-таза с использованием возрастных референтныхинтервалов в раннем возрасте затруднена, по-скольку он претерпевает быстрые количественныеи качественные изменения; во-вторых, имеютсязначительные технические трудности сбора образ-цов крови; в-третьих, возможно взятие лишь не-большого количества крови, следовательно, необ-ходимо использование микрометодов; в-четвер-тых, значительная вариабельность концентрацииразличных плазматических компонентов требуетнабора больших референтных групп пациентоводного возраста, что усугубляется быстрыми (втечение нескольких часов и дней) количествен-ными изменениями концентрации и активностикомпонентов гемостаза в этом возрасте.

Гемостаз плода адаптирован к условиям внут-риутробного статуса и родовому стрессу. В тече-ние первого полугодия жизни состояние гемос-таза изменяется соответственно изменившимсяусловиям существования и к 6 месяцам соответ-ствует статусу зрелого организма. Поскольку ге-мостаз детей раннего возраста отличается от та-кового у взрослых, нарушения гемостаза в этомвозрасте также имеют свои особенности. Крометого, коррекция нарушений гемостаза у плодови детей до 6 месяцев часто требует отличногоподхода.

Важнейшей клинической особенностью состо-яния гемостаза плодов, новорожденных и детейпервых месяцев жизни является тенденция к бо-лее легкому возникновению разнонаправленныхнарушений по сравнению с детьми старшего воз-раста и взрослыми. Чем младше ребенок, чем бо-лее незрелым он родился, тем выше у него рискразвития тромботических и геморрагических ос-ложнений.


Размер, количество и время жизни тромбоци-тов в крови у плодов старше 30 недель гестации иноворожденных достоверно не отличаются от нормвзрослых людей. Количество тромбоцитов у пло-дов от 18-й до 30-й недели гестации относительнониже, чем у взрослых. Структура тромбоцитов изпуповинной крови под электронным микроскопомне отличается от структуры тромбоцитов взрослыхлюдей. Однако концентрация серотонина и АДФ вплотных гранулах составляет менее 50% от взрос-лой нормы. Также на мембранах тромбоцитов изпуповинной крови концентрация GPIIb-IIIa суще-ственно ниже в отличие от GPIb и Р-селектина, ко-торые представлены «нормальным» количеством.

Концентрация и относительное содержаниеактивных высокомолекулярных мультимеров

фактора Виллебранда (vWF) в пуповинной кро-ви выше, чем в крови детей старшего возраста ивзрослых, а активность металлопротеаз, редуци-рующих высокомолекулярный vWF, ниже. Со-став vWF в пуповинной крови сходен с соста-вом vWF в пуле хранения эндотелия. Эта осо-бенность, видимо, является причиной положи-тельного теста агрегации тромбоцитов из пупо-винной крови с малыми дозами ристоцетина ивносит вклад в укороченное время кровотеченияу новорожденных.

Важнейший для агрегации тромбоцитов ре-цептор GPIIb-IIIa появляется на мембране на ран-них сроках гестации. Фибриноген присутствуетв достаточной концентрации во все сроки геста-ции. Однако адреналин-индуцированная агрега-


ция в целом снижена относительно взрослых нормиз-за меньшей доступности α-адренергическихрецепторов. Агрегация тромбоцитов пуповиннойкрови, индуцированная АДФ, коллагеном, тром-бином и арахидоновой кислотой, варьирует, нов то же время имеется тенденция к более низкимпоказателям относительно норм взрослых людей.К концу 2-х суток жизни у здоровых новорожден-ных агрегация тромбоцитов с АДФ уже не отли-чается от таковой у взрослых. Исследования фун-кции тромбоцитов новорожденных в цельнойкрови методом проточной цитометрии показалисниженную реакцию на тромбин, комбинациюАДФ и эпинефрина и аналог тромбоксана А,.

Наконец, ретракция кровяного сгустка у пло-дов и новорожденных такая же, как у взрослых.

Время кровотечения, возможно, лучший внастоящее время тест, отражающий взаимодей-ствие тромбоцитов и сосудистой стенки in vivo.Исследование этого теста у новорожденных по-казало в целом более короткое время.

Исследование активности тромбоцитов с ис-пользованием динамического агрегометра PFA-100,требующего очень маленькое количество крови,

идеально для новорожденных и грудных детей.Результаты этого исследования у здоровых ново-рожденных не отличаются от таковых у взрослыхлюдей.

При исследовании состояния тромбоцитарно-го звена в процессе родов были получены убедитель-ные доказательства его активации. Уровень тром-боксана А2, β-тромбоглобулина и тромбоцитарно-гофактора 4 был повышен, содержание гранул сни-жено, а доступность рецепторов эпинефрина умень-шена из-за их загруженности агонистами. Видимо, вродах имеется многофакторный механизм активациитромбоцитов, включающий температурные колеба-ния, гипоксию, ацидоз, адренергическую стимуля-цию, тромбогенный эффект амниотической жидко-сти. Активация коагуляционной системы приводитк парадоксальным изменениям в тестах: с одной сто-роны, выявляется удлинение времени свертыванияв одностадийном исследовании, с другой стороны,время свертывания цельной крови, исследованноеразличными методами, укорочено по сравнению снормой взрослых людей. Все эти данные свидетель-ствуют, что активация гемостаза в родах носит ог-раниченный и строго регулируемый характер.

Антикоагулянтные свойства сосудистой стенки

Исследование обмена полиненасыщенных жир-ных кислот выявило избыток синтеза простацикли-на сосудами пуповины относительно сосудов взрос-лых. Оксид азота, вырабатываемый сосудистой стен-кой, играет большую роль в формировании нормаль-ного сосудистого тонуса в легких плода и новорож-денного, он модулирует физиологические изменениясосудистой резистентности в процессе родов.

Исследования показали, что пуповиннаякровь генерирует меньше тромбина в присутствииэндотелиоцитов пуповины. Вероятно, это свиде-тельствует об активации ингибиторов свертыва-ния крови, в первую очередь АТШ, клетками эн-дотелия пуповины.

Коагуляционное звено гемостаза

Белки системы гемостаза не проникают че-рез плацентарный барьер, они синтезируютсяорганизмом плода de novo. Концентрация боль-шинства плазменных белков гемостаза стано-вится измеряемой после 10 недель гестации ипостепенно повышается по мере созреванияплода. В приложении, в табл. 1-8 приведенырезультаты исследования активности белковгемостаза и тестов, полученных у плодов раз-

ного возраста в зависимости от сроков геста-ции, недоношенных и доношенных новорож-денных, младенцев и детей разного возраста.Эти результаты с осторожностью можно ис-пользовать при оценке гемостаза недоношен-ных новорожденных. Корректные показателигемостаза недоношенных новорожденных мало-доступны, поскольку почти все недоношенныеимеют различную патологию.


Коагуляционные белки. Активность витамин-К-зависимых факторов, фактора XI и факторовконтактной системы у плодов и новорожденныхдетей более низкая, чем у взрослых и постепенноповышается, доходя до взрослой нормы к 6 меся-цам. Следствием этого является более длинноеAЧТВ. Плазменный уровень vWF и ф.ХIII у но-ворожденных аналогичен взрослым нормам. У пло-да активность ф.Vи ф.VIII снижена на ранних сро-ках гестации и повышается до нормы взрослогочеловека ко времени рождения.

Феталъная форма белков коагуляции. Некото-рые коагуляционные белки (ф.ХII, ф.VII, прекал-ликреин, фибриноген) имеют фетальную форму.Особенностью фетального фибриногена являет-ся повышенное относительно зрелой формы со-держание сиаловой кислоты. Концентрация фиб-риногена у плодов значительно ниже, чем у взрос-лых и постепенно повышается. Рождаются здо-ровые дети с уровнем фибриногена, близким квзрослым нормам, однако он может повышатьсяв течение первой недели жизни.

Генерация тромбина у плодов и новорожден-ных замедлена и снижена, что напрямую связанос концентрацией протромбина и других прокоа-гулянтов.

Прямые ингибиторы тромбина. Из трех важ-нейших ингибиторов тромбина - АТIII, кофак-тора гепарина II, α2-макроглобулина - последнийиграет большую роль у новорожденных, чем увзрослых, так как концентрация других ингиби-торов относительно снижена.

Помимо этого, в пуповинной крови находятциркулирующий антикоагулянт, аналогичныйгликозаминогликанам дерматансульфата, - фе-талъный антикоагулянт. Его концентрация вплазме составляет около 0,29 мкг/мл, молекуляр-ная масса - 150 кДа. Есть мнение, что фетальныйантикоагулянт потенцирует активность кофакто-ра гепарина П. Видимо, он поступает в кровь пло-да из крови матери и (или) синтезируется в пла-центе. Длительность циркуляции фетального ан-тикоагулянта в крови новорожденного неизвест-на, однако он в течение недели обнаруживается вкрови недоношенных детей, больных респиратор-ным дистресс-синдромом (у которых часто при-чиной патологии является недоразвитие сурфак-танта). За исключением этих особенностей, актив-ность ингибирования тромбина остается более

низкой у новорожденных детей по сравнению совзрослыми.

Система протеинов С и S. При рожденииплазменная концентрация протеина С значитель-но ниже, чем у взрослых, и остается сниженной втечение первого полугодия жизни. Концентрацияобщего протеина S тоже снижена, однако функ-ционально это практически несущественно, по-тому что большая часть протеина S находится всвободной форме. С4-связывающий протеин уноворожденных низкий. Плазменная концентра-ция тромбомодулина повышена в раннем детствеи постепенно снижается до взрослой нормы пос-ле десяти лет. Однако разницы в экспрессии тром-бомодулина на эндотелии в зависимости от воз-раста выявлено не было.

Физиологические механизмы, потенциальнообъясняющие разницу плазменных концентрацийразличных белков гемостаза у плодов и новорож-денных, включают сниженную продукцию и ус-корение клиренса. Исследования показали уско-ренный клиренс фибриногена у новорожденныхпо сравнению со взрослыми. Период полувыве-дения антитромбина у здоровых новорожденныхменьше. Видимо, ускоренный в целом метаболизмноворожденных и детей раннего возраста вноситвклад в относительно быстрое выведение коагу-ляционных белков.

Активация системы коагуляции в моментрождения не влечет за собой значимого потреб-ления факторов свертывания крови и не являетсяпричиной низкой активности ряда компонентовгемостаза, а представляет собой жестко контро-лируемый, ограниченный процесс.

Система фибринолиза. У новорожденных кон-центрация плазминогена и α2-антиплазмина дос-товерно ниже, чем у взрослых, а α2-макроглобу-лина - выше. Концентрация тканевого активато-ра плазминогена (t-PA) и ингибитора активато-ра плазминогена 1-го типа (PAI-1) у плодов сни-жена, но после рождения ребенка происходит зна-чительное нарастание их активности в крови; на-чиная с 1-х суток жизни их концентрация досто-верно превышает норму взрослых людей.

Плазминоген, как и фибриноген, имеет фе-тальную форму, точнее 2 гликоформы, содержа-щие большее количество маннозы и сиаловойкислоты. Энзиматическая активность фетально-го плазминогена и его способность связываться


с фибрином/фибриногеном ниже, чем у зрелойформы.

В целом активность фибринолитической сис-темы у новорожденных имеет разнонаправленныетенденции. Укороченное время лизиса эуглобули-нового сгустка и повышение уровня продуктов

фибринолиза в плазме новорожденных доказыва-ет, что эта система активируется в родах. В то жевремя способность плазмы генерировать плазминв ответ на воздействие различных активаторовфибринолиза снижена, что является следствиемотносительно низкого уровня плазминогена.

Особенности физиологии и исследования гемостаза у женщин

ОСОБЕННОСТИ ФИЗИОЛОГИИ И ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕМОСТАЗА УЖЕНЩИН ПРИ МЕНСТРУАЦИИ И БЕРЕМЕННОСТИ

Менструальные кровотечения

Менструация - физиологическое периодичес-кое кровотечение из матки. Кровотечению предше-ствуют изменения сосудов матки, которые сначаласокращаются, а затем расслабляются и тем самымобеспечивают менструальное кровотечение. Оба этипроцесса контролируются простагландинами, ко-торые образуются в слизистой и мускулатуре мат-ки. По крайней мере, 2 механизма участвуют в обес-печении менструальных кровотечений:1. Ингибирование агрегации тромбоцитов, ко

торое обеспечивается теми же простагландинами, которые определяют дилатацию сосудов матки.

2. Усиление фибринолиза . Менструальноекровотечение поддерживается образованием вэндотелиальных клетках большого количестватканевого активатора плазминогена (t-PA), чтосопровождается примерно 5-кратным увели-

чением его содержания в менструальной кро-ви по сравнению с венозной кровью. Крометого, в менструальной крови содержание про-урокиназы (scu-PA) может быть повышено до50 раз по сравнению с венозной кровью. Боль-шое количество проурокиназы поддержива-ется фактором некроза опухоли-α (ФНО-α),вырабатываемым эндометриальными клет-ками. ФНО-а стимулирует образование scu-PA эндотелиальными клетками сосудовматки.Тканевой активатор и урокиназа стимулиру-

ют переход плазминогена в плазмин, которыйэффективно разрушает образующийся в менстру-альной крови фибрин, поэтому фибриновый сгу-сток не формируется. Усиление фибринолиза применструации - всегда локальный процесс, огра-ниченный пределами матки.

Изменения гемостаза при беременности

Изменения показателей системы гемостаза на-чинают регистрировать не раньше, чем со 2-го ме-сяца беременности, затем изменения прогрессивноувеличиваются вплоть до родов. Скрининговые те-сты ПТ, АЧТВ и показатели фибринолиза указы-вают на развитие гиперкоагуляции и гипофибри-нолиза. Отдельные факторы гемостаза чаще всегоменяются следующим образом:• Концентрация фибриногена и содержание

ф.VII и ф.VIII увеличиваются. Причем дляф.УП имеет место пропорциональное повышение как активности, так и содержания(VII:C и VII:Ag), тогда как ф.VIII непропорционально повышается по отношению к комплексу ф.VII- vWF.

• Имеет место некоторое повышение факторовIX, X и протромбина.

• Содержание ф.ХШ имеет тенденцию к снижению.

• Обнаруживают уменьшение свободного протеина S, что связывается с увеличением С4-связывающего белка.

• Высокочувствительными методами регистрируется повышение активационных маркеровпротромбина - F1+2.

• Обнаруживается повышение агрегации тромбоцитов.Наиболее значительным является угнетение

фибринолиза во 2-м и особенно в 3-м триместребеременности. Причем количество плазминогена,эндогенных и экзогенных активаторов фибрино-лиза имеет тенденцию к повышению (t-PA, u-PA,ф.ХII, прекалликреин и высокомолекулярныйкининоген). Угнетение же фибринолиза связано

Особенности физиологии и исследования гемостаза у женщин

с существенным увеличением ингибиторов: ингиби-тора активатора плазминогена 1-го типа (PAI-1),который освобождается из эндотелиальных кле-ток, и особенно ингибитора активатора плазми-ногена 2-го типа (PAI-2), который нарабатыва-ется плацентой. Ингибирование фибринолиза прибеременности - основная причина сдвига гемо-статического баланса к гиперкоагуляции и фор-мированию предтромботического состояния.

Клинический пример 1

Пациентка 20 лет. Беременность 32 недели.Без осложнений.

Коагулологическое обследование: АЧТВ 31 с(норма для взрослых, принятая для общей попу-ляции в данной лаборатории, - 35-45 с), ПТ 100%,ТВ 26 с (норма 28-30 с), фибриноген 4,8 г/л (нор-

После родов все показатели гемостаза возвра-щаются к норме примерно за 6 недель.

Гиперкоагуляция при беременности - физио-логическое состояние, которое обеспечивает эф-фективную имплантацию яйцеклетки, адекватноесоединение плаценты с маткой и остановку кро-вотечения во время родов. Однако необходимоучитывать, что при беременности повышен рисквенозных тромбозов и эмболии легочных артерий.

ма 2-4 г/л), РКФМ 7,5 мг/дл (норма до 4 мг/дл),лизис эуглобулиновой фракции 220 мин (норма140-240 мин). Агрегация тромбоцитов с АДФ(2,5 мкмоль/л): степень 72%, скорость 40%>/мин,время 7'25", однофазная, необратимая.

Заключение: коагулограмма соответствуетсроку беременности.

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

ОБЕСПЕЧЕНИЕ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИИ ГЕМОСТАЗА В

Общие подходы

Исследование нарушений гемостаза прово-дится в несколько этапов.

Перед проведением лабораторного исследо-вания собирается анамнез. Во-первых, необходи-мо выяснить наличие клинических признаков ге-моррагического или тромботического заболева-ния у пациента. Во-вторых, требуется определитьналичие таких признаков у членов семьи. Рас-спрос о семейных заболеваниях - очень важныйэтап, так как многие нарушения гемостаза насле-дуются. При сборе анамнеза необходимо обра-щать внимание на то, имеются ли признаки врож-денного нарушения гемостаза или это приобре-тенное состояние. При наличии признаков при-обретенного нарушения гемостаза необходимоучитывать сопутствующие заболевания и симп-томы, а также применяемые пациентом медика-ментозные препараты, которые могли повлиятьна гемостаз.

Однако данные анамнеза являются субъек-тивной информацией и не всегда помогают в ус-тановке правильного диагноза. Клиническое об-следование пациента выявляет ряд признаков на-рушения гемостаза - петехии, синячки на коже,кровоизлияния в слизистые оболочки, признакивенозного застоя или артериальной недостаточ-ности и др. Необходимость сбора анамнеза и ос-мотра перед началом лабораторного обследова-ния важна еще и потому, что проведение всех воз-можных тестов оценки состояния системы гемо-стаза - чрезвычайно дорогостоящее занятие. Кро-ме того, в настоящее время нет лабораторных те-стов, позволяющих досконально охарактеризо-вать все звенья системы гемостаза. Поэтому напредварительном этапе необходимо выбрать ра-циональную палитру тестов, наиболее соответ-ствующую клинической картине нарушений уданного пациента.

На следующем этапе рекомендуется провес-ти некоторое количество скрининговых тестов,которые позволят определить направленностьнарушения. И лишь на следующем этапе рацио-нально выполнить соответствующие данным кли-нической картины и скрининговых тестов анали-зы, способные выявить конкретные нарушениягемостаза у пациента.

Важно понимать, что применяемые тестыдолжны быть информативными, то есть обладатьвысокой чувствительностью по выявлению пато-логии и достаточной специфичностью. В любомслучае лучше использовать несколько тестов,чем искать один даже самый специфичный тест,так как сама комбинация дает дополнительнуюи зачастую решающую информацию. Это объяс-няется тем, что практически все элементы систе-мы гемостаза в той или иной степени связаны,изменение в одном элементе затрагивает и дру-гие его звенья. Поэтому во всех случаях при на-значении и проведении расширенной коагу-лограммы необходим тесный контакт с лечащимврачом и, может быть, совместное с ним назна-чение перечня дорогих и редких, но обоснован-ных исследований.

Так как лабораторное исследование гемоста-за может быть достаточно дорогим, следует до-казывать администрации, что лечение больныхс тромбозами и патологическими кровотечения-ми значительно дороже, чем любые лаборатор-ные исследования. А затраты на приобретениекачественных реактивов и оборудования окупа-ются исключением повторных исследований ипроведением адекватной, эффективной и контро-лируемой терапии.

Помимо коагулологических тестов, при ис-следовании нарушений гемостаза большую по-мощь оказывают лабораторные тесты общего


назначения. Они могут указать на заболеванияпечени или почек, которые имеют значение длясинтеза и катаболизма факторов гемостаза. Опу-холь с метастазами способна стать причинойтромбоза. Лекарственные препараты могут вы-зывать кровотечения, а в некоторых случаях пе-редозировка прямых и непрямых антикоагулян-тов, наоборот, приводит к тромбофилии.

Важную информацию о причинах развиваю-щихся тромбозов и кровотечений могут дать та-кие лабораторные исследования, как общий ана-лиз крови, определение гомоцистеина, витами-нов, гормонов, наличие аутоантител. Для паци-ентов, леченных препаратами крови, необходи-мо проводить тесты на вирусоносительство.

Преаналитический этап

Взятие крови

Существенное значение имеет, на какой кро-ви выполняется тот или иной тест: на цельной,стабилизированной капиллярной или на плазмевенозной крови.

Капиллярная кровь

Капиллярная кровь как диагностический ма-териал имеет ограниченное значение. Тем не ме-нее у больных, принимающих непрямые антикоа-гулянты, использование капиллярной крови изпальца позволяет избежать повторного травмиро-вания и тромбирования вен, затрат времени нацентрифугирование крови и отделение плазмы.При этом использование капиллярной крови уве-личивает вероятность преаналитической ошибки;становится сложнее стандартизовать исследова-ние, требуются специальные реактивы и оборудо-вание. Стоимость реактивов для исследования про-тромбинового времени в капиллярной кровивыше, их стабильность ниже, чем обычного тром-бопластина, используемого для анализа плазмывенозной крови. Для избежания неверных резуль-татов капиллярная кровь может использоватьсятолько для некоторых специально адаптирован-ных методов: подсчет тромбоцитов, определениевремени кровотечения, определение протромбино-вого (ПВ) и активированного частичного тром-бопластинового времени (АЧТВ). ОпределениеАЧТВ в капиллярной крови используется исклю-чительно для мониторинга гепаринотерапии.

Определение ПВ в капиллярной крови ис-пользуется в основном для контроля за приемомнепрямых антикоагулянтов в амбулаторных идомашних условиях, а также для экспресс-диаг-ностики у детей первых месяцев жизни.

Фирма «Roche Diagnostics» выпускает комби-нированный тромбопластиновый реагент «HepatoQuick», который специально предназначен для ра-боты с капиллярной кровью. В состав реактивавходят тромбопластин, фактор V и фибриноген,для определения используется 20 мкл цельной кро-ви. Реактив прокалиброван. Для проведения ра-бот по контролю качества используются специаль-но подготовленные лиофилизированные плазмы.При использовании реактива предусмотрена воз-можность коррекции влияния гематокрита на ре-зультат теста. Все эти условия позволяют прово-дить контроль за антикоагулянтами непрямогодействия по протромбиновому тесту, выполняемо-му на полученной из пальца капиллярной крови.Этот метод оценивает международное нормализо-ванное отношение (MHO) в микрообъемах цель-ной или стабилизированной цитратом капилляр-ной крови. Существенным ограничением методаявляется то, что используемый в нем реагент сло-жен, дорог и малодоступен многим практическимлабораториям. Одновременно фирма «Roche» пред-лагает портативный прибор «CoaguCheck Plus» дляопределения ПВ и АЧТВ, в котором в качествебиологического материала используется каплякапиллярной крови. Прибор может применятьсяв амбулаторных условиях или самостоятельно па-циентами для контроля терапии непрямыми анти-коагулянтами (рис. 65).

Основные проблемы и рекомендации при рабо-те с капиллярной кровью:• При прохождении крови через поврежденную

ткань активируется свертывание, длительность взятия крови является критическим показателем.

• Немецкий стандарт DIN 58910-D: кровь, вытекающая самотеком, должна быть забрана


Рис. 65. Портативный прибор «CoaguCheck Plus»(фирма «Roche») для определения ПВ и АЧТВ:А - общий вид и картридж для программированияприбора, Б - тест-полоска вводится в прибор, В -капля капиллярной крови наносится непосред-ственно на тест-полоску, помещенную в прибор,Г - результат готов через несколько минут, причемданные по протромбиновому времени (ПВ) пред-ставляются сразу в единицах международного нор-мализованного отношения (MHO)

в стерильный капилляр и перенесена в нитрат-ный буфер в течение 10 с. Чистое и сухое ме-сто кончика пальца или ушной мочки пунк-тируется стерильным скарификатором. Про-кол должен быть достаточно глубоким, что-бы кровь текла самотеком. Не допускаетсядавление или сжатие. Для исследования ис-пользуются первые капли крови, берется 10-50 мкл в стерильный капилляр, который дер-жится горизонтально, один конец касаетсяместа прокола. В капилляре кровь с цитра-том не перемешивается, предварительныйзабор антикоагулянта только усложняет про-цедуру. Капиллярная кровь при взятии в про-бирку с цитратом должна быть перемешанаво время или сразу после взятия. Не допуска-ется, чтобы кровь стекала на дно по стенкепробирки, она должна прямо скапывать вцитрат, перемешиваясь с ним (рис. 66).

Венозная кровь

До настоящего времени венозная кровь - ос-новной источник материала для анализа состоя-ния гемостаза. Взятие венозной крови - крити-ческая процедура для тестов на коагулограмму.Взятие крови должно быть приурочено ко време-ни исследования, чтобы свести до минимума вре-мя хранения проб. В то же время, учитывая су-точные биоритмы, рекомендуется брать кровь на

исследование утром от 7 до 9 часов. Необязатель-но брать кровь строго натощак, можно рекомен-довать пациенту легкий завтрак, но без жировой

Рис. 66. При взятии крови в антикоагулянт не допускает-ся стекание крови по коже пальца, по стенке пробирки илюбой другой поверхности, так как мгновенно происходитконтактная активация процесса свертывания. Кровь само-теком из прокола должна попадать прямо в антикоагулянт,перемешиваясь с ним


пищи. Исследование рекомендуется проводить упациентов, отдохнувших не менее 15 мин посленезначительной физической нагрузки.

Важным моментом является длительностьналожения манжеты. Во время венопункции дли-тельность венозного стаза рекомендуется не бо-лее 1 мин, а сила сжатия - ниже на 10 мм Hg диа-столического давления крови. Стаз крови придлительном наложении манжеты вызывает акти-вацию фибринолиза, повышение концентрациифакторов гемостаза из-за освобождения белковиз сосудистой стенки (в том числе t-PA и vWF) иактивацию тромбоцитов. Так, после 3 мин стазакрови происходит укорочение ПВ, АЧТВ и тром-бинового времени, примерно на 10% повышает-ся количество антитромбина, фибриногена и дру-гих факторов свертывания, ф.VIII в отдельныхслучаях повышается более чем на 20%.

Кровь берут из локтевой вены утром натощаксиликонированной иглой с широким просветом(внутренний диаметр 1,0 - 0,8 - 0,6 мм) без шпри-ца (самотеком). Использование шприца нежела-тельно. Если кровь брать слишком быстро, то из-за турбулентного движения крови в шприце и сме-шивании ее с воздухом (вспенивание) происходитактивация тромбоцитов (сопровождается измене-нием формы тромбоцитов и освобождением изних тромбоцитарных факторов) и факторов свер-тывания крови. Если кровь брать медленно, то вшприце может начаться необратимое свертыва-ние, опять же с активацией факторов гемостаза.

В современной лабораторной практике всечаще используются системы вакуумного заборакрови (вакутейнеры и вакуэты). Активация гемо-стаза в них предотвращается за счет моменталь-ного смешивания поступающей крови с раство-ром цитрата натрия. Если в силу технических об-

стоятельств забор крови проводится пластико-вым (не стеклянным) шприцем, необходимо вы-полнять эту манипуляцию как можно аккуратнее,избегая вспенивания и резкого поступления кро-ви в шприц. После этого кровь необходимо так-же аккуратно в минимальные сроки перенести впластиковую или стеклянную силиконированнуюпробирку с раствором цитрата натрия.

При прокалывании иглой сосуда тканевыйтромбопластин попадает с током крови в пробир-ку, поэтому первые капли крови не годятся дляпроведения коагулологических тестов. Кровь нагемостаз желательно брать во вторую пробирку.Кровь из первой пробирки рекомендуется исполь-зовать для подсчета форменных элементов. Так,например, АЧТВ, определяемое в первой пробир-ке, может быть на 20% короче, чем во второй.

Кровь рекомендуется брать:• «бабочкообразной» иглой в градуированную

силиконированную стеклянную или пластиковую пробирку, содержащую антикоагулянт;

• в градуированный пластиковый шприц, содержащий антикоагулянт;

• в моноветт - коммерческая аспирационнаясистема (градуированный шприц), содержащая антикоагулянт;

• в вакутейнер - коммерческая система (пробирка с определенным отрицательным давлением для взятия точного объема крови), содержащая антикоагулянт (рис. 67);

• в специальные пробирки для транспортировки крови для исследования гемостаза. Например, пробирка СТАД (рис. 68) содержит цитрат натрия (0,105 М), теофиллин, аденозин идипиридамол. Три последних вещества предотвращают активацию тромбоцитов. СТАД

Рис. 67. Вакутейнер - система для взятия венозной крови, состоит изаспирационной иглы, переходника и пробирки с отрицательным давле-нием для набора крови, После введения иглы в вену пробирки могутменяться, при этом в каждую берется дозированная порция крови

Рис. 68. Пробирка СТАД специально созданадля транспортировки крови на исследованиегемостаза, содержит цитрат натрия (0,105 М),теофиллин, аденозин и дипиридамол


существуют и в виде вакутейнеров. Скринин-говые тесты и исследования отдельных фак-торов свертывания могут выполняться изСТАД так же, как из цитратной плазмы. Внекоторых клинических ситуациях (например,при шоке) извлечение крови из локтевой венызатруднительно из-за низкого давления. Попыткинабирать кровь с помощью шприца часто закан-чиваются неудачей: кровь сворачивается. В не-отложных ситуациях, когда невозможно взятиекрови из периферической вены, можно использо-вать кровь, полученную из центрального (подклю-чичного) катетера. При этом желательно удалитьдо 10 мл крови (использовать ее на проведение ге-матологических или биохимических исследова-ний), а затем забрать кровь на коагулологическиеисследования. Такой способ взятия крови приме-ним только в тех случаях, когда в катетер не вво-дился гепарин. Если же через этот катетер гепа-рин вводился, то удаляют до 20 мл крови, а затемберут кровь на исследование гемостаза. Тем неменее даже в этом случае приоритет должны по-лучать гепарин-независимые тесты (ПВ, рептилаз-ное время, фибриноген, фибрин-мономеры, анти-тромбин), так как сохраняется высокая вероят-ность влияния следов гепарина на такие тесты, какАЧТВ, тромбиновое время.

Положение тела

Положение тела влияет на состав крови, чис-ло клеток, состав белков и белково-связываю-щих макромолекул, особенно выраженные изме-нения наблюдаются у пациентов с отеками. Уро-вень этих показателей всегда выше в положениистоя, так как при этом часть жидкости из сосу-дистого ложа переходит в окружающие ткани.При переходе из стоячего положения в сидячее,а особенно в положение лежа, жидкость быстровозвращается в сосуды («разведение крови»),этот эффект в большей степени выражен у паци-ентов с отеками. У здоровых людей через 8 ч ле-жания в постели концентрация фибриногена и ак-тивность антитромбина в крови примерно на 20%ниже, чем после 1 ч в положении стоя. У больныхс отеками эта разница будет еще больше. Поэто-му при мониторинге за состоянием пациентакровь всегда нужно брать из одного и того жеположения пациента.

Влияние физической нагрузкии эмоционального стресса

Физическая нагрузка и эмоциональные пере-живания сопровождаются изменениями плазмен-ного гемостаза, фибринолиза и функции тромбо-цитов. После серии приседаний содержание вплазме фактора Виллебранда (vWF:Ag) увеличи-вается до 50%о, у спортсменов после бега на 10 кмсодержание ф.VIII повышается на 60%, vWF -примерно в 3 раза, что приводит к укорочениюАЧТВ. Активация фибринолиза после физичес-кой нагрузки связана с повышением в плазме тка-невого активатора плазминогена (t-PA). Анало-гичные изменения наблюдаются у пациентов, пе-ренесших эмоциональный стресс.

Влияние факторов преаналитического этапана показатели плазменного гемостаза представ-лено в табл. 10.

Влияние пищи на показатели гемостаза

Практика показывает, что исследование ге-мостаза необязательно проводить натощак. Лег-кий завтрак без жира даже показан перед взяти-ем крови на исследование гемостаза.

Характер пищи после длительного периодаголодания оказывает влияние на показатели плаз-менного гемостаза и фибринолиза.

Жирное мясо уменьшает фибринолитическуюактивность, в то же время бесхолестериновая ди-ета способствует повышению фибринолитичес-кой активности крови.

Фрукты и зеленые овощи в большом количе-стве способствуют активации фибринолиза в ос-новном за счет уменьшения ингибитора актива-тора плазминогена (PAI-1).

Рыбная диета в течение нескольких недельсопровождается уменьшением количества и агре-гации тромбоцитов, а также снижением фибри-нолиза. Уменьшение агрегации тромбоцитовобъясняется увеличением в их мембране полине-насыщенных жирных кислот, которыми богатарыба и морепродукты.

Витамин С, витамин Е, лук и чеснок могутвызвать нарушения агрегации тромбоцитов.

Витамин К в организме человека частичносинтезируется микрофлорой кишечника, частич-но поступает с пищевыми продуктами. Несмотряна то что при применении per os антибиотиков


Влияние различных факторов преаналитического этапана результаты коагулологических исследований

Таблица 10

Преаналитические факторы Влияние

Время суток Снижение содержания факторов свертывания и повышение уровня PAI-1в ночное время

Прием пероральных контрацептивов Повышение активности большинства факторов свертывания, агрегациитромбоцитов, снижение уровня AT

Длительный стаз (более 3 мин) Увеличение фибринолитической активности, укорочение АЧТВ, ПВ, ТВ,повышение уровня фибриногена, AT

Стресс, физическая нагрузка Повышение фибринолитической активности (уровня t-PA), укорочениеАЧТВ, активация фактора VIII, увеличение vWF

Положение тела В положении стоя происходит относительное увеличение содержанияфакторов свертывания

Температура +18... +24 °С в течение8 часов

Снижение активности факторов VIII, V и IX (удлинение АЧТВ)

Температура +4 °С Увеличение активности факторов VII, XI и XIIширокого спектра могут возникнуть кровотече-ния из-за недостатка витамин-К-зависимых фак-торов, тем не менее для организма важен и пище-вой витамин К. Витамин К в больших концент-рациях содержится в овощах (шпинате, кабачках),злаках и печени. ПТ может стать патологическиудлиненным, если полностью заменить в пищехлеб на помидоры, которые не содержат витами-на К. У больных, принимающих непрямые анти-коагулянты, исключительно овощная диета вбольших количествах требует дополнительнойкорректировки антикоагулянтного потенциалакрови по ПТ. Если такую коррекцию проводить,то овощная диета не будет доставлять особыхпроблем пациентам, принимающим непрямые ан-тикоагулянты.

Алкоголь влияет на показатели системы гемо-стаза в зависимости от дозы. После приема алко-голя наблюдается уменьшение антитромбина ифибриногена, повышение ингибитора активато-ра плазминогена и уменьшение времени крово-течения. Хронический алкоголизм сопровожда-ется уменьшением количества тромбоцитов и на-рушением их агрегации, которые однако доста-точно быстро восстанавливаются после выходаиз запоя.

Кофе даже после 5 чашек не влияет на пока-затели свертывания крови. Большие дозы кофеи-на повышают количество t-PA и уменьшают ак-тивность PAI-1.

Курение приводит к увеличению агрегациитромбоцитов и их адгезии, повышению β-тром-боглобулина, t-PA, активности PAI-1 и фибрино-гена, снижению ф.VII.

Кокаин в большой дозе может вызвать на-столько сильную активацию и агрегацию тром-боцитов, что это перерастает в тяжелую тромбо-цитопению и ДВС-синдром.

Интерферирующие лекарственные препараты

Оральные контрацептивы повышают актив-ность большинства факторов плазменного гемо-стаза, увеличивают агрегацию тромбоцитов иснижают уровень протеина С и протеина S. Какправило, сами оральные контрацептивы не вы-зывают клинических проявлений патологии гемо-стаза, но они резко увеличивают вероятностьтромбозов при наличии наследственных или при-обретенных риск-факторов тромбофилий.

Валъпроиковая кислота (используется в пре-паратах для лечения эпилепсии) может вызватьтромбоцитопению, уменьшение уровня фибрино-гена, состояние, имитирующее болезнь Виллеб-ранда II типа.

Аспарагиназа (препарат для лечения лимфо-бластных лейкозов) может приводить к снижениюфибриногена, уменьшению антитромбина, про-теинов С и S, витамин-К-зависимых факторов,снижению плазминогена.


Антибиотики широкого спектра действиямогут привести к различным отклонениям в по-казателях гемостаза. Принимаемые внутрь анти-биотики вызывают дефицит витамина К в орга-низме за счет подавления активности бактериаль-ной микрофлоры. После назначения высокойдозы пенициллина наблюдалась тромбоцитопе-ния, нарушения функций тромбоцитов, удлине-ние тромбинового времени.

Анальгетики (нестероидные противовоспали-тельные, антиревматоидные, жаропонижающиепрепараты), содержащие ацетилсалициловуюкислоту, влияют на функцию тромбоцитов. Нео-братимое ингибирование циклооксигеназы вызы-вает подавление, вплоть до полного отсутствия,адгезии тромбоцитов. Другие анальгетики (индо-метацин, фенилбутазон, диклофенак) подавляютагрегацию тромбоцитов в меньшей степени, чемаспирин.

Подбор антикоагулянтов

Материалом для коагулологических исследо-ваний является плазма (рис. 69).

Для получения плазмы или крови для лабо-раторных исследований используют противосвер-тывающие вещества (табл. 11). Согласно стандар-ту для производителей DIN ISO Standard 6710коммерческие пробирки с антикоагулянтом ме-тятся цветом крышки: пробирки с ЭДТА закры-ты крышкой светло-лилового (лаванды) цвета,пробирки с гепарином - зеленой, пробирки с цит-ратом - синей крышкой.

Трехзамещенный цитрат натрия обладаетспецифической способностью стабилизировать

Рис. 69. Получение фракций крови для проведения ко-агулологических исследований

лабильные факторы свертывания (V и VIII). Цит-ратная плазма, обогащенная тромбоцитами, ис-пользуется для изучения их агрегации. В связи сэтим цитрат натрия является антикоагулянтомвыбора для коагулологических исследований.В соответствии с рекомендацией ВОЗ концентра-ция цитрата должна быть 109 ммоль.

Кровь смешивают с 3,8% раствором цитратанатрия в соотношении 9:1. На этом этапе могутбыть допущены три ошибки.

Первая ошибка - неточность приготовленияраствора стабилизатора. Важно учесть, что трех-замещенный 5,5-водный цитрат натрия готовитсяв концентрации 3,8% (0,11 моль), а 2-водный - в кон-центрации 3,2%) (0,11 моль). Американский Коми-тет Стандартизации Клинических Лабораторий

Применение и механизм действия антикоагулянтовТаблица 11


рекомендует для коагулологических исследованиибуферный раствор 3,2% цитрата. Забуферивание ан-тикоагулянта способствует большей стабилизациилабильных факторов свертывания. Хранение ра-створа цитрата допускается в течение 1 недели при+2...+8 °С. Более длительное хранение приводит кбактериальному загрязнению и снижению концен-трации цитрата натрия.

Вторая ошибка связана с тем, что нарушает-ся принятое соотношение крови и раствора цит-рата (9:1), поскольку раствор цитрата остается вплазме и не проникает в клетки крови. Считает-

ся, что в пределах разведения крови цитратом 9:1и 12:1 практически нет различий в результатахкоагулологических тестов. Большее количествоантикоагулянта по отношению к плазме можетвызвать удлинение ПВ и АЧТВ (рис. 70).

Такая ситуация может возникнуть, когда вприготовленную заранее пробирку с цитратомнабрано слишком мало крови (рис. 71).

Аналогичная ситуация возникает при раз-ном гематокрите (рис. 72): гематокрит в преде-лах между 0,25-0,55 (25-55%) несущественно вли-яет на результаты, при гематокрите свыше 60%

Рис. 70. Влияние разведе-ния крови антикоагулян-том на протромбиновыйтест (ПТ) и активированноечастичное тромбопластино-вое время (АЧТВ), Разведе-ние крови антикоагулянтомсопровождается удлинени-ем ПВ (снижение ПТ) и АЧТВ,при разведении меньшем,чем 8:1, это приводит к ре-гистрации ложноположи-тельного результата

Рис. 71. Взято недостаточное количество крови в ан-тикоагулянт - типичная преаналитическая ошибка. Боль-шее количество антикоагулянта по отношению к плазмеможет вызвать значительное изменение показателей ко-агулограммы

Рис. 72. Соотношение объема плазмы и раствора цитра-та при разном гематокрите. При высоком гематокрите со-здаются условия избыточного количества антикоагулянта ислишком сильного разведения плазмы с получением ре-зультатов, соответствующих состоянию гипокоагуляции.Наоборот, при низком гематокрите есть высокая вероят-ность регистрации «ложной» гиперкоагуляции


создается избыточная концентрация цитрата вплазме, приводящая к «ложной» гипокоагуля-ции. Напротив, при снижении гематокрита(ниже 25%) обнаруживается «ложная» гиперко-агуляция, кровь при смешивании с цитратом вотношении 9:1 может свернуться в пробирке ещедо исследования. Высокий гематокрит - физио-логическая характеристика крови новорожден-ных, у взрослых высокий гематокрит возникаетпри полицитемиях (эритремиях), сердечной не-достаточности.

Перерасчет объема стабилизатора в соответ-ствии с гематокритным показателем позволяетизбежать этой ошибки (табл. 12). Если же у боль-ного нет значительного сгущения крови или, на-оборот, анемизации, приемлемо стандартное со-отношение крови и цитрата (9:1).

Таблица 12Соотношение объема антикоагулянта и венозной

крови для постановки коагулограммы

Третья ошибка. Наиболее частой погрешно-стью при взятии крови является плохое или недо-статочное перемешивание ее со стабилизатором.Для предотвращения этого требуется немедлен-но после заполнения пробирки кровью до требу-емого объема закрыть ее крышкой (не резиновой)или чистой полиэтиленовой пленкой и 2-3 разамедленно перевернуть (не встряхивая).

Для рекальцификации к цитратной плазмедобавляют определенное количество хлоридакальция. Причиной изменения времени сверты-вания может стать несоответствие добавляемо-го кальция содержанию цитрата: коагулологи-ческие исследования являются более чувстви-тельными к избытку кальция в плазме (высокий

гематокрит, слишком мало крови), чем к его не-достатку (низкий гематокрит, слишком многокрови).

Для некоторых тестов рекомендуются специ-альные антикоагулянты. При исследовании фун-кции тромбоцитов практически любой антикоа-гулянт может быть источником ошибок. ЭДТА,флуорид и гепарин не используются при прове-дении традиционных тестов коагулограммы.

Сыворотка

Сыворотка, естественно, не может быть ис-пользована в тестах, основанных на определениивыпадения фибрина. Кроме того, сывороткапрактически не содержит факторов II, V, VIII иXIII, которые удаляются со сгустком, в сыворот-ке частично сохраняются ф.VII, -IX, -X и -XII. Сы-воротку можно использовать для исследованиянекоторых компонентов, на определение которыхоказывают интерферирующий эффект компонен-ты плазмы, в частности, в сыворотке можно оп-ределять содержание продуктов деградации фиб-рина/фибриногена (ПДФ).

Хранение и центрифугирование

Кровь в пробирке необходимо тщательноперемешать, перевертывая пробирку, при этом недопускается образования пены. Нельзя трястипробу, так как это может вызвать денатурациюбелков и активацию тромбоцитов.

Сразу же после взятия крови происходит из-менение активности компонентов системы свер-тывания и фибринолиза. В пробе, не закрытойпробкой, возрастает рН из-за потери СО2. След-ствием этого является увеличение времени свер-тывания. На стабильность рН пробы влияет бу-ферная система эритроцитов, а также использо-вание буферных растворов цитрата. В пробе кро-ви, хранящейся при комнатной температуре и зак-рытой пробкой, не происходит заметных измене-ний в результатах ПВ и АЧТВ. Эффект физиоло-гического забуферивания за счет эритроцитовисчезает в открытой пробирке при попадании внее атмосферного воздуха.

Согласно международным рекомендациямсрок доставки проб в лабораторию (ARUPLaboratories, 2002) для исследования показате-


лей гемостаза не должен превышать 45 минутпосле взятия крови у пациента. Стабилизиро-ванную кровь до центрифугирования (в томчисле и в процессе транспортировки) хранятпри комнатной температуре (+18... +25 °С).Транспортировка крови на большие расстоя-ния и ее частое встряхивание искажают резуль-таты исследования. Кровь нельзя хранить вольду (что делается в некоторых клиниках), таккак это может привести к холодовой актива-ции фактора XII (процесс запускается черезконтактную фазу и развивается достаточно ча-сто) и вызвать значительные изменения функ-ции тромбоцитов.

Центрифугирование для получения плазмыдолжно проводиться при ускорении 1500-2000 gв течение 10 минут, при этом получается плазма,«бедная» тромбоцитами. Если пробы необходи-мо заморозить перед проведением теста, то пос-ле размораживания рекомендуется повторно от-центрифугировать пробу и работать с суперна-тантом. Это делается для удаления остатков раз-рушенных тромбоцитов, фосфолипидов и белкових мембран, которые могут влиять на некоторыекоагуляционные тесты.

Проверка исследуемых образцовперед выполнением тестов

Проверка образцов крови или плазмы передпроведением коагуляционных тестов позволяетизбежать многих ошибок, связанных с преанали-тическими погрешностями.

Неправильное соотношение кровь/цитратможно определить, если объем крови в пробиркеменьше или больше, чем требуемый. При маломобъеме крови будет зарегистрировано ложноеудлинение коагуляционных тестов.

Пробы с видимыми сгустками фибрина. В за-висимости от степени свертывания коагуляцион-ные тесты могут быть укорочены, нормальны илиудлинены.

Гемолиз может произойти при хранении не-отцентрифугированной крови или после центри-фугирования. В таких тестах результаты варьи-руют в зависимости от степени гемолиза. Еслигемолиз присущ in vivo, что подтверждается взя-тием нового образца, то тесты могут выполнять-ся для оценки гемостатической ситуации. Еслигемолиз произошел после взятия крови, то такиеобразцы следует отбросить, чтобы не получитьложных результатов.

Тесты для оценки сосудистого и тромбоцитарного компонентов гемостаза

Традиционные тесты на исследование сосу-дистого и тромбоцитарного компонентов гемо-стаза, в том числе пробы на резистентность(ломкость) капилляров, пробы на длительностьи величину капиллярного кровотечения, под-счет тромбоцитов в камере, изучение размеровтромбоцитов в мазке, визуальные методы на

.

спонтанную и индуцированную агриегацю, хо-рошо известны и представлены во многих по-собиях. В настоящем изложении остановимсятолько на относительно новых методах, отра-ботанных на новой лабораторной технике, по-ступающей в клинико-диагностические лабора-тории.

Время кровотечения

Время кровотечения - это время от моментананесения стандартной раны кожи до моментапрекращения вытекания крови. Оно характери-зует функциональную активность тромбоцитов ивзаимодействие тромбоцитов с сосудистой стен-кой. Время кровотечения не выявляет всех тром-боцитарных нарушений (такого метода вообщене существует), этот скрининговый тест позволя-ет заподозрить тромбоцитопатии различного ге-

неза, болезнь Виллебранда и нарушения проаг-регантных свойств сосудистой стенки. После вы-явления патологии нет необходимости повторятьэто исследование, нужно использовать более чув-ствительные и специфичные методы. У этого ме-тода есть серьезные недостатки: Метод плохостандартизуется. Результаты

теста позволяют лишь предположить наличиетех или иных нарушений.


Низкая чувствительность. Отсутствие удли-нения времени кровотечения не всегда позво-ляет исключить нарушения тромбоцитарно-го или сосудистого звеньев гемостаза.Низкая специфичность не позволяет одно-значно интерпретировать результаты метода.

Однако это наиболее доступный метод для вы-явления нарушений взаимодействия тромбоцитов ссосудистой стенкой. Кроме того, это дешевый ме-тод, позволяющий заподозрить нарушения соответ-ствующего звена гемостаза и решить вопрос о необ-ходимости дальнейших углубленных исследований.

Динамический анализ функции тромбоцитов

Новым подходом в лабораторной диагности-ке является имитирование тромбоцитарного гемо-стаза на приборе PFA-100® (фирма «Dade Behring»,Германия). В PFA-100 в измерительном картрид-же цитратная кровь пропускается через капиллярдиаметром 150 мкм, моделирующий микрососуд,покрытый пленкой из коллагена/адреналина иликоллагена/АДФ (рис. 73-74). Это сопровождаетсяобразованием тромбоцитарной пробки, что оце-нивается по перфузионному давлению. Остановкаперфузии фиксируется как «время окклюзиисосуда». Метод позволяет эффективно с высокойчувствительностью и специфичностью выявлятьдефицит фактора Виллебранда, функциональныенарушения тромбоцитов, вызванные аспирином,наследственные и приобретенные нарушения ад-гезии и агрегации тромбоцитов. С применением

2 агонистов (индукторов агрегации) возможно се-лективное выделение аспириновых тромбоцитопа-тий. По типу измерения PFA-100 является дина-мическим агрегометром.

На практике трудно наработать материал спервичным нарушением гемостаза, чтобы уста-новить референтные значения теста, так как боль-ных с однородными нарушениями достаточномало. При тромбоцитопатиях, вызванных дли-тельным приемом антитромбоцитарных препара-тов, очень много различных вариантов измене-ний первичного гемостаза. Тем не менее метод по-зволяет выявлять ранние признаки нарушенийпервичного гемостаза и, по-видимому, имеетбольшие перспективы для внедрения в коагуло-логические лаборатории и лаборатории экспресс-диагностики.

Рис. 73. Динамический агрегометр PFA-1OO. Он позво-ляет наблюдать in vitro за процессом закупорки сосуда примоделировании этого процесса в специально созданномкартридже. Образование тромбоцитарной пробки оцени-вается по перфузионному давлению

Рис. 74. Датчик динамического агрегометра PFA-1OO со-держит капилляр, моделирующий микрососуд. В цельной кро-ви, проходящей по капилляру, активируется образование сгу-стка, На стенках нанесен коллаген и адреналин или АДФ,которые являются первичной причиной запуска гемостаза


Тромбоцитарные показатели

Число тромбоцитов (Platelets, PL, PLT)

При подсчете на автоматических анализато-рах тромбоциты распознаются по размерам в ди-апазоне 2-20 фл (рис. 75). Автоматические счет-чики позволяют получать достаточно надежныерезультаты по количеству тромбоцитов. При под-счете тромбоцитов в камере Горяева коэффици-ент вариации составляет 7-15%, тогда как авто-матический подсчет воспроизводится с точностьюдо 2-4%. Современные анализаторы сигнализи-руют (флагирование на бланке) о выходе количе-ства тромбоцитов за референтные пределы, на-личии агрегатов тромбоцитов, макротромбоци-тов или других элементов, сравнимых по объемус тромбоцитами (микроэритроциты).

Ложное занижение числа тромбоцитов можетбыть при их агрегации, агглютинации под дей-ствием тромбоцитарных агглютининов и приприлипании тромбоцитов к лейкоцитам (тромбо-цитарный «сателлитизм»). При подсчете на гема-тологических анализаторах в качестве антикоа-гулянта используется ЭДТА. При наличии ауто-антител к тромбоцитам калиевая соль ЭДТА ини-циирует агрегацию тромбоцитов, что проявляет-ся псевдотромбоцитопенией.

Средний объем тромбоцита (MPV)

У здоровых людей MPV равен 6-12 фл и нахо-дится в обратной зависимости от числа тромбо-цитов. Такое соотношение определяет постоянствотромбоцитарной массы в циркулирующей крови.MPV увеличивается с возрастом; отмечено, что умужчин MPV несколько выше, чем у женщин.

Использование ЭДТА в качестве антикоагу-лянта вызывает изменение формы тромбоцитов отдиска к сфере, что приводит к увеличению MPVна 10-12% в течение 2 часов, а затем показательсущественно не меняется. Под действием цитратанатрия MPV может уменьшаться или увеличивать-ся, а при высокой концентрации (1:4) - не изменя-ется со временем. Кроме типа применяемого ан-тикоагулянта и времени от момента взятия пробыдо исследования, на MPV оказывает влияние тем-пература окружающей среды. Преходящее увели-чение MPV отмечается у рабочих, контактирую-щих с асфальтовыми испарениями, органически-ми растворителями. MPV - важный диагностичес-кий показатель функции тромбоцитов. Причиныизменения MPV представлены в табл. 13.

Таблица 13Причины изменения MPV

Рис. 75. Гистограмма тромбоцитов, которая изобража-ется при представлении результатов счета клеток крови нагематологических анализаторах, Помимо гистограммы, ге-матологические анализаторы представляют результатыподсчета количества тромбоцитов (PLT), среднего объематромбоцитов (MPV), дисперсии распределения тромбоци-тов по объему (PDW), тромбоцитокрита (РСТ)

Дисперсия распределения тромбоцитовпо объему (PDW)

PDW - показатель, являющийся мерой ге-терогенности размеров (анизоцитоза) тромбо-


цитов. Величина PDW в среднем составляет10-15%.

Как артефакт, ложнозавышенное увеличениеPDW может быть связано с присутствием микро-цитов, шизоцитов, микроагрегатов тромбоцитов,фрагментов цитоплазмы лейкоцитов.

Этот показатель находится в обратной зави-симости от числа тромбоцитов и их периода жиз-ни. В каждом конкретном случае важна не толь-ко величина PDW, но и ее динамика во времени,а также связь с другими тромбоцитарными по-казателями. Так, увеличение PDW с одновремен-ным снижением MPV свидетельствует о преоб-ладании микротромбоцитов среди общей попу-ляции тромбоцитов (указывает на угнетениетромбоцитопоэза), а сочетание повышенногоPDW с увеличением MPV отражает нарастаниечисла макротромбоцитов (усиление продукциитромбоцитов). Одновременное присутствиефракций макротромбоцитов и микротромбоци-тов ведет к увеличению PDW, но MPV может ос-таваться в пределах нормы. В современных ге-матологических анализаторах отдельными пока-зателями указывается процентное содержаниемикротромбоцитов (MicroPLT) и макротромбо-цитов (MacroPLT).

PDW может применяться для дифференци-альной диагностики. Так, увеличение PDW свы-ше 10,5% было обнаружено у 50% больных эссен-циальной тромбоцитемией, у 21% пациентов с ре-активным тромбоцитозом и лишь у 14% здоро-вых людей.

Тромбоцитокрит (РСТ)РСТ - показатель, характеризующий процент

тромбоцитарной массы в объеме крови: вычис-ляется суммированием прямо измеренных объе-

У здорового человека показатель стремитсяостаться стабильным: при уменьшении числа тром-боцитов усиливается тромбопоэз, в циркулирую-щую кровь выбрасывается большее число моло-дых макротромбоцитов, что ведет к увеличениюMPV. При увеличении количества циркулирую-щих тромбоцитов снижается продукция их в кост-ном мозге, тем самым уменьшается процент мак-ротромбоцитов и MPV уменьшается. Однако принарушении этого равновесия происходит илиуменьшение РСТ, что в конечном счете приводитк патологии первичного гемостаза и риску возник-новения кровотечений, или повышение РСТ, уве-личивающее активность тромбоцитов и их способ-ность к агрегации. Это повышает риск тромбозов.

Нормальные значения РСТ варьируют в пре-делах 0,15-0,35%. Было обнаружено, что сниже-ние РСТ менее 0,1% обусловило возникновениепослеоперационных кровотечений у пациентов сразвившейся тромбоцитопенией. Также было от-мечено, что этот показатель оказался более чув-ствительным для оценки риска возникновениякровотечения, чем число тромбоцитов.

Если скрининговые методы указывают нанарушение функции тромбоцитов, необходимовыполнить специальные тесты с учетом диеты илекарственных препаратов, принимаемых паци-ентом (отмена за 7-10 суток перед исследовани-ем глюкокортикостероидов, аспирина и другихнестероидных противовоспалительных средств,адреноблокаторов, блокаторов кальциевых кана-лов, антиагрегантов: пентоксифиллина, папаве-рина, теофиллина, дипиридамола, тиклопидина,антибиотиков - пенициллина, карбенициллина).

Агрегация тромбоцитов

Агрегацию тромбоцитов исследуют на агре-гометре с использованием индукторов агрегации.Требования к пробам критичны. Исследованиеагрегации проводят на плазме, богатой тромбо-цитами (ПБТ, английская аббревиатура PRP).Желательно использовать ПБТ, содержащуюпримерно 200 клеток/нл. Это требование затруд-

няет оценку агрегации тромбоцитов при тромбо-цитопении.

Пробы помещаются в кювету агрегометра,который представляет собой оптический приборс регистрацией проходящего света. Проба в кю-вете постоянно перемешивается специальной ме-шалкой. При формировании агрегатов повыша-

мов тромбоцитов или произведением среднегообъема тромбоцитов на их число:


ется прозрачность плазмы и, следовательно, уве-личивается поток проходящего через кювету све-та (рис. 76). Изменение светопропускания регис-трируется в виде кривой.

Агрегация с АДФ

Характер агрегации тромбоцитов при ин-дукции АДФ зависит от дозы. Как правило, приконцентрации 0,5-1 мкмоль возникает обрати-мая агрегация, при концентрации до 5 мкмоль -двухфазная агрегация, при большей концентра-ции (до 10 мкмоль) - необратимая однофазнаяагрегация (или агрегация, при которой неразли-чим переход от 1-й до 2-й волны).

При связывании на поверхности тромбоци-тов АДФ с рецептором происходит изменениеформы тромбоцитов, экспозиция на мембранекомплекса GPIIb-IIIa (рецептор для фибриноге-на) и первичная Са-зависимая агрегация. Еслипервичный ответ на АДФ не будет поддержанвторичной реакцией, то в отсутствии фибриноге-на происходит десенситизация рецепторов, кото-рая приводит к дезагрегации тромбоцитов. Вто-ричная агрегация опосредована внутриклеточнойпередачей сигнала через G-белки с повышениемвнутриклеточной концентрации Са2+. Происхо-дит активация простагландин-тромбоксановойсистемы, развивается секреция из α-гранул vWF,β-тромбоглобулина, тромбоспондина, фибронек-тина и других активных компонентов, развива-ется вторичная агрегация.

Выяснение путей АДФ-активации тромбоци-тов позволило использовать в клинике антиагре-гационные соединения. Оказалось, что тиклопи-

дин и клопидогрель селективно ингибируют ак-тивацию G-белка, АДФ-агрегацию и активностьстимулированной аденилатциклазы.

Агрегация с адреналином

Особенности агрегации с адреналином в зна-чительной степени обусловлены концентрациейСа2+ в среде. При физиологических концентра-циях Са2+ (1-2 ммоль, которая характерна дляплазмы крови) адреналин не вызывает актива-ции тромбоцитов и их агрегации. При значи-тельном снижении Са2+ в цитратной плазме до 20-40 мкмоль адреналин вызывает дозозависимуюагрегацию с экспрессией комплекса GPIIb-IIIaпри первичной волне агрегации и ТХА2-опосре-дованную вторичную волну (рис. 28).

По-видимому, в условиях организма прямаяадреналиновая агрегация отсутствует, что связа-но с относительно высокой концентрацией Са2+

в плазме и низкой концентрацией самого адрена-лина. Однако адреналин, очевидно, потенцируетдействие других агонистов, что проявляется ужепри его концентрации порядка 0,01 мкмоль. По-этому при курении, стрессе и особенно кардио-генном шоке, когда уровень адреналина в кровиповышается до 0,6 мкмоль, он становится суще-ственным фактором внутрисосудистой агрегациитромбоцитов.

Агрегация с тромбином

Тромбин - очень сильный физиологическийиндуктор агрегации. Воздействие тромбина натромбоцит опосредовано собственным рецепто-

Рис. 76. Принцип оценкииндуцированной агрега-ции. А - до агрегации; Б -агрегация. После добавле-ния индуктора агрегации иформирования агрегатовтромбоцитов происходитпросветление суспензии


ром (рис. 20) и GPIbα. Стимуляция тромбиново-го рецептора сопровождается активацией тром-боцитов через G-белок, фосфолипазы С и вклю-чение фосфоинозитольного механизма актива-ции. Этот путь сопровождается быстрым увели-чением концентрации цитозольного Са2+ и сек-рецией α-гранул и электронно-плотных 5-гранул.Секретируемый из 5-гранул АДФ существенендля образования агрегатов, а выделяемые α-гра-нулами фибриноген, vWF, тромбоспондин - дляих стабилизации. Оккупация молекулами тром-бина высокоаффинных рецепторов GPIbα приво-дит к перестройке фосфолипидной мембраны,стимуляции ее прокоагулянтной активности иповышению аффинности GPIIb-IIIa. В результа-те комплексной стимуляции тромбином практи-чески не наблюдается двухволновой агрегации.

Агрегация с арахидонатом

Арахидоновая кислота в цитратной плазмевызывает дозозависимое изменение формы тром-боцитов, первичную и вторичную агрегацию.Арахидонат активирует тромбоциты без участияспецифических рецепторов, проникая внутрьклетки, активируя свои метаболиты - ПГG2,

ПГН2 и тромбоксан. Эту особенность активациитромбоцитов арахидоновой кислотой использу-ют для дифференциации нарушений, связанных сдефицитом пулов хранения и нарушениями в цик-лооксигеназном пути активации тромбоцитов.

Вид агрегатограммы зависит от типа и концен-трации индуктора. Наиболее распространенныеиндукторы АДФ и адреналин используются в не-скольких концентрациях. Форма агрегатограммыможет быть несколько отлична на агрегометрахразных производителей, так как выводимый резуль-тат теста в определенной степени зависит от скоро-сти и характера перемешивания, температуры, спо-соба регистрации и некоторых других факторов.

Лекарственные средства, такие, как аспирини другие нестероидные противовоспалительныепрепараты, антибиотики (3-лактамного ряда, не-которые витамины, пряности могут быть причи-ной нарушенной агрегации. Из вышесказанногоследует, что для адекватной оценки результатовтеста требуется тщательная стандартизованнаяподготовка больных и стандартизация протоко-ла аналитических процедур.

Болезнь Виллебранда и врожденные наруше-ния функции тромбоцитов легко диагностируют-ся агрегатометрией (табл. 14).

Изменения агрегатограмм при нарушениях функции тромбоцитовТаблица 14

Н - нормальная агрегатограмма, 4- - сниженная реакция на индуктор агрегации.


Мальчик А. 6 лет. Обратился за помощьюпо поводу носового кровотечения. Со слов ро-дителей - единственный ребенок в семье, име-ющий геморрагические проявления в виде кож-ного гемосиндрома, гемартрозов и носовыхкровотечений. Ребенок наблюдается по месту

жительства с диагнозом гемофилия А. При но-совых кровотечениях и гемартрозах получаетпереливания цельной крови с положительнымэффектом. При осмотре, помимо кровотеченияиз полости носа, выявлен кожный гемосиндромсмешанного типа - гематомы, экхимозы, пете-хии и пурпурозные элементы. Для оказания эк-стренной помощи был введен концентрат фак-


тора VIII, после чего кровотечение останови-лось, однако рецидивировало через несколькочасов. С учетом характера кожного гемосинд-рома диагноз гемофилии А вызвал сомнения.Необходимо было проводить дифференциаль-ный диагноз между коагулопатией, болезньюВиллебранда и нарушением тромбоцитарногогемостаза. Было проведено коагулологическоеобследование.

Результаты: время кровотечения значитель-но удлинено, количество тромбоцитов 150 х 109/л.ПТ-тест 155%, АЧТВ 31 с (норма 28-43 с), ф.УШ>200%, ф.1Х 195%, ристоцетин-кофакторная ак-тивность 71%. Агрегация тромбоцитов с АДФ,коллагеном и адреналином отсутствует, агрегациятромбоцитов с аггристином нормальная. Данныеобследования позволили поставить диагноз:тромбастения Гланцмана.

Исследования агрегации тромбоцитов вобразцах цельной крови

Корпорация «Chrono-log» производит агре-гометры, работающие на образцах цельной цит-ратной крови и использующие электронно-им-педансный и люминесцентный методы детек-ции (рис. 77). Прибор регистрирует микротоки,протекающие в специальном электродном бло-ке, при погружении его в различные образцы -цельную кровь, плазму, богатую тромбоцитами(ПБТ), разведенную кровь или во взвесь отмы-тых тромбоцитов. Первоначальный контактэлектродов с образцом приводит к образованиюмонослоя тромбоцитов. Затем при добавлениииндукторов агрегации и других активных аген-тов происходит постепенная агрегация тромбо-цитов на электродах, которая приводит к харак-терным изменениям электрических свойств сис-темы.

Методом электронного импеданса можнопроводить измерения агрегации в условиях, в

которых оптическая агрегация это сделать неможет - в гемолизированных, иктеричных и ли-пемичных образцах. Импедансная агрегометрияможет быть использована с успехом при иссле-довании пациентов с синдромом гигантскихтромбоцитов, где оптическая агрегометрия при-водит к неправильным результатам.

Исследование агрегации на агрегометрах«Chrono-log» проводится очень быстро: для ис-следования агрегации в 5 мл цельной крови не-обходимо времени меньше, чем требуется дляприготовления плазмы для коагулограммы. Приэтом методика позволяет выявить большинствовидов дисфункции тромбоцитов. Высокочув-ствительный импедансный метод позволяеточень быстро и точно провести скрининг длявыявления болезни Виллебранда на основе рис-тоцетин-агрегации цельной крови (рис. 78). Этотже подход помогает подтвердить синдром Бер-нара-Сулье у детей, быстро найти объяснениедлительным кровотечениям у пациентов, прини-мающих различные противовоспалительные ле-карства.

Рис. 77. Агрегометр «Chrono-log», исследующий агрега-цию тромбоцитов на цельной крови электронно-импеданс-ным методом

Рис. 78. Быстрая диагностика болезни Виллебранда иврожденных нарушений функции тромбоцитов на агрего-метре «Chrono-log» с цифровым и графическим представ-лением результатов


Наличие на агрегометре люминесцентногодатчика позволяет одновременно с агрегациейтромбоцитов исследовать и другие процессы, на-пример секрецию гранул.

В то же время практически все агрегометрыкорпорации «Chrono-log», как дополнение к им-педансным и люминесцентным каналам, имеютоптические каналы для проведения классической(турбидиметрической) агрегометрии.

Процессы агрегации в цельной крови наи-более приближены к физиологическим услови-ям in vivo. Именно поэтому достигается высокаядостоверность и специфичность результатов ис-следования, что дает возможность не только

быстро провести необходимую диагностику, нои обеспечить надежную программу мониторин-га проводимой терапии в реальном времени. По-скольку импедансная агрегометрия на цельнойкрови является наиболее адекватным средствомдля определения гиперагрегации, метод реко-мендуется для исследования пациентов с рискомтромбоэмболических осложнений. Этот методболее чувствителен и адекватен по сравнению соптической агрегацией, поскольку измеренияпроисходят в присутствии всех нативных элемен-тов цельной крови, включая эритроциты и лей-коциты.

Тромбоэластография

Тромбоэластография (ТЭГ) - один из первыхметодов комплексной оценки гемостаза. Тромбо-эластография была предложена еще в 1948 г. Гар-тертом (Hartert) и до настоящего времени оста-ется единственным методом, который качествен-но и полуколичественно позволяет охарактери-зовать процесс образования сгустка, его механи-ческие характеристики, плотность, стабильностьи процесс фибринолиза. В настоящее время ме-тод усовершенствован, он позволяет количествен-но оценить перечисленные параметры. Модифи-кацию метода с использованием компьютерногоанализа данных можно назвать тромбоэластомет-рией (ТЭМ). ТЭГ и ТЭМ могут быть использова-ны для исследования цельной крови, цельной кро-ви с антикоагулянтами, богатой и бедной тром-боцитами плазмы с цитратом в качестве антико-агулянта.

Принцип ТЭГ: исследуемый образец помеща-ется между двумя поверхностями, на одну из ко-торых подаются вращательно-колебательныедвижения, а другая соединена с устройством, при-нимающим и фиксирующим колебания. Последобавления в образец активатора свертываниякрови начинается образование сгустка. По мереполимеризации фибрина колебания с одной по-верхности начинают передаваться на другую ирегистрироваться. Получающаяся кривая зависи-мости амплитуды колебаний от времени харак-теризует процесс свертывания крови, а позжефибринолиза (рис. 79).

Наиболее важной информацией, которуюможно извлечь из кривой ТЭГ (рис. 80), является:• Время до начала образования фибрина (г-вре-

мя).• Время формирования сгустка (к-время).• Максимальная амплитуда (зависит от кон

центрации фибриногена, количества и качества тромбоцитов, взаимодействия фибринаи тромбоцитов в сгустке).

• Время лизиса тромба.Метод позволяет исследовать как спонтанную

коагуляцию, так и индуцированную активатора-ми. Применение различных активаторов и реак-тивов позволяет достичь разных диагностическихцелей. В качестве дополнительных реактивов мо-гут использоваться гепарин, фибринолитики илиих ингибиторы. Изменения ТЭГ, которые отража-ют наиболее распространенные изменения гемос-таза, представлены на рис. 81. Наряду с изменени-ями, вызываемыми лекарственными препаратами,ТЭГ позволяет идентифицировать тромбоцитопа-тии, гиперкоагуляцию и другие нарушения.

В настоящее время разработаны достаточнокомпактные тромбоэластографы, которые мож-но размещать на каталке около постели больно-го и оценивать процесс гемостаза немедленнопосле взятия крови, что существенно уменьшаетвлияние преаналитических факторов. Один изнаиболее адаптированных к клиническим иссле-дованиям тромбоэластографов «Rotem Gamma»показан на рис. 82.



Молекулярно-биологические методы

Высокоинформативным методом, сочетаю-щим иммунохимические технологии с исследо-ванием клеточных популяций, является проточ-ная цитометрия. Проточная цитометрия позво-ляет охарактеризовать клеточные популяции, ихразмеры, стадию дифференцировки. Этим мето-дом определяют наличие или отсутствие на кле-точной поверхности специфических рецепторовили продуктов клеточной активации, субпопу-ляции тромбоцитов и даже циркулирующие эн-дотелиальные клетки. Метод возможен при на-личии проточного цитометра и специфическихреактивов, в первую очередь моноклональныхантител. Основным достоинством этой техноло-гии является возможность разделить клеточныепопуляции на активированные и неактивные.Тем не менее использование данной технологиидля оценки гемостаза используется крайне ред-ко, так как технология дорогая и требуется вы-сококвалифицированный персонал, подготов-ленный в области проточной цитометрии и ге-мостазиологии.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) начина-ет внедряться в лаборатории, занимающиеся ге-

мостазом, в первую очередь наследственныминарушениями свертывания крови. Наследствен-ные заболевания связаны с отсутствием или дис-функцией белков в результате мутаций в генах,кодирующих их синтез. Задачей молекулярно-биологических методов является выявление этихмутаций. Обширные молекулярно-генетическиеисследования проводятся при диагностике гемо-филии А и В, а также болезни Виллебранда. ПЦРиспользуется для выявления мутаций фактора VЛейден, протромбина 20210G→A, полиморфиз-ма фактора XIII, дефицита AT, протеинов С и Sи в других случаях. ПЦР и другие методы моле-кулярной и генной диагностики используются длявыявления наследственных заболеваний, при ко-торых нарушения гемостаза являются сочетаннойформой патологии.

Эти методы играют очень важную роль в пре-натальной диагностике, объектом для исследова-ния может быть амниотическая жидкость илихорион, которые можно получить на 8-10-й не-деле беременности. Этими исследованиями мож-но выявить гетерозиготное и гомозиготное носи-тельство патологических генов.

Методические основы лабораторной оценки плазменного гемостаза

Коагуляционные методы

Коагуляционные, или клоттинговые, методыоснованы на определении промежутка времени отдобавления стартового реактива, запускающегокаскад свертывания плазмы, до момента образо-вания сгустка (выпадения фибрина). При поста-новке коагуляционных тестов необходимо пере-мешать плазму с реактивом до гомогенной сус-пензии и поддерживать стабильной температуруреакции. Коагуляционные тесты - в настоящеевремя наиболее распространенный методическийподход для оценки плазменного гемостаза в кли-нико-диагностических лабораториях. Необходи-мо подчеркнуть, что коагуляционные методы яв-ляются скрининговыми, тем не менее на их осно-ве сконструирован ряд методов для оценки актив-ности факторов плазмы.

Ручные методыРучные методы обнаружения момента выпа-

дения сгустка проводятся на водяной бане. Авто-матическая регуляция температуры воды толькочастично решает проблему поддержания посто-янной температуры. Частое вынимание пробир-ки во время исследования для наблюдения за по-являющимся сгустком является причиной того,что температура реакции не соответствует тем-пературе водяной бани. При визуальной оценкевремени появления сгустка даже опытному лабо-ранту невозможно точно установить момент по-явления сгустка, что является главной причинойплохой повторяемости результатов. Однако сле-дует помнить, что в ситуациях, в которых отсут-ствуют или подводят автоматические методы


(формируется неплотный сгусток), применениеэтого метода обоснованно.

Точность определения времени больше зави-сит от исследователя, чем от типа используемогов исследованиях секундомера. Удовлетворитель-ной следует считать точность определения време-ни до 0,5 с. К недостаткам этого метода можноотнести длительность его выполнения и необхо-димость максимального внимания во время про-ведения исследования.

Автоматизированные коагулометры

Автоматизированные коагулометры суще-ственно улучшили точность и повторяемость ре-зультатов коагуляционных тестов, уменьшиливлияние человеческого фактора. В настоящее вре-мя имеется большой выбор различных приборовдля исследования гемостаза, начиная от самыхпростых, в которых автоматизирован лишь про-цесс фиксации момента свертывания крови, досложных машин, требующих лишь установитьотцентрифугированные пробирки в штатив и за-дать программу исследований. В последние годыпоявляются биохимические анализаторы, в кото-рых предлагаются программы для регистрациикоагуляционных тестов методом турбидиметриипо резкому изменению светопропускания в мо-мент свертывания плазмы. Все это значительнорасширило возможности оценки гемостаза в кли-нико-диагностических лабораториях. В то же вре-мя исследование гемостаза по-прежнему предъяв-ляет высокие требования к преаналитическомуэтапу, качеству подготовки проб, квалификациилаборантов, проводящих исследования.

В последние несколько лет в аналитическомподходе к оценке гемостаза, в том числе и из-завнедрения автоматизации, существенно повыше-ны требования к стандартизации. Стандартиза-ция рассматривается как спектр приемов иссле-дования гемостаза, обеспечивающий воспроизво-димые в разных лабораториях результаты за счетприменения разовых систем взятия крови, аттес-тованных методов, реактивов, приборной базы,международных стандартов при калибровке, про-ведения внутрилабораторного контроля качества,участия во внешнем и международном контролекачества и др. Наиболее ярким примером такогоподхода является переход от определения нестан-

дартизованного протромбинового индекса к оп-ределению международного нормализованногоотношения (MHO) при использовании аттесто-ванного по международным стандартам тромбоп-ластина (см. ниже). Однако многие коагуляцион-ные методы плохо поддаются стандартизации, втом числе такой широко распространенный тест,как активированное частичное тромбопластино-вое время (АЧТВ).

В основе регистрации момента выпадениясгустка в коагулометрах используются несколь-ко принципов: механический, турбидиметричес-кий, оптико-механический. Каждый из них име-ет свои преимущества и недостатки, которые важ-но знать при интерпретации результатов иссле-дований (см. ниже).

Ограничения коагуляционных методов:• Ограниченное время регистрации. Тест дол

жен быть проведен в течение примерно 10-200 с. Это возможно далеко не для всех анализов.

• Далеко не все компоненты гемостаза можноисследовать по времени образования сгустка. Компоненты системы фибринолиза, ингибиторы не оказывают прямого влияния навремя свертывания, и их количественнаяоценка не поддается исследованию клоттин-говым методом.

• Метод чувствителен к различным неспецифическим внешним воздействиям. Например, исследование активности ф.VIII клот-тинговым методом невозможно у пациента,получающего терапию гепарином или непрямыми антикоагулянтами, хотя ни те ни другие не оказывают непосредственного влияния на этот фактор.

• Метод малочувствителен для определенияповышенной активности компонентов системы свертывания крови.

• Для ряда тестов сложно создать устойчивыереактивы, удобные для применения в диагностических лабораториях. Существеннойпроблемой на этом пути является использование активаторов плазменных факторов, вчастности использование на первом этапе активаторов протеолитических реакций. Активаторы могут быть нефизиологическими, которые имитируют твердую фазу поверхности (каолин, целит), или физиологическими


(экстракты тканей, очищенные или рекомби-нантные активаторы факторов свертыва-ния). Несколько этапов свертывания требу-ют не только активаторов, но и кофакторовсвертывания, фосфолипидов и ионов Са2+.Для практических целей применяются сме-си этих веществ, часто с нестабильными бел-ками, которые иногда трудно очистить и ста-билизировать (например, тромбин). В учреж-дениях с высоким научным потенциаломчасто применяются активаторы на основезмеиных ядов. Эти натуральные активаторызачастую превышают по своим характерис-тикам даже высокоочищенные и рекомби-нантные активаторы. Они бывают устойчи-выми к действию ингибиторов и прямых ан-тикоагулянтов, часто не требуют кофакто-ров и ионов Са2+. Однако использование та-ких активаторов ограничено высокой сто-имостью и малой доступностью для практи-ческих лабораторий.

Механические коагулометры

Принцип работы механических коагуломет-ров представлен на рис. 83. В одном из вариан-тов кювета с плазмой вращается в наклонном

Рис. 83. Принцип работы механического коагуломет-ра. Кювета с плазмой расположена под наклоном и вра-щается, шарик стоит на месте, не вращается. В моментсвертывания шарик захватывается сгустком; как толькошарик уходит от датчика, меняется магнитное поле, при-бор регистрирует момент свертывания плазмы

положении. Металлический шарик в кювете нач-нет вращаться при свертывании плазмы. Моментзахвата шарика выпавшим сгустком и начало еговращения вместе с кюветой фиксируется магнит-ным датчиком. При других вариантах регистри-руется прекращение вращения внутри кюветымагнитной мешалки, захват сгустка опускаю-щимся в кювету крючком или иные схемы, ос-нованные на переходе жидкой плазмы в сгусток.Механические коагулометры характеризуютсявысокой надежностью и простотой в обслужи-вании. Кроме того, они могут работать с цель-ной кровью. Основные проблемы возникают вситуациях, когда формируется неплотный сгус-ток, например при использовании гепарина. Вэтих случаях выпадающий фибрин часто не мо-жет сразу увлечь за собой механическое устрой-ство, результаты получаются плохо воспроизво-димыми. Другой проблемой является формиро-вание на шарике, мешалке или других устрой-ствах, погруженных в кювету, белковых конгло-мератов, которые мешают регистрации.

Оптико-механические коагулометры

Коагулометры этого класса характеризуют-ся способностью регистрировать выпадающиехлопья фибрина даже без формирования плотно-го сгустка, что бывает при приеме пациентами ан-тикоагулянтов, а также в случаях коагулопатий.Принцип оптико-механического коагулометрапредставлен на рис. 84. За счет использованияследящей схемы регистрируется изменение пода-ваемого на лампу напряжения, чтобы обеспечи-вался заданный световой поток, проходящий че-рез кювету с образцом. В этом случае резко умень-шается влияние исходной плотности плазмы, ееиктеричности и липемичности, в принципе воз-можно исследовать свертывание плазмы с тром-боцитами.

Турбидиметрические коагулометры

Турбидиметрические коагулометры регис-трируют момент свертывания крови по приро-сту оптической плотности (рис. 85). При свер-тывании плазмы происходит резкое изменениесветопропускания или рассеивания. В коагуло-метре программируется, при каком приросте


О 5 10 15 20 25 30 35 40 45Время, с

Рис. 84. Принцип регистрации выпадающего фибринаоптико-механическим коагулометром. Выпавшие в кюветенити фибрина меняют световой поток, падающий на фото-диод. Фотодиод связан через следящую схему компенса-ции с напряжением на лампе. В результате на лампу пода-ется такое напряжение, которое меняет яркость свечениялампы, чтобы световой поток, попадающий на светодиод,поддерживался в заданном диапазоне. По изменению на-пряжения на лампе регистрируется начало выпадения фиб-ринового сгустка

Рис. 85. Принцип регистрации момента образованиясгустка турбидиметрическим коагулометром. При свер-тывании плазмы происходит резкое увеличение оптичес-кой плотности в фотометрической ячейке. Коагулометропределяет время от внесения активатора свертывания домомента изменения оптической плотности на ДА (напри-мер, на 0,1 ед. оптической плотности)

оптической плотности по отношению к исход-ному уровню (ΔА) регистрируется момент свер-тывания. Время от внесения в оптическую кю-вету индуктора свертывания до момента дости-жения заданного ΔА определяется как времясвертывания плазмы в исследуемом тесте. Тур-бидиметрический принцип используется приопределении показателей свертывания плазмына многофункциональных фотометрах и биохи-мических анализаторах. Фотометрический ка-нал при этом программируется по методу «вре-мя достижения фиксированной величины аб-сорбции». Программы для исследования гемо-стаза стали использовать даже на многофунк-циональных плашечных фотометрах, в которыхсвертывание плазмы исследуется на стриппахили планшетах.

Основными преимуществами оптических си-стем измерения являются:1. Более точные результаты измерений при низ

ких показателях свертывания. Полностьюисключена проблема «слабого сгустка».

2. Исключено загрязнение пробы, так как отсутствуют мешалки и другие механические компоненты.

3. Имеется возможность снижения объема пробы, так как не нужно место под механические компоненты (мешалки), это важно, особенно в педиатрии. Кроме того, уменьшается расход реагентов.

4. Эргономичность и удобство работы.Типичным представителем этого семейства

приборов является оптический двухканальныйкоагулометр KG-1 производства компании «Сог-mау» (рис. 86).

Нефелометрические коагулометры

Нефелометрические коагулометры определя-ют момент образования сгустка по изменениюрассеяния света. Новейшие разработки в этойобласти технологий нашли воплощение в коагу-лометрах фирмы «Sysmex» (Япония), в которыхиспользуется принцип определения сгустка по бо-ковому рассеиванию света (рис. 87). Метод рас-сеивания обеспечивает высокое качество анали-зов - высокую специфичность и чувствительностьметода детекции сгустка даже для сложной липе-мичной или иктеричной плазмы.


Рис. 86. Оптический двухканальный коагулометр KG-1производства компании «Соrmау». Точность результатовповышается за счет синхронизации времени попадания ре-агента в измерительную кювету и запуска отсчета времени,а также исключения из применения магнитных мешалок визмерительных кюветах, Прибор эргономичен, термостат дляпроб и реагентов размещен в самом приборе, у кювет естьперемычки и держатели для удобства переноса из термо-стата в измерительные ячейки. Работа на приборе эконом-на, так как снижен расход реагентов за счет уменьшенияобъема кювет, использования многоразовых кювет

Рис. 87. Нефелометрический принцип измерения све-торассеяния, заложенный в основу определения момен-та выпадения сгустка на коагулометрах фирмы «Sysmex»(Япония). Метод позволяет повысить точность измерений иих воспроизводимость до 2-3%, а также снизить влияниена результат самого образца. Анализаторы работают налюбых реагентах (в том числе на российских)

В табл. 15 указаны преимущества и недостат-ки автоматизированных коагулометров, исполь-зующих разные принципы регистрации выпада-ющего сгустка.

Современные коагулометры сочетают в од-ном приборе несколько методов измерения, по-

этому могут использоваться для комплекснойоценки гемостаза. Так, фирма «Sysmex» предла-гает серию коагулометров с разными возможно-стями и производительностью для любой клини-ко-диагностической лаборатории любого уровняисследования гемостаза (рис. 88).

Таблица 15Преимущества и недостатки различных методов обнаружения сгустка

Методы Преимущества Недостатки

Механический Принципиальная возможность работы нацельной крови, высокая толерантность к типуиспользуемых реагентов и пробирок, низкаястоимость анализаторов

Низкая чувствительность - нет детекциислабых сгустков, необходимо применятьмешалки в пробах

Оптико-механический

Точность больше, чем в механическом методе,перемешивание пробы во время снятияпоказаний

Чувствительность ниже нефело-метрического метода, необходимо приме-нять мешалки в пробах

Турбидиметриче-ский

Чувствительность выше предыдущих мето-дов, низкая стоимость анализаторов

Чувствительность ниже нефело-метрического метода

Нефело-метрический

Высокая чувствительность, высокая точностьизмерения

Высокая стоимость прибора


Рис. 88. Коагулометры фирмы «Sysmex»

Амидолитические методы с использованием хромогенных и флуорогенных субстратов

Применение синтетических хромогенных суб-стратов явилось прорывом при исследовании от-дельных ферментов или ингибиторов, которые неучитываются простыми коагуляционными теста-ми или очень трудны для стандартизации. Во мно-гих случаях хромогенные субстраты являются спе-цифичными и позволяют определить протеолити-ческую активность отдельных компонентов плаз-менного гемостаза и их ингибиторов. Эти тестысхожи с тестами клинической химии, поэтому лег-ко автоматизируются и могут выполняться на био-химических анализаторах как в клинико-диагнос-тических, так и в научных лабораториях.

Принцип тестов с хромогенными субстрата-ми представлен на рис. 89. Протеаза расщепляеткороткоцепочечный пептид (из 3-10 аминокис-лот), к которому через эфирную связь пришитхромоген (в нашем случае паранитроанилин -pNA). Комплекс пептид-pNA имеет максимумпоглощения в области короткого ультрафиоле-та, свободный pNA - при 380 нм. Итоговая кон-центрация pNA пропорциональна активностипротеазы и определяется по увеличению погло-щения светового пучка с длиной волны 405 нм.

Рис. 89. Принцип определения активности протеолити-ческого фермента (протеазы) с использованием хро-могенного субстрата. Максимум поглощения паранитро-анилина, связанного с пептидом, находится в области ко-роткого ультрафиолета, а свободного паранитроанилина -380 нм, При длине волны 405 нм поглощает практически толь-ко свободная форма хромогена, на этой длине волны про-водится регистрация протеолитической реакции


Для оценки активности факторов гемостазастали использовать флуорогенные субстраты, вчастности 7-амино-4-метилкумарин (АМК), кото-рый имеет максимум эмиссии при 440 нм. Флуо-рогенные субстраты обладают большей аналити-ческой чувствительностью и позволяют измеритьспецифическую активность компонентов гемо-стаза в большем диапазоне, чем хромогенные суб-страты. Они могут использоваться для определе-ния компонентов гемостаза, присутствующих вплазме в следовых концентрациях или обладаю-щих относительно низкой активностью.

Преимущества использования хромогенныхи флуорогенных субстратов:• Высокая чувствительность метода. pNA или

АМК обладают фотометрическими характеристиками, позволяющими использовать кинетические методы измерения.

• Высокая специфичность. Для каждой отдельной сериновой протеазы системы гемостазаизвестна структура участка гидролиза. Моделирование в короткоцепочечном пептиде специфической для конкретной протеазы последовательности из 3 аминокислот позволяетисключить влияние других протеаз на результаты исследования. При синтезе хромогенныхсубстратов для повышения специфичностииспользуются L- или D-стереоизомеры аминокислот, а также различные блокирующие группировки, чтобы предупредить деградацию их

неспецифическими аминопептидазами. Крометого, в тестах используется концентрация хро-могенных субстратов в несколько сотенмкмоль/л, что существенно выше, чем константаМихаэлиса (Км) соответствующих ферментов,поэтому скорость реакции не зависит отконцентрации субстратов. Факторы, которыенеобходимо учитывать при использованиихромогенных субстратов в практической клинико-диагностической лаборатории:• Растворимость субстратов должна быть хо

рошей.• Реакция должна быстро достигать линей

ность, чтобы использовать соответствующийнабор на биохимических анализаторах, в которых часто бывает ограниченным времяпроведения измерения.

• В пробе не должно быть мутности, которуючасто привносит фибрин или денатурированные белки.Недостатки метода с использованием хромо-

генных субстратов:• Высокая стоимость реактивов.• Возможное завышение результатов при исследовании активности витамин-К-зависимых факторов у лиц, получающих непрямые антикоагулянты либо имеющих дефицит витамина К.Некоторые хромогенные субстраты, используемые для определения активности факторовсвертывания, представлены в табл. 16.

Таблица 16Типичные хромогенные и флуорогенные субстраты и ингибиторы, применяемыедля выявления активности протеолитических ферментов системы гемостаза


Иммунохимические методы

Иммунохимические методы активно началивнедряться в клинико-диагностических лаборато-риях с целью исследования гемостаза в последнеедесятилетие. Они позволяют количественно оп-ределять концентрацию конкретного белка, чтоотличает их от коагуляционных методов и мето-дов с хромогенными субстратами, в которых оп-ределяется функциональная активность компо-нентов, а не их концентрация. Первые тест-сис-темы не позволяли различить активные и неак-тивные (профакторы) компоненты системы гемо-стаза. В последнее время предлагается все боль-ше тест-систем для определения концентрацииактивных компонентов свертывания, их кофак-торов, активаторов, ингибиторов, продуктов про-теолитического гидролиза, а также сформировав-шихся субстрат-ферментных комплексов. Эти те-сты основаны на использовании специфическихантител. В современных клинико-диагностичес-ких лабораториях доступными стали иммунохи-мические методы для ручного и автоматизирован-ного использования, основанные на латекс-агг-лютинации (рис. 90) и методе ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).

Латекс-агглютинация

Латекс-агглютинация выявляется визуальноили на автоматизированных нефелометрах. Не-

достатком этого подхода является нелинейностьоптического сигнала при турбидиметрическом инефелометрическом методах регистрации.

Метод ELISA

Метод ELISA (рис. 91) для выявления кон-центрации факторов гемостаза, как правило,использует принцип «сендвича». На стенки мик-роплашки наносятся антитела к исследуемомуфактору гемостаза (твердая фаза). После добав-ления плазмы происходит осаждение специфи-ческого антигена (белка системы гемостаза) нафиксированных антителах. Плашка промыва-ется и заполняется вторичными антителами,взаимодействующими с этим же белком, но подругим эпитопам (антигенным структурам).Вторичные антитела конъюгированы с фермен-том (ELISA), радиоактивной меткой (РИА),люминесцентной меткой (ЛИА). В тесте ELISAпосле отмывки несвязавшихся антител добав-ляется субстрат ферментативной реакции и хро-моген. Изменение светопропускания растворапропорционально количеству антигена (факто-ра), осажденного на фиксированных антителах.Методика позволяет оценить этот параметрколичественно в концентрации <1 нг/мл, чтодостаточно для многих компонентов свертыва-ющей системы.

Рис. 90. Принцип латекс-агглютинации. Латексные час-тицы, покрытые антителами против фактора гемостаза, привзаимодействии с этим фактором (антигеном) образуютагрегаты, видимые визуально или регистрируемые на со-ответствующих приборах

Рис. 91. Принцип ELISA. На плашке, покрытой антителамипротив фактора гемостаза, связывается антиген, Проявля-ющие антитела, конъюгированные с ферментом, связыва-ются с антигеном. Фермент меняет цвет хромогена про-порционально количеству антигена


В настоящее время значительное развитиеполучают быстрые качественные и полуколиче-ственные иммунохимические иммунодиффузион-ные методы, основанные на визуальном опреде-лении реакции антиген-антитело.

Радиальная иммунодиффузия

Метод радиальной иммунодиффузии (РИД)основан на образовании колец преципитации врезультате взаимодействия специфических анти-тел, содержащихся в геле, с анализируемым ан-тигеном, помещаемым в углубления стандартно-го размера (рис. 92). В результате диффузии в гелерастворимых антигенов кольцо преципитацииобразуется в зоне оптимального соотношенияантиген/антитело. Площадь, ограниченная коль-цом преципитации, пропорциональна количествуантигена.

«Ракетный» иммуноэлектрофорез

«Ракетный» иммуноэлектрофорез - иммуноло-гический метод, сочетающий в себе электрофорези иммунодиффузию (рис. 93). Метод дает возмож-ность различить сходные по электрофоретическойподвижности вещества с помощью специфическойреакции преципитации между антигеном, помеща-емым на гелевую (целлюлозо-ацетатную) пластин-ку, и соответствующими антителами, которые со-держатся в ней. Длина «ракетных» иммунопреци-питатов пропорциональна концентрации антиге-на. Метод довольно прост в исполнении и облада-ет относительно высокой точностью.

При фундаментальном подходе к исследовани-ям компонентов гемостаза применение флуоресцент-ной или люминесцентной меток повышает чувстви-тельность иммунохимических методов и расширяетспектр определяемых компонентов.

Ат Ат Ат

Ат Ат

Ат Ат Ат

Ат Ат Ат

Ат-Аг

Ат Щ О Ат

Ат-Аг

Ат Ат Ат

Рис. 92. Принцип метода радиальной иммунодиффузии,используемый для полуколичественной оценки неко- Рис. 93. Принцип метода «ракетный» иммуноэлектро-торых факторов гемостаза форез

Скрининговые тесты оценки плазменного звена гемостаза

Лабораторная диагностика нарушений систе-мы гемостаза является одной из самых дорогосто-ящих в лабораторной практике. Выполнение всехвозможных тестов для уточнения характера нару-шений для всех пациентов - практически недоступ-ная задача. Поэтому чрезвычайно важно соблю-дать этапность проведения тестов, исходить изклинических данных и анамнеза пациента.

На первом этапе для уточнения направленнос-ти нарушений необходимо провести тесты, отража-ющие состояние целых звеньев системы гемостаза.Поскольку в разных лабораториях при анализе ге-мостаза преследуются разные цели, перечень тестов,входящих в гемостатический скрининг для даннойлаборатории, может отличаться от такового в дру-

гих лабораториях. Однако существует набор тестов,традиционно называемых (и рекомендуемых) скри-нинговыми для диагностики состояния системы ге-мостаза. Обычно к ним относят определение вре-мени кровотечения и несколько тестов, оцениваю-щих состояние плазменного звена гемостаза, кото-рые входят как основной компонент в понятие коа-гулограммы. Наиболее полно этапность разработа-на для диагностики геморрагических нарушений.Скрининговые тесты:• Время кровотечения.• Количество тромбоцитов.• АЧТВ.• Протромбиновое время (по Квику).• Тромбиновое время и/или фибриноген.


Для пациентов с тромботическими заболева-ниями адекватного скрининга для диагностикинарушений системы гемостаза не разработано.Имеет смысл проведение исследования наиболеезначимых маркеров тромбофилии, о которых бу-дет говориться ниже. Однако есть возможностьконтроля активности самого процесса патологи-ческого тромбообразования на основе анализаконцентрации маркеров тромбообразования.

Скрининговые тесты на состояние внутренне-го и внешнего каскада активации протромбиназыпозволяют выявлять нарушения со стороны фак-торов-субстратов, кофакторов, ингибиторов кас-када свертывания, а также действие некоторых

лекарственных препаратов или аутоантител. Ос-новным тестом на состояние внутреннего каскадасвертывания плазмы является АЧТВ, на состояниевнешнего каскада - ПВ. Их диагностическое зна-чение представлено в табл. 17 и на рис. 94.

Несмотря на то что в тестах АЧТВ и ПВ уча-ствует большинство плазменных факторов, дале-ко не во всех случаях при патологии того илииного звена или действии лекарственных препа-ратов эти показатели меняются (табл. 18). Коагу-лограмма - это комплексный анализ по многимтестам, совокупность которых может позволитьопределить конкретную причину нарушения свер-тывания крови.

Таблица 17

· Концентрация фибриногена начинает влиять на результаты тестов при снижении ее нижеопределенного порога. Как правило, эти тесты не позволяют количественно определитьфибриноген или заподозрить умеренное снижение его концентрации.

Рис. 94. Факторы, влияющие на результаты скрининговых тестов АЧТВ и ПВ. Звездочкой зависимые факторы, накоторые влияют антикоагулянты непрямого действия


Таблица 18Изменение А ЧТВ и ПВ при патологии отдельных компонентов плазменного звена гемостаза

и влиянии некоторых лекарственных средств

В названии АЧТВ (иногда его обозначаюткак активированное парциальное тромбопласти-новое время, АПТВ) слово «частичное», или «пар-циальное», указывает на то, что в тесте использу-ются реагенты, содержащие фосфолипиды, а нетканевые факторы (в этом отличие от ПВ, гдеиспользуется тканевой тромбопластин). Факто-ры и взаимные влияния некоторых из них наАЧТВ представлены на рис. 95.

АЧТВ используется как скрининговый тестдля оценки внутреннего каскада свертыванияплазмы, скрининговой диагностики волчаночно-го антикоагулянта и слежения за антикоагулянт-ным действием гепаринов. АЧТВ - более значи-мый тест для первичного выявления патологии,

чем ПВ, так как выявляет относительно частовстречающуюся гемофилию А и В (дефицит фак-торов VIII и IX соответственно) и наличие вол-чаночного антикоагулянта.

Лабораторные условия, влияющие на АЧТВ

Нормальные значения теста АЧТВ зависят отиспользуемых реактивов и приборов. Большоезначение имеет преаналитическая стадия: прини-маемые пациентом лекарственные препараты,правильность взятия крови, использованный ан-тикоагулянт, условия хранения и транспортиров-ки пробы и т. д. Охлаждение пробы ведет к акти-вации контактной фазы in vitro. Стабильность

■

10 9

Активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ)


Рис. 95. Последовательные и взаимовлияющие реак-ции, определяющие значение активированного частично-го тромбопластинового времени (АЧТВ)

пробы зависит от применяемых пробирок. Поэто-му каждая лаборатория должна нарабатыватьсобственные нормы. До настоящего временипрактически нет системы межлабораторнойстандартизации теста АЧТВ, приборная и реа-гентная база этого теста пока не поддаются стан-дартизации. Рекомендуется корректировать нор-мы для каждой серии реактивов. Опытным пу-тем следует удостовериться в качестве АЧТВ-реактивов, которые должны отвечать следую-щим критериям:• Иметь одинаковые диапазоны нормальных

значений для разных серий реактивов от одного производителя.

• Должны выявлять клинически значимое снижение факторов свертывания удлинениемвремени образования сгустка (т. е. результаты должны соответствовать клиническимпроявлениям гипокоагуляции).

• Быть чувствительными к антикоагулянтномуэффекту гепарина, при этом не проявлятьслишком высокой чувствительности при использовании гепарина в терапевтическойконцентрации.

• Выявлять наличие волчаночного антикоагулянта, для этого рекомендуется использовать,в частности, 2 набора с разной чувствительностью к волчаночному антикоагулянту.

Предпочтительно использовать готовые ре-активы, что уменьшает ошибку оператора.

Время преинкубации в тесте АЧТВ имеетбольшое значение для выявления патологии ге-мостаза. При коротком времени от момента до-бавления активаторов (каолин и кефалин) домомента внесения СаС12 тест АЧТВ получаетсядостаточно длительным и нестабильным. Опытпоказывает, что 30 с преинкубации недостаточ-но, однозначные стабильные результаты гаран-тированно получаются после 600 с преинкуба-ции. Однако такая длительная преинкубация не-технологична. Общепринятой считается преин-кубация 60 с, при которой нестабильность неприводит к искажениям результатов, которые бызначимо влияли на диагностические характери-стики теста.

Тем не менее при дефицитной плазме по од-ному из факторов контактной фазы (XII, XI, пре-калликреин, ВМК), особенно прекалликреину,длительная фаза преинкубации с активаторамисоздает условия для нивелирования результатов.Только при коротком периоде преинкубации вэтих условиях удается выявить дефицит фактора,при 60-минутной преинкубации часто дефицитфакторов контакта не выявляется. Результатыбудут ложно «нормальными», что ведет к оши-бочному диагнозу.

Диагностическое значение АЧТВ

Укорочение А ЧТВ иногда определяется у боль-ных с тромбофилией. Это может быть связано с ре-зистентностью фактора V к активному протеину С,повышенным уровнем фактора VIII или активи-рованных факторов свертывания. Однако чащевсего укорочение АЧТВ объясняется нарушения-ми работы с кровью на преаналитическом этапе.

Удлинение А ЧТВ происходит при:• врожденном или приобретенном дефиците

факторов II, V, VIII, IX, X, XI, XII, прекал-ликреина, ВМК;

• снижении активности ф-VIII на фоне болезни Виллебранда;

• лечении гепарином, гирудином или апроти-нином (ингибитор контактной фазы коагуляции);

• присутствии в крови ПДФ, волчаночногоантикоагулянта;


• нарушении функции печени;• коагулопатии потребления (ДВС-синдром);• тяжелой дисфибриногенемии или афибрино-

генемии.Важно подчеркнуть (обычно это не учитыва-

ется), что при хранении снижается стабильностьпробы, особенно от больных, которым вводилсягепарин. В результате резко увеличивается вари-ация данных АЧТВ, регистрируемых подряд изодной пробы.

Реактивы, используемые для постановкиАЧТВ, не стандартизуются. Поэтому свойствареактивов должны быть известными, лучшепользоваться реактивами от одного производи-теля. Набор реактивов для АЧТВ содержит ак-тиватор контактной фазы и фосфолипиды. СаС12

добавляется в пробу отдельно как стартовый ре-актив. Контактный активатор - это высокодис-персионная суспензия отрицательно заряженныхчастиц каолина (белая глина) или эллаговая кис-лота, полифенол или сульфатиды (отрицательнозаряженные сульфатированные липиды) в смесис каолином. Фосфолипиды используют или син-тетические, или выделенные из тканей живот-ных (мозг кролика) или из сои. Лучшие результа-ты достигаются при использовании смеси разныхфосфолипидов, включая отрицательно заряжен-ный фосфатидилсерин. Вид и концентрация фос-фолипидов - более важный компонент для харак-теристики набора АЧТВ, чем компоненты кон-тактной фазы активации. Стабилизация реактиваобеспечивается в первую очередь ионной силойраствора и свойствами буферной системы, это вомногом влияет на коагуляционные свойстваАЧТВ-реактива.

Чувствительность теста А ЧТВ к разным из-менениям гемостаза в значительной мере связанасо свойствами используемых в тесте реактивов.Большинство тест-наборов АЧТВ (но не все) чув-ствительно к снижению активности факторов VIIIили IX. Однако умеренное снижение активностиф.IХ может не вызывать удлинения АЧТВ при вы-сокой активности ф.VIII, несмотря на наличие ге-моррагических проявлений у пациента. При дефи-ците других факторов чувствительность теста зна-чительно варьирует, однако при остатке фактора<10% нормы АЧТВ во всех случаях удлиняется.

Фактор VIII является острофазным белком,повышается при воспалительных реакциях, трав-

мах. Данный факт необходимо учитывать при ин-терпретации укорочения АЧТВ в этих случаях.АЧТВ - менее чувствительный тест на выявлениепатологии на общем этапе коагуляции и недоста-точности фибриногена, чем ПВ.

Чувствительность АЧТВ к волчаночному ан-тикоагулянту варьирует в зависимости от реак-тива (от полного отсутствия удлинения АЧТВ дозначительного удлинения).

В присутствии ПДФ происходит значитель-ное удлинение АЧТВ (рис. 96). Следует отметить,что ингибирующий эффект зависит от использу-емых реактивов для определения АЧТВ.

Рис. 96. Изменение АЧТВ из-за накопления ПДФ при ле-чении стрептокиназой тромбоза глубоких вен бедра. Уд-линение АЧТВ значительно превысило референтный диа-пазон, Результат нельзя объяснить снижением активностиотдельных факторов гемостаза. Эффект связан с прямымдействием ПДФ на полимеризацию фибрин-мономеров

Выявление дефицита факторовс использованием принципа заменных проб

АЧТВ используется для выявления дефицитаотдельных факторов плазменного гемостаза, дляэтого применяются заменные пробы с контрольны-ми плазмами, дефицитными по конкретному фак-тору (рис. 97). Например, при гемофилии А (де-фицит фактора VIII) тест АЧТВ с плазмой боль-ного пациента будет соответственно удлинен.При добавлении к такой плазме контрольной


Рис. 97. Принцип проведения заменной пробы. Кплазме больного гемофилией добавляются дефицитныеплазмы по одному из факторов плазменного гемостаза.Если тест АЧТВ после добавления заменной пробы невосстанавливается, то в плазме больного и дефицитнойплазме отсутствует один и тот же фактор. Если АЧТВвосстанавливается, значит в плазме больного отсутствуетдругой плазменный фактор

плазмы, истощенной по фактору VIII, восстанов-ления времени коагуляции в тесте АЧТВ не про-изойдет. Это доказывает, что в плазме больногои в контрольной, истощенной по фактору VIII,отсутствует один и тот же компонент. Если же кплазме больного гемофилией А добавить плазму,истощенную по другому фактору (например, IX),то время свертывания в тесте АЧТВ восстановит-ся до нормальных значений, так как в этой плаз-ме присутствует фактор VIII, с недостатком ко-торого было связано удлинение АЧТВ плазмыбольного гемофилией А. Эта методика позволя-ет диагностировать дефицит того или иного плаз-менного фактора.

Использование АЧТВ для выявленияволчаночного антикоагулянта

Волчаночный антикоагулянт может удлинятькак АЧТВ, так и ПВ, однако тест АЧТВ, как пра-вило, более чувствителен. В то же время эффект

волчаночного антикоагулянта в значительнойстепени зависит от состава фосфолипидов в реа-гентах. Принцип проведения теста АЧТВ в этомслучае представлен на рис. 98. Если при добавле-нии к плазме больного с удлинением АЧТВ кон-трольной плазмы, содержащей все факторы,АЧТВ восстанавливается, то в плазме больногобыл дефицит фактора. Если АЧТВ не восстанав-ливается в полной мере, то в плазме больного при-сутствует ингибитор, в частности, им может бытьволчаночный антикоагулянт, который блокиру-ет фосфолипидную матрицу. Чувствительностьк волчаночному антикоагулянту проявляют от-рицательно заряженные фосфолипиды, поэтомутест зависит от реактивов. В некоторых лабора-ториях применяются 2 набора реактивов для те-ста АЧТВ, по-разному чувствительные к волча-ночному антикоагулянту. В то же время присут-ствие волчаночного антикоагулянта отмечаетсяу пациентов, склонных к тромбозам. Поэтому уд-линение АЧТВ при наличии тромбоза сразу на-стораживает на присутствие волчаночного анти-коагулянта.

Рис. 98. Заменная проба на основе АЧТВ для диффе-ренциальной диагностики между дефицитом фактора илиприсутствием ингибитора (волчаночного антикоагулянта) вплазме


Трудность вызывает ситуация с транзитор-ным повышением волчаночного антикоагулянтапри инфекции или лечении некоторыми препара-тами, при которых нет клинических проявлений.Например, гепарин оказывает синергичный эф-фект с волчаночным антикоагулянтом, вызываяслишком сильное удлинение времени свертыва-ния. В этом случае изменение АЧТВ будет указы-вать на передозировку гепарина. В то же времяиспользование реактивов, нечувствительных кволчаночному антикоагулянту, покажет относи-тельно адекватное изменение АЧТВ на вводимуюдозу гепарина. Поэтому еще раз рекомендуем ис-пользовать для постановки АЧТВ реактивы сразной чувствительностью к волчаночному анти-коагулянту.

Использование АЧТВдля контроля гепаринотерапии

Лечение гепарином контролируется тестомАЧТВ. Общепринято, что при использовании не-фракционированного гепарина «терапевтическийдиапазон» достигается при удлинении АЧТВ в 1,5-2,5 раза. АЧТВ - тест более чувствительный к при-сутствию гепарина, чем ПВ, в то же время сильнозависит от качества применяемых реактивов. Это,вероятно, связано с тем, что реактивы при выпол-нении АЧТВ добавляются последовательно. Сна-чала вводится каолин и кефалин и проводится пре-инкубация в отсутствии ионов Са. В этот периодпроисходит: 1) максимальная активация факторовXII и XI; 2) инактивация антитромбином и гепа-рином следов тромбина и других активных фак-торов. Затем при добавлении Са практически от-сутствует активирующий эффект тромбина на фак-торы VIII и V по механизму обратной связи. Еслиже в пробе не было гепарина, то активирующийэффект тромбина на факторы VIII и V сохранен.Такое же объяснение, по-видимому, справедливок оценке действия гирудина, эффект которого так-же регистрируется тестом АЧТВ, но не ПВ.

Реактивы в тесте АЧТВ имеют разную чув-ствительность к гепарину и ингибитору внешне-го пути (ИВП, TFPI), который повышается в про-бах пациентов, леченных гепарином. Это приво-дит к тому, что при использовании малочувстви-тельных гепаринов однотипное удлинение АЧТВдостигается при разных концентрациях гепари-

на, а при использовании высокочувствительныхреактивов нетерапевтические малые дозы будутсущественно удлинять АЧТВ-тест. Кроме того, самгепарин имеет разные свойства, варьирует по раз-меру, степени очистки, активности in vivo и in vitro.У пациентов во время инфузии гепарин представ-лен нативной молекулой, а через некоторое вре-мя гепариноподобный эффект оказывают его де-риваты, но уже с другой антикоагулянтной ак-тивностью. Причем продукты метаболизма гепа-рина по-разному влияют на нейтрализацию фак-тора 4 тромбоцитов (освобождается из тромбо-цитов in vivo и in vitro, особенно при нарушенияхпреаналитического этапа, что может существен-но изменять показатели гемостаза), а также наантитромбиновую и анти-Ха-активность. Поэто-му не имеет большого смысла тестировать реак-тивы на чувствительность к гепарину, эти резуль-таты дают сугубо ориентировочную информа-цию, особенно на контрольной плазме. Для боль-шей уверенности иногда строят «кривую чувстви-тельности к гепарину», используя для этого пул-плазму от пациентов, которые в недавнем про-шлом успешно лечились гепарином.

Некоторые АЧТВ-реагенты настолько чув-ствительны к присутствию гепарина, что вообщене регистрируют свертывание при концентрациигепарина даже в терапевтической концентрации.Кроме того, коммерческие гепарины разные. Ге-парин - это глюкозаминогликан, получаемыйпутем экстракции в основном из тканей легкихкрупного рогатого скота или свиньи или из сли-зистой оболочки кишечника быков. Слабо очи-щенная фракция - это нефракционированный ге-парин, он имеет молекулярную массу от 5000 до30 000 Да, в основном ингибирует тромбин и фак-тор Ха. С недавнего времени стали широко ис-пользовать низкомолекулярный гепарин (НМГ),который получают из нефракционированного ге-парина путем энзиматической и химической дег-радации. Сравнительные характеристики нефрак-ционированного и фракционированного низко-молекулярного гепарина представлены в табл. 19.

Контроль за лечением низкомолекулярнымфракционированным гепарином

Контроль за лечением низкомолекулярнымфракционированным гепарином рекомендуется на


Таблица 19Сравнительная характеристика нефракционированного и низкомолекулярного гепарина

основе теста анти-Ха (единица измерения - анти-Ха-МЕ/мл), ставить который следует перед очереднымвведением препарата. Тест анти-Ха заключается визмерении оставшегося Ха с использованием специ-фического хромогенного субстрата (табл. 20).

Контроль лечения гирудином

АЧТВ применяется для контроля лечения ги-рудином. Гирудин - антикоагулянт слюны меди-цинской пиявки. Это полипептид, состоящий из65 аминокислот, имеющий молекулярный вес око-ло 7000 Да. Гирудин - высокоспецифичный ин-гибитор действия тромбина, он необратимо бло-кирует активные центры тромбина и центры свя-зывания тромбина на фибриногене. Тем самымблокируется переход фибриногена в фибрин. Ги-рудин не взаимодействует с AT, он действует какпрямой ингибитор свертывания крови. Передо-

зировка гирудином может привести к тяжелымкровотечениям. После подкожного или внутри-венного введения гирудин быстро распределяет-ся по кровотоку и межклеточному пространству.Он не метаболизируется печенью, а выводитсячерез почки, период полувыведения у здоровыхлюдей от 60 до 120 минут. Особенно тщательноконтроль за применением гирудина следует про-водить у больных с нарушением почечной функ-ции, при ожирении и у детей. Гирудин показан убольных с гепарин-индуцированной тромбоцито-пенией.

АЧТВ-реактивы существенно отличаютсяпо чувствительности к выявлению антикоагу-лянтного эффекта гирудина. Многие наборы ре-гистрируют «эффект плато» с гирудином, т. е.при увеличении дозы гирудина не удлиняетсяАЧТВ, что может быть условием передозиров-ки гирудина.

Таблица 20Терапевтический диапазон анти-Ха при терапии фракционированным гепарином


Скрининговый тест на основе АЧТВ для оценкиантикоагулянтной активности протеина С

Антикоагулянтная активность протеина С,связанная с ингибированием активных факторовVilla и Va, рассматривается в последнее время какодин из основных физиологических барьеров про-тив тромбоза. Поэтому определение резистентно-сти к активированному протеину С (РАПС) -один из самых первых подходов при выявлениииндивидуального риска тромбоза. Наиболее ре-

альным скрининговым тестом для определенияРАПС является постановка АЧТВ в условияхпредварительной активации протеина С актива-тором из змеиного яда с фирменным названиемProtac® (см. ниже). Чувствительность теста к фак-тору Лейден и дефициту протеина С близка к100%. Тест с Protac® может нарушаться также приналичии волчаночного антикоагулянта, мутациипротромбина 20210G—>A или повышенной актив-ности ф.УШ:С (> 150%).

Протромбиновое время

Протромбиновое время (ПВ) - широко ис-пользуемый скрининговый тест для оценки внеш-него каскада свертывания плазмы. ПВ обычноиспользуется для определения активности ф.УП,контроля за лечением непрямыми антикоагулян-тами, при скрининге системы гемостаза, редкодля количественного определения фибриногена(в автоматических коагулометрах, имеющих спе-циальную программу).

ПВ удлиняется при:• дефиците факторов VII, X, V, протромбина и

фибриногена, в том числе при тяжелых заболеваниях печени, при наличии аутоантителпротив факторов свертывания. Чувствительность к недостатку протромбина и фибриногена в тесте ПВ меньше, чем к недостатку других вышеперечисленных факторов;

• иногда в присутствии волчаночных антикоагулянтов.Несколько типов реагентов для постановки

ПВ используется в КДЛ:• Рекомбинантные ПВ-реактивы

Рекомбинантный тканевой фактор, Са2+, фос-фолипиды, буфер, стабилизаторы.

• Тканевые тромбопластиныЭкстракты тканей, богатые тканевым тром-бопластином (печень, мозг кролика, быка,свиньи, плацента человека).

• Комбинированные тромбопластиныТканевой тромбопластин, разведенный в растворе фибриногена быка; его целесообразно использовать при контроле за лечением непрямыми антикоагулянтами.Реактивы могут отличаться по нескольким

показателям: чувствительностью, реактивностью

к гепарину, разной активностью по свертываниюконтрольной плазмы, характеризоваться межсе-рийными колебаниями. Свертывание в тесте ПВне должно быть <10 с, особенно в тех случаях,когда определение проводится в относительныхединицах или процентах. На результат протром-бинового теста (ПТ) могут влиять патологичес-кие ингибиторы фосфолипид-зависимых реакцийи ингибиторы полимеризации фибрина - продук-ты его деградации (ПДФ) или миеломные белки(парапротеины).

Для представления результатов ПВ в разноевремя предлагалось использовать:1) время свертывания в секундах;2) протромбиновый индекс (ПИ), который оп

ределяется как

4) ПТ по Квику - % от нормы, которая определяется по калибровочному графику;

5) международное нормализованное отношение(MHO), которое представляет собой ПО, возведенное в степень Международного индекса чувствительности (МИЧ):

Первые три выражения, хотя и представля-ются в виде цифр, но из-за отсутствия калибров-ки являются, по сути, качественными показате-

3) протромбиновое отношение (ПО), котороеопределяется как


лями с неопределенным масштабом. Кроме того,существенным недостатком определения про-тромбинового времени в секундах является низ-кая воспроизводимость из-за использования не-стандартизованного тромбопластина. Поэтомунельзя сопоставлять результаты у одного паци-ента, полученные в разных лабораториях, на раз-ных приборах или с тест-наборами разных серий.Выражение ПИ в процентах не несет смысловойнагрузки и путает врачей, так как между количе-ством факторов и измерением ПВ в секундах нетпрямой пропорциональной зависимости.

Два последних выражения для ПВ являютсявзаимодополняющими.

Протромбиновый тест (ПТ) по КвикуМетодика выполнения ПТ-теста была предло-

жена Квиком (Quick AJ. и соавт.) в 1935 г. и состо-ит в определении времени свертывания цитратноиплазмы после добавления тромбопластина и Са2+.

В тесте протромбиновое время по Квику дляперевода времени свертывания в % факторовпротромбинового комплекса строится калибровоч-ный график с использованием разведений стандарт-ной плазмы. График имеет форму логарифмичес-кой зависимости. Для вычислений вручную мож-но использовать линелизацию графика (рис. 99) вкоординатах «1/% протромбина» (т. е. 100% —0,01;75% - 0,0133; 50% - 0,02; 25% - 0,04; дальнейшееразведение нежелательно, так как возможно откло-нение калибровки из-за значительного сниженияконцентрации фибриногена). Недостатком этогометода калибровки ПВ является то, что разведе-

ние плазмы моделирует только снижение концен-трации факторов, которое может наблюдаться,например, при нарушении синтеза белков в пече-ни или развитии коагулопатии потребления. Придефиците витамина К или приеме его антагонис-тов (непрямых антикоагулянтов) концентрацияфакторов может быть близкой к норме, но их фун-кциональные свойства существенно изменены.Поэтому ПВ по Квику рекомендуется использо-вать при постановке коагулограммы для выявле-ния механизмов нарушения свертывания крови.

Наклон калибровочной кривой может зави-сеть от того, какой буфер или физиологическийраствор были использованы для разведений. Раз-веденная плазма нестабильна, поэтому растворыразведенной контрольной плазмы хранить не ре-комендуется, необходимо использовать столькоисходной плазмы, сколько требуется для серииразведений и не больше.

При очевидной простоте выполнения самоготеста оценка его результатов представляет собойсерьезную проблему, которая окончательно не ре-шена до настоящего времени. Две основные при-чины обуславливают сложность проблемы. Во-первых, в тесте активируется ряд последователь-ных и взаимовлияющих реакций, и суммарная ско-рость зависит от многих параметров (рис. 100). Во-вторых, время свертывания нормальной и, что ис-ключительно важно, патологической плазмы зна-чительно варьирует в зависимости от источника иметода получения тромбопластина.

Рис. 99. Линелизация калибровочного графика протром-биновое время по Квику в координатах «1/% протромби-на» - время

Рис. 100. Последовательные и взаимовлияющие реак-ции, определяющие суммарную активность протромбино-вого теста (ПТ)


Протромбиновое время, выраженное черезмеждународное нормализованноеотношение (MHO)

Современные коагулометры программиру-ются на вычисление MHO. Стандартизованныйпротромбиновый тест был разработан Междуна-родным комитетом по стандартизации в гемато-логии и Международным комитетом по тромбо-зу и гемостазу и принят ВОЗ в 1983 г. В его осно-ве лежит наличие линейной зависимости междулогарифмами протромбинового времени, опреде-ленными с разными тромбопластинами. На прак-тике это означает, что значения ПО, определен-ные с использованием разных тромбопластинов,могут быть приведены путем возведения в сте-пень, представляющую собой МИЧ используемо-го тромбопластина, к величине, которая была быполучена при определении факторов протромби-нового комплекса с первичным стандартом тром-бопластина. Эту величину было предложено на-зывать MHO - международным нормализованнымотношением (INR - английская аббревиатура). Порекомендации ВОЗ определение МИЧ (ISI - анг-лийская аббревиатура) является обязанностьюпроизводителей тромбопластина, которые долж-ны определять относительную чувствительностькаждой серии выпускаемых ими тромбопласти-нов, сравнивая ее с эталоном тромбопластина,чувствительность которого принята за единицу.

MHO рассчитывают по формуле:

Контроль за лечением непрямымиантикоагулянтами

При приеме непрямых антикоагулянтов ме-няются как внешний, так и внутренний пути ак-тивации протромбиназы, однако эффект непря-мых антикоагулянтов в большей степени сказы-вается на внешнем каскаде, и соответственнобольше меняется ПВ, чем АЧТВ.

При терапии непрямыми антикоагулянтамииспользование MHO позволяет оценивать сте-пень гипокоагуляции независимо от используе-мого тромбопластина, сравнивать результаты,полученные разными лабораториями. Для конт-

роля за терапией непрямыми антикоагулянтамирекомендуется использовать тромбопластины созначениями МИЧ ниже 2 (лучше 1,0-1,2).

Ограничения использования MHO

Имеются достаточно значительные ограни-чения в использовании MHO в лабораторнойпрактике:• MHO не может использоваться на начальном

этапе лечения непрямыми антикоагулянтами,так как существующие различия между разными тромбопластинами вносят слишкомбольшие флуктуации на этом этапе, которыене могут быть компенсированы производителями реагентов.

• MHO не используется для контроля и мониторинга состояния внешнего каскада активации протромбиназы в общей популяции пациентов, не принимающих непрямых антикоагулянтов. В этом случае нужно использоватьПТ, различия в определении которого сохраняются между разными лабораториями.Комментарии по поводу разных способов

выражения ПТ-теста представлены в табл. 21.

Интерпретация результатов

ПВ удлинено (ПИ снижен, ПО и MHO повы-шены) - врожденный дефицит факторов II, V,VII, X, хронические заболевания печени с нару-шением функции, дефицит витамина К (холес-таз, мальабсорбция, дисбактериоз), лечение ан-тикоагулянтами непрямого действия, гипофиб-риногенемия (менее 0,5 г/л), дисфибриногенемияи нарушение полимеризации фибрина, ДВС-син-дром, присутствие ингибиторов свертывания (ге-парин, ПДФ).

ПВ укорочено (ПИ увеличен, ПО и MHO сни-жены) - состояние гиперкоагуляции, массивноепоступление тканевого тромбопластина в крово-ток (травма, некроз), повышенная свертывае-мость во время беременности и после родов.

Выявление дефицита факторовс использованием принципа заменных пробв тесте ПВ

Клоттинговый метод определения активнос-ти ф.VII основан на использовании заменных


Таблица 21Способы выражения протромбинового теста

проб с плазмой, лишенной ф.УП. Метод анало-гичен определению активности других факторов

в тесте АЧТВ, однако при анализе активностиф.VII используется тест ПВ.

Тромбиновое время

Тромбиновое время (ТВ) - скрининговый тестна полимеризацию фибриногена/фибрина и на ан-тикоагулянтную активность в плазме. ТВ регистри-руется по свертыванию плазмы при добавлении к нейнизкой или средней концентрации тромбина (бычь-его или человеческого). ТВ определяется в основномколичеством и качеством фибриногена и присут-ствием антикоагулянтов в плазме. Если в плазмеприсутствует гепарин, то комплекс гепарин-анти-тромбин быстро нейтрализует добавленный тром-бин и ТВ будет удлиняться. Среди скрининговыхтестов ТВ - наиболее чувствительный тест на при-сутствие гепарина. В то же время известно, что чув-ствительность к гепарину у ТВ зависит от рН, ион-ной силы тест-системы, свойств тромбина (проис-хождение и степень очистки), т. е. в значительнойстепени определяется составом набора реагентов.

Увеличение ТВ происходит также в присут-ствии относительно высокой концентрации про-

дуктов деградации фибрина (ПДФ), наблюдае-мой при назначении тромболитической терапии,при ДВС-синдроме, заболеваниях печени и придисфибриногенемиях. Результат определяется нетолько общим количеством ПДФ, но и их соста-вом. Непрямые антикоагулянты не влияют нарезультаты теста.

Иногда удлинение ТВ наблюдается в присут-ствии аутоантител к тромбину или парапротеиновпри миеломной болезни, которые препятствуютполимеризации мономеров фибрина. Ингибитора-ми полимеризации фибрин-мономеров могут бытьIgG или IgM, которые удлиняют как ТВ, так и реп-тилазное время. Аутотела к тромбину подавляюттолько ТВ и не влияют на рептилазное время.

К увеличению ТВ приводят: • снижениеконцентрации фибриногена менее

0,5 г/л (врожденная или приобретенная гипо/афибриногенемия);


• качественные изменения молекулы фибриногена (дисфибриногенемия);

• присутствие физиологических (гепарин) ипатологических (ПДФ, моноклональные белки) ингибиторов тромбина и фибринообра-зования;

• наличие парапротеинемии, уремии, в некоторых случаях волчаночных антикоагулянтов.Пределы нормальных значений ТВ зависят от

условий постановки метода и должны определять-ся в каждой лаборатории самостоятельно. Тест нестандартизован, в разных лабораториях могут ис-

пользоваться разные концентрации тромбина.Тест может выполняться в модификациях, в част-ности после нейтрализации гепарина протамин-сульфатом. Тест практически не пригоден для мо-ниторинга за лечением гепарином или гирудином,так как результаты зависят от состояния системыфибриноген-фибрин, кроме того, ТВ характери-зуется очень малым временным интервалом. Ре-зультаты во многом зависят от того, на каком ко-агулометре проводилось исследование - механи-ческом или оптическом, но в любом исполнениихарактеризуются низкой воспроизводимостью.

Рептилазное время (батроксобиновое время)

Батроксобин (или рептилаза) - тромбинопо-добная протеаза из яда щитомордника обыкновен-ного, которая способна вызывать переход фибри-ногена в фибрин. Рептилаза отщепляет от фибри-ногена только фибринопептид А, что отличает ееот действия тромбина, который, кроме фибрино-пептида А, отщепляет от фибриногена еще и фиб-ринопептид В (рис. 101) и активирует факторы V,VIII, XIII. Рептилаза не подавляется антитромби-ном, поэтому этот тест может использоваться дляоценки полимеризации мономеров фибрина в при-сутствии гепарина. Рептилазное время часто оп-ределяют одновременно с ТВ (табл. 22).

Таблица 22Тромбиновое и рептилазное время

при различных состояниях

Нормальные значения рептилазного времениустанавливаются в каждой лаборатории, так какпоказатель зависит от реагентной и приборной

базы. Рептилазное время удлиняется при афибри-ногенемии и при некоторых формах дисфибри-ногенемии, часто не параллельно ТВ и в присут-ствии относительно высоких концентраций ПДФ(при гиперфибринолизе).

Рис. 101. Принцип и влияние факторов при постановкетестов тромбиновое время (ТВ) и рептилазное время.Тромбин оказывает комплексный эффект, рептилаза от-щепляет от фибриногена только фибринопептид А (ФПА),На ТВ активно влияет АТ-гепарин, на рептилазное времягепарин не влияет, ПДФ за счет ингибирования полимери-зации фибрин-мономеров удлиняют как ТВ, так и рептилаз-ное время


Отдельные факторы гемостаза

В случае обнаружения патологических изме-нений АЧТВ и/или ПВ необходимо проводитьдополнительные исследования с целью выясне-ния причины этих отклонений. Несмотря на точто за последнее время для определения отдель-ных факторов гемостаза были разработаны ме-тоды с использованием хромогенных субстратов(амидолитические методы), многие лабораториипродолжают пользоваться коагуляционнымитехнологиями с использованием контрольныхплазм, обедненных по определенному фактору.Дефицитные плазмы получают: 1) путем имму-носорбции отдельных факторов с добавлениемдругих факторов, 2) от доноров, больных гемо-филией с недостаточностью одного из факторовсвертывания. Важнейшими качественными кри-териями наборов с дефицитной плазмой являют-ся очень низкий или неопределяемый уровень од-

ного фактора, высокий уровень других факто-ров, наличие в наборе калибраторов с дробнымсодержанием фактора, чтобы можно было пост-роить калибровочную кривую как в зоне с нор-мальным, так и патологическим содержаниемфактора. Для получения калибровочной кривойвозможно разведение калибраторов. Ведущиемировые производители выпускают калибрато-ры, тестированные относительно стандартовВОЗ (там, где они имеются). Следует подчерк-нуть, что далеко не любая комбинация дефицит-ной плазмы и тест-наборов на ПВ или АЧТВдают схожие результаты, поэтому следует поль-зоваться рекомендациями фирм-производителейдефицитных плазм и тест-наборов. Качество де-фицитной плазмы и чувствительность реагентовимеют существенное значение в определениидефицита факторов в клинике.

Референтные диапазоны содержания факторов

В табл. 23 приведены референтные диапазо-ны активности факторов гемостаза в плазме изаболевания, при которых наблюдаются сниже-ние или увеличение этих факторов. Для боль-шинства факторов нормальный диапазон актив-ности составляет 70-130%, для факторов V и VIIIдиапазон шире. Обычно умеренное снижениефакторов (ниже нормального диапазона), так жекак гетерозиготное носительство дефицита фак-тора, не сопровождается кровотечениями, одна-ко при массивных оперативных вмешательствахили нарушениях функции тромбоцитов это мо-жет быть решающим моментом развития гемор-рагического синдрома. Количественная харак-теристика факторов является значимой для ди-агностики гемофилии и лечения с использовани-ем гемоконцентратов. Содержание факторовсвертывания крови важно знать перед операци-ей у больных с заболеваниями печени, злокаче-ственными опухолями, сепсисом, нефротическимсиндромом, у пациентов, принимающих антико-агулянты непрямого действия, так как оператив-

ное вмешательство, особенно обширное, в этихслучаях может привести к дополнительному по-треблению проблемных факторов и развитиюкровотечения. Технологией с использованиемдефицитных плазм определяются все факторы,за исключением фибриногена и фактора XIII.Эта технология представлена в многочисленныхпособиях по исследованию факторов гемостаза,поэтому в данной книге воспроизводиться небудет.

В последние несколько лет появился интереск выявлению случаев повышения содержания от-дельных факторов гемостаза, что объясняетсяобнаружением хотя и относительно невысокой,но достоверной корреляции между повышеннымсодержанием факторов II, VII, VIII, IX, XI и уве-личенным риском тромбозов. Повышение актив-ности факторов может быть зарегистрированокоагуляционными методами с применением тех-нологии значительного разведения плазмы илиметодами с использованием хромогенных суб-стратов.


Таблица 23Диапазоны активности факторов гемостаза в плазме и клинико-диагностическое значение

изменения активности факторов


Принцип дифференцирования истинного дефицита факторов и действия ингибиторов

Удлинение АЧТВ и/или ПВ может быть выз-вано дефицитом факторов свертывания или при-сутствием ингибиторов, в частности аутоантител,волчаночного антикоагулянта и др. Для диффе-ренцирования дефицита факторов свертыванияот присутствия специфического ингибитора иливолчаночного антикоагулянта необходимо про-вести скрининговое исследование (количествотромбоцитов, АЧТВ, ПТ), исследование коррек-ции активности факторов или скрининговых тес-тов при смешивании тестируемой плазмы с нор-мальной, контрольной плазмой и тест разведения.Особенности проведения скрининговых тестовбыли описаны выше.

Исследование коррекции активности факторовсвертывания проводится путем смешивания иссле-

дуемой плазмы с контрольной нормальной плаз-мой. Соотношения компонентов могут бытьразличными. Чаще применяется смешивание 1:1(1 часть исследуемой плазмы / 1 часть контроль-ной), это соотношение удобно для подсчета и обла-дает неплохой чувствительностью. При низкой ак-тивности ингибитора можно использовать соотно-шение: 2 части исследуемой плазмы / 1 часть конт-рольной. При высокой активности можно исполь-зовать соотношение 1:4 и более и по степени коррек-ции косвенно судить об активности ингибитора.

После смешивания необходимо проводить те-сты немедленно и через 1 час инкубации, что по-зволяет определить характер ингибитора (табл. 24).

Для более точной дифференциальной диагно-стики между истинным и вторичным дефицитом

Дифференциальная диагностика врожденного дефицита факторов VIII и IX,специфического ингибитора и волчаночного антикоагулянта

Таблица 24

можно провести пробу с разведением, по край-ней мере, до 3 разных концентраций. Пробы сдефицитом показывают при разведении одинако-вый расчетный процент фактора в цельной плаз-ме. Пробы, в которых присутствует ингибитор,при разведении показывают относительное уве-личение фактора, что связано с диссоциацией

Рис. 102. Метод разведения пробы позволяет разли-чить истинный дефицит фактора и его ингибирование.При истинном дефиците разведение не меняет относитель-ной активности фактора, а при подавлении активностифактора ингибитором разведение сопровождается отно-сительным повышением активности фактора

комплекса фактор-ингибитор и освобождениемфактора из блокированного состояния (рис. 102).


Определение фибриногена

Определение фибриногена - один из рутин-ных тестов коагулограммы, выполняемый разны-ми методами.

Определение по Клауссу

Определение фибриногена по Клауссу счита-ется наиболее адекватным тестом, выполняетсяна коагулометрах. Он основан на определениивремени выпадения сгустка при добавлении оченьвысокой концентрации тромбина к разбавленнойв 10-20 раз плазме. При этом логарифм временивыпадения сгустка прямо пропорционален лога-рифму концентрации фибриногена. В этих усло-виях критической для свертывания становитсяконцентрация фибриногена. Калибровочная кри-вая показывает укорочение времени свертыванияпри увеличении концентрации фибриногена. Есливремя свертывания очень короткое (<5 с), то тестпроводится на разведенной плазме. Гепарин неоказывает влияния на результаты определенияфибриногена. Основными ограничениями мето-да определения фибриногена по Клауссу являет-ся чувствительность результатов к гипо-, дис- игиперфибриногенемии, а также к ПДФ, которыевлияют на процесс полимеризации фибрин-моно-меров и могут быть причиной ложно низких ре-зультатов (рис. 103).

Турбидиметрический метод

Определение фибриногена по изменениюмутности плазмы с использованием батроксоби-

Рис. 103. На результаты определения фибриногена пометоду Клаусса могут оказывать влияние присутствую-щие в системе циркуляции продукты деградации фибри-ногена/фибрина (ПДФ), а также гипо-, дис- и гиперфиб-риногенемия

на широко используется на автоматических ко-агулометрах и клинических анализаторах. В руч-ном исполнении он малопригоден, так как из-менение мутности нелинейное, необходимо ки-нетическое измерение пропускания. В частности,фирмой «Instrumentation Laboratory» (IL) разра-ботан кинетический метод определения фибри-ногена на основе использования коммерческоготромбопластина и неразведенной плазмы (PT-Fib-rinogen Recombinant). Определено, что в турбиди-метрическом тесте «протромбиновое время (ПВ)»скорость нарастания мутности (производная из-мерения мутности) при выпадении фибрина про-порциональна концентрации фибриногена вплазме. Фактически ставится турбидиметричес-кий метод определения ПВ, и в этом же тесте оп-ределяется концентрация фибриногена. Однакодля этого необходимо, чтобы прибор, регистри-рующий изменение пропускания, имел возмож-ность автоматически определятьпроизводную

изменения пропусканиянии результаты менее подвержены влияниюПДФ и дисфибриногенемиям.

Иммунохимические методы

Иммунохимические методы для фибриноге-на основаны на турбидиметрическом или нефе-лометрическом способах регистрации, исполь-зовании поликлональных антител и адаптиро-ваны на иммунохимические анализаторы. Какправило, для каждого иммунохимического ана-лизатора применяется специфический тест-на-бор на фибриноген. Недостатком иммунохими-ческих методов является то, что они не диффе-ренцируют нативный фибриноген и продуктыего деградации. Это особенно существенно приведении больных на тромболитической тера-пии, обширных тромбозах и ДВС-синдроме,когда происходит значительное увеличение вплазме ПДФ.

ELISA-метод основан на применении специ-фических моноклональных антител. Однако этотметод очень дорог и пока не нашел широкогоприменения в лабораторной практике для опре-деления фибриногена.

В этом исполне-


Интерпретация результатов

Референтный диапазон для фибриногена вплазме в норме составляет 1,8-3,5 г/л (часто при-водят значения 2-4 г/л), практически не зависитот возраста и пола. Печень синтезирует 2-5 г фиб-риногена в день, время полувыведения фибрино-гена из крови составляет около 4 дней.

Фибриноген - острофазный белок. Концент-рация его может превышать 10 г/л при тяжелыхбактериальных инфекциях, при травме и тром-бозе. Повышение уровня фибриногена в остройфазе воспаления, как правило, имеет транзитор-ный характер. У курящих людей уровень фиб-риногена в плазме крови несколько выше, чему некурящих. К значительному росту фибрино-гена приводят заболевания почек (пиелонеф-рит, гломерулонефрит, гемолитико-уремичес-кий синдром), коллагенозы (ревматоидный ар-трит, узелковый периартериит), ночная паро-ксизмальная гемоглобинурия, новообразования(рак легкого).

При атеросклерозе наблюдается устойчивоеувеличение фибриногена, трудно корригируемоелекарственными препаратами. В результате рисксердечно-сосудистых заболеваний повышается свозрастанием исходного уровня фибриногена винтервале 3,0-4,5 г/л. Обнаружено, что повыше-ние уровня фибриногена в плазме крови больныхсердечно-сосудистыми заболеваниями предше-

ствует развитию инфаркта миокарда и инсульта.Корреляция между уровнем фибриногена и раз-витием этих осложнений особенно четко просле-живается у пациентов молодого и среднего возра-ста. Определение уровня фибриногена - наиболеечувствительный тест для выявления бессимп-томных стадий заболевания периферических ар-териальных сосудов.

Дисфибриногенемия - относительно частовстречающееся заболевание, причем это состоя-ние может определяться несколькими мутациями,одни из которых не сопровождаются, другие со-пряжены с кровотечениями, а при некоторых -развиваются тромбозы.

Снижение концентрации фибриногена вплазме наблюдается при врожденном дефици-те фибриногена, печеночно-клеточной недоста-точности, ДВС-синдроме, острых фибриноли-тических состояниях, поражениях костногомозга (лейкоз, опухолевые метастазы), при ин-фекционном мононуклеозе. Гипофибриногене-мию могут вызвать такие лекарственные пре-параты, как вальпроат натрия, фибраты, фено-барбитал, стрептокиназа, урокиназа, L-acnapa-гиназа. Физическая перегрузка снижает фибри-ноген. Лекарственную дефибринизацию плаз-мы можно достичь, используя ферменты змеи-ного яда (Reptilase® или анкрод), которые при-меняются для улучшения реологии крови за счетснижения вязкости.

Определение фактора Виллебранда (vWF)

Определение vWF проводится в основном для:• диагностики и последующего мониторинга

врожденной или приобретенной болезни Виллебранда;

• диагностики тромбофилии;• дифференциальной диагностики гемофилии А.

Имеется несколько методических подходовдля диагностики болезни Виллебранда. Один изалгоритмов диагностики болезни Виллебрандапредставлен в табл. 25.

Концентрация vWF определяется методамииммунотурбидиметрии, ELISA, «ракетным» элек-трофорезом. Связывающая способность фактораВиллебранда с коллагеном определяется в мик-

роплашках, покрытых коллагеном, методомELISA. Результат выражается как % от нормы.Состав субъединиц определяется электрофорезомв геле агарозы или иммуноблотом. Функциональ-ная активность определяется методом агглюти-нации фиксированных или отмытых тромбоци-тов или агрегации в богатой тромбоцитами плаз-ме при индукции ристомицином (Ристоцетин®).Метод с хромогенными субстратами в настоящеевремя рекомендуется использовать только какориентировочный.

Алгоритмы дифференциальной диагностикиприводятся в разделе, посвященном болезни Вил-лебранда.


Таблица 25Алгоритм диагностики болезни Виллебранда

Определение фактора X с использованием хромогенного субстрата

Определение фактора X - один из самыхраспространенных методов с использованиемхромогенных субстратов. Это объясняется тем,что по активности фактора Ха в последнее вре-мя все больше и больше контролируют анти-коагулянтный эффект низкомолекулярных ге-паринов (табл. 20). Появились предложенияконтролировать лечение непрямыми антикоа-гулянтами также с помощью определения фак-тора Ха.

В тесте используют фермент яда гадюки Рас-села, активирующий фактор X (RVV-X - factor Xactivation enzyme from Russel viper venom), или ядагюрзы обыкновенной - лебетоксовый тест. Ак-

тивный фактор Ха определяют в прямой реакциис хромогенным субстратом, в частности с Pefa-chrome® FXa (фирма «DADE Behring MarburgGmbH», Германия). Принцип метода представ-лен на рис. 104.

Рис. 104. Принцип определения содержания фактора Xс использованием хромогенного субстрата. pNA-пара-нитроанилин. Измерение проводится при длине волны (λ)405 нм фотометрическим методом

Определение фактора VIII с использованием хромогенного субстрата

Определение фактора VIII основано на том,что количество образующегося фактора Ха в ре-акциях активации плазменного гемостаза про-порционально содержанию фактора VIII в пробе(рис. 105).

Этот тест выполняет не только аналитичес-кую функцию, но и характеризует функциональ-ную активность, так как фактор VIIIa оценива-ется в присутствии физиологических кофакторовфосфолипидов и ионов Са2+. Тест может выпол-

няться как на специализированных фотометрахдля исследования гемостаза, так и на обычныхфотометрах и биохимических анализаторах. Ка-либровочная кривая для этого теста, как прави-ло, имеет линейный участок в широком диапазо-не концентраций фактора VIII.

Исследование с хромогенными субстратамипозволяет надежно количественно определять нетолько дефицит, но и избыток активности ф.VIII.Это позволяет диагностировать и прогнозировать

Определение с использованием хромогенного субстрата


Рис. 105. Принцип определения содержания фактора VIII с использованием хромогенного субстрата. ФЛ - фосфо-липиды

развитие патологических тромбозов, посколькуувеличение в плазме активности фактора VIII рас-сматривается как фактор тромбофилии.

Методические и аналитические моменты (об-разование комплекса между фактором VIII и фак-тором Виллебранда (vWF) в дефицитной плазме,разные типы фосфолипидов, использование плаз-мы или концентратов и т. д.) могут приводить ксистематическим различиям результатов междукоагуляционными методами и методами с хромоген-ными субстратами при определении фактора VIII.

Более того, одна технология может выявлять па-тологию, а другая свидетельствовать о нормаль-ном содержании фактора VIII. Поэтому в насто-ящее время проводятся активные попытки стан-дартизации как коагуляционных, так и хромоген-ных методов определения фактора VIII. До вве-дения стандартизации рекомендуется метод с хро-могенными субстратами использовать толь-ко как ориентировочный и предпочтительно дляоценки концентратов фактора VIII, а не с диаг-ностическими целями.

Определение фактора VII с использованием хромогенного субстрата

Фактор VII является слабой амидазой и неспособен гидролизовать синтетические субстра-ты в плазме. Поэтому определение фактора VIIпроводится с помощью сопряженных реакций(рис. 106).

Фактор VII в пробе активируется тканевымфактором, фосфолипидами и ионами Са2+. Обра-зующийся комплекс ф.VII-ТФ-ФЛ-Са2+ активи-рует фактор X, активную форму которого опре-деляют тест-системой, аналогичной Pefachrome®.В то же время следует учитывать, что метод со-

пряженных реакций в случае определения факто-ра VII характеризуется существенным усилениемсигнала, так как фактор VIIa приводит к актива-ции не одного, а нескольких десятков молекулфактора X.

Соотношение коагуляционного и хромогенногометодов. Коагуляционный метод не всегдапозволяет достаточно точно оценить активностьфактора VII в плазме. Это связано с тем, что тка-невыми тромбопластинами активируется толькочасть фактора VII. Кроме того, разные тромбо-

Рис. 106. Принцип определения содержания фактора VII с использованием хромогенного субстрата. ТФ - тканевойфактор


пластины обладают разным активирующим эф-фектом, хотя полной активации фактора VII впробе не удается достичь ни одним из тромбоп-ластинов. Еще одной причиной ошибок можетбыть способность ф.VII к нестимулированной ихолодовой активации.

По-видимому, при оценке активности факто-ра VII с использованием хромогенных субстра-тов выявляется большее количество этого факто-ра, чем при использовании клоттинговых тестов.Клоттинговые тесты практически не выявляют

повышения фактора VII, а технология с хромо-генными субстратами способна определить егоповышенное содержание в плазме. Исходя изтого, что повышение фактора VII в плазме уве-личивает риск тромбоэмболической болезни, алечение стероидами, беременность, сахарный ди-абет, состояние после инфаркта миокарда и ги-пертриглицеридемия сопровождаются повыше-нием активности фактора VII, методы с хромо-генными субстратами необходимо внедрять, что-бы оценивать риск тромбозов.

Определение протромбина (фактора II) с использованием хромогенного субстрата. - ■ - - ■ - - - - - - - - . . . . . .

Протромбин достаточно надежно определя-ется коагуляционным методом. Однако опреде-ление протромбина с использованием хромоген-ного субстрата относительно хорошо стандарти-зовано. Кроме того, измерительный диапазонсущественно расширяется при скрининге пациен-тов с протромбиновой мутацией G20210A, прикоторой увеличен риск тромбоэмболии . Про-тромбин активируется металлопротеазой экари-ном (фермент яда эфы многочешуйчатой) до ме-зотромбина - производное, которое не блокиру-ется гепарином и комплексом антитромбин-гепа-рин, но способно гидролизовать хромогенныйсубстрат (рис. 107) и свертывать не только обык-новенный фибриноген, но и некоторые тромбин-резистентные его производные (РКМФ).

PIVKA-протромбин активируется экарином,поэтому этот хромогенный тест может дать ложно-

завышенные результаты по активности протромби-на у пациентов, принимающих непрямые антикоа-гулянты или страдающих дефицитом витамина К.Примечание. PIVKA - Proteins Induced by VitaminК Absence or Antagonists - протеины, синте-зируемые печенью при отсутствии витамина К илив присутствии его антагонистов (непрямых анти-коагулянтов). PIVKA не способны участвовать впроцессе свертывания крови (см. раздел «Лечениеантикоагулянтами непрямого действия».

Рис. 107. Принцип определения протромбина с исполь-зованием хромогенного субстрата

Определение фактора XIII

Исследование фактора XIII следует проводитьв тех случаях, когда у больного имеются проявле-ния кровоточивости, но при этом ПВ, АЧТВ и тес-ты на первичный гемостаз нормальные. Среди ори-ентировочных и скрининговых тестов на недоста-точность ф.ХIII может указать только тромбоэлас-тограмма, на другие тесты дефицит ф.ХIII практи-чески не влияет. В то же время дефицит ф.ХIII име-ет выраженные клинические проявления и можетбыть причиной кровотечений неясной этиологии учеловека на фоне полного здоровья, геморрагичес-кого синдрома при ДВС, гиперфибринолизе, после

удаления миндалин, при патологии печени и кост-но-мозгового кроветворения. Дефицит ф.ХIII мо-жет быть врожденным и приобретенным, в том чис-ле в результате появления аутоантител. Определе-ние дефицита ф.ХIII и его причины необходимо дляназначения адекватного лечения, в частности ис-пользования концентратов фактора XIII. Для оп-ределения врожденного дефицита ф.ХIII использу-ются иммунохимические методы, в том числеELISA, применяется ПЦР-диагностика для геноти-пирования врожденных мутаций. Однако ф.ХIII -это высокополиморфный белок, определение его


структурных компонентов часто бывает недоста-точным, поэтому требуются функциональные тес-ты с определением активности ф.ХIII.

Фотометрический метод

Фактор XIII - фермент трансглютаминаза,которая образует поперечные сшивки между пеп-тидами. При этом изопептидные связи образуют-ся между остатками глютамина и лизина, в реак-ции освобождается аммиак. Последний опреде-ляется в ферментной реакции с глютаматдегид-рогеназой (ГлДГ) и α-кетоглютаратом, кофакто-ром реакции является НАДН, окисляющийся доНАД (рис. 108). Измерение проводится фотомет-рически при длине 340 нм, метод может выпол-няться на биохимических анализаторах.

Инкорпорирующий метод

Разработан новый метод определения фак-тора XIII, основанный на введении субстрата в

иммобилизированный белок, которое обеспечи-вается фактором ХIIIа. Раньше иммобилизо-вался казеин. В новом методе используетсяфизиологический субстрат-фибрин. Фактор ХIIIаинкорпорирует субстрат 5-(биотинамидо)-пен-тиламин (БАПА) в фибрин, который определя-ется количественно с конъюгатом стрептави-дин-щелочная фосфатаза (рис. 109). Инкорпо-рирующий метод позволяет оценивать физиоло-гическую роль мутации Val34Leu фактора XIII,которая сочетается с риском внутричерепныхкровоизлияний и кровотечений из внутреннихорганов. В то же время больные с этой мутаци-ей фактора XIII практически не страдают ин-фарктом миокарда и венозными тромбозами.Мутацию Val34Leu фактора XIII не выявляетфотометрический метод. Инкорпорирующийметод может с успехом использоваться для мо-ниторирования больных с очень низким уров-нем ф.ХIII, что бывает при наследственных де-фицитах.

Рис. 108. Принцип определения фактора XIII фотометрическим методом

Рис. 109. Принцип определения фактора XIII инкорпорирующим методом. БАПА - 5-(биотинамидо)-пентиламин, ЩФ-щелочная фосфатаза


Тесты для определения гепарина

Антикоагулянты прямого действия широкоиспользуются для профилактики и лечения тром-боэмболической болезни. Традиционный тестАЧТВ полезен для контроля за лечением гепари-ном, когда гепарин применяется в относительнонизких концентрациях (описан выше). При вы-соких дозах гепарина, например при операцияхна открытом сердце или при диализе, АЧТВ непозволяет следить за эффектами гепарина. Анти-коагулянтное действие низкомолекулярного гепа-рина АЧТВ не улавливает.

Определение гепаринас помощью хромогенных субстратов

Синтетические субстраты применяются дляопределения гепарина, особенно при использова-нии низкомолекулярного гепарина (НМГ). Гепа-рин определяется опосредованно: используется егоспособность усиливать комплексообразованиеф.Ха или тромбина с антитромбином и тем самымподавлять активность этих протеаз, после чего оп-ределяется их остаточная активность (рис. 110).Тест с определением остаточной активности ф.Ха(«анти-Ха-активность») применяется при контро-ле за лечением короткоцепочечным фракциони-рованным гепарином, который обладает большейтропностью к ф.Ха, чем к тромбину. Кроме того,ф.Ха - относительно стабильный фермент, поэто-му тест с использованием этого фактора техни-чески более надежный, чем тест с активным тром-бином.

Тест может выполняться в разных модифи-кациях: как кинетический метод, определениепо начальной скорости или метод по конечнойточке. В некоторых тестах используется насы-щающая концентрация AT, тогда тест обозна-чается как «общий гепарин», в других - исполь-

зуется эндогенный AT пробы, в этих случаяхтест обозначается как набор для определениякомплекса гепарин-АТ, или «активный гепа-рин». Определение гепарина с использованиемхромогенных субстратов легко адаптируетсядля автоматических биохимических анализато-ров. На результаты теста с хромогенными суб-стратами не оказывают влияния продукты дег-радации фибрина (ПДФ) и повышенное содер-жание ф.VIII, которые меняют результаты приопределении АЧТВ.

Для тестов на определение гепарина разра-ботаны и промышленно выпускаются калибра-торы - лиофильно высушенные препараты плаз-мы со стандартным содержанием гепарина. Ка-либраторы должны быть тестированы по стан-дарту ВОЗ, которому придано значение актив-ности 1,0 анти-Ха-Ед/мл. Терапевтический диа-пазон для лечения гепарином рекомендуется впределах 0,3-0,7 анти-Ха-Ед/мл.

Определение гепаринас помощью коагуляционных методов

Принцип определения гепарина с использо-ванием коагуляционных тестов подобен таково-му в тестах с хромогенными субстратами. Опре-деление основано на ингибировании свободногоф.Ха на первом этапе. После инкубационногопериода выпадение сгустка вызывается добавле-нием реактивов, содержащих фосфолипиды с ад-сорбированными на них фактором V, протром-бином, фибриногеном из бычьей плазмы и СаС12(рис. 111). Автоматизация этого метода затруд-нена, так как сигнал достаточно слабый для оп-тического метода. Тест может выполняться нацельной крови на коагулометрах с механическойсистемой регистрации.

Рис. 110. Принцип определения содержания гепарина с использованием хромогенного субстрата, AT - антитромбин


Рис. 111. Принцип определения содержания гепарина коагуляционным методом

Преаналитические факторы, влияющиена результаты определения гепарина

Качество подготовки пробы - существенныйфактор, влияющий на результаты определениягепарина. Нарушение взятия крови из локтевойвены может сопровождаться активацией тромбо-цитов in vitro, что приведет к ложным результа-там с недооценкой содержания гепарина в кровибольных. При активации тромбоцитов освобож-дается фактор 4 тромбоцитов (PF4). PF4 высту-пает как естественный антигепарин, нейтрализу-

ющий как нефракционированный, так и низко-молекулярный фракционированный гепарин(НМГ), хотя следует отметить, что НМГ менеечувствителен к подавляющему действию PF4.

Для предупреждения этого эффекта и подав-ления активации тромбоцитов при транспорти-ровке крови рекомендуется использовать специ-альные пробирки для крови, например CTADtubes, в которых содержится цитрат, теофиллин,аденозин, декстроза - «коктейль», который пре-дупреждает активацию тромбоцитов.

Методы для определения резистентности к активированному протеину С,

активности протеина S, антитромбина, антифосфолипидных антител

Резистентность к протеину С

Термин «резистентность к протеину С» вве-ден при описании феномена практического отсут-ствия удлинения АЧТВ после добавления акти-вированного протеина С (рис. 112). Устойчивость(резистентность) ф.Vа к ингибирующему воздей-ствию активированным протеином С (РАПС) -один из серьезных факторов риска патологичес-

Рис. 112. Резистентность к активированному протеинуС (АПС) при мутации в гене, контролирующем синтезфактора V, которая приводит к образованию фактораЛейден. Тест основан на определении АЧТВ

ких тромбозов. РАПС - нарушение функциони-рования системы протеина С.

Факторы, которые влияют на РАПС, представ-лены в табл. 26. РАПС может быть как врожден-ной, так и приобретенной. В случае наследованияРАПС гетерозиготы имеют риск развития тромбо-зов примерно в 7 раз, а гомозиготы - в 80 раз выше,чем в среднем по популяции. РАПС была обнару-жена среди 20% больных с первичным тромбозомглубоких вен бедра и среди 40% больных тромбо-филией. По разным данным от 20 до 60% больныхс тромбозом глубоких вен бедра имеют РАПС.

Таблица 26Факторы, влияющие на резистентность к АПС


Скрининговые тесты на АПС разработаны наоснове модифицированного теста АЧТВ, кото-рый проводится с и без АПС, или на основе ПВсо змеиным ядом.

Тест резистентности фактора Va к АПСна основе модифицированного АЧТВ

Добавление АПС в норме вызывает удлине-ние АЧТВ за счет инактивации факторов Va иVilla в плазме. Поэтому в тесте сравнивается вре-мя выпадения сгустка в тесте АЧТВ с добавлени-ем и без добавления АПС и рассчитывается от-ношение (рис. 114). Референтные значения тестазависят от используемых реактивов и приборов.Тем не менее, несмотря на разные методы и при-борную базу, обычно добавление АПС к плазмеприводит, по крайней мере, к 2-кратному удли-нению АЧТВ (табл. 27).

Недостаточное удлинение АЧТВ (патологи-ческий результат, свидетельствующий о РАПС)наблюдается у пациентов с фактором V Лейден,волчаночным антикоагулянтом, при беременно-сти, увеличенном содержании фактора VIII и при-

еме оральных контрацептивов. Этот тест имеетспецифичность для выявления фактора V Лейденпримерно 80%, неполная специфичность связана свлиянием на результат других факторов, в част-ности с подавлением активности фактора VIIIa. Нарезультаты теста оказывают влияние прием не-прямых антикоагулянтов и введение гепарина.Тест полезен для выявления пациентов с высокимриском тромбоэмболической болезни.

Тест для диагностики фактора V Лейден

Мутация гена фактора V (фактор Лейден)оценивается как наиболее распространенная при-чина РАПС. Эту патологию можно выявить припроведении теста на РАПС с плазмой пациента,разбавленной 1:5 плазмой с дефицитом ф.V. Этоттест обладает высокой специфичностью и чув-ствительностью на выявление фактора V Лейден(табл. 28).

Тест на РАПС проводится также с использова-нием змеиного яда, обозначаемого как протак (Рго-tac), специфически активирующего протеин С.При внесении активатора протеина С в смесь нор-

Примеры резистентности к активированному протеину СТаблица 27

Таблица 28Примеры определения резистентности к активированному протеину С методом без разведения и

методом разведения испытуемой плазмы плазмой с дефицитом ф. V


мальной и дефицитной по ф.V плазмы время свер-тывания в тесте АЧТВ удлиняется примерно в2 раза. Если имеется РАПС, удлинение АЧТВ вы-ражено в малой степени.

Определение протеина С

Для определения протеина С разработанонесколько методов: иммунохимический метод,метод с хромогенным субстратом и коагуляцион-ный вариант. Для функциональных методов ис-пользуется специфический активатор протеина Сиз яда змеи щитомордника, обозначаемый какпротак.

Определение протеина С с использованием хро-могенного субстрата

Определение основано на активации протеи-на С активатором протак с последующим опре-делением (кинетическим методом или методомконечной точки) изменения оптической плотнос-ти пробы из-за образования паранитроанилина(рис. 113). Этот метод прост, специфичен, легкоавтоматизируется. Так как протеин С - витамин-К-зависимый гликопротеин, то при лечении не-прямыми антикоагулянтами (антагонистами ви-тамина К) появляются PIVKA-формы протеина С,которые не обладают антикоагулянтной актив-ностью, но определяются методами с хромоген-ными субстратами. Поэтому у больных, прини-мающих непрямые антикоагулянты, могут бытьзавышенными результаты определения протеина Схромогенными методами.

разцах исследуемой плазмы активируется про-таком. Для контроля тест проводится с и безпротака (рис. 114). Активированный протеин Свызывает протеолиз и соответственно инактива-цию факторов Va и VIIIa в плазме (рис. 115).Последнее сопровождается удлинением временисвертывания в тесте АЧТВ, по которому оцени-вается активность протеина С в плазме пациен-та. Если фактор Va нечувствителен к активномупротеину С, то АЧТВ не удлиняется в присут-ствии активатора протеина С. Рассчитываютотношение АЧТВ с протаком/АЧТВ без прота-ка, величина которого определяется в конкрет-ной лаборатории, так как тест зависит от исполь-зованных приборов и реактивов. Тем не менееэтот коэффициент близок к 1 практически у всехбольных с фактором Лейден и с дефицитом про-теина С и существенно выше 1 в случаях без де-фицита активности протеина С и при дисфунк-ции протеина S. Метод легко автоматизируется.

Коагуляционный метод оценивает актив-ность протеина С, фиксирующегося карбоксили-рованной частью на фосфолипидах. PIVKA-фор-мы не функционируют в этой системе, и тест недает ложных результатов у пациентов, принима-ющих непрямые антикоагулянты или имеющихдефицит витамина К.

Исказить результаты теста могут такие фак-торы, как наличие мутации ф.V Лейден, присут-ствие в плазме волчаночного антикоагулянта,

Определение протеина С коагуляционным ме-тодом

Пробы пациентов сопоставляются с дефи-цитной по протеину С плазмой, которую полу-чают методом иммуносорбции. Протеин С в об-

Рис. 114. Принцип скрининга на резистентность к акти-вированному протеину С (РАПС). Активатор протеина Сиз змеиного яда (протак), добавленный к пробе, в нормесущественно удлиняет АЧТВ, Если же имеет место РАПС, тоудлинения АЧТВ в присутствии протака не происходит


Рис. 113. Принцип определения протеина С с использо-ванием хромогенного субстрата, АПС - активированныйпротеин С

Рис. 115.Принцип определения протеина С коагуляционным методом. АПС - активированный протеин С, ФЛфосфолипиды

терапия гепарином. Для получения достоверныхрезультатов очень важно качество используемойпротеин-С-дефицитной плазмы.

У некоторых пациентов, принимающих не-прямые антикоагулянты, выявляются чрезвычайнонизкие цифры содержания протеина С. Этирезультаты могут быть связаны не только с ис-тинным дефицитом протеина С, но и с развитиемрезистентности фактора Va к АПС.

Определение протеина С иммунохимическимметодом

Иммунохимическое определение протеина Сприменяется реже, чем функциональные методы.Это объясняется тем, что данный способ выявляеттолько классическое снижение концентрациипротеина С и не определяет его функциональнуюнеполноценность. Методическим обеспечениемэтого определения чаще всего служат автомати-зированный турбидиметрический метод илиELISA-тест.

Оценка результатовВ норме активность протеина С у взрослых

составляет 70-140%.Небольшое повышение протеина С отмеча-

ется во время беременности, а уменьшение - в пос-леродовом и послеоперационном периодах.

Снижение содержания (активности) протеинаС наблюдается при:• врожденном (наследственном) дефиците или

аномалиях протеина С;• геморрагической болезни новорожденных;• заболеваниях печени с нарушением функции;• синдроме острой дыхательной недостаточно

сти;• менингококковом сепсисе;• ДВС-синдроме;• гемодиализе;

• лечении L-аспарагиназой;• лечении пероральными (непрямыми) антико

агулянтами (дефицит витамина К).Отдельные результаты могут колебаться в

зависимости от используемых методов и тест-на-боров, тем более что многие из них разработаны дотого, как стала известна мутация гена фактора VЛейден. В общем случае разведение пробы можетминимизировать влияние фактора V Лейден вкоагуляционных тестах.

В некоторых случаях при лечении больных сдефицитом протеина С непрямыми антикоагулян-тами у них могут возникнуть некрозы кожи в ре-зультате рикошетных тромбозов. Если антикоагу-лянты назначаются в высокой дозе без поддержкигепарином, то возникает состояние, при которомпротеин С очень быстро снижается (время его по-лужизни в системе циркуляции 4-6 ч). В то же времявитамин-К-зависимые факторы свертывания, втом числе протромбин, остаются еще в пределахнормы (у них период полужизни 16-20 ч) (рис. 116).

Рис. 116. Быстрое снижение протеина С, превышающееуменьшение витамин-К-зависимых факторов свертывания,может быть причиной возникновения тромботического со-стояния (рикошетные тромбозы) при начале лечения высо-кими дозами непрямых антикоагулянтов


Эта ситуация может усугубляться тем, что непря-мые антикоагулянты начинают назначать в слу-чае развития тромбозов или угрожающей ситуа-ции по тромбообразованию (при воспалении, ин-фекциях, лихорадке), когда система прокоагулян-тов активирована. Быстрое снижение протеина Спровоцирует в этом случае массивное тромбооб-разование, проявляющееся вплоть до некрозовкожи. Непосредственно в период лечения непря-мыми антикоагулянтами (кумаринами) определе-ние протеина С затруднено. Определять его сле-дует до начала лечения кумаринами.

Определение протеина S

Протеин S - витамин-К-зависимый белок,который является кофактором АПС. Эта функ-ция положена в основу всех известных коммер-ческих тест-систем определения протеина S. Опи-саны случаи как функционального, так и количе-ственного дефицита протеина S. При проведениитестов важно помнить, что протеин S присутству-ет в плазме частично в свободном состоянии, ча-стично в комплексе с С4-связывающим протеи-ном (С4-СП), но активна только свободная фор-ма протеина S.

Определение протеина S коагуляционным ме-тодом

Для определения протеина S необходимоиспользовать тест-систему, содержащую очищен-ный активный протеин С, его субстрат - фактор Vaи дефицитную по протеину S плазму. После ин-кубации исследуемой плазмы с тест-системойопределяют время свертывания, выполняя тестАЧТВ или индуцируя активацию змеиным ядом,фосфолипидами и Са2+ (рис. 117). Удлинение вре-мени свертывания пропорционально активностипротеина S. Специфичность метода относитель-ная, так как фактор V Лейден, высокий уровень

ф.VIII и волчаночный антикоагулянт могут су-щественно влиять на результаты теста, а именно:с этими факторами часто проводят дифференци-альную диагностику, определяя протеин S. Нарезультаты влияют качество дефицитной плазмыи препаратов АПС, а также состав фосфолипи-дов, поэтому значения теста зависят от конкрет-ного производителя. Так как коагуляционныйметод подвержен действию многих интерфериру-ющих факторов и не стандартизован, то предпо-читают использовать иммунохимический методдля определения протеина S.

Определение протеина S иммунохимическимметодом

Иммунохимический метод достаточно широ-ко распространен. Первая генерация тест-набо-ров определяла «общий протеин S», включая сво-бодную форму и форму протеина S, связанную сбелком С4-СП. Наборы последних генерацийпозволяют определять «свободный протеин S»прямо без предварительной обработки. Чаще все-го используют турбидиметрический метод с по-листироловыми частицами или метод ELISA.Недостатком иммунохимического метода являет-ся то, что он выявляет протеолитически неактив-ные формы протеина S, которые иногда появля-ются в плазме.

Оценка результатовУменьшение содержания (активности) проте-

ина S наблюдается при:• врожденном (наследственном) дефиците;• врожденном (наследственном) уменьшении

свободной фракции протеина S;• заболеваниях печени с нарушением синтети

ческой функции;• нефротическом синдроме;• ДВС-синдроме;

Рис. 117. Принцип определения протеина S коагуляционным методом


• системной красной волчанке;• лечении L-аспарагиназой;• лечении пероральными (непрямыми) антико

агулянтами;• приеме эстрогенов (пероральных контрацеп

тивов);• беременности, в послеродовом периоде;• наличии аутоантител к протеину S.Относительный дефицит протеина S наблюдается при повышении С4-СП. С4-СП - белокострой фазы, его количество повышается вплазме крови при воспалении, аутоиммунныхреакциях, беременности, у женщин, принимающих стероидные контрацептивы. С4-СП определяют методом иммунотурбидиметрии илиELISA.

Определение антитромбина

В клинико-диагностических лабораторияхAT определяют иммунохимическими методами(ELISA, турбидиметрия, нефелометрия), тестамис хромогенными субстратами или коагуляцион-ными методами.

Методом с хромогенным субстратом AT оп-ределяется через фактор Ха или Па при насы-щающей концентрации гепарина. Принцип оп-ределения AT представлен на рис. 118. При вы-боре предпочтение отдают методу с использо-ванием ф.Ха, так как он более стабилен и под-вержен меньшим влияниям со стороны интер-ферирующих воздействий, чем тромбин (фак-тор На).

Нормальный уровень активности AT в плаз-ме взрослых колеблется в диапазоне 75-125%,этот диапазон практически одинаков при исполь-зовании разных тест-наборов. Дефицит AT - се-рьезный фактор риска развития венозных тром-бозов.

У новорожденных уровень AT составляетоколо 50% и достигает уровня взрослых к 6 мес.

Небольшое снижение AT наблюдается в середи-не менструального цикла, в пред- и послеродо-вом периоде, при токсикозах второй половиныбеременности, в послеоперационном периоде.Эти сдвиги более выражены у пациентов с груп-пой крови А (II), а также у пожилых.

Снижение содержания (активности) А Т от-мечается при:• врожденном (наследственном) дефиците или

аномалии AT (снижение активности или чувствительности к гепарину);

• заболеваниях печени (опухоли, цирроз, алкогольный гепатит);

• нефротическом синдроме (протеинурия свыше 5 г/л);

• карциноме легких;• ДВС-синдроме;• множественных травмах, тяжелых родах, по

здних гестозах;• приеме эстрогенов (пероральных контрацеп

тивов), кортикостероидов;• лечении L-аспарагиназой;• многие протеазы, включая гранулоцитарную

эластазу, могут вызывать деградацию AT.Тест может применяться для мониторинга

лечения гепарином. Длительная гепаринотера-пия может приводить к снижению активностиAT в плазме. Лечение высокими дозами гепари-на, особенно нефракционированным гепарином,приводит к транзиторному снижению AT по ме-ханизму потребления (рис. 119), особенно у боль-ных с тяжелой патологией, в критических слу-чаях, при ДВС-синдроме, сепсисе, злокачествен-ных опухолях.

Увеличение содержания (активности) А Т от-мечается во время менструации, а также при:• остром вирусном гепатите;• холестазе;• приеме анаболических стероидов;• лечении пероральными (непрямыми) антико

агулянтами.

Рис. 118. Принцип определения антитромбина (AT) хромогенным методом


Рис. 119. Снижение уровня AT в плазме в период активно-го лечения нефракционированным гепарином

Лабораторная диагностикаантифосфолипидного синдрома иволчаночного антикоагулянта (см. также«Тромбозы. Волчаночныи антикоагулянт»)

При антифосфолипидном синдроме в кровициркулируют антитела против фосфолипидов илифосфолипид-связанных белков. При этом синдро-ме возникает лабораторный феномен, при кото-ром происходит удлинение времени свертываниякрови в тестах, выполняемых на фосфолипидах(АЧТВ, ПВ). Этот феномен впервые был описан упациентов с системной красной волчанкой и по-этому получил название волчаночного антикоагу-лянта. Клинически, однако, при антифосфолипид-ном синдроме и волчаночном антикоагулянте нетгеморрагических проявлений, но есть выраженнаятенденция к патологически усиленному тромбооб-разованию. Нельзя ставить знак равенства между

волчаночным антикоагулянтом и антифосфоли-пидным синдромом. В некоторых случаях при ко-агулологических признаках волчаночного антико-агулянта не находят иммунологических признаковантифосфолипидного синдрома, в свою очередьантифосфолипидный синдром не всегда сопровож-дается коагулологическими признаками волчаноч-ного антикоагулянта.

Антифосфолипидный синдром, сопровождаю-щийся волчаночным антикоагулянтом, выявляюткомбинацией фосфолипид-зависимых коагуляци-онных и иммунохимических методов, причем на-дежная диагностика обеспечивается только комп-лексным использованием группы тестов. Как пра-вило, волчаночныи антикоагулянт распознается поудлинению фосфолипид-зависимых коагуляцион-ных тестов. Волчаночныи антикоагулянт являет-ся неспецифическим ингибитором. При подозре-нии на волчаночныи антикоагулянт необходимоначинать лабораторные анализы со екрининговыхтестов и теста смешивания. В табл. 29 представле-ны данные екрининговых тестов при врожденномдефиците факторов VIII и IX, при наличии специ-фического ингибитора и волчаночном антикоагу-лянте. Важно помнить, что не все реактивы дляпроведения АЧТВ одинаково чувствительны кволчаночному антикоагулянту. Для анализа АЧТВпри подозрении на волчаночныи антикоагулянтнеобходимо применять реактивы, содержащие ка-олин, но не эллаговую кислоту.

Выявление волчаночных антикоагулянтовпроводят последовательно: сначала в екринин-говых методах, а затем в подтверждающих. Нарис. 120 представлен алгоритм выявления вол-

Таблица 29Изменения екрининговых тестов при врожденном дефиците факторов VIII и IX,

наличии специфического ингибитора и волчаночном антикоагулянте


Рис. 120. Алгоритм выявления волчаночных антикоагулянтов

чаночного антикоагулянта (Баркаган З.С., Мо-мот А.П., 1999).

Еще одним подтверждающим тестом для опре-деления волчаночного антикоагулянта является тестразведения. В серии последовательных разведенийанализируемой плазмы буфером активность фак-торов свертывания крови, определяемая коагуля-ционным методом, относительно возрастает приналичии волчаночного антикоагулянта (табл. 30).

Таблица 30Эффект разведения на активность факторов

свертывания в присутствии волчаночногоантикоагулянта

Для подтверждения диагноза волчаночного ан-тикоагулянта необходимо провести подтверждаю-

щие тесты, например тест нейтрализации на тром-боцитах. Проводится определение АЧТВ и активно-сти факторов внутреннего пути плазмы больного дои после инкубации с тромбоцитами здорового до-нора или эритрофосфатидом. При наличии волча-ночного антикоагулянта АЧТВ сокращается, а ак-тивность факторов возрастает за счет связываниячасти антифосфолипидных антител на тромбоцитахздорового человека. В группу подтверждающих вне-сены также индексы, основанные на сравнении ре-зультатов фосфолипид-зависимьгх и фосфолипид-не-зависимых тестов (лебетокс/эхитоксовый индекс).

Для уточнения диагноза антифосфолипидно-го синдрома необходимо провести определениекардиолипиновых антител с использованием ме-тода ELISA. В табл. 31 представлен перечень ан-тифосфолипидных антител, которые выявляют-ся ИФА и коагуляционным методом.

Определение антифосфолипидныхантител (АФА)

АФА, выявляемые твердофазным ИФА, пред-ставляют собой различные комбинации иммуно-


Таблица 31Спектр антифосфолипидных антител, присутствующих в сыворотке больных А ФС

глобулинов, принадлежащих к классам IgG иIgM, реже IgA. Определяют аутоантитела противкардиолипина, фосфатидилсерина, β2-гликопро-теина I. Специфичность диагностики по антите-лам различна: антитела против β2-гликопротеи-наI демонстрируют большую специфичность, чемантитела к кардиолипину или другим фосфоли-пидам. Лабораторный диагноз антифосфолипид-ного синдрома можно ставить только в том слу-чае, если содержание диагностических аутоанти-тел в сыворотке крови, выявленных иммунофер-ментным методом, подтверждает патологию по-вторно с интервалом, по крайней мере, в 6 недель.

Результаты определения АФА могут считатьсяположительными лишь при их повышении в 2 иболее раза по сравнению с верхней границей нор-мы. Кроме того, необходимо иметь в виду, чтоАФА присутствуют всегда в сыворотке здоровыхлюдей, но они заблокированы гистонами и ихтитр достаточно низкий.

Определению АФА может мешать ревмато-идный фактор, поэтому, если на фоне клиничес-ких признаков заболевания иммунохимическиетесты на АФА дают отрицательный результат, тонеобходимо провести коагулянтные тесты на на-личие волчаночного антикоагулянта.

Тесты АЛЯ исслелования фибринолитической системы

■

.■ .. ■ ■

Основным функциональным ферментом фиб-ринолиза является плазмин. При лизисе фибрино-вого сгустка плазминоген и его активаторы фик-сируются на фибрине, где идет активное расщеп-ление субстрата, тогда как в плазме фибринолизслабо выражен, плазмин блокирован а2-антиплаз-мином.

Спонтанный эуглобулиновый лизис

Спонтанный эуглобулиновый лизис - тради-ционный метод оценки фибринолиза. В кислойсреде при низкой температуре происходит осаж-дение эуглобулиновой фракции белков плазмы,содержащей фибриноген, факторы свертывания,плазминоген и его активаторы (рис. 121). Ингиби-торы фибринолиза выпадают в осадок в незначи-тельном количестве (около 2%). После растворе-ния эуглобулиновой фракции и образования фиб-

ринового сгустка определяют время его лизиса, чтоотражает фибринолитическую активность плазмы.Укорочение времени лизиса эуглобулинов (ак-тивация фибринолиза) отмечается при:• уменьшении концентрации фибриногена -

гипо- и дисфибриногенемия;• увеличении содержания плазминогена и его ак

тиваторов - панкреатит, панкреонекроз, мета-

Рис. 121. Компоненты фибринолитической системы, ко-торые определяют результаты метода «спонтанный эугло-булиновый лизис»


стазирующии рак предстательной железы, легкого,яичников, метастазы меланомы, операции налегких, предстательной, поджелудочной железе,гиперкатехоламинемия (стресс, тиреотоксикоз,гипертонический криз, введение адреналина),шок, патология беременности, терминальные идругие состояния, сопровождающиеся развитиемДВС-синдрома, цирроз, рак, метастатическоепоражение печени (снижение ан-типлазминовой иантиактиваторной функции). Увеличение временилизиса эуглобулинов (угнетение фибринолиза)отмечается при:• гиперфибриногенемии;• врожденной а-, гипо- или дисплазминогенемии;• дефиците плазминогена и его активаторов - ре

цидивирующие венозные тромбозы, системныеваскулиты, сепсис, нефротический синдром, ги-покоагуляционная стадия ДВС-синдрома, цирроз печени (нарушение синтеза плазминогена).Тест может применяться при фибринолитичес-

кой терапии для контроля эффективности лечения.Метод требует учета исходного содержания вплазме фибриногена, так как при снижении фиб-риногена время лизиса укорачивается, что трак-туется ошибочно как гиперфибринолиз. При ги-перфибриногенемии время лизиса удлиняется.Поэтому при отклонениях содержания фибрино-гена в плазме, а также неполноценной полимери-зации фибрина и гепаринемии возможно получе-ние ошибочных результатов. В связи с ориентиро-вочным характером и недостаточной специфично-стью в последнее время вместо теста спонтанноголизиса эуглобулинового сгустка начали использо-вать определение отдельных факторов фибрино-лиза, в первую очередь плазминогена.

Определение плазминогена

Дефицит плазминогена - один из потенциаль-ных факторов риска тромбоза, хотя клиническиэто подтверждается не всегда.

При добавлении стрептокиназы (бактериаль-ный препарат, который используется как тромбо-литик) к разведенному образцу исследуемой плаз-мы образуется плазминоген-стрептокиназный ком-плекс, который обладает ферментативной актив-ностью и способен расщеплять хромогенный суб-страт (рис. 122). Ферментативная активность ком-плекса плазминоген-стрептокиназа не подавляет-ся α2-макроглобулином и α2-антиплазмином. Тес-ты, в которых сначала переводили плазминоген вплазмин, а затем пытались определить активностьплазмина, не получились надежными, так как сво-бодный плазмин мгновенно инактивируется α2-ан-типлазмином, присутствующим в пробе.

Определение α2-антиплазмина

α2 -антиплазмин - самый быстрый «реактив-ный» ингибитор плазмина, он не позволяет при-сутствовать плазмину в крови в свободном виде.α2 -антиплазмин, помимо плазмина, ингибируетактиваторы плазминогена - урокиназу (u-РА) и тка-невой активатор (t-PA). Дефицит α2-антиплазминавстречается относительно редко, но если возникает,то это сопровождается тяжелым геморрагическимсиндромом, проявляющимся диапедезными крово-течениями. Основной причиной кровотечений яв-ляется присутствие свободного плазмина, которыйразрушает все тромбы и деградирует фибриноген.

Определение α2-антиплазмина вместе с опре-делением ингибитора тканевого активатора плаз-миногена типа 1 (PAI-1), XIII фактора можно рас-сматривать как тесты 2-го уровня, которые необ-ходимо выполнять, если скрининговые тесты (ПВ,АЧТВ, ТВ и определение функции тромбоцитов)нормальны, а больной страдает кровотечениями.

Уменьшение содержания (активности) α2-ан-типлазмина наблюдается при:• врожденном (наследственном) дефиците;• заболеваниях печени (нарушается синтез α2-ан-

типлазмина);

Рис. 122. Принцип определения плазминогена хромогенным методом. СК - стрептокиназа


• ДВС-синдроме;• лейкозах;• нефротическом синдроме;• интенсивной тромболитической терапии, ко

торая может вызвать потребление α2-анти-плазмина.После экстракорпорального кровообраще-

ния с использованием АИК может наблюдатьсяистощение α2-антиплазмина, что приводит к ги-перфибринолизу, сочетающемуся с истощениемфибриногена, деградацией плазмином плазмен-ных белков (в том числе факторов гемостаза),разрушением тромбоцитов и кровотечениями.

Принцип определения α2-антиплазмина подо-бен технологиям определения других ингибито-ров (рис. 123). Так как происходит быстрая инак-тивация плазмина α2-антиплазмином, то стадияингибирования и стадия измерения стартуютпрактически одновременно (что позволяет повы-сить специфичность метода при сниженной актив-ности ингибитора в плазме).

Опрелеление ингибитора активатораплазминогена типа 1 (PAI-1)

PAI-1 в качестве основного ингибитора уро-киназы (u-РА) и тканевого активатора (t-PA) иг-рает важную роль в контроле за активностьюфибринолиза. Определение PAI-1 часто включа-

ется как один из тестов профиля (панели) оценкитромбофилии. У больных с кровотечениями не-ясного генеза с нормальными скрининговымитестами дефицит PAI-1 может быть причиной па-тологии. Истинный дефицит выявляется относи-тельно редко, но сопровождается тяжелыми кро-вотечениями.

Повышение PAI-1 встречается достаточно ча-сто, так как PAI-1 - белок острой фазы. Это име-ет клиническое значение, так как является при-чиной рецидивирующего венозного тромбоза иотмечается часто у мужчин в преклонном возрас-те. PAI-1 повышается при:

инфекционных и воспалительных процессах;послеоперационном периоде;злокачественных опухолях;ожирении;гипертриглицеридемии;лечении дексаметазоном.У больных с инфарктом миокарда персисти-

рующий подъем PAI-1 рассматривается как не-благоприятный прогностический признак.

Определение PAI-1 состоит из несколькихэтапов. На первом этапе необходимо инактиви-ровать ингибиторы плазмина - α2-антиплазмин иα2-макроглобулин. Затем используется общийпринцип определения остаточной активности до-бавленного в избытке фактора, который долженподавляться исследуемым ингибитором (рис. 124).

Рис. 123. Принцип определения α2-антиплазмина хромогенным методом. ПАП - комплекс плазмин-антиплазмин

Рис. 124. Принцип определения ингибитора тканевого активатора плазминогена типа 1 (РАМ) хромогеннымметодом. u-PA - урокиназа, t-PA - тканевой активатор


При использовании u-РА метод в техничес-ком исполнении несколько проще, чем при ис-пользовании избытка t-PA, и может быть авто-матизирован на современных анализаторах.

Содержание PAI-1 в системе циркуляции под-вержено суточным ритмам, поэтому пробы присистемном анализе необходимо брать в одно вре-мя, лучше по утрам. Кроме того, PAI-1 - один изсамых неустойчивых белков плазмы, поэтомуопределение необходимо проводить сразу послевзятия крови, транспортировка может привестик потере активности PAI-1 в пробе.

Завышенные результаты теста можно полу-чить при увеличении активности PAI-2. Этот ин-гибитор повышается при беременности, поэтомув данном случае исследование PAI-1 описаннымвыше методом может дать ложные результаты.В последнее время активно используется опреде-ление PAI-1 методом ELISA или комбинацией им-мунохимических и функциональных методов.

Определение тканевого активатораплазминогена (t-PA)

Тканевой активатор плазминогена (t-PA) ос-вобождается в кровоток из эндотелиальных кле-ток сосудистой стенки, где он синтезируется. По-этому диагностика дефицита t-PA основываетсяне только на определении концентрации t-PA вкрови, но и на способности освобождаться из со-судистой стенки при стрессовых воздействиях, в

частности при манжеточной пробе (дозирован-ном пережатии вен). Сначала определяют базо-вый уровень t-PA, потом на 10-15 минут на пред-плечье накладывают жгут или раздувают манжет-ку, вызывающую венозный стаз, затем берут вто-рую порцию крови, в которой повторно опреде-ляют t-PA. Сравнивают результаты обеих проб.Из-за быстрой инактивации тканевого актива-тора плазминогена PAI-1 и другими ингибитора-ми пробы крови необходимо немедленно закислить,чтобы предупредить инактивацию t-PA in vitro.В настоящее время выпускаются специальныепробирки с кислым антикоагулянтом. t-PA име-ет суточный ритм, поэтому его необходимо оп-ределять так же, как PAI-1.

t-PA обладает высокой амидазной активнос-тью, позволяющей эффективно использовать дляего определения метод хромогенных субстратов.Однако при низких концентрациях t-PA в плазметребуется проведение дополнительных процедурнепрямого определения активности фермента че-рез плазминоген и использование растворимогофибрина (рис. 125).

Определение t-PA проводится у больных стромбофилией как часть панели тестов на выявле-ние причины тромбофилии, особенно при нагру-зочных манжеточных пробах. Повышение t-PAпосле инфаркта миокарда рассматривается какнеблагоприятный фактор. Нарушение освобожде-ния t-PA после венозного стаза описано у боль-ных с тромбозами и патологией почек.

Рис. 125. Принцип определения тканевого активатора плазминогена (t-PA) хромогенным методом


Тесты активации свертывания кровиОпределение D-димеров

D-димеры - это специфические продукты дег-радации фибрина, входившего в состав тромба.Они образуются в процессе лизиса сгустка кровипод влиянием плазмина и некоторых неспецифи-ческих фибринолитиков (рис. 60). КонцентрацияD-димеров в сыворотке пропорциональна актив-ности фибринолиза и количеству лизируемогофибрина. Этот тест позволяет судить об интен-сивности процессов образования и разрушенияфибриновых сгустков.

Определение D-димеров проводится иммуно-ферментным методом с использованием монокло-нальных антител, иммунодиффузии, методом тур-бидиметрии, латекс-агглютинации (табл. 32). Вовсех методах исследования используются моно-клональные антитела к эпитопам на D-димере,которые образуются при расщеплении нераство-римого фибрина плазмином. Этих эпитопов нетна фибриногене и растворимых фибрин-мономе-рах, поэтому D-димеры - показатель того, что впроцессе фибринолиза расщепляется именно фиб-рин, а не фибриноген или фибрин-мономеры. По-скольку эти антитела не взаимодействуют с фиб-риногеном, исследования могут проводиться какв плазме, так и в сыворотке.

Принцип теста, основанный на методе ELISAна твердой фазе (стриппированные планшеты), снанесенными на поверхность пластика первичны-ми антителами, показан на рис. 126. Так как D-ди-меры - не стандартизованный аналит, то разныеметоды могут показывать разные результаты,

несмотря на то, что используются специфическиеантитела и калибраторы.

На определение D-димеров практически неоказывает влияние техника взятия крови, примесьтромбоцитов, не требуется использования инги-биторов для подавления других факторов.

Повышение уровня D-димеров в крови оп-ределяется при возникновении венозных тром-бозов, атеротромбозе, тромбоэмболии легочнойартерии, ДВС-синдроме, после операций, осо-бенно при большом операционном поле и дру-гих состояниях с повышенным образованием

Рис. 126. Принцип метода ELISA для определения D-ди-меров. Специфические антитела нанесены на твердуюфазу (пластик). С ними взаимодействует субъединица D изпробы и остается иммобилизованной на твердой фазе, До-бавляются проявляющие антитела, конъюгированные с фер-ментом, которые могут взаимодействовать только с D-ди-мерами. Несвязавшиеся антитела отмываются, добавляет-ся субстрат для фермента, по изменению окраски раство-ра определяется количество D-димеров, D-мономеры, фор-мирующиеся при деградации фибриногена и входящие всостав ПДФ, не определяются тестом на D-димеры

Характеристики методов определения D-димеровТаблица 32


фибрина. D-димеры достаточно долго циркули-руют в крови, время их полувыведения состав-ляет более 24 ч, повышение D-димеров можетперсистировать в течение нескольких недельпосле острого тромбоза.

Уровень D-димеров повышен у больных стромбозом глубоких вен бедра, с тромбоэмболи-ей легочной артерии, он может повышаться пос-ле обширных хирургических вмешательств,травм, при онкологических заболеваниях. На зна-чение D-димеров влияют такие факторы, как ве-личина тромба, время от начала клиническихпроявлений до назначения антикоагулянтной те-рапии, прием антикоагулянтов, на фоне которыхуровень D-димеров постоянно снижается. Поэто-му более важной для исключения диагноза тром-боза является отрицательная диагностическаязначимость теста. Причем для разных тестов от-рицательная диагностическая значимость колеб-лется от 78 до 100%, она выше у более чувстви-тельных методов, что характерно для ИФА-ди-агностики. D-димеры определяются в моче, но ихпоявление интерпретируется как маркер почечнойдисфункции.

Продукты деградациифибрина/фибриногена (ПДФ)

Продукты деградации фибрина/фибриногенаопределяются традиционно в общей группе с ис-пользованием поликлональных антител. Приэтом антитела могут взаимодействовать с эпито-пами фибриногена, поэтому требуется не толькоиспользование сыворотки, но и полное удалениефибриногена с добавлением к крови тромбинаили змеиного яда с тромбиноподобным эффек-том. В последнее время для метода ELISA сталииспользовать моноклональные антитела к нео-эпитопам, которые образуются при деградациифибрина или фибриногена под влиянием плазми-на. Тем не менее трудно отдифференцироватьПДФ, образующиеся при деградации фибрина изтромба, от ПДФ, сформировавшихся при дегра-дации фибриногена, особенно при использованииактиваторов фибринолиза. Для определенияПДФ широко распространен метод латекс-агглю-тинации. Этот метод легко автоматизируется натурбидиметрах, но характеризуется относитель-но низкой специфичностью.

Положительная проба - содержание ПДФ вплазме/сыворотке свыше 0,5 мкг/мл - указывает на:• ДВС-синдром;• тромбоз глубоких вен;• тромбоэмболию легочной артерии;• метастазы в легкие, рак яичников;• фибринолитическую терапию.

Тромбин-антитромбиновый комплекс (ТАТ)

Определение ТАТ - новый тест в диагностикеДВС-синдрома, он активно внедряется в практи-ку клинико-диагностических лабораторий. Кли-ренс ТАТ из системы циркуляции достаточно бы-стрый, он удаляется в течение нескольких минут.Поэтому присутствие ТАТ в плазме свидетельству-ет об образовании тромбина in vivo непосредствен-но в момент взятия крови на исследование и о воз-можности истощения антикоагулянтов.

В методе ELISA на твердую фазу нанесеныантитела к тромбину. После отмывки проявляю-щие антитела связываются с антитромбином, при-сутствующем в ТАТ, оценка количества ТАТ про-водится цветной реакцией. Определение ТАТочень информативно в острой ситуации, непос-редственно при тромбообразовании. В этом пла-не определение ТАТ по диагностическому значе-нию схоже с определением фибринопептида А(ФПА), однако для ТАТ менее критичными яв-ляются требования к процедуре взятия крови.Иногда тест с некоторыми модификациями ис-пользуется для определения антитромбина (AT).

Фрагменты протромбина F1 +2

F1+2 - также новый тест, он отражает актив-ность превращения протромбина в тромбин с уча-стием протромбиназного комплекса (фактор Ха,фактор Va, фосфолипиды и Са2+), который фор-мируется при активации системы плазменно-го гемостаза (рис. 127).

Определение F1+2, так же как ТАТ, проводитсяс целью диагностики состояния гиперкоагуляции,которое может быть значимым при остром и хрони-ческом ДВС, тромбозе глубоких вен бедра, эмболиилегочной артерии, злокачественных опухолях и ост-рых миелоидных лейкозах (протекающих с актива-цией системы свертывания), наличии факторов рис-ка тромбоэмболии, остром инфаркте миокарда и


синдрома. F1+2, в отличие от ТАТ, имеют относи-тельно продолжительный период циркуляции в сис-

теме кровотока. Состояние гиперкоагуляции можнозарегистрировать с помощью как ТАТ, так и F1+2,тогда как состояние гипокоагуляции можно выявитьтолько по уменьшению F1+2. Поэтому определениеF1+2 проводится иногда с целью мониторингаантикоагулянтов непрямого действия, эффективностипрофилактического подкожного или внутривенноговведения гепарина.

Определение F1+2 можно использовать длярешения вопроса о назначении/неназначении те-рапевтических вмешательств у пациентов с дефи-цитом антикоагулянтов и при беременности в случаериска возникновения тромбозов (табл. 33).

Фибринопептид А (ФПА, FPA)

ФПА отщепляется от молекулы фибриногенатромбином (рис. 44), поэтому при тромбинемии

количество ФПА в плазме увеличивается. Опреде-ление ФПА достаточно давно используется какмаркер активации гемостаза. В современных наборахиспользуется метод ELISA с моноклональны-миантителами. ФПА - очень чувствительный тест напотребление фибриногена, его концентрацияповышается при различных заболеваниях с тром-

Таблица 33Примеры решения вопроса о назначении антикоагулянтной терапии у 3 пациентов с

дефицитом антитромбина (референтные значения AT > 80%, F1 +2 < 1,4 нмолъ/л)

Полужирным шрифтом выделены показатели, выходящие за границы принятого в лаборатории референтно-го диапазона.

Рис. 127. Образование фрагмента протромбина F1+2.Протромбин расщепляется протромбиназным комплексомв 2 участках в 2 этапа с образованием разных промежу-точных продуктов, но обязательным формированием тром-бина и фрагмента F1 + 2. Между количеством фрагментовF1 + 2 и количеством образующегося тромбина существу-ет стехиометрическое соотношение

последующей тромболитической терапии. Исследо-вание F1+2 полезно использовать при мониторингелекарственной коррекции состояния гиперкоагуля-ции, в частности при лечении гепарином и концент-ратами антитромбина. Определение ТАТ и F1+2 ха-рактеризуется высокой аналитической чувствитель-ностью, поэтому их увеличение можно зарегистри-ровать до появления клинических признаков ДВС-


боэмболией. Результаты теста очень сильно зави-сят от процедуры взятия крови, даже небольшиеотступления от прописанной схемы могут вызватьзначительные сдвиги в уровне ФПА в пробе.

Растворимые фибрин-мономерныекомплексы (РФМК)

При ряде форм патологии, характеризующихсяактивацией свертывания крови (ДВС, тромбозы,тромбофилии), происходит расширение пула фибри-ногена. В норме в крови из пула фибриногена присут-ствует практически только сам фибриноген в коли-честве 1,8-3,5 г/л. Все остальные продукты (рис. 128)находятся в минимальном количестве, которое прак-тически не определяется лабораторными тестами.

При ДВС-синдроме за счет свободного тром-бина происходит постоянный процесс трансформа-ции фибриногена в фибрин с появлением в кровифибринопептидов А и В, накоплением мономеровфибрина. Активация фибринолиза сопровождает-ся повышенным образованием ПДФ. ПДФ взаимо-действуют с фибрин-мономерами, увеличивая ко-личество растворимых фибрин-мономерных комп-лексов (РФМК). РФМК - это фибрин-мономеры иолигомеры, а также их комплексы с ПДФ (рис. 129).

Паракоагуляционные тесты

Для выявления растворимых фибрин-моно-мерных комплексов (РФМК) в КДЛ традицион-но использовали так называемые паракоагуляци-

онные («гельобразующие») тесты - этаноловый ипротаминсульфатный. Однако из-за качественнойоценки результатов они малоинформативны. Раз-личные модификации протаминсульфатного те-ста с количественным и полуколичественнымпредставлением результата малоточны и плоховоспроизводимы. Протаминсульфат связываетсяс гепарином, поэтому у больных, получавших ге-парин, протаминсульфатный тест дает отрица-тельный результат. В настоящее время эти тестыможно считать устаревшими.

В последнее время стал активно использо-ваться паракоагуляционный ортофенантролино-вый тест . С помощью ортофенантролиновоготеста возможно не только качественное, но и ко-личественное определение РФМК. Гепаринотера-пия с содержанием гепарина в плазме крови доконцентрации 10 ед/мл не влияет на результатытеста. Ортофенантролиновый тест более чувстви-телен, чем другие паракоагуляционные тесты .Однако при остро протекающих (катастрофичес-ких) формах ДВС с глубокой гипофибриногене-мией показатели паракоагуляционных тестовмогут снижаться. Краткая характеристика и ди-агностическое значение представленных выше идополнительных тестов активации системы гемо-стаза даны в табл. 34.

В табл. 35 суммированы наиболее вероятныеизменения лабораторных тестов при некоторыхпатологических состояниях.

Рис. 128. Пул метаболитов фибриногена в норме. Изобозначенных продуктов в крови присутствует только самфибриноген, Все остальные метаболиты находятся в исче-зающе малых количествах

Рис. 129. Пул метаболитов фибриногена при ДВС-син-дроме. Количество фибриногена снижается, появляютсяпродукты деградации фибрина (ПДФ), фибринопептиды(ФПА и ФПВ), растворимые фибрин-мономерные комплек-сы (РФМК), РЭС - ретикулоэндотелиальная система


Таблица 34Маркеры активации гемостаза

Изменение некоторых показателей активации гемостаза при патологииТаблица 35


Обеспечение качества лабораторной оценки системы гемостаза

Контроль качества в коагулологии являетсяцентральным элементом обеспечения эффектив-ности диагностических исследований. Помимонепосредственного контроля за самой аналити-ческой процедурой, необходимо стандартизо-вать и контролировать взятие и подготовку об-разцов на преаналитическом этапе. Оценка по-лученных данных должна проводиться с учетомсостояния пациента, используемых им лекар-ственных препаратов, особенностей подготовкиобразца на преаналитическом этапе, методикивыполнения анализа, используемых инструмен-тов и реактивов. О высокой степени качества и

диагностической эффективности лабораторныхисследований можно говорить лишь тогда, ког-да под контролем находится весь процесс от на-значения исследования и взятия биологическо-го материала до получения достоверного резуль-тата. Решающим фактором правильности вы-полнения исследования является проведение все-объемлющего внутрилабораторного контролякачества всех выполняемых тестов. Оптималь-ная система контроля предполагает оценку ка-чества лабораторных исследований на внутри-лабораторном, федеральном и международномуровнях.

Стандартные образцы (калибраторы)

Калибраторы требуются для многих тестов.Часто для практических целей используется све-жая сливная плазма от нескольких (не менее 5, же-лательно более 20) здоровых доноров (пулирован-ная плазма, или пул-плазма). Основой примененияпул-плазмы является представление о том, что присмешивании плазмы значительного количестваздоровых доноров (в импортных пулах смешива-ется плазма десятков и сотен тысяч здоровых до-норов) активность практически всех факторов ге-мостаза становится средней для данной популяциии принимается за 100%, или 1 Ед/мл.

Тем не менее возможны колебания активнос-ти различных факторов в пул-плазмах, собран-ных в разных регионах. Это связано с нескольки-ми факторами:• имеются генетически детерминированные

особенности активности различных факторовв данной популяции людей;

• при использовании пула плазмы, набраннойот ограниченного количества доноров (20 именее), однонаправленные изменения активности фактора у нескольких из них могут влиять на результирующую активность факторав пуле.Эти факторы обуславливают необходимость

федерального и международного контроля актив-ности различных факторов в пуле. Приготовле-ние пулированной плазмы для коагулологической

диагностики требует соблюдения некоторых ус-ловий:• необходимо собрать плазму от достаточного

количества доноров в течение ограниченного времени;

• пул-плазму необходимо тщательно перемешать до однородной массы;

• рационально хранить ее небольшими порциями;

• температура хранения должна быть не выше-40 °С.Все это часто делает невозможным приготов-

ление пул-плазмы в клинико-диагностическойлаборатории. Однако у приготовленной на мес-те плазмы есть одно преимущество: активностьфакторов в ней соответствует средней для попу-ляции, проживающей в данном регионе.

Альтернативой пул-плазме являются коммер-ческие контрольные плазмы, которые готовятсяна биологической матрице (лучшие из плазмы че-ловека) путем добавления определенных коли-честв факторов от тестированных доноров, иликоммерческие пулированные плазмы, при изго-товлении которых смешивается плазма десяткови даже сотен тысяч доноров. Такие плазмы, какправило, проходят строгий международный кон-троль. В продаже имеются не только нормальныеконтрольные плазмы, но и плазмы, дефицитныепо отдельным факторам.


Обычно на основе калибраторов делается се-рия разведений и строится калибровочная кри-вая. Как правило, для построения калибровочнойкривой бывает достаточно 4 разведений. При не-линейной калибровке используют 6 разведенийкалибратора.

В соответствии с клиническими и аналитичес-кими потребностями предлагаются калибровоч-ные растворы для следующих основных коагуло-логических тестов:• калибровочная плазма для установления ак

тивности протромбина, факторов протром-бинового комплекса и всех факторов свертывания, определяемых коагуляционными методами;

• калибровочная плазма для колориметрических методов определения AT, протеина С;

• калибровочная плазма для определения фибриногена хронометрическим или оптическим методом на основе протромбиновоговремени;

• калибровочная плазма для определения концентрации нефракционированного и низкомолекулярного гепарина.Референтная плазма - централизованно при-

готовленная нормальная плазма, критерии и про-

цедура приготовления которой определены встандарте DIN58939-1.

Стандарты ВОЗ

Для некоторых аналитов, определяемых вклинико-диагностических лабораториях, Всемир-ная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомен-дует международные стандарты. На основе этихстандартов изготовлены стандартные образцы(первичные стандарты), которые предлагаютсяпроизводителям коммерческих наборов, а те всвою очередь производят вторичные стандарты,тестированные по первичным стандартам. Вто-ричные стандарты фасуются вместе с выпускае-мыми коммерческими наборами реактивов. Сре-ди стандартов ВОЗ для системы гемостаза широ-ко известен стандарт тромбопластина, использу-емый в тесте протромбиновое время (ПВ). Фир-мами-изготовителями стандартизация по «индек-су чувствительности» (ISI, или МИЧ) проводитсяпо одному из международных эталонов (RBT/90,ВСТ/253 и др.). Этот индекс чувствительности,если он определен, указывается на упаковке реа-гента и в инструкции к выпускаемому тромбо-пластину.

Внутрилабораторный контроль качества

К тестам на исследование гемостаза предъяв-ляются такие же требования по контролю каче-ства, как и к другим лабораторным исследовани-ям. Все тесты в лаборатории должны быть обес-печены внутрилабораторным контролем каче-ства, лаборатории должны участвовать в про-граммах межлабораторного контроля качества.

При проведении внутрилабораторного кон-троля контрольные пробы необходимо включатьв каждую серию измерений. По крайней мере,исследования на контрольной плазме необходи-мо проводить ежедневно, обязательно при поста-новке новой серии с новым реактивом, после про-филактики прибора, при введении нового мето-да или его модификации. Для каждого контро-лируемого показателя строятся контрольные кар-ты с использованием, по крайней мере, 2 конт-рольных проб - с показателями в нормальном ипатологическом диапазоне. Фирма «Bio-Rad»

(наиболее известный производитель контрольныхматериалов в мире) для проведения контроля ка-чества выпускает контрольные материалы дляисследования коагуляции 3 уровней под общимнаименованием «Lyphochek Coagulation». Еслипроводится лекарственный мониторинг, то жела-тельно использовать контрольные материалы споказателями в терапевтическом диапазоне. Прииспользовании автоматических коагулометровчасто реактивная база закрыта, в этом случае не-обходимо использовать контрольные материалыдля данной технологии, предоставляемые постав-щиками такой продукции.

В случае отсутствия контрольных материаловс установленными показателями для коагулологи-ческих тестов следует применять аликвотированныесливные плазмы для контроля воспроизводимости.

Требования к аналитическому качеству, при-нятые в настоящее время в России, изложены в


двух документах: приказе МЗ РФ № 45 и отрас-левом стандарте ОС 91500.13.0001-2003.

Согласно этим документам требуемое анали-тическое качество аналитов определяется следу-ющими характеристиками:1. «Предельно допустимые значения смещения (В)

и коэффициента общей аналитической вариации (CV), рассчитанные по 20 измерениям определяемого аналита в контрольном материале». В табл. 36 приведены объединенные данные нормативных документов, установленныепутем экспертной оценки на основе сведений обиологической вариации и данных об аналитической вариации в лабораториях России.

2. «Биологически обоснованные нормы аналитической точности клинических лабораторных исследований». Данные взяты из международной базы данных и получены, исходя изследующих предположений.Целевое значение коэффициента общей ана-литической вариации не должно превышатьполовины коэффициента внутрииндивиду-альной вариации, или:

фициент внутрииндивидуальной биологичес-кой вариации, %.Требования к целевому значению смещенияформулируются в виде неравенства:

где В - целевое значение смещения среднейарифметической от установленного значе-ния, %; CVl - коэффициент внутрииндивиду-альной биологической вариации, %; CVG -коэффициент межиндивидуальной биологи-ческой вариации, %.

Таблица 36Биологически обоснованные нормы

аналитической точности клиническихлабораторных исследований

Внелабораторный контроль качества

Межлабораторный контроль качества пока-зателей гемостаза организован в рамках Феде-ральной системы внешней оценки качества лабо-раторных исследований (ФСВОК). Ниже приве-дены соответствующие программы, в которыхдолжна участвовать каждая КДЛ, занимающая-ся исследованием гемостаза.

Раздел ФСВОК «Коагулология»: оценка каче-ства исследований показателей плазмы крови внормальном и патологическом диапазонах - про-тромбиновое время (индекс и международноенормализованное отношение); АЧТВ (индекс);фибриноген и тромбиновое время (индекс).

Контрольные образцы: лиофилизированнаяплазма человека.

Число циклов за год: 3 или 6 по выбору лабо-ратории.

«Коагулология-1,5»: для лабораторий, кото-рым для двукратного измерения всех исследуемыхиз числа вышеперечисленных показателей доста-точно 1,5 мл плазмы.

«Коагулология-3»: для лабораторий, которымдля двукратного измерения всех исследуемых изчисла вышеперечисленных показателей достаточ-но 3,0 мл плазмы.

«Коагулология-4,5»: для лабораторий, кото-рым для двукратного измерения всех исследуемыхиз числа вышеперечисленных показателей доста-точно 4,5 мл плазмы.

где CV - целевое значение коэффициента об-щей аналитической вариации, %; CV: - коэф-

Патология гемостаза

ПАТОЛОГИЯ ГЕМОСТАЗА

В норме в организме гемостатический баланссохраняется при широком диапазоне активностиразличных компонентов. Однако в случае возник-новения значительного дисбаланса компонентовсистемы гемостаза развиваются нарушения, харак-теризующиеся повышенной кровоточивостью,либо повышенной склонностью к тромбообразо-ванию, либо одновременно обоими этими явлени-ями. К сожалению, в рамках настоящего изданиянет возможности представить все аспекты наруше-ний гемостаза; здесь будут охарактеризованы толь-ко наиболее распространенные клинически значи-мые формы патологии свертывания крови.

Теоретически геморрагические проявлениямогут возникать при дефиците прокоагулянтов илиизбытке антикоагулянтов, а тромботические -наоборот. Однако в действительности, как пра-вило, возникают более сложные ситуации. Напри-мер, патологическое снижение активности фиб-ринолиза или значительное повышение активно-сти факторов свертывания крови на практике не-часто приводят к развитию тромбозов, а сниже-ние активности фактора XII или высокая актив-

ность антитромбина III могут не иметь клиничес-ких проявлений в виде кровоточивости.

В общем виде петехии, пурпура, кровотече-ния из слизистых и носовые кровотечения харак-терны для нарушений сосудистой стенки и тром-боцитов (патология сосудисто-тромбоцитарногогемостаза). Обширные кровотечения в мышцы,полости, суставы характерны для нарушенийплазменного гемостаза, включая патологию фиб-ринолиза и антикоагулянтов.

Помимо изменения активности различныхкомпонентов гемостаза, у пациентов с тромботи-ческими проявлениями возможны так называемые«протективные» нарушения, т. е. нарушения суб-страта, защищающие его от воздействия ингиби-тора или системы элиминации. При этом актив-ность этого фактора (субстрата) может оставать-ся в пределах нормы, но неконтролируемое егоучастие в свертывании приводит к неограничен-ному тромбообразованию.

В табл. 37 описаны генетически детерминиро-ванные изменения активности некоторых факто-ров свертывания крови.

Таблица 37Генетически детерминированные изменения некоторых факторов свертывания




Задачи лабораторной службы при ведении пациентов с подозрением на

нарушения системы гемостаза

При ведении пациентов с подозрением нанарушения системы гемостаза, как ни в какомдругом разделе медицины, важны результаты ла-бораторных исследований. Многие геморраги-ческие заболевания имеют сходную клиническуюкартину, однако требуют разных терапевтичес-ких подходов. Только лабораторная диагностикапозволяет установить точный диагноз и назначитьсовременную адекватную терапию. Тромбо-тические проявления, как правило, возникаютпри сочетании разных протромботических фак-торов, как врожденных, так и приобретенных.Лабораторная диагностика позволяет выявитьэти факторы и провести не только лечение раз-вившегося тромбоза, но и фоновых изменений и

предупредить рецидивы тромбозов, контролируятерапию.

Без правильных современных лабораторныхисследований невозможно лечение и профилакти-ка нарушений гемостаза.

Основными задачами лаборатории при ведениипациентов с нарушениями гемостаза являются:1. Диагностика нарушений системы гемостаза:

• выявление нарушенного звена или звеньев;

• уточнение характера нарушения (дефицит синтеза, специфический или неспецифический ингибитор).

2. Контроль проводимой терапии.

Врожденные геморрагические заболевания

Наследственные геморрагические коагулопатии

Наследственные геморрагические коагулопа-тии, как правило, связаны с генетически детер-минированным дефицитом активности факторовсвертывания крови. В подавляющем большинствеслучаев имеется изолированный дефект одного изфакторов, однако возможны комбинированныедефекты. В редчайших случаях геморрагическиепроявления могут быть связаны со значительнымусилением активности антикоагулянтов, напри-мер плазминогена, что, как правило, являетсяследствием генетически детерминированного де-фицита ингибиторов.

Наследственная недостаточность факторовсвертывания встречается в популяции относи-тельно редко. Болезнь чаще всего имеет семейныйхарактер, проявляется в детстве, а больные кон-центрируются в гематологических центрах. Сре-ди наследственных геморрагических заболеванийнаиболее частой является болезнь Виллебранда,которая в некоторых популяциях встречается счастотой до 1%. Однако классически болезньВиллебранда не относят к коагулопатиям. Срединаследственных геморрагических коагулопатии

наиболее распространены гемофилия А и В, го-раздо реже встречается дефицит ф.VII (гипопро-конвертинемия). Дефицит других факторов свер-тывания встречается еще реже, а его распростра-ненность сильно зависит от особенностей попу-ляции. Например, дефицит ф.ХI широко распро-странен в популяции евреев-ашкенази, а в другихпопуляциях встречается лишь спорадически. Го-мозиготный дефицит ф.Х, приводящий к тяжелымгеморрагическим проявлениям, встречается чащев популяциях, где распространены родственныебраки.

Лечение заболеваний, связанных с наслед-ственным дефицитом факторов свертывания, восновном заключается в коррекции дефицитапрепаратами, содержащими отсутствующийфактор. Такие препараты производят из донор-ской плазмы или получают генноинженернымпутем (рекомбинантные препараты). Также длялечения может применяться свежезамороженнаяили лиофилизированная плазма или ее первич-ные производные - криопреципитат или супер-натант.


Гемофилия А

Гемофилия А - геморрагическая коагулопа-тия, связанная со снижением активности факто-ра VIII в крови. Выделяют наследственную фор-му гемофилии, связанную с мутациями гена фак-тора VIII и приобретенную гемофилию.

Наследственная гемофилия АГен фактора VIII расположен в Х-хромо-

соме, наследственная гемофилия А - заболева-ние, сцепленное с полом. Тяжелый врожден-ный дефицит ф.VIII встречается у лиц мужс-кого пола. Женщины являются носителямигена, но у них очень редко возникают геморра-гические проявления, связанные с дефицитомф.VIII (рис. 130). Девочки могут иметь клини-ческие проявления врожденной гемофилии внескольких случаях: если обе Х-хромосомы с де-фектным геном ф.VIII (отец болен гемофили-ей, а мать является носителем гена гемофилиии передала ей дефектную хромосому); если ак-тивна только одна Х-хромосома с дефектнымгеном ф.VIII (например, при синдроме Шере-шевского-Тернера) и др.

Гемофилия А - наиболее распространеннаягеморрагическая коагулопатия. Встречается, поразным данным, с частотой от 3 до 20 случаев на100 000 мужского населения. Примерно в поло-вине случаев диагностируется тяжелая форма за-

болевания. В настоящее время существует не-сколько классификаций гемофилии по тяжести.Все они основаны на определении активностиф.VIII в крови. В табл. 38 приведена классифика-ция гемофилии А, рекомендованная Всемирнойфедерацией гемофилии.

Помимо приведенной, предложены другиеклассификации, в которых тяжелая форма диаг-ностируется при уровне фактора до 2 или 3%.

Рис. 130. Генетическое древо наследственной гемофи-лии. Поскольку ген ф.VIII и ф.IХ находится в Х-хромосоме иотсутствует в Y-хромосоме, риск передачи его от материсоставляет 50%, а риск рождения мальчика - 25%

Клиническая классификация гемофилии АТаблица 38


При тяжелой форме гемофилии А актив-ность ф.VIII в крови практически не меняетсяв течение жизни. При среднетяжелой - возмож-ны колебания в незначительных пределах, апри легкой форме активность фактора может из-меняться, в том числе повышаться, особеннопри применении синтетических аналогов ва-зопрессина.

Генетика гемофилии А. Врожденная гемо-филия А обусловлена дефектами в Х-хромосо-ме, в которой ген, определяющий синтез фак-тора VIII, составляет фрагмент 0,1% массы хро-мосомы. Во фрагменте ДНК в 9 Kb кодируетсяпоследовательность из 2351 аминокислоты, раз-личные мутации этого фрагмента, включая де-леции, дубликации, замены, могут вызыватьгемофилию А. У женщины-носителя гена гемо-филии есть 25 шансов из 100 родить дочь-носи-теля гена гемофилии и 50 из 100 - родить здо-рового мальчика или девочку, не являющуюсяносителем гена гемофилии.

Семейный анамнез. По данным Всемирной фе-дерации гемофилии 2/3 больных гемофилией име-ют в семейном анамнезе данные за геморрагичес-кую коагулопатию, а у трети - нарушения выяв-ляются впервые. Анализ, проведенный в гемато-логическом центре Измайловской ДГКБ г. Мос-квы, показал другие результаты: среди семей, вкоторых есть дети, больные гемофилией, лишьоколо 1/3 до момента рождения больного ребен-ка знали о наличии геморрагических проявленийу членов семьи.

Анализ ДНК гена фактора VIII в настоящеевремя является важной частью обследования се-мьи больного гемофилией. В развитых странах впрограммы медицинского страхования больныхгемофилией введен генетический анализ больныхи их семей, что имеет большое практическое зна-чение. Во-первых, это позволяет проводить семей-ную консультацию с оценкой риска рождения де-тей с гемофилией у родственников больного. Во-вторых, генетический анализ позволяет провес-ти диагностику гемофилии у плода на ранних сро-ках беременности. В-третьих, выяснение характе-ра мутации позволяет предсказать риск развитияингибитора к вводимому с лечебными целямифактору VIII. К сожалению, в нашей стране донастоящего времени генетический анализ мало-доступен.

Клинические проявления гемофилии АДля гемофилии А характерны отсроченные

кровотечения и кровоизлияния, возникающиепосле травмы. Поскольку при гемофилии не стра-дает первичный тромбоцитарный гемостаз, притравмах сосудов небольшого калибра кровотече-ния останавливаются. Однако аномально дли-тельный процесс свертывания крови не позволя-ет создать своевременно плотный тромб, что при-водит к рецидиву кровотечения. В зависимостиот тяжести гемофилии без адекватного лечениявторичное кровотечение может остановиться че-рез некоторое время, но может длиться очень дол-го, приводя к тяжелой анемии. Очень характер-ным для гемофилии является кровоизлияние вэлементы опорно-двигательного аппарата. Гема-томы мышц и рецидивирующие кровоизлиянияв суставы приводят этих больных к нарастающе-му остеопорозу, мышечной дистрофии, артрозамкрупных суставов. Значительное поражение опор-но-двигательного аппарата у неправильно лечен-ных пациентов с тяжелой гемофилией А форми-руется к младшему школьному возрасту.

Наиболее значимыми осложнениями гемо-филии являются поражение опорно-двигатель-ного аппарата, хроническая постгеморрагичес-кая (железодефицитная) анемия. У пациентов,имевших в анамнезе внутричерепные кровоизли-яния, выявляется остаточная неврологическаясимптоматика.

Лечение гемофилииОсновным патогенетическим методом лече-

ния гемофилии А является введение препаратовфактора VIII. Поскольку ф.VII содержится вцельной крови и плазме, это были первые пре-параты, которые использовали для остановки ос-трых кровотечений. Однако в настоящее времяот их использования отказались из-за целогоряда серьезных недостатков. Во-первых, отно-сительно низкое содержание ф.VIII в единицеобъема не позволяет создать в крови больногоактивность, достаточную для достижения гемо-стаза в сложных случаях. Во-вторых, посколь-ку содержание ф.VIII в каждой конкретной дозенеизвестно, нельзя точно дозировать препарат.В-третьих, имеется высокий риск инфицирова-ния гемотрансмиссивными инфекциями (гепати-тами и ВИЧ). В-четвертых, имеется проблема


хранения. Цельная кровь и плазма могут хра-ниться только при температурах ниже -20 °С ог-раниченное время, что исключает их примене-ние вне больницы. В-пятых, при частом приме-нении возрастает число аллергических и анафи-лактических реакций.

Препаратом следующего поколения стал кри-опреципитат - осажденная при +4 °С часть плаз-мы, содержащая большое количество ф.VIII, фиб-риногена и ф.ХIII. По сравнению с кровью иплазмой криопреципитат содержит большее ко-личество ф.VIII на единицу объема, что позволяетостанавливать кровотечения даже при некоторыххирургических вмешательствах. Однако востальном криопреципитат обладает теми же не-достатками. В качестве гемостатического препа-рата при гемофилии А в развитых странах онпрактически не применяется.

Революционным шагом стала разработкавысокоочищенных препаратов ф.VIII. Это по-зволило создать препараты с высокой активно-стью ф.VIII в малом объеме, что решило про-блему достижения любой необходимой концен-трации ф.VIII в крови реципиента. К тому жеразработанные методы удаления вирусов позво-лили свести на нет риск заражения наиболее зна-чимыми инфекциями, передающимися черезкровь, - ВИЧ, гепатитами В и С. Современныепрепараты концентратов ф.VIII представляютсобой лиофилизированный порошок с точноопределенной активностью ф.VIII. Препаратможет храниться при комнатной температуре до6 месяцев, а при +2... +8 °С - до 2 лет, что позво-ляет легко использовать его в домашних усло-виях. Однако такие препараты стоят дорого.Создание концентратов ф.VIII сделало возмож-ным их профилактическое введение для предот-вращения кровоизлияний в суставы. В настоя-щее время разработано четвертое поколение ан-тигемофильных препаратов - концентраты ре-комбинантного ф.VIII. При их производстве во-обще не применяются компоненты крови чело-века, что теоретически полностью исключаетриск инфицирования гемотрансмиссивными ви-русами. К сожалению, стоимость этих препара-тов значительно выше, чем препаратов произ-водных человеческой плазмы.

Современные подходы к лечению гемофилии,с учетом стоимости гемостатических препаратов,

требуют регулярного контроля состояния гемос-таза с обязательным определением активности де-фицитного фактора.

Ингибиторная форма гемофилии АНаиболее значимым специфическим ослож-

нением терапии препаратами ф.VIII являетсяразвитие ингибиторной формы гемофилии. При-мерно у 5-20% пациентов с тяжелой формой ге-мофилии А, получавших препараты ф.VIII, вкрови появляются антитела к нему. При высо-ком титре антител весь вводимый препарат не-медленно связывается и выводится из кровото-ка. Это создает значительные трудности при ока-зании гемостатической помощи. С практическойточки зрения необходимо знать активность развив-шегося ингибитора. Активность измеряется мето-дом Бетезда (см. ниже) в Бетезда единицах (БЕ).При титре ингибитора до 5 БЕ возможно лече-ние высокими дозами концентрата ф.VIII. Прититре более 5 БЕ необходимы другие пути реше-ния проблемы.

В настоящее время для оказания гемостати-ческой помощи пациентам с ингибиторной фор-мой гемофилии применяются препараты, позво-ляющие запустить коагуляционный каскад «ни-же» факторов VIII и IX. Наиболее часто приме-няются препараты FEIBA и NovoSeven.

FEIBA - активированный концентрат факто-ров протромбинового комплекса. В его составвходят факторы IX, X, VIIa. Его внутривенноевведение активирует образование протромбиназ-ного комплекса.

NovoSeven - концентрат рекомбинантногоактивированного фактора VII. В основе механиз-ма гемостатического действия этого препараталежит значительная активация первого этапавнешнего каскада, происходящая при контактеТФ и ф.VIIа. Кроме того, этот препарат в тера-певтических концентрациях способен активиро-вать ф.IХ и ф.Х на мембране активированныхтромбоцитов без участия ТФ.

Коагулограмма при гемофилии АДиагностический алгоритм гемофилии пред-

ставлен в табл. 39:• На первом этапе выполняются скрининговые

тесты: время кровотечения, ПВ, АЧТВ, фиб-риноген, количество тромбоцитов.


Таблица 39Изменение коагулограммы при заболеваниях, сопровождающихся геморрагиями

• На втором этапе выполняются уточняющиетесты.

• После выявления удлинения АЧТВ и снижения активности ф.УШ проводится тест смешивания. Плазма пациента смешивается снормальной контрольной плазмой (100% активности факторов) в соотношении 1:1.АЧТВ и активность ф.УШ определяются немедленно и после инкубации в течение часапри 37 °С. Если активность ф.УШ в обоихтестах равна 50%, данных за ингибитор нет.Если активность достоверно ниже 50% тольков инкубированной пробе, имеются данные заналичие специфического ингибитора к ф.УШ.Если активность снижается в обеих пробах(при исследовании сразу после смешиванияи после часовой инкубации), можно заподозрить наличие волчаночного антикоагулянта.

• При наличии признаков специфического ингибитора на этапе первичной диагностикиили при контрольном обследовании показано проведение исследования титра ингибитора по методу Бетезда.

Контроль терапииПоскольку специфическая терапия гемофилии

предусматривает введение препаратов фактораVIII, важно знать, какой уровень фактически дос-тигается после их введения. Эта необходимостьвозникает при использовании препаратов с опре-

деленной активностью фактора, поскольку каж-дый пациент имеет индивидуальные особенностираспределения и метаболизма факторов свертыва-ния. Необходимость контроля может быть связа-на с недостаточной эффективностью препарата впериод оперативного лечения или после травмы,поскольку при активной кровопотере или большойраневой поверхности потребление факторов свер-тывания существенно усиливается. В ряде случаевдостаточно проводить однократное определениеактивности, но для большей точности дозирова-ния дорогостоящих препаратов более надежныйспособ - это проведение теста восстановления ак-тивности ф.VIII после введения известной дозыпрепарата. Тест описан ниже.

Исследование активности ингибитора пометоду БетездаЗа 1 единицу Бетезда (БЕ) принято такое ко-

личество антител, которое блокирует 50% актив-ности фактора в контрольной плазме. Метод ос-нован на тесте смешивания. Плазма пациента пос-ледовательно разводится до концентрации, кото-рая блокирует 50% или менее активности факто-ра в контрольной плазме, после чего, зная степеньразведения плазмы пациента, можно вычислитьактивность ингибитора. Для большей точностижелательно учитывать результаты 2-3 последо-вательных разведений и вычислять среднее ариф-метическое.


Пример. У пациента с подозрением на инги-биторную форму гемофилии активность ф.УШв результатах тестов смешивания следующая(табл. 40).

Вычисляем по данным табл. 40. Разведениеплазмы пациента 1/16 блокирует 20% активностиф.УШ в контрольной плазме (50 - 30). Вычисляем,что разведение, которое блокирует 50%, составит1/6,4. Разведение 1/8 блокирует 41% активностифактора VIII (50 - 9), разведение, которое блоки-рует 50%, будет равно 1/6,6. Так же для разведения1/32 разведение, блокирующее 50%, составит 1/5,1.Среднее арифметическое из полученных 3 резуль-татов будет примерно равно 1/6. Таким образом,50% активности ф.VIII блокируется плазмой па-циента в разведении 1:6, т. е. активность ингиби-тора в плазме больного составляет 6 БЕ.

Данный метод применим для исследованияактивности специфического ингибитора к любо-му фактору свертывания.

Исследование восстановленияфактора VIII в кровиИзвестно, что активность ф.VIII в крови пос-

ле введения концентратов в дозе 1 МЕ/кг веса по-

вышается в 1,5-2 раза, а период полувыведениясоставляет около 12 часов. Однако возможны зна-чительные индивидуальные колебания этих пока-зателей. Проведение теста восстановления актив-ности ф.VIII включает определение его активнос-ти в плазме, собранной непосредственно перед вве-дением известной дозы фактора, и через опреде-ленные интервалы. Имеются разные методики про-ведения теста. Если есть возможность, необходи-мо определить активность через 15 мин, 6, 12, 24 и48 часов после введения препарата. Доза вводимогопрепарата должна быть не менее 25 МЕ/кг, но же-лательно не более 50 МЕ/кг. На основании полу-ченных результатов можно построить график, покоторому в дальнейшем удобно вычислять ожи-даемую активность препарата. Тест восстановле-ния необходимо проводить неоднократно на про-тяжении жизни пациента, поскольку активностьметаболизма факторов и соотношение объемаплазмы и веса тела меняются по мере роста и взрос-ления ребенка. Важно помнить, что тест восста-новления необходимо проводить в период, когданет значимых геморрагических проявлений, что-бы на его результаты не оказывало влияние по-требление фактора из-за кровотечения.

Таблица 40Данные для определения активности ингибитора фактора VIII по методу Бетезда


Больной, возраст 2,5 года. Страдает гемофи-лией А тяжелой формы, ф.VIII:С 0,8%, получалгемостатическую терапию по требованию кон-центратом фактора VIII в дозе 250 ME на введе-ние. В возрасте 1 года после травмы слизистойполости рта началось кровотечение. После дву-кратного введения 500 ME концентрата фактораVIII с интервалом в 3 часа кровотечение не пре-кратилось. Проведено исследование коагулог-раммы. ПТ 120%, АЧТВ 120 с (норма 28-43 с),

ф.VIII <0,5%, ф.IХ 95%, ф.ХI 105%, ф.ХII 73%.АЧТВ после смешивания 1:1с нормальной плаз-мой (активность ф.VIII 100%) 89 с. Предположи-ли наличие специфического ингибитора к ф.VIII.Исследование ингибитора по методу Бетездапоказало, что его титр равен 2,5 БЕ. Проведено ле-чение концентратом фактора VIII в дозе 200 МЕ/кгежедневно в течение 4 дней. Кровотечение оста-новилось после первого введения. В дальнейшемначата профилактика концентратом ф.VIII в дозе2000 ME 1 раз в 2 дня. Исследование ингиби-


тора через 6 месяцев показало его следовую ак-тивность, пациент был переведен на профилак-тическое лечение концентратом ф.VIII в дозе

500 ME 1 раз в 2 дня. Исследование коагулог-раммы через год показало отсутствие ингиби-тора к ф.VIII у пациента.

Гемофилия В

Гемофилия В - геморрагическая коагулопа-тия, возникающая вследствие снижения актив-ности фактора IX. Частота встречаемости при-близительно 1 на 30 000 мальчиков. Заболева-ние сцеплено с полом, клинически сходно с ге-мофилией А. Классификация по тяжести ана-логична классификации гемофилии А, основа-на на определении активности фактора IX вкрови: тяжелая форма - ГХа <1%, среднетяже-лая - 1-5%, легкая форма - >5-30%. Встреча-ются врожденные и приобретенные формы.Причина меньшей частоты врожденных и при-обретенных форм этого заболевания, возможно,кроется в меньшем размере гена и молекулыф.IХ, чем гена и молекулы ф. VIII По этой жепричине, вероятно, частота развития ингибитор-ных форм гемофилии В также значительно мень-ше, чем при гемофилии А.

В настоящее время для лечения гемофилии Вприменяются свежезамороженная плазма, крио-супернатант (концентрат нативной плазмы), раз-личные препараты концентрированного факто-ра IX. Осложнения лечения гемофилии В сходныс осложнениями лечения гемофилии А.

В табл. 41 представлены изменения основныхкоагулологических тестов у больных гемофили-ей В. Следует помнить, что при легких формахгемофилии В может не быть удлинения АЧТВ.При тяжелой и умеренной степени дефицита ф.IХимеет место удлинение АЧТВ, однако результатво многом зависит от коммерческого набора ре-активов. При наличии клинических проявленийлегкой гемофилии необходимо исследовать ак-тивность ф.VIII и ф.IХ.

Исследования активности ингибитора и те-ста восстановления проводятся по схеме, ана-логичной схеме у больных гемофилией А. Од-нако при проведении теста восстановления не-обходимо учитывать более длительный периодполувыведения. Соответственно взятие матери-ала будет проводиться по схеме: до введения,через 15-30 минут после введения, через 12, 24,48 и 72 часа.

Дефицит фактора XI

Дефицит фактора XI (ранее заболевание оп-ределялось как гемофилия С) - геморрагичес-кое заболевание, возникающее из-за дефектагена фактора XI. Дефицит фактора XI переда-ется как аутосомно-рецессивный признак. Этозаболевание достаточно часто встречается впопуляции евреев-ашкенази, среди которых го-мозиготное носительство составляет от 0,1 до0,3%, а гетерозиготное - от 5,5 до 11%. В дру-гих группах людей описаны лишь спорадичес-кие случаи. Клинически дефицит ф.ХI значи-тельно отличается от гемофилии А и В, вслед-ствие этого термин «гемофилия С» исключен изклассификации. У больных с гомозиготнойформой заболевания активность ф.ХI в кровисоставляет от 0 до 15%, у гетерозиготных носи-телей - от 25 до 70%о.

При дефиците ф.ХI имеется умеренно выра-женный геморрагический синдром в виде боль-шого количества кожных геморрагических эле-ментов, носовых, маточных кровотечений, дли-тельных кровотечений после хирургических вме-шательств, кровотечений после удаления зуба илитонзиллэктомии. В каждом конкретном случаетрудно предсказать, как больной среагирует нахирургическое вмешательство. Тяжесть геморра-гического синдрома может не коррелировать сактивностью ф.ХI в крови. Клинические прояв-ления возникают при остаточной активностиф.ХI менее 30%, однако возможны минимальные

Таблица 41Изменения лабораторных показателей

при гемофилии В


проявления у гетерозиготных носителей с актив-ностью ф.ХI между 50 и 70%.

Лечение. Для лечения геморрагических прояв-лений при дефиците ф.ХI используется свежезамо-роженная плазма. Разработаны и концентрирован-ные очищенные препараты ф.ХI, которые приме-няются в некоторых странах.

Лабораторная диагностика дефицита ф.ХIоснована на проведении стандартных тестов ко-агулограммы и на определении активности ф.ХIв плазме (табл. 42).


при дефиците ф.Х1

Врожденный дефицит фактора VII(гипопроконвертинемия)

Геморрагическое заболевание, возникаю-щее вследствие дефицита активности ф.VII вплазме (гипопроконвертинемия), передаетсякак аутосомно-рецессивный признак. Литера-турных данных о распространенности этогозаболевания практически нет, что, вероятно,связано с отсутствием клинических проявленийу многих пациентов с уровнем активности ф.VIIвыше 5%. При тяжелой форме с активностьюф.VII ниже 3% геморрагический синдром похожна проявления у больных тяжелой формой ге-мофилии А, включая эпизоды гемартрозов.Первые проявления могут возникать сразу пос-ле рождения: кровотечения из пупочного кана-тика, пупочной ранки, кефалогематомы, внут-ричерепные гематомы. В дальнейшем характер-ны кожные геморрагические проявления в видемножественных гематом и экхимозов, носовые,маточные кровотечения, длительные кровоте-чения после травм и хирургических процедур.Реже встречаются гематомы мягких тканей.Тяжесть геморрагических проявлений коррели-

рует с активностью ф.VII. С целью коррекциигемостаза при дефиците ф.VII может вводить-ся свежезамороженная плазма, концентратыфакторов протромбинового комплекса. Имеет-ся очищенный концентрат ф.VII.

Лабораторная диагностика дефицита ф.VIIоснована на изменении стандартных тестов коа-гулограммы и на определении активности ф.VII(табл. 43).


при дефиците ф. VII

Дефицит фактора X (болезньСтюарта-Прауэра)

Болезнь Стюарта-Прауэра - редкое геморра-гическое заболевание, вызванное дефицитом ак-тивности ф.Х. Имеются немногочисленные лите-ратурные описания этого заболевания. БолезньСтюарта-Прауэра передается как аутосомно-ре-цессивный признак. Наследственный дефицитф.Х встречается в популяциях с частыми род-ственными браками. Клинические проявленияимеются в основном у гомозиготных носителей,у которых активность ф.Х составляет около 1%.Реже у гомозигот может быть активность до 25%.Тяжесть заболевания коррелирует с активностьюф.Х в крови. При тяжелой форме заболеванияпроявления сходны с таковыми при тяжелой ге-мофилии: гемартрозы, гематомы мягких тканей,кровотечения из ран слизистых, тяжелые после-операционные кровотечения. Очень характерныдля тяжелого врожденного дефицита ф.Х внут-ричерепные кровоизлияния сразу после рожденияи на первом году жизни, когда диагноз еще неиз-вестен. Часто эти эпизоды заканчиваются гибе-лью ребенка.

Геморрагические проявления при болезниСтюарта-Прауэра купируются применением све-

>•- -■ •• •■ •:..;: ,.., •'


жезамороженной плазмы или концентратов фак-торов протромбинового комплекса.

Лабораторная диагностика дефицита ф.Хоснована на изменении стандартных тестов ко-агулограммы и определении активности ф.Х(табл. 44).


при дефиците ф.Х


Мальчик 3 мес. Родители обратились с жалоба-ми на кожный геморрагический синдром в виде си-няков в области груди и спины, кровотечение из сса-дины слизистой рта в течение 3 суток. Кровотеченияиз мест инъекции после прививок не было. Проявле-ний кровоточивости в семейном анамнезе также неотмечалось. Родители состоят в родственном браке(троюродные брат и сестра). У ребенка есть старшаясестра, не страдающая кровоточивостью.

При осмотре: состояние средней тяжести засчет геморрагических проявлений. Изменений состороны внутренних органов не выявили.

Проведен коагулологический скрининг: времякровотечения нормальное, количество тромбоцитов399 х 107л. АЧТВ 101с (норма 28-43 с), ПВ значи-

тельно удлинено (не определяется), агрегация тром-боцитов с АДФ, коллагеном, адреналином и аггрис-тином нормальная. У ребенка была заподозрена по-здняя форма геморрагической болезни новорожден-ных, проведено лечение концентратом факторовпротромбинового комплекса и витамином К. Кро-вотечение было остановлено. Однако для уточне-ния диагноза была исследована активность факто-ров свертывания крови. Выявили: ф.VIII 120%, ф.IХ91%, ф.VII 71,8%, ф.II 102%, ф.V 113%, ф.Х <0,5%,фибриноген 4,3 г/л, фактор Виллебранда 85%.

Ребенку был установлен диагноз: врожден-ный дефицит ф.Х, в дальнейшем подтвержден-ный генетическим анализом. Профилактическоевведение концентрата протромбинового комп-лекса 1 раз в неделю в дальнейшем позволилоизбежать тяжелых геморрагических проявлений.

Дефицит фактора V (гипопроакцелеринемия,или парагемофилия)

Наследственный дефицит ф.V - редкое аутосом-но-рецессивное геморрагическое заболевание, длякоторого характерна умеренная или легкая крово-точивость по гематомному типу: послеоперацион-ные и посттравматические кровотечения, гематомымягких тканей, послеродовые кровотечения, менор-рагии, эпистаксис, редко бывают гемартрозы. У но-ворожденных возможны внутричерепные гематомы.

У гомозиготных носителей активность ф.V, какправило, находится в пределах до 10%. Корреляцияклинических проявлений и уровня активности ф.Vв крови невысокая. Однако имеются данные, чтогеморрагические проявления при гомозиготном де-фиците ф.V коррелируют с активностью ф.Vв тром-боцитах, а этот показатель не всегда страдает при

дефиците плазменного ф.V. Для гемостатическойпомощи применяют свежезамороженную плазму.Лабораторная диагностика дефицита ф.V ос-нована на изменении стандартных тестов коагуло-граммы и определении активности ф.V (табл. 45).


при дефиците ф. V


Дефицит фактора II (гипопротромбинемия)

Наследственный дефицит протромбина -чрезвычайно редко встречающееся геморрагичес-кое заболевание, связанное с мутацией гена ф.II.Различают гипо- и диспротромбинемии. Заболе-вание передается аутосомно-рецессивным путем.

Основные проявления - кожный гемосиндромв виде гематом и экхимозов, эпистаксис, маточныекровотечения, тяжелые кровотечения после хирур-гических вмешательств. Гемартрозы редки. Тяжестьгеморрагического синдрома, как правило, соответ-ствует уровню активности ф.II в крови. Пациентыс активностью протромбина менее 2% не описаны.Видимо, такой дефект не совместим с жизнью.

Лабораторная диагностика дефицита ф.II ос-нована на проведении стандартных тестов коагуло-граммы и на определении активности ф.II (табл. 46).


при дефиците ф.П

Афибриногенемия, гипофибриногенемия идисфибриногенемия

Наследственные количественные и качественныенарушения фибриногена, приводящие к развитиюгеморрагических или тромботических состояний,встречаются достаточно часто. В этом разделе ко-ротко представлены геморрагические заболевания,связанные с нарушением синтеза фибриногена.

Афибриногенемия - редкое аутосомно-рецес-сивное заболевание, которое проявляется часты-ми клинически значимыми кровотечениями, в томчисле кровотечениями из пуповинного остатка,гемартрозами, кровоизлияниями в мозг, форми-рованием гематом мягких тканей, выраженнымкожным гемосиндромом, кровотечениями из сли-зистых. Отсутствие фибриногена плазмы не все-гда сочетается с дефицитом фибриногена ос-гра-нул тромбоцитов , поэтому тромбоцитарныйтромб может формироваться.

О состоянии гипофибриногенемии говорят втом случае, если содержание фибриногена в плаз-ме менее 1 г/л. Клинические проявления анало-гичны проявлениям при афибриногенемии, одна-ко менее выражены.

Диагноз дисфибриногенемий соответствует со-стоянию, при котором изменена структура фибри-ногена, однако содержание самого белка в крови(антигена) нормальное или снижено непропорци-онально функции. Дисфибриногенемий могут про-являться кровотечениями, тромбозами или неиметь никаких проявлений. Клинические проявле-ния геморрагических дисфибриногенемий сходныс проявлениями гипофибриногенемии.

Лабораторная диагностика количественных икачественных нарушений фибриногена основанана изменении стандартных тестов коагулограммы(табл. 47). Для установления диагноза дисфибри-ногенемий показано проведение дополнительныхтестов. Часто этот диагноз можно поставить толь-ко после исследования гена ф.I.

Таблица 47Изменение скрининговых тестов

при афибриногенемии


Дополнительным тестом, позволяющим покосвенным признакам заподозрить дисфибрино-генемию, является тромбоэластография.

Дефицит факторов контактной активацииДефицит ф.ХII, прекалликреина (ПК) и вы-

сокомолекулярного кининогена (ВМК) нельзя вполной мере отнести к геморрагическим заболе-ваниям. Дефицит активности ВМК или ПК кли-нически никак не проявляется.

У пациентов с дефицитом ф.ХII (болезнь Ха-гемана) имеются разнонаправленные тенденции.У большинства из них, даже при глубоком дефи-

ците, нет геморрагических проявлении, однако унекоторых пациентов этой группы имеет местоповышенная кровоточивость. Некоторые паци-енты с дефицитом ф.ХII имеют тенденцию к тром-ботическим проявлениям.

Распространенность дефицита ф.ХII в попу-ляции довольно высока. Большинство случаев уд-линения АЧТВ у пациентов без клинических про-явлений связано с этой патологией. По некоторымданным частота гетеро- и гомозиготных форм де-фицита ф.ХII в популяции достигает 1,5-3%.

Лабораторные данные при дефиците ф.ХII,ПК, ВМК представлены в табл. 48.

Таблица 48Изменения скрининговых тестов при дефиците факторов контактной активации

Комбинированный врожденный дефицитфакторов свертывания

Встречаются два основных типа врожденныхкомбинированных дефектов факторов свертыва-ния крови.

Первый тип возникает вследствие общностимутации:• Сочетанный дефицит факторов V и VIII свя-

зан с дефектом гена, расположенного на длин-ном плече 18-й хромосомы. Ген отвечает засинтез белка, участвующего в осуществлениитранспортной функции в эндоплазматичес-ком ретикулуме. Этот белок участвует втранспорте в том числе факторов V и VIII.

• Комбинированный дефицит факторов II, V,IX, X возникает у пациентов с 1-м доминантным типом эластической псевдоксантомы,при варфариновой эмбриопатии, мутациигена гаммаглутамилкарбоксилазы.

• Комбинированный дефицит факторов VIII и IX,гены которых расположены на Х-хромосоме,возникает вследствие дефекта хромосомы,затрагивающего оба гена.

• Комбинированный дефицит факторов VII и X,связанный с делецией 13-й хромосомы.Второй тип возникает вследствие независимых мутаций гена у одного пациента.

Диагностика комбинированных мутацийпроводится по стандартному плану.


Врожденные нарушения функции тромбоцитов

Врожденные нарушения функции тромбоци-тов - достаточно гетерогенная группа тромбоци-топатий. До настоящего времени исследуютсявнутриклеточные механизмы активации и функ-ционирования тромбоцитов, которые обеспечи-ваются разнообразными функциональными ме-ханизмами. Поэтому существует несколько пред-ложений по классификации наследственных тром-боцитопатий, одна из них, которая учитываетнаиболее разработанные представления о мета-болизме и регуляции тромбоцитарных функций,представлена в табл. 49.

На рис. 131 показана схема нарушения функ-ции тромбоцитов при наиболее распространен-ных врожденных дефектах.

Клинические проявления врожденных на-рушений функции тромбоцитов для большин-ства заболеваний сходны. Отмечается разной

степени выраженности кровоточивость помикроцирку ляторному типу: петехии,экхимо-зы, длительные первичныекровотечения после травм слизистых,первичные послеоперационные кровотечения,носовые кровотечения, маточныекровотечения на фоне менструации. Вбольшинстве случаев геморрагический син-дром выражен не сильно и редко угрожает жиз-ни. Исключение составляют такие заболевания,как тромбастения Гланцмана и синдром Берна-ра-Сулье, при которых возможны опасные дляжизни проявления: внутричерепные кровоизли-яния, тяжелые маточные и носовые кровотече-ния, кровотечения со слизистых других лока-лизаций, послеоперационные кровотечения.При тромбастении Гланцмана описаны гемарт-розы с развитием артропатии, сходной с гемо-филической.

Классификация врожденных нарушений функции тромбоцитов(Rao. Am J Med Sci 1998; 316: 69-77)

Таблица 49


Изменения лабораторных тестов при врож-денных нарушениях функции тромбоцитов пред-ставлены в табл. 50.

Индуцированная агрегация на различныеактиваторы является одним из наиболее показа-тельных лабораторных тестов для выявления на-

следственных нарушений функции тромбоцитов(рис. 132). Наиболее значимые лабораторные те-сты, используемые для диагностики врожденныхнарушений функций тромбоцитов, суммированыв табл. 51.

Рис. 131. Схема механизмов развития врожденных нарушений функции тромбоцитов. ДАГ - диацилглицерол, ЛЦМ -легкие цепи миозина, ПГС2 и ПГН2- эндоперекиси, ФЛА2- фосфолипаза А2, G - G-белок, 1Р3 - инозитолтрифосфат, PAF -тромбоцит-активирующий фактор, Р1Р2 - фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат, R - рецептор, vWF - фактор Виллебранда


Врожденные нарушения функции тромбоцитов

Таблица 50

А-Р - аутосомно-рецессивный, А-Д - аутосомно-доминантный, «+» - присутствует, нормальная, «-» - отсутствует илиснижена, «±» - вариабельна либо слегка снижена.

Рис. 132. Агрегация тромбоцитов с различными индукторами у здоровых людей и при врожденных нарушениях функциитромбоцитов


Наиболее значимые лабораторные тесты, используемые для диагностикиврожденных нарушений функций тромбоцитов

Таблица 51

Наследственная болезнь Виллебранда

Болезнь Виллебранда (БВ) - геморрагическоезаболевание, являющееся следствием качествен-ных или количественных нарушений фактораВиллебранда. БВ бывает наследственной или при-обретенной. Строго говоря, болезнь Виллебран-да нельзя отнести в группу тромбоцитарных на-рушений, поскольку тромбоциты при болезниВиллебранда не страдают.

Причиной наследственной болезни Вилле-бранда является мутация гена фактора Виллеб-ранда (vWF). К настоящему времени показано,что наследственная болезнь Виллебранда являет-ся наиболее распространенным геморрагическимзаболеванием. Частота носителей дефектногогена vWF в популяции достигает 1:100 человек,но лишь 10-30% из них имеют клинические про-явления.

Классификация и патогенезболезни Виллебранда

В соответствии с общепринятой классифика-цией (Sadler, 1994) БВ подразделяется на 3 типа, атип 2 - на 4 подтипа:• 1-й тип - наследственное заболевание с час-

тичным дефицитом vWF в крови и нормаль-ным распределением мультимеров vWF;

• 2-й тип - наследственная патология с качественным изменением vWF. Второй тип подразделяют на 4 подтипа:

подтип 2А - характеризуется снижениеммультимеров vWF большой и средней мо-лекулярной массы;

- подтип 2В - большие мультимеры vWFснижены, увеличена аффинность к тром-боцитарному гликопротеину 1Ь и снижена аффинность к другим рецепторнымгликопротеинам;

- подтип 2М - характеризуется сниженнойристомицин-кофакторной активностьюпри нормальном количественном и качественном составе мультимеров vWF;

- подтип 2N - качественные варианты vWFсо значительным снижением аффинности к ф.VIII (снижена vWF:FVIIIB);

• 3-й тип - практическое отсутствие vWF вкрови.Диагностические признаки болезни Вилле-

бранда представлены в табл. 52.

Псевдоболезнь Виллебранда

Псевдоболезнь Виллебранда (тромбоцитарныйтип) возникает вследствие повышенного связы-


Таблица 52Клинические особенности и диагностические признаки болезни Виллебранда (БВ)

вания vWF с GPIb-IX-V за счет мутации после-днего. Это приводит к ускоренной элиминациив первую очередь наиболее высокомолекулярныхкомплексов vWF из плазмы и диспропорциональ-ному снижению его активности по сравнению сантигеном.

Клиническая характеристикаболезни Виллебранда

Основным клиническим проявлением болез-ни Виллебранда является повышенная кровото-чивость при травмах или патологических процес-сах. При болезни Виллебранда страдает функцияостановки кровотечения, следовательно, харак-терны первичные кровотечения, начинающиесясразу после травмы.

Характер и тяжесть геморрагического синд-рома при болезни Виллебранда зависят от фор-

мы заболевания. В целом можно условно выде-лить три варианта:

I вариант. Геморрагический синдром по мик-роциркуляторному типу характерен для 1, 2А, 2В,2М типов болезни Виллебранда. Типичными яв-ляются кожный гемосиндром в виде экхимозов,петехий, кровотечения из травмированных сли-зистых оболочек, длительные кровотечения излунок удаленных или выпавших зубов, носовыекровотечения, маточные кровотечения у девочекпосле начала менструаций, интра- и послеопера-ционные кровотечения, желудочно-кишечныекровотечения и кровотечения из мочевых путей.Менее характерны кровотечения из мест инъек-ций и гематомы тканей после различных травм.

II вариант. Выраженный геморрагический син-дром по смешанному (гематомному и микроцирку-ляторному) типу. Этот вариант характерен длябольных тяжелыми формами 1-го и 3-го типов бо-


лезни Виллебранда, клинически напоминает гемо-филию. Первые проявления могут отмечаться в пе-риод новорожденности: кожный гемосиндром, ге-матомы и кровотечения из мест инъекций. У детейи подростков возникают гематомы мягких тканей,кровотечения при травмах слизистой рта, смене зу-бов, кровотечения из ран кожи и слизистых, носо-вые, кишечные кровотечения, кровотечения из мо-чевых путей. После начала менструаций у девочекнередки маточные кровотечения. Кровоизлияния всуставы, так же как и при гемофилии, могут начать-ся на первом году жизни. Эти больные страдают отинтра- и послеоперационных кровотечений.

/// вариант. Клиническая картина сходна с та-ковой у больных гемофилией А с аналогичнымуровнем фактора VIII: гематомный тип кровоточи-вости, редко сопровождающийся поражением сус-тавов. Для этого варианта болезни Виллебрандахарактерен кожный гемосиндром в виде гематом,отсроченные (возникающие через несколько часовили дней после наступления травмы) кровотеченияпри травмах и после операций. Могут возникатьпосттравматические гематомы мягких тканей.

Осложнения геморрагических проявлений.Наиболее частым проявлением геморрагическо-

го синдрома у детей является хроническая пост-геморрагическая анемия. Артропатии суставоввозникают у детей с рецидивирующими гемарт-розами при 3-м типе болезни Виллебранда. Так-же описаны единичные случаи формированияпсевдоопухолей у пациентов с болезнью Виллеб-ранда.

Лабораторная диагностикаболезни Виллебранда

Диагностика болезни Виллебранда основанана анализе анамнестических, клинических и ла-бораторных данных.

Диагностические критерии болезни Вилле-бранда:• Типичный геморрагический синдром.• Признаки снижения специфической активно

сти vWF: vWF:RCo, vWF:RCB, vWF:FVIIIB.• Для типа 2В типична положительная реакция

агрегации тромбоцитов при использованиив качестве индуктора ристоцетина в низкойконцентрации.Дифференциальный диагноз болезни Вилле-

бранда представлен в табл. 53.

Дифференциальный диагноз болезни ВиллебрандаТаблица 53



vWF:Ag - антиген фактора Виллебранда, vWF:RCo - коллаген-связывающая активность фактора Виллебранда,ф.VIII - фактор коагуляции VIII, А-Д - аутосомно-доминантное, А-Р - аутосомно-рецессивное.


Мальчик, возраст 1 год. Родители обрати-лись по поводу геморрагических проявлений.В анамнезе: с рождения кровотечения из местинъекции в течение многих часов, останавлива-лись самостоятельно; кровотечения при проре-зывании зубов продолжались до несколькихдней, также останавливались самостоятельно;кровотечение из травмированной уздечки верх-ней губы - в течение суток, остановилось послевведения свежезамороженной плазмы. Со словматери, у ее отца были геморрагические прояв-ления, однако он не обследовался. Анамнез и

клиническая картина не позволяли сделать од-нозначного предположения о диагнозе. Былопроведено обследование.

Время кровотечения не определяли. ПТ 99%,АЧТВ 83 с (норма до 43 с), активность ф.VIII 1,5%,активность ф.IХ 55%, ристоцетин-кофакторнаяактивность <3%, агрегация тромбоцитов с аггри-стином отсутствует; агрегация с АДФ, коллаге-ном и адреналином - нормальная.

Ребенку был выставлен диагноз: болезнь Вил-лебранда, тип 3. В дальнейшем гемостатическаятерапия препаратами, содержащими факторВиллебранда, позволила останавливать крово-течения.


Болезнь Виллебранда часто сопровождает-ся изменениями гемостаза, клинически схожи-ми с проявлениями гемофилии А, это связанос тем, что vWF является в плазме носителемфактора VIII. При болезни Виллебранда частоснижены как vWF, так и ф.VIII. При гемофи-лии А уровень ф.VIII снижен, a vWF нормаль-ный (рис. 133).

В табл. 54 представлены изменения основныхкоагулологических тестов у пациентов с болезньюВиллебранда (тип 1) по сравнению с больнымигемофилией А с геморрагическими проявления-ми и при передозировке непрямыми антикоагу-лянтами (дефиците витамина К).

Таблица 54Изменение коагулограммы при заболеваниях,

сопровождающихся геморрагиями

Алгоритм диагностики болезни Виллебранда

Необходимый минимум обследования: времякровотечения, количество тромбоцитов, ПВ,

АЧТВ, агрегация, индуцированная ристоцети-ном, ристомицин-кофакторная активность фак-тора Виллебранда.

При снижении vWF:RCo следует определитьантиген фактора Виллебранда (vWF:Ag), рассчи-тать отношение vWF:RCo/vWF:Ag.

При подозрении на тип 2В требуется выпол-нить индуцированную агрегацию с низкими до-зами ристоцетина, а при подозрении на тип 2N -определить vWF:F.VIIIB.

В дальнейшем для типирования формы болез-ни Виллебранда следует провести тесты в соответ-ствии с табл. 55.

Соотношение активности фактора Виллебрандаи группы крови

Исследования активности и антигена фактораВиллебранда у здоровых лиц показали, чтоvWF:RCo и vWF:Ag в целом не одинаковы у людейс разными группами крови. У лиц с 1 -й группой име-ет место наиболее низкое содержание фактора Вил-лебранда. Ниже приведены нормы vWF:Ag в зави-симости от группы крови, рекомендованные Все-мирной ассоциацией тромбоза и гемостаза.

Нормальное содержание vWF:Ag36-157 49-234 57-24164-238

Рис. 133. Комплекс Ф.VIII—vWF определяется синтезом фактора VIII на основе информации в Х-хромосоме исинтезом vWF, программированном в 12-й хромосоме. Гемофилия А зависит от мутации в Х-хромосоме, болезньВиллебранда - от мутации в 12-й хромосоме

Группа крови

1(0)2 (А)3(В)

4(АВ)


Дифференциальный диагноз форм болезни ВиллебрандаТаблица 55

80% лиц с диагностированной лабораторноБВ имеют 0 группу крови. У людей с не первойгруппой крови риск венозного тромбоза и ИБСпримерно в 2 раза выше по сравнению с лицами с1-й группой крови. Среди лиц с постоянно увели-ченным содержанием ф.VIII более чем 150% посравнению со средним показателем по популяциириск этих осложнений в 5 раз выше.

Лечение болезни ВиллебрандаПри рассмотрении вопроса о лечении болезни

Виллебранда надо понимать, что речь идет о тера-пии или профилактике проявлений болезни. Гемо-статические препараты можно разделить на 2 боль-шие группы - специфические гемостатические пре-параты, повышающие активность vWF в крови, инеспецифические гемостатические препараты.


Специфическая гемостатическая терапия(ДДАВП, концентраты фактора Виллебранда).Десмопрессин (1-дезамино-8D-аргинин-вазопрес-син, ДДАВП) - синтетический аналог антидиу-ретического гормона вазопрессина, стимулируетвысвобождение vWF из депо, что приводит к по-вышению его концентрации в плазме. Наиболееэффективно применение ДДАВП при 1-м типеболезни Виллебранда, возможен эффект притипе 2А болезни Виллебранда. Во всех осталь-ных случаях показано применение препаратовvWF. Наиболее рационально использованиеочищенных, вирус-инактивированных концент-ратов ф.VIII+vWF.

Неспецифические гемо статические препара-ты. Ингибиторы фибринолиза - эпсилон-амино-капроновая кислота, трансэкзамовая кислота -могут применяться внутривенно, перорально илиместно.

Местные гемостатические препараты, такие,как фибриновый клей, гемостатическая губка идр., показаны в первую очередь при оперативномлечении и в стоматологической практике.

Этамзилат (дицинон) применяется в качестведополнительного гемостатического препаратапри купировании кровотечений различной этио-логии. В ряде случаев препарат эффективен дляпрофилактики носовых кровотечений.

Осложнения терапии БВ. У больных с 3-м ти-пом БВ примерно в 10-15% случаев к вводимомуvWF развиваются блокирующие антитела (инги-

битор). При ингибиторе введение концентратовvWF противопоказано из-за риска развития пост-инфузионных анафилактических реакций. В этихслучаях возможно применение противоингиби-торных препаратов (NovoSeven), ингибиторовфибринолиза и терапии, направленной на элими-нацию ингибитора (гормональная терапия, плаз-маферез, в/в иммуноглобулин и др.).

Лабораторный контроль за лечением болез-ни Виллебранда очень важен. Дело в том, что со-зданы единичные препараты, в которых извест-ны и строго контролируются активность и муль-тимерный состав vWF. В России в настоящее вре-мя такие препараты не зарегистрированы. Поэто-му необходимо контролировать состояние гемо-стаза, особенно у больных тяжелыми формами БВперед операционным лечением, при недостаточ-ном эффекте применения специфических гемо-статических препаратов. При использованииДДАВП необходимо знать, до какого уровня по-вышается активность vWF. Для этого определя-ют базальную активность vWF и повторяют ис-следование через 30-60 мин после введенияДДАВП. Если препарат планируется вводитьповторно через день, рекомендуется повторятьтест после повторных введений. Это связано с тем,что скорость восстановления vWF в депо у раз-ных людей отличается, поэтому данная информа-ция будет необходима для прогноза эффективно-сти терапии.


Мальчик В. 12 лет. Обследовался и наблюдалсяв другом регионе с диагнозом гемофилия А. В анам-незе - кожный гемосиндром в виде гематом и экхи-мозов, гемартрозы локтевых, коленных и голено-стопных суставов. Получал лечение криопреципи-татом с удовлетворительным эффектом. В12 лет про-ведена экстракция зуба на фоне введения концент-рата фактора VIII в дозе 30 МЕ/кг, при этом был ис-пользован моноклонально очищенный концентрат,не содержащий других факторов. Через 3 часа пос-ле экстракции началось профузное кровотечение излунки удаленного зуба. Кровотечение остановленоповторным введением того же препарата - концен-трата фактора VIII - в общей дозе 200 МЕ/кг в тече-

ние 6 часов и 10 доз криопреципитата. Было запо-дозрено формирование ингибитора к ф.VIII, и па-циент был направлен в детский гематологическийцентр для уточнения диагноза.

Первичное обследование по месту житель-ства: время кровотечения незначительно удлине-но, ПТ 90%, АЧТВ не определяется (более 180 с),ф.VIII 1,5%, фибриноген 3,5 г/л, агрегация тром-боцитов с АДФ на стекле нормальная, количествотромбоцитов 180 х 109/л.

Повторное обследование в гематологическомцентре: время кровотечения значительно удлине-но, количество тромбоцитов 250 х 109/л, ПТ100%, АЧТВ 105 с (норма 28-43 с), тромбиновоевремя 17 с (норма 15-20 с), фибриноген 2,5 г/л,ф.VIII 1,8%, ф.IХ 89%, ристоцетин-кофакторная


активность <3%, ингибитор к ф.VIII не выявлен.Агрегация тромбоцитов с АДФ, коллагеном, ад-реналином нормальная, с ристоцетином - прак-тически отсутствует.

Данные обследования позволили поставитьдиагноз: болезнь Виллебранда, тип 3.

Недостаточная эффективность остановки кро-вотечения моноклонально очищенным концентра-том фактора VIII объяснялась отсутствием в этомпрепарате фактора Виллебранда. Применение кри-опреципитата позволило остановить кровотече-ние, так как он содержит фактор Виллебранда.

Приобретенные геморрагические заболевания

Приобретенные нарушения тромбоцитарного звена

Тромбоцитопении

Тромбоцитопения - снижение числа тромбо-цитов ниже 150 тыс./мкл. Тромбоцитопения можетбыть обусловлена недостаточным образованиемтромбоцитов, повышенным их разрушением илипотреблением (табл. 56). Тяжелая тромбоцитопе-ния проявляется множественными петехиями накоже, кровотечениями из слизистых оболочек.

Таблица 56Классификация тромбоцитопенических

состояний

Подсчет форменных элементов периферичес-кой крови - важнейшее исследование не толькодля выявления тромбоцитопении, но и для выяс-нения ее причины (табл. 57). Следует обратитьвнимание на размеры тромбоцитов (рис. 17): по-вышение доли крупных тромбоцитов позволяетдумать о компенсированном увеличении образо-вания тромбоцитов. Исследование пунктата кос-тного мозга позволяет оценить число и внешнийвид мегакариоцитов и подтвердить наличие за-болевания, нарушающего функцию костного моз-га (лейкоз).

Периферическая кровьпри тромбоцитопениях

Таблица 57


Иммунная тромбоцитопеническая пурпура (ИТП)

Иммунные тромбоцитопенические пурпу-ры в зависимости от механизма развития делят-ся на:• аутоиммунные тромбоцитопении, при кото

рых антитела вырабатываются к антигенамсобственных тромбоцитов (чаще всего ауто-антитела бывают направлены против комплекса GPIIb-IIIa и GPIb). Группа аутоиммунных пурпур включает:- острые или хронические;- первичные (идиопатические) или вторич

ные (симптоматические);- неонатальную трансиммунную тромбо-

цитопеническую пурпуру (проникновение антител матери с аутоиммуннойтромбоцитопенической пурпурой черезплацентарный барьер вызывает тромбо-цитопению у ребенка);

- циклическую аутоиммунную пурпуру;• аллоиммунные, при которых антитела выра

батываются к антигенам тромбоцитов, которых нет у источника антител, например алло-антитела матери, проникающие в кровь плода и направленные против антигенов тромбоцитов плода или отца, посттрансфузионныеаллоиммунные тромбоцитопении (антитела кантигенам донорских тромбоцитов);

• изоиммунные, при которых вырабатываются антитела против неизмененных антигенов

Клинический пример 7Больная 28 лет. Консультация в городском ге-

матологическом центре.Основной диагноз: иммунная тромбоцитопения.Проявления нарушений гемостаза: синяки на

коже, кровохарканье, носовые кровотечения,обильные менструальные кровотечения, сплено-мегалия, предстоит операция спленэктомии.

Лабораторные данные: НЬ 142 г/л, СОЭ 2 мм,тромбоциты 102 х 109/л. АЧТВ 38 с, ПТ 97%, ТВ28 с, фибриноген 2,2 г/л, лизис эуглобулиновойфракции 240 мин, РКМФ отр. Ретракция кровя-ного сгустка 27% (норма 44-66%). Агрегация тром-боцитов с АДФ (0,625 мкмоль/л) 1,5% с дезагрега-цией (норма 24-40%) (рис. 134). Агрегация тром-боцитов с ристомицином 30% (норма 48-91%).

Заключение: умеренная тромбоцитопения свыраженным снижением функциональных

донорских тромбоцитов, например при пере-ливании тромбоцитов больным с тромбасте-нией Гланцмана или синдромом Бернара-Сулье;

• гаптеновые, при которых антитела образуют-ся против комплекса лекарства с тромбоци-тарным антигеном.Идиопатические аутоиммунные тромбоцито-

пении (ИТП) наиболее распространены средииммунных тромбоцитопении, они составляют до40% всех геморрагических заболеваний. Часто-та ИТП - около 1:10 000. Это заболевание у де-тей обычно развивается после перенесенных ви-русных или бактериальных инфекций, после при-вивок. В ряде случаев причина заболевания ос-тается неизвестной. Острая тромбоцитопеничес-кая пурпура заканчивается выздоровлением.После перенесенной острой ИТП возможны ре-цидивы тромбоцитопении, которые почти все-гда заканчиваются восстановлением нормально-го количества тромбоцитов. Хронические тром-боцитопенические пурпуры могут протекатьциклично, с колебанием количества тромбоци-тов от нормального до единичных. В другихслучаях тромбоциты могут быть снижены по-стоянно.

Для ИТП у взрослых более характерно отсут-ствие видимой причины и длительное течение.Женщины болеют в 2 раза чаще мужчин. Средидетей мальчики и девочки поражаются с равнойчастотой.

свойств кровяных пластинок (ретрактивных, аг-регационных).

Рис. 134. Агрегация тромбоцитов у больной с иммун-ной тромбоцитопенией. Агрегация тромбоцитов с АДФ(0,625 мкмоль/л) составляет всего 1,5% (норма 24-40%),быстро развивается дезагрегация, Агрегация тромбоцитовс ристомицином также снижена - 30% (норма 48-91%)


Вторичная иммунная тромбоцитопения можетнаблюдаться при: Лимфопролиферативныхзаболеваниях:• Хронический лимфолейкоз.• Неходжкинская лимфома.• Болезнь Ходжкина.• Макроглобулинемия Вальденстрема.Солидных опухолях, иммунных заболеваниях:• Системы крови (синдром Фишера-Эванса).• Генерализованные (ревматоидный артрит,

системная красная волчанка).• Органоспецифичные:

- иммунологические заболевания суставов(анкилозирующий спондилит и др.);

- иммунологические заболевания кишечника (болезнь Крона, неспецифическийязвенный колит);

- иммунологические заболевания печени(хронический активный гепатит);

- тиреоидит.Инфекционных заболеваниях:• Бактериальные инфекции.• Некоторые вирусные инфекции.• Хронические и персистирующие вирусные ин

фекции (HIV-инфекция, вирус Эпштейна-Барра).

Неонатальная аллоиммунная тромбоцитопения

При неонатальной аллоиммунной тромбо-цитопении антитела вырабатываются в резуль-тате иммунизации матери аллоантигенными де-

терминантами, содержащимися на тромбоцитахотца и ребенка. Тромбоцитопения в этом слу-чае сохраняется у новорожденного в течение 2-3 недель.

Гаптеновые (гетероиммунные) тромбоцитопении

Гаптеновые тромбоцитопении сопровожда-ются выработкой антител против измененныхили чужеродных структур на поверхности тром-боцитов, появляющихся в результате воздей-ствия некоторых лекарственных препаратов(табл. 58). Хинин и препараты хининового рядаспособны стимулировать образование гаптено-вых антител, так как они связываются с тромбо-цитарными рецепторами с образованием комп-лексов.

Следует подчеркнуть, что какой бы ни былапричина нарушения функции тромбоцитов, притромбоцитопении следует избегать лекарствен-ных средств, способных нарушать эти функции,в частности, следует отказаться от аспирина инекоторых других нестероидных противовоспа-лительных средств.

Тромбоцитопения, вызванная гепарином

Тромбоцитопения развивается примерно у5% больных, получавших бычий гепарин, и 1%больных, получавших свиной гепарин. У больныхс гепариновой тромбоцитопенией прогрессивноувеличивается риск тромбоза, возникают угрожа-

Препараты, способные вызвать лекарственную тромбоцитопениюТаблица 58


ющие жизни артериальные тромбы (рикошетныетромбозы). Патогенез гепарин-индуцированнойтромбоцитопении (ГИТ) связан с действием па-тогенных гепарин-зависимых IgG-антител (ГИТ-IgG). Тромбоцитарный фактор 4 является гепа-рин-связывающим белком. На поверхности тром-боцитов формируется мультимолекулярный ком-плекс между IgG и гепарином/тромбоцитарнымфактором 4 (рис. 135). Мультимолекулярный ком-плекс связывается со специфическим рецептором(FcγRIIA) на тромбоцитарной мембране. Пред-расположенность к этому осложнению связана смутацией в FcγRIIA-гене. В результате в молеку-ле FcyRIIA-рецептора происходит заменаArg 131 —>His 131, и пациенты с такой мутациейстановятся склонны к развитию гепарин-индуци-рованных рикошетных тромбозов. В будущем,по-видимому, молекулярно-генетическая диагно-стика позволит идентифицировать пациентов сповышенным риском развития гепариновойтромбоцитопении и рикошетных гепариновыхтромбозов. В настоящее время диагностика такихсостояний проводится сочетанием метода ELISAс использованием антител против комплекса ге-парин - тромбоцитарный фактор 4 или методомопределения агрегации или освобождения 14С-се-ротонина из предварительно нагруженных тром-боцитов под действием гепарина. Однако эти ме-тоды неспецифичны и часто бывают нечувстви-тельными.

Покрытые IgG тромбоциты активно удаля-ются из системы циркуляции макрофагами.ГИТ-IgG способны повреждать эндотелиальныеклетки. Это связано с тем, что гепарансульфатгликокаликса эндотелия как структурный аналоггепарина может вступать в качестве антигена вовзаимодействие с ГИТ-IgG. Затем возможно раз-витие иммунных реакций на поверхности эндо-телия, адгезия в этих зонах макрофагов и разви-тие пристеночного тромба.

Следует отметить, что низкомолекулярныегепарины (фраксипарин, фрагмин, ловенокс,клексан) не вызывают тромбоцитопении, вероят-но, из-за меньших, чем требуется для образова-ния иммунного комплекса, размеров молекул этихпрепаратов.

Если у больного, получавшего гепарин, раз-вивается тромбоцитопения, необходимо прове-сти тест для определения гепарин-ассоциирован-ной агрегации тромбоцитов и гепарин-индуци-рованной тромбоцитопении. Для этой цели с ус-пехом использовали импедансный и люминес-центный агрегометр «Chrono-log» (рис. 77), ко-торый одновременно с агрегацией тромбоцитовв цельной крови позволяет определять высво-бождение из гранул АТФ как конечную точкуактивации тромбоцитов, вызванной антителами.Методика позволяет в течение 1 часа поставитьдиагноз нарушения функции тромбоцитов и де-фектов накопления.

Рис. 135. Активация тромбоцитов гепарином за счет образования на поверхности мембран мультимолекулярногокомплекса между гепарин-зависимыми lgG-антителами и тромбоцитарным фактором 4


Дифференциальная диагностика тромбоцито-пений должна быть направлена на выяснение при-роды тромбоцитопении: 1) иммунной природы(иммунные тромбоцитопении), 2) тромбоцитопе-нии, возникающей в результате угнетения тром-боцитопоэза в костном мозге, или 3) наследствен-ных тромбоцитопении, ассоциированных с тром-боцитопатиями. Лабораторные методы, приме-няемые при диагностике тромбоцитопении, пред-ставлены в табл. 59.

Таблица 59Методы лабораторной диагностики

тромбоцитопении

Приобретенный дефицит факторов свертывания крови

Развитие специфического ингибитора

Чаще всего встречается развитие ингибито-ра к факторам VIII и IX у пациентов, страдаю-щих соответственно гемофилией А и В и получа-ющих специфическую заместительную терапию.Однако описаны приобретенные формы гемофи-лии А, болезни Виллебранда, реже приобретен-ный дефицит других факторов свертывания у лиц,не страдавших врожденными нарушениями.

Основными предрасполагающими фактора-ми являются:• аутоиммунные заболевания;• онкологические заболевания;• перенесенная инфекция;• прием некоторых лекарственных препаратов.

Возможно возникновение антител без явныхпровоцирующих воздействий.

Приобретенный ингибитор к фактору VIII(приобретенная гемофилия А)

Возникает вследствие образования антител ксобственному ф.VIII. Чаще развивается у лицстарше 50 лет, однако описаны случаи заболева-ния детей. Мужчины и женщины страдают оди-

наково часто. Расчетная частота развития инги-битора к ф.VIII у пациентов, не болевших гемо-филией, составляет 1 случай на миллион человекв год.

У описанных в литературе за последние 10 лет215 пациентов в 50% случаев ингибитор развилсяспонтанно. В качестве фоновых заболеваний на-зывают: системные заболевания соединительнойткани, ревматоидный артрит, многоформную эри-тему, герпетиформный дерматит, аллергическиереакции на пенициллин, бронхиальную астму, не-специфический язвенный колит, болезнь Крона,терапию α-интерфероном, моноклональные гам-мапатии, беременность и послеродовый период.

У части пациентов ингибитор спонтанно ис-чез через 12-18 месяцев после развития, однакоостальным потребовалось специальное лечение.Терапия аналогична лечению ингибиторной фор-мы гемофилии А.

Диагностика основана на клинических(признаки развившегося геморрагического за-болевания с кровоточивостью по гематомномутипу) и лабораторных данных (снижение актив-ности ф.VIII, наличие специфического ингиби-тора к ф.VIII).


Больная 68 лет. Поступила в отделение гаст-роэнтерологии. На 3-й день в области бедер, яго-дицы появились обширные гематомы. Переведе-

на в гематологическое отделение с диагнозом:геморрагический синдром неясной этиологии.

Лабораторный анализ: АЧТВ 161 с (норма 35-45 с), ПТ 93%, ТВ 34 с (норма 28-30 с), фибрино-ген 2,4 г/л, лизис эуглобулиновой фракции 140 мин,


ретракция кровяного сгустка 46%, фактор VIII1,3%, агрегация тромбоцитов с АДФ 72%.

Заключение: значительное удлинение време-ни свертывания крови при активации по внутрен-нему пути, резкое снижение ф.VIII. Подозрение

на ингибиторную форму гемофилии А. Для под-тверждения необходимо определение ф.VIII:Ag.Больная направлена в гематологическийцентр, где была подтверждена приобретенная (ин-гибиторная) гемофилия А.

Приобретенный ингибитор к ф./Х

Чрезвычайно редкое заболевание. Клиника идиагностика приобретенной гемофилии В анало-гичны таковым при приобретенной гемофилии А.

Ингибитор к фактору Вимебранда(приобретенная болезнь Виллебранда,приобретенный синдром Виллебранда)

Приобретенная болезнь Виллебранда (приоб-ретенный синдром) лабораторно подобна нару-шениям, характерным для врожденной болезниВиллебранда. Редкое заболевание. Возникает какспонтанно, так и на фоне ряда заболеваний: па-тология сердца и сосудов, онкологические забо-левания, системные заболевания соединительнойткани, гипотиреоз, опухоль Вильмса, прием цип-рофлоксацина и др. Патогенетические механиз-мы формирования приобретенного синдромаВиллебранда:• Специфические антитела к ф.VIII/vWF.• Неспецифические антитела, которые форми

руют иммунные комплексы и приводят к более активному клиренсу vWF.

• Абсорбция vWF клетками злокачественныхопухолей.

• Повышение протеолитической деградацииvWF.

• Потеря тяжелых молекул vWF в условияхстресса, связанного с высоким напряжениемсдвига при активном кровотоке.

• Снижение синтеза или высвобождения vWF.Диагностика: выявление развившихся признаков приобретенного геморрагического заболевания, сходных с наследственной болезньюВиллебранда. Лабораторная диагностика приобретенной болезни Виллебранда аналогична диагностике врожденной болезни Виллебранда. Приэтом, помимо состояния гемостаза, необходимовыявить фоновые заболевания.

Лечение приобретенного синдрома Вилле-бранда: симптоматическая терапия и/или профи-

лактика кровотечений - ДДАВП и концентратыфактораVIII + vWF; патогенетическое лечение,включая лечение фонового заболевания.

Приобретенный ингибитор к фактору V

Редкое заболевание, возникающее у пожи-лых людей, не имевших предшествующего дефи-цита ф.V. Развитие ингибитора чаще всего свя-зано с предшествующим хирургическим лечени-ем, часто после операций по поводу злокаче-ственных заболеваний. В ряде случаев развитиедефицита ф.V происходило после операций, вкоторых использовался фибриновый клей из бы-чьей плазмы, или после применения антибиоти-ков с бета-лактамным кольцом, или после пере-ливания крови.

Диагностика основывается на появлении при-знаков геморрагического заболевания, сходногос врожденным дефицитом ф.V, и наличии лабо-раторных данных за ингибитор к ф.V.

Приобретенные ингибиторы к протромбину,факторам VII и X

За исключением антител к протромбину, ас-социированных с волчаночным антикоагулян-том, специфические антитела к ф.II, -VI, -Xвстречаются очень редко. Есть лишь единичныеописания таких случаев. Диагностика основы-вается на наличии клинических и лабораторныхпризнаков ингибитора к соответствующему фак-тору.

Описаны единичные случаи развития инги-битора к ф.ХI, ф.ХII и другим факторам контак-тной активации. Их диагностика была лабора-торной находкой, и никто из пациентов, за ис-ключением имеющих ингибитор к ф.ХI, не стра-дал значительными геморрагическими проявле-ниями.

Приобретенные ингибиторы к фибриногену,фибрину, ф.ХIII и промежуточным продуктам


последней фазы свертывания крови. Имеютсянемногочисленные описания развития ингиби-тора к фибриногену, фибрину, ф.ХIII и проме-жуточным продуктам процесса полимеризациии стабилизации фибрина. Большинство из боль-ных страдали тяжелыми геморрагическими про-явлениями с угрозой для жизни, сходными спроявлениями афибриногенемии или дефицитаф.ХIII.

Лабораторная диагностика основана наснижении активности ф.ХIII и признаках егоингибитора либо удлинении тромбинового вре-мени, которое не корригируется в тесте смеши-вания с нормальной плазмой. Специальное ис-следование позволяет выявить специфичностьантител.

Приобретенный дефицит витамина К

Причины дефицита витамина К у детей стар-шего возраста и взрослых:• Синдромы нарушенного кишечного всасы

вания (мальабсорбции), в том числе дефицит α1-антитрипсина, абеталипопротеине-мия, атрезия желчных проходов, целиакия,хроническая диарея, холестатическая болезнь и др.

• Недоедание (голод).• Алкоголизм.• Прием лекарственных препаратов - кумари-

нов, в том числе из растительных сборов, отравление ядами и др., антиконвульсанты, антибиотики (цефалоспорины, антибиотики,содержащие бета-лактамную цепь), передозировка витамина Е, салицилаты.Коагулопатия, возникающая вследствие

приобретенного дефицита витамина К, прояв-ляется кожным геморрагическим синдромомразличной степени выраженности, кровотечени-

ями со слизистых, в том числе из желудочно-ки-шечного тракта, носовыми кровотечениями. Ла-бораторная диагностика при приобретенном де-фиците витамина К аналогична диагностике де-фицита витамин-К-зависимых факторов другойэтиологии.

Лечение антикоагулянтами непрямого действия,отравление антагонистами витамина К

Передозировка непрямых антикоагулянтовили отравление антагонистами витамина К при-водят к состоянию гипокоагуляции. Эти препа-раты являются неактивными аналогами витами-на К и конкурируют с активными формами ви-тамина К. Вследствие этого синтезированные ви-тамин-К-зависимые факторы не имеют у-карбо-ксиглутамина, не могут фиксироваться на фос-фолипидной матрице и выполнять свою функ-цию (PIVKA-белки). Клиника и диагностика пе-редозировки и отравления антагонистами вита-мина К аналогична геморрагическому состоянию,вызванному дефицитом витамина К, и варьируетпо тяжести (в зависимости от дозы препарата).Лечение передозировки непрямых антикоагулян-тов описано в разделе, посвященном примене-нию непрямых антикоагулянтов для лечениятромбозов.

Поскольку антагонисты витамина К ис-пользуются в качестве ядов для борьбы с до-машними грызунами (кумарины), гематологиэпизодически сталкиваются со случаями отрав-ления этими препаратами. Лечение отравленийтребует массивного введения препаратов вита-мина К и заместительной терапии препарата-ми протромбинового комплекса. Продолжи-тельность лечения может быть очень большой(многие месяцы) из-за кумулятивного эффектакумаринов.


Больной 68 лет. Находился на санаторномлечении. Состояние после аортокоронарногошунтирования (АКШ). Принимает варфарин.

Коагулограмма для контроля антикоагулянт-ной терапии: количество тромбоцитов 330 х 109/л.

В моче микрогематурия (2-3 эритроцита в полезрения).

ПВ 80,5 с (норма 15,5-21,2 с), MHO 8,5.Заключение: передозировка варфарина. Необ-

ходимо уменьшить дозу. Контроль MHO проводитьежедневно до достижения рекомендуемого для про-филактики тромбоэмболии значения MHO = 2-3.


Гепариноподобные антикоагулянты

Развитие гепариноподобного антикоагулянтабыло описано у пациентов, страдающих неопла-зиями или получающих терапию сурамином приадренокарциноме. Клинически это нарушение про-является выраженными геморрагическими симп-томами. Лабораторно выявляется удлинение тром-бинового времени, которое корригируется приме-нением протаминсульфата, либо толуидиновогоголубого, либо гепариназы. Биохимические и фи-зико-химические исследования показали сходствоэтого антикоагулянта с гликозаминогликанами.

Заболевания печени

Кровотечения часто сопутствуют хроническимили острым заболеваниям печени. Геморрагичес-

кий синдром при заболеваниях печени носит сме-шанный характер (по гематомному и микроцир-куляторному типу). Наиболее опасны кровотече-ния из пищеварительного тракта, которые неред-ко становятся причиной гибели этих пациентов.

В табл. 60 перечислены основные дефекты си-стемы гемостаза, связанные с поражением печени.

В табл. 61 представлены особенности резуль-татов лабораторного анализа гемостаза при раз-личных заболеваниях печени.

Системный фибринолиз

Значительная активизация системного фиб-ринолиза - довольно редкая причина геморра-гического синдрома. Однако развитие системно-го гиперфибринолиза может повлечь за собой

Дефекты системы гемостаза при поражениях печениТаблица 60

Возможные изменения показателей гемостаза при заболеваниях печениТаблица 61


опасные геморрагические проявления, а при ис-тощении плазминогена - тромбозы (табл. 62).Системный фибринолиз может быть причиноймассивных кровотечений из желудочно-кишеч-ного тракта у пациентов с печеночной недоста-точностью.

Таблица 62Гиперфибринолиз и его осложнения

Большинство скрининговых тестов не выяв-ляет состояние гиперфибринолиза. Относитель-но специфичными являются тесты определениявремени лизиса сгустка. Тромбоэластограммаспособна наглядно продемонстрировать развитиегиперфибринолиза.

Из-за относительно невысокой специфично-сти плазмин может деградировать многие белкикрови. Кроме того, плазмин может активироватьметаллопротеазы, которые, в свою очередь, спо-собны индуцировать деструкцию тканей и апоп-тоз. Высока вероятность развития гиперфибри-нолиза при множественных травмах, сепсисе,ДВС-синдроме, выпадении функции органов, об-ширном метастазировании с деструкцией тканей.Врожденный или приобретенный недостаток од-ного или нескольких ингибиторов фибринолиза(особенно α2-антиплазмина или PAI-1) сопровож-дается проявлениями гиперфибринолиза.

Гиперфибринолиз клинически проявляет-ся склонностью к кровотечениям, а при исто-щении факторов - тромбозами. Состояние ги-перфибринолиза необходимо диагностироватьи лечить. Для коррекции гиперфибринолизаиспользуются апротинин, ингибиторы фибри-нолиза и ингибиторы протеолитических фер-ментов.

Геморрагические мезенхимальные лисплазии

Мезенхимальные дисплазии (МД) - группаврожденных заболеваний соединительной ткани,в основе которых лежит недостаточное или ано-мальное развитие коллагеновых структур, приво-дящее к неполноценности сосудистой стенки, свя-зочного аппарата, клапанов сердца, кожи, скеле-та и других стромальных образований, часто со-четающихся с неполноценностью иммунитета игемостаза.

Мезенхимальные дисплазии, сочетающиесяс нарушениями в системе гемостаза и геморра-гическим синдромом, в современной литерату-ре обозначают как геморрагические мезенхи-мальные дисплазии (ГМД). Геморрагическиепроявления описаны при многих мезенхималь-ных дисплазиях: генерализованной фибродисп-лазии (синдром Черногубова-Элерса-Данлоса),мезодермальной аномалии Марфана, несовер-шенном остеогенезе, синдроме отсутствия луче-вой кости (ТАР-синдроме), мозжечковой атак-сии-телеангиэктазии (синдром Луи-Бар), болез-ни Рэндю-Ослера, диффузной ангиокератоме ту-ловища (болезнь Фабри), гемангиомах (синдромКазабаха-Меритта, микроангиоматозы с тром-боцитопенией) и др. В основе геморрагическогосиндрома при гематомезенхимальных дисплази-ях лежат несколько механизмов:• Нарушение строения соединительной тка

ни приводит к повышенной ранимости сосудов.

• Сочетание генетически обусловленных аномалий коллагена с генетически обусловленными нарушениями компонентов системыгемостаза (качественные и/или количественные дефекты тромбоцитов, дефицит активности факторов свертывания, качественныеи/или количественные дефекты фактораВиллебранда, нарушения взаимодействия


тромбоцитов с коллагеном сосудов, каче-ственные и/или количественные дефектыфибриногена, в том числе нарушение его по-лимеризации).

• Сочетание аномалии строения коллагена сприобретенными нарушениями системы ге-мостаза (секвестрация тромбоцитов и по-требление факторов свертывания в геман-гиомах, вторичные дефекты системы гемостазана фоне хронических инфекций у пациентов симмунодефицитными состояниями, вчастности при синдроме Луи-Бар). Несколькоподробнее остановимся на двух состояниях.

Гемангиомы, особенно гигантские каверноз-ные гемангиомы Казабаха-Меритта, приводят кактивации и секвестрации тромбоцитов, потреб-лению плазменных факторов гемостаза. Помимокровотечений вследствие травмы патологическиизмененных сосудов, изменения гемостаза вносятсвой вклад в развитие геморрагического синдро-ма у этих пациентов.

Одним из серьезных осложнений большихгемангиом является острый или хроническийДВС, приводящий к потреблению прокоагулян-тов и активации фибринолиза. При этих явле-ниях нарушения гемостаза характеризуютсятромбоцитопенией, снижением концентрациифибриногена, повышением количества ПДФ,D-димеров. На фоне этого часто развиваетсяанемия.

Болезнь Рэндю-Ослера-Вебера - наследствен-ное заболевание, проявляющееся множественны-ми телеангиэктазиями на коже, в желудочно-ки-шечном тракте, дыхательных путях и других орга-нах. Области телеангиэктазий легко ранимы,вследствие чего у пациентов возникают носовые ижелудочно-кишечные кровотечения.

Причиной заболевания является мутация рас-положенного в 9-й хромосоме гена эндоглина -белка, участвующего в ангиогенезе и репарациитканей. Распространенность заболевания состав-ляет 1:2500-40 000 человек.

Специфических изменений при исследованиисвертывающей системы крови нет, однако бо-лезнь Рэндю-Ослера-Вебера может сочетаться сболезнью Виллебранда.

Диагностика гематомезенхимальных диспла-зий основана на сочетании тщательного клини-

ческого обследования пациента и комплекса ла-бораторных методов.

Спектр лабораторных исследований, применя-емых для уточнения характера патологии гемос-таза, очень широк. Помимо обязательного прове-дения скрининговых тестов, в диагностическуюпалитру необходимо включить исследование фун-кции тромбоцитов (агрегация с различными ин-дукторами, исследование адгезии тромбоцитов,определение доступности фактора 3 тромбоцитов,тест ретракции кровяного сгустка), при исследо-вании плазменных белков системы свертываниякрови обязательно исследование концентрациифибриногена по Клауссу, анализ процесса аутопо-лимеризации фибриновых мономеров, активнос-ти фактора Виллебранда в тестах ристоцетин-ко-факторной активности и коллаген-связывающейактивности. При наличии нарушений в скринин-говых тестах необходимо проведение углубленно-го исследования соответствующего звена гемоста-за. Помимо анализа состояния системы гемоста-за, при гематомезенхимальных дисплазиях пока-зано проведение исследования структуры колла-гена и молекулярно-генетическое исследование.

Нарушения структуры коллагена

Синдром Элерса-Данлоса, синдром Марфа-на могут сопровождаться геморрагическим син-дромом различной тяжести. Лабораторные нару-шения при этой патологии могут отсутствовать.Однако может быть удлинение времени кровоте-чения, умеренное нарушение функции тромбоци-тов, признаки дисфибриногенемии.

Кровотечения, связанные с массивнойкровопотерей

Быстрая массивная кровопотеря - нередкоеосложнение тяжелых травм и патологическихродов; она может осложнять операции трансплан-тации органов, оперативное лечение сердечно-со-судистой патологии и рака. Это состояние можеттребовать массивных гемотрансфузий (более чем1 ОЦК в сутки). При кровопотере интенсивнос-тью 1 ОЦК менее чем за 2 часа могут возникатьсерьезные нарушения гемостаза.

Имеется несколько патогенетических факто-ров этих нарушений.


Наиболее распространенная клиническаяпроблема - разведение плазменных компонентовгемостаза и тромбоцитов вводимыми плазмоза-менителями. Использование коллоидных и крис-таллоидных растворов, эритроцитарной массы,разведенной изотоническим солевым растворомВ гематокрита 60%, при массивной гемотранс-фузии приводит к значительному снижению ак-тивности компонентов гемостаза.

Одним из следствий массивной кровопоте-ри и массивной заместительной терапии явля-ются тромбоцитопения и тромбоцитопатия,возникающие вследствие быстрой внутрисосу-дистой активации тромбоцитов продуктамидеградации фибрина/фибриногена, разведенияи секвестрации тромбоцитов в сосудистом рус-ле на фибриновых депозитах. В случаях массив-ной кровопотери при тяжелой травме, особен-но головы и мозга, гипотонии с гипоксией иацидозом, бактериальном сепсисе, прежде-временной отслойке плаценты может развить-ся ДВС-синдром.

Рекомендуемые лабораторные тесты для кон-троля состояния гемостаза при массивной крово-потере и массивных гемотрансфузиях: ПТ, АЧТВ,фибриноген, гематокрит, количество тромбоци-тов, ПДФ, D-димеры, тест лизиса эуглобулино-вого сгустка.

Нарушения гемостаза,связанные с патологией почек

До начала использования гемодиализа крово-течения были серьезным осложнением у пациен-тов с хроническим поражением почек. Однакодаже при систематическом проведении гемодиали-за примерно у половины больных с хроническойпочечной недостаточностью имеются такие про-явления, как пурпура, меноррагии, носовые кро-вотечения, реже кровотечения из желудочно-ки-шечного тракта. Тяжелые кровотечения у даннойгруппы пациентов, как правило, связаны с трав-мой или оперативным лечением, тем не менее ге-моррагический синдром осложняет их ведение и вдругих ситуациях.

Патофизиологические механизмы, приво-дящие к геморрагиям у пациентов с хроничес-кой почечной недостаточностью, в основномсвязаны с явлениями уремии. У этих пациентов

выявляются значительные нарушения тромбо-цитарно-сосудистого взаимодействия. Однимиз возможных механизмов является повышениесинтеза и экспрессии оксида азота эндотелием.Определенный вклад вносит анемия; патогене-тические механизмы этого неясны, однако пос-ле трансфузии эритроцитарной массы уменьша-ется время кровотечения и геморрагическийсиндром.

Еще одним патогенетическим фактором по-вышенной кровоточивости при хронической по-чечной недостаточности является тромбоцитопе-ния, которая довольно часто бывает у таких па-циентов.

Процедура гемодиализа сопровождаетсяприменением гепарина. Остаточное его количе-ство может вносить вклад в геморрагическиепроявления.

Лабораторные данныеУ пациентов с уремией часто удлинено время

кровотечения. Степень удлинения может варьи-ровать от незначительной до очень большой.Агрегация тромбоцитов может быть снижена,однако ее снижение не коррелирует с тяжестьюгеморрагических проявлений. Другие скрининго-вые тесты (ПТ, АЧТВ, тромбиновое время, фиб-риноген) могут быть нормальными или немногоудлинены.

У пациентов с нефротическим синдромом,особенно у детей, изменение скрининговых тес-тов возникает даже без уремии за счет потери ф.IХи ф.ХII через почки.

Тромботические проявления у пациентов споражением почек ассоциируются с нефротичес-ким синдромом, гипергомоцистеинемией и гепа-рин-индуцированной тромбоцитопенией.

Амилоидоз

Около 10% пациентов с системным амилои-дозом имеют выраженный геморрагический син-дром. Безусловно, кожный гемосиндром у нихможет быть связан с повышением хрупкости со-судов в связи с отложением амилоида в их стен-ках и в периваскулярном пространстве. Крометого, у этих больных имеются также системныедефекты гемостаза, в первую очередь - снижениеактивности ф.Х. Вероятной причиной этого яв-ляется адсорбция ф.Х на амилоиде. Активность


ф.Х в плазме пациентов с амилоидозом может со-ставлять 2-4% от нормальных значений.

При данном заболевании также отмечаетсяусиление системного фибринолиза. Полностьюмеханизм этого процесса не раскрыт. Происхо-дит снижение оц-антиплазмина, видимо, тоже засчет адсорбции его на амилоиде. Описано повы-шение в плазме активаторов плазминогена и сни-

жение ингибитора активатора плазминогена-1.Наконец, имеются единичные описания развитияспецифического ингибитора к ф.VIII.

Лабораторная диагностика включает стан-дартные тесты скрининга (ПТ, АЧТВ, ТВ, фиб-риноген, время кровотечения, количество тром-боцитов), помимо этого, рекомендуется прово-дить исследование рептилазного времени.

Тромботические заболевания

Тромбоцитоз

Увеличение содержания тромбоцитов в сыво-ротке свыше 400 х 109/л определяется как тром-боцитоз. Тромбоцитоз возникает при миелопро-лиферативных заболеваниях, злокачественных со-стояниях (рак, болезнь Ходжкина, лимфомы),воспалениях (ревматоидный артрит, язвенныйколит, туберкулез, остеомиелит), после удаленияселезенки (2 месяца) и при другой патологии.Тромбоцитоз - компонент острофазной реакции.Эссенциальная тромбоцитемия - миелопролифе-ративное заболевание. Состояние после спленэк-томии объясняется удалением основного местаразрушения тромбоцитов. Увеличенное содержа-ние тромбоцитов может привести к артериально-му или венозному тромбозу.

Тромбофилии. Общее представление

Проблема патологического тромбообразова-ния - одна из важнейших терапевтических проблемв развитых странах. Ишемическая болезнь серд-ца, тромбоэмболия легочной артерии (ТЭЛА),тромбозы глубоких вен - патологические состоя-ния, приводящие к тяжелой инвалидности и гибе-ли человека. При лечении таких пациентов лабо-раторный контроль состояния гемостаза - важней-ший фактор успеха.

Артериальные и внутрисердечные тромбы,образуясь в условиях высокой скорости кровото-ка, состоят преимущественно из тромбоцитов, со-единенных фибриновыми мостиками - белыетромбы. Артериальные тромбы преимуществен-но пристеночные. Важнейшими факторами пато-генеза артериального тромба являются врожден-ная или приобретенная аномалия сосудистой

стенки и патологическая активация тромбоцитов.Наиболее частая аномалия - атеросклероз. Дру-гие состояния - это врожденные нарушения раз-вития сосудов, ангиоматозные образования, ин-фекционное поражение эндотелия, ятрогенныенарушения. Закупорка просвета артериальногососуда может наступить при увеличении тромбана фоне нарастания патологического процесса(атеросклероз) или при эмболии нижележащихболее мелких сосудов оторвавшимися элемента-ми тромба.

Венозные тромбы образуются в условиях от-носительно медленного кровотока и низкого на-пряжения сдвига, включают в себя значительноеколичество эритроцитов и большое количествофибрина. Венозные тромбы часто полностью об-турируют просвет сосуда. Основной механизмобразования венозного тромба связан с повыше-нием свертываемости крови и стазом. Если тром-боз возникает в магистральной вене, нарушениевенозного оттока может привести к венозномуполнокровию, повышению внутриорганного дав-ления, снижению притока крови, ишемии и дист-рофическим изменениям органа. При сохраняю-щемся кровотоке по тромбированной вене воз-можен отрыв части тромба и эмболия.

Патогенез тромбофилии

Как правило, тромбофилия - комбинированноесостояние, возникающее вследствие действиянескольких патогенетических факторов. Основ-ные патогенетические факторы тромбофилии: •Повреждение эндотелиальных клеток с обна-жением тромбогенных субэндотелиальныхструктур.


• Активация тромбоцитов циркулирующимиагонистами либо вследствие взаимодействиятромбоцитов с субэндотелиальными структурами или фактором Виллебранда.

• Активация свертывания крови.• Резистентность к антикоагулянтам или дефи

цит антикоагулянтов.• Снижение активности фибринолиза.• Реологические нарушения и стаз.

Эти факторы возникают на фоне целого рядапатологических состояний.

Наследственные факторы риска патологичес-кого тромбообразования (генетические дефектывыявляются у 30-50% пациентов с тромботичес-ким состоянием):• Мутация фактора V (фактор V Лейден).• Дефицит антитромбина III.• Дефицит протеина С.• Дефицит протеина S.• Мутации протромбина, в первую очередь

G20210A.• Полиморфизм тромбоцитарного рецептора

GPIIIa.• Дисфибриногенемии.• Гиперлипопротеинемия (а).• Мутация ингибитора пути тканевого факто

ра (ИВП), 536С/Т.• Гипергомоцистеинемия (у детей, как прави

ло, носит наследственный характер).• Дефекты тромбомодулина.• Мутации гена GPIIIa тромбоцитов.• PAI-1.

Приобретенные факторы патологическоготромбообразования:• Возраст.• Пороки сердца и сосудов.• Атеросклероз.• Катетеризация вен, особенно длительное на

хождение катетера в вене.• Повышение вязкости крови (полицитемия,

потеря жидкости).• Операция или травма.• Длительная иммобилизация.• Инфекция (ВИЧ, ветряная оспа, гнойный

тромбофлебит).• Аутоиммунные заболевания (волчаночный

антикоагулянт, антифосфолипидный синдром, сахарный диабет, болезнь Бехчета и др.).

• Нефротический синдром.

• Ингибиторы к протеинам S и С.• Онкологические заболевания.• Химиотерапия (L-аспарагиназа, преднизо-

лон).• Заболевания печени.• Талассемия (постспленэктомический тромбоз

печеночных вен).• Серповидно-клеточная анемия.• Прием гормональных противозачаточных

препаратов.Факторы, роль которых в развитии тромбо-

зов неясна:• Высокий уровень активности факторов VIII,

XI, XII, Виллебранда, ингибитора активатора плазминогена.

• Дефицит факторов XII, кофактора гепарина II, плазминогена, активаторов плазминогена, тромбомодулина.

Лабораторные тесты при тромбофилии

Лабораторные тесты при диагностике тром-бофилии можно сгруппировать в 2 группы:

1. Маркеры активации. Повышение концентрации этих маркеров является признаком высокой активности образования фибрина, но не предоставляет информации о причинах гиперкоагуляции. Эти тесты дают возможность решить вопрос о назначении антикоагулянтов.

2. Тесты на выявление причин тромбофилии.Эти тесты проводятся для выяснения причинтромбофилии. Они не дают представления о риске развития тромбоза в момент исследования.Часто эти тесты проводятся после постановки тестов 1-й группы и купирования тромбоза. К сожалению, далеко не во всех случаях удается установить причину тромбофилии.

Маркеры активации - индикаторы тромбоза,их повышение в сыворотке свидетельствует, чтопроисходит активация тромбина. Казалось бы, чторезонно измерять сам тромбин в сыворотке, одна-ко после образования тромбин в течение 15 с инак-тивируется, главным образом за счет образованиякомплекса тромбин-антитромбин (ТАТ). Марке-ры активации представлены на рис. 136.

Время появления маркеров активации коагу-ляции неоднозначно:• Ранними маркерами активации тромбина яв

ляются F1+2 и ТАТ.


Рис. 136. Маркеры активации коагуляции. К ним отно-сятся: фрагменты протромбина 1 + 2 (F1 + 2), тромбин-ан-титромбиновый комплекс (ТАТ), фибрин-мономеры, фибри-нопептид А (ФПА), фактор 4 тромбоцитов (PF4), р-тромбо-глобулин ((3-TG), D-димеры

• Непосредственно в момент образования сгусткаопределяют фибрин-мономеры (ФМ) и ФПА.

• Поздними маркерами, возникающими послеобразования фибрина, являются D-димеры,которые представляют собой одновременномаркеры фибринообразования и фибриноли-тической активности.Маркеры активации имеют разный период

полувыведения (t1/2) из системы циркуляции:- ФПА - 3-5 минут (быстро выводятся через

почки);- ТАТ- 15 минут;- F1+2-90 минут;- D-димеры - несколько часов;- ФМ - несколько часов (комплексы фибрин-мономеров перераспределяются в организмев зависимости от их количества).Клиническое значение определения этих маркеров различно (см. раздел «Тесты активации свертывания крови»), что во многом определяется процессами их появления, способами удаления из системыциркуляции, а также преаналитическими факторами и аналитическими возможностями лабораторий.

Маркеры тромбофилии

Мутация фактора V (фМ Лейлен, Leiden)

Мутация фактора свертывания крови V былаописана в 1993 году в семьях с патологическойустойчивостью к действию протеина С. При изу-чении этого феномена выяснилось, что пример-но в 95% случаев патология была вызвана точеч-ной заменой аргинина на глутамин в позиции 506гена ф.V. ф.V Лейден - наиболее распространен-ный в европейской популяции протромботичес-кий дефект. Частота гетерозиготного наследова-ния у европейцев колеблется от 2 до 16%. Гомози-готы по этой мутации встречаются гораздо реже,примерно в 0,1%. В африканской, американской,австралийской (аборигены) и азиатской популя-ции эта мутация практически отсутствует. По рас-четам гетерозиготное носительство гена ф.У Лей-ден увеличивает риск развития тромбоза в 5-10 раз,а гомозиготы по этой мутации имеют риск раз-вития тромбоза в 80 раз больше, чем лица, не стра-дающие тромбофилией. Тромботические прояв-ления у лиц с ф.V Лейден, как правило, впервые

возникают в пубертатном возрасте с расчетнойчастотой 0,28%. Тромбозы, ассоциированные сф.У Лейден, в первую очередь затрагивают веноз-ную систему. Наиболее характерная локализациятромбозов, ассоциированных с этой мутацией -поверхностные и глубокие вены конечностей,тромбозы церебральных вен. Риск тромбозовповышается при приеме оральных контрацепти-вов, при развитии антифосфолипидного синдро-ма (наличие аутоантител к фосфолипидам илибелкам, связанным с фосфолипидами, таким, какпротеины С и S, протромбин, α2-гликопротеин I идр.), при дефиците одного из ингибиторныхбелков, таких, как протеин С, протеин S или ан-титромбин. Фактор V Лейден часто обнаружива-ется у женщин с хроническим невынашиваниембеременности. Спонтанные аборты у них возни-кают на поздних сроках и связаны с характернымдля этих сроков повышением С4-СП и функцио-нальным гипофибринолизом, что в сочетании сРАПС приводит к тромбозу сосудов плаценты.Риск тромбоэмболии легочных артерий у лиц с


ф.V Лейден, по сравнению с общей популяцией,повышается незначительно. У детей и лиц моло-дого возраста тромбозы возникают при присое-динении дополнительных факторов риска (инфек-ционных заболеваний, болезни Пертеса, Бехчета,при ДЦП, порэнцефалии и др.), не связанных свозрастом.

Лабораторная диагностика: определение по-вышения резистентности к протеину С, молеку-лярный анализ гена ф.V. Мутация Лейден адек-ватно выявляется методом полимеразнои цепнойреакции (ПЦР).


Больной 15 лет. Заболел остро, появилисьболи в поясничной области, дизурические прояв-ления. Предъявлял жалобы на частые головныеболи и подъем артериального давления.

Клиническое обследование: проведена аорто-графия, селективная ангиография культи правойпочечной артерии (правая почка значительноуменьшена в размерах). Правая почечная артерияокклюзирована в средней трети, уменьшена в диа-метре. На экскреторной урографии - отсутствиефункции правой почки. На ангиосцинтиграфиипочек выявлен двусторонний нефроптоз. При эхо-кардиоскопии выявлено пролабирование мит-рального клапана II степени и аневризматичес-кое выпячивание в области овального окна.

При исследовании общего анализа крови вы-явлена умеренная полиглобулия (гемоглобин -159 г/л), в анализе мочи - протеинурия. При ис-следовании системы гемостаза найдено снижениерезистентности фактора Va к активированному

протеину С (НО = 0,52, контроль 1,10 ± 0,02).Спонтанная агрегация тромбоцитов - 22% (кон-троль до 20%), АДФ-агрегация - 86% (контроль60-71%), адреналин-агрегация - 94%о (контроль69-75%), коллаген-агрегация - 76%о (контроль 60-70%). Волчаночный антикоагулянт не обнаружен.Другие показатели гемостаза нарушены не были.

Таким образом, у больного выявлено: пост-тромботическая окклюзия правой почечной ар-терии. Вторично сморщенная почка. Вазоре-нальная гипертония, гематогенная тромбофилиясложного генеза: резистентность фактора Va кпротеину С, тяжелая форма, гиперагрегацион-ный синдром, вторичная ренальная полиглобу-лия. Учитывая молодой возраст пациента, мож-но предположить врожденный характер тромбо-филии.

Выявленные изменения позволили составитьплан профилактики рецидивов тромбозов в те-чение жизни. В связи с резистентностью к проте-ину С назначение непрямых антикоагулянтов непроводилось.

Дефицит протеина С

Несмотря на то что первые описания дефи-цита ПС появились с начала 80-х годов XX века,до сих пор в литературе имеются противоречи-вые сведения о характере наследования и зна-чении разных форм в патогенезе тромбообра-зования. До последнего времени предполага-лось, что дефицит ПС наследуется по аутосом-но-доминантному типу с неполной пенетрант-ностью. Однако в последние годы было пока-зано, что наследование осуществляется по ауто-сомно-рецессивному типу, что одна и та же му-тация гена ПС может встречаться у лиц с тром-ботическими эпизодами из семей с наследствен-ной тромбофилией и у родственников, не име-

ющих клинических проявлений, но являющих-ся носителями мутации. Выделяют 2 типа дефи-цита ПС:• Тип I (гипоформа) - количественный дефи

цит с пропорциональным снижением антигена и активности ПС.

• Тип II (дисформа) - качественный дефект, прикотором на фоне сниженной активности антиген ПС нормальный.Расчет показал, что гетерозиготное носитель-

ство гена дефицита ПС повышает риск венозно-го тромбоза в 7 раз. Частота мутации у здоровыхлиц составляет 0,2-0,3%, у отдельных пациентовс эпизодами тромбоза глубоких вен дефицит ПСвстречается в 3% случаев, а в семьях с наследствен-ной тромбофилией - 6%.


Значение дефицита ПС, как изолированногодефекта в патологическом тромбообразовании,также дискутируется. Видимо, в детстве тромбо-зы развиваются у лиц с гомозиготным носитель-ством. При сочетании с другими дефектами дажегетерозиготное носительство дефицита ПС при-водит к возникновению тромботических эпизо-дов в детском возрасте. Были описаны сочетанияс дефектом ф.V Лейден. По некоторым даннымэто сочетание встречается в 20% семей с наслед-ственной тромбофилией и дефицитом ПС. Дефи-цит ПС встречается как при артериальных, так ипри венозных тромбозах. Тромботические про-

явления у пациентов с изолированным гетерози-готным дефицитом ПС, как правило, начинают-ся после 15 лет. Для пациентов с глубоким дефи-цитом ПС при гомозиготном носительстве харак-терны тяжелые ранние тромботические проявле-ния в виде неонатальной фульминантной пурпу-ры или ДВС-синдрома в первые дни жизни при ак-тивности ПС <1%. Это состояние практически несовместимо с жизнью. Если активность ПС состав-ляет 5-25%, то рецидивирующие эпизоды тромбо-эмболии проявляются позже.

Лабораторная диагностика: определение ак-тивности и антигена протеина С.


Больная 34 лет. Обратилась в гематологичес-кий центр 10 лет назад по поводу привычного не-вынашивания беременности и возникновения наее фоне тромбозов вен нижних конечностей. Изанамнеза заболевания установлено, что на сроке12-14 недель развился острый илеофеморальныйфлеботромбоз слева, по поводу которого прове-дена тромбэктомия, назначено лечение гепари-ном, непрямыми антикоагулянтами. На сроке 16-17 недель возникли схваткообразные боли внизуживота с самопроизвольным выкидышем. Двепредыдущие беременности закончились выкиды-шами при сроке 6-8 недель. Во время четвертойбеременности развился тромбоз глубоких вен бед-ра и голени справа, осложнившийся ТЭЛА. Бе-ременность прервалась на сроке 12-13 недель пос-ле проведения пликации нижней полой вены.При исследовании гемостаза обнаружены :

АПТВ - 35 с (контроль 39 с), ПВ - 16 с (норма 16 с),тромбиновое время - 15 с (контроль 15 с), фиб-риноген - 3,5 г/л. При повторных исследовани-ях отмечался повышенный уровень РФМК вплазме - от 4,5 до 6,0 мг% (норма 3,5 мг%), за-медление ХИ-зависимого фибринолиза от 12 до20 минут (контроль 6 минут), высокий уровеньспонтанной агрегации тромбоцитов - от 30 до38% (контроль до 20%). Активность АТIII -120%, протеина S - 105%, протеина С при повтор-ном определении клоттинговым методом - от 30до 43%, при использовании хромогенных субстра-тов активность протеина С составила 30%. Послепроведенного обследования у больной вновь на-ступила беременность, в течение всего срока ко-торой она получала антитромботическую терапиюфраксипарином. Беременность закончилась в 39-40 недель родами здорового ребенка. Учитывая ха-рактер тромбофилии, от назначения непрямых ан-тикоагулянтов воздержались.

Дефицит протеина S

Описания дефицита ПS, как причины тромбо-филии, появились в конце 1984 года. Наследованиедефекта происходит по аутосомно-доминантномупути с неполной пенетрантностью. К настоящемувремени описано более 70 генетических дефектов упациентов с дефицитом ПS. ПS в плазме присут-ствует в двух видах - свободный (примерно 40% отобщего) и связанный с С4-связывающим протеином(60% соответственно). Свободный ПS является ак-

тивным антикоагулянтом, его уровень коррелиру-ет с клиническими симптомами тромбоза.Выделяют три типа дефицита ПS:• Тип I - количественное снижение ПS (про

порциональное снижение активности и антигена ПS).

• Тип II - качественный дефект (сниженная активность при нормальном или непропорционально сниженном антигене).

• Тип III - снижение свободного ПS при нормальном общем.


Частота дефицита ПS у больных с венозны-ми тромбозами составляет 1-2%, в семьях с на-следственной тромбофилией - 6%. Частота мута-ции в популяции неизвестна; по расчетам она со-ставляет 1:33 000.

Тромбозы у пациентов с изолированным ге-терозиготным носительством, как правило, впер-вые проявляются у взрослых. Однако сочетаниедефицита ПS с другими факторами, предраспо-лагающими к тромбозам, приводит к более ран-ним эпизодам патологического тромбообразова-ния. Гомозиготное носительство встречаетсячрезвычайно редко. К настоящему времени опи-сано только 2 пациента с проявлениями, анало-гичными проявлениям при гомозиготном носи-тельстве дефицита ПС. Значение гетерозиготно-го носительства в патологическом тромбообра-зовании изучается. По разным данным гетерози-готное носительство может увеличивать рисктромбоза в 1,5-6-10 раз. При этом основную рольиграет уровень свободного ПS.

Описаны случаи появления вторичного инги-битора к протеинам С и S, которые клиническипроявляются аналогичным образом. Причинамивторичного дефицита ПS могут быть заболева-ния печени, передозировка непрямых антикоагу-лянтов, дефицит витамина К, заболевания почек,коагулопатия потребления, беременность, дли-тельные лихорадки, сопровождающиеся остро-фазной реакцией с повышением С4-связывающе-го протеина.

Лабораторная диагностика: исследование ак-тивности свободного ПS, антигена ПS

Мутация протромбина 20210А

Описана в 1996 году Poort с соавторами. То-чечная мутация (аденин замещен гуанином) в по-зиции 20210 3' нетранслируемого региона генапротромбина, что приводит к повышению уров-ня протромбина (сам протромбин не изменен) вкрови и ассоциируется с повышенным рискомтромбообразования. Каких-либо других измене-ний со стороны протромбина при этой мутациивыявить не удалось. Расчетная частота этой му-тации в европейской популяции составляет 2-3%,а в средиземноморском регионе - 4-5%. У лиц сэпизодами венозных тромбозов, особенно тром-бофлебитов нижних конечностей, протромбин

20210А встречается в 6—10% случаев. От 4 до 8%>пациентов с впервые выявленным тромбозом глу-боких вен имеют эту мутацию. Роль этой мута-ции в развитии артериальных тромбозов изуча-ется. Гомозиготные носители этой мутации ред-ки. Гетерозиготное носительство по расчетамповышает риск венозного тромбообразования в2-3 раза. Как правило, первые эпизоды тромбо-зов возникают у взрослых и связаны с присоеди-нением возрастных факторов риска. Особенносильно риск тромбофилии возрастает при соче-тании этой мутации с другими факторами рискасердечно-сосудистых заболеваний - курениеммолодых женщин, ожирением, гипертонией, са-харным диабетом.

Лабораторная диагностика: молекулярныйанализ гена протромбина.

Дефицит антитромбина

Первое сообщение о дефиците AT, как о фак-торе риска патологического тромбообразова-ния, было сделано в 1965 году Egeberg. В насто-ящее время описано более 80 мутаций гена AT.Наследование - аутосомно-доминантное с не-полной пенетрантностью. Выделяют два типадефицита AT:• Tun I - количественный дефект, приводящий

к пропорциональному снижению активностии антигена AT:- подтип Iа - снижение синтеза AT;- подтип IЪ - увеличенная скорость распа

да (выведения).• Тип II - качественный тип, характеризуемый

снижением активности при нормальном антигене AT:- подтип Па - дефект активного центра (из

мененное свойство реактивировать тромбин) и участка связывания гепарина (измененная реактивность с гепарином);

- подтип IIb - дефект активного центра;- подтип IIе - дефект участка связывания

гепарина.При II типе функциональный дефицит AT воз-

никает в результате различных мутаций, требуют-ся дополнительные исследования, в частности оп-ределение гепарин-связывающих свойств AT.

Гомозиготных носителей гена дефицита ATне описано: предположительно эта мутация не


совместима с жизнью, дети погибают внутриут-робно или вскоре после рождения. Однако былиописаны гомозиготные носители дефекта связы-вания AT с гепарином. Гетерозиготное носитель-ство встречается у 0,05-1% здоровых лиц в попу-ляции, у 1% лиц с первым в семье случаем веноз-ного тромбоза и в 4% семей с наследственнойтромбофилией.

Вторичное снижение AT может иметь местопри лечении гепарином или НМГ (фрагмин,фраксипарин, ловенокс, клексан), заболеванияхпечени, нефротическом синдроме, лечении L-ac-парагиназой, эстрогенами, при коагулопатияхпотребления. Уменьшение активности AT на 25-30% сопровождается развитием гепаринорезис-тентности, что может вызвать появление рико-шетных тромбозов. На неэффективность антикоа-гулянтного действия гепарина указывает отсут-ствующее удлинение АЧТВ, персистенция и дажеповышение фибринопептидов А и В или другихмаркеров активного фибринообразования. Еслиже имеет место дефицит или врожденная анома-лия AT, то антикоагулянтный эффект гепаринабудет изначально ослаблен. Во всех этих случаяхнеобходим контроль за активностью AT в плаз-ме. При значительном дефиците AT и высокомриске тромбозов показано введение больным кон-центратов AT или инфузия свежезамороженнойплазмы.

AT иногда рассматривается как отрица-тельный реактант острой фазы воспаления, уро-вень его снижается при инфекциях. Активность AT(но не его концентрация) существенно умень-шается при инсулин-зависимом сахарном диа-бете I типа, причем снижение активности ATкоррелирует с уровнем гликирования плазмен-ных белков.

Расчетное повышение риска тромбообра-зования у лиц с гетерозиготными мутациямигена AT - 5-10 раз. Сроки начала первых про-явлений и тяжесть течения заболевания во мно-гом зависят от остаточной активности AT и со-четания этого дефекта с другими факторамитромбофилии.

Тромбозы при дефиците AT локализуютсякак в венозной, так и в артериальной системе.

Лабораторная диагностика: определениеактивности AT хромогенным методом, а такжеантигена AT.

Гипергомоцистеинемия

Гомоцистеин - аминокислота, производноеметионина, в клетке имеет два пути метаболиз-ма (рис. 137): 1) реметилирование в метионин сучастием ферментов метионинсинтазы (кофак-тором является кобаламин), 5,10-метилентетра-гидрофолатредуктазы и бетаинметионинметил-трансферазы; 2) транссульфирование в цистеинс участием цистатионинсинтазы, кофакторомкоторой является пиридоксин. В плазме гомоци-стеин окисляется в дисульфиды и смешанныедисульфиды и находится как в свободной, так ив связанной с белком форме (общий гомоцисте-ин). Нормальная концентрация в плазме состав-ляет 5-16 мкмоль/л.

У взрослых лиц гипергомоцистеинемия(ГГЦ) может быть врожденным и приобретен-ным дефектом, у детей, как правило, - следствиедефицита ферментов, метаболизирующих гомо-цистеин. Наиболее тяжелые формы ГГЦ связа-ны с дефектом цистатионин-бета-синтазы. Час-тота ее гомозиготного носительства среди насе-ления составляет от 1:200 000 до 1:335 000, гете-розиготное - встречается в 0,3-1,4%. Полимор-физм метилентетрагидрофолатредуктазы широ-ко распространен в европейской популяции. Ге-терозиготное носительство, по некоторым дан-ным, встречается у 60% лиц европеоидной расы.Гомозиготный полиморфизм, по разным дан-ным, - у 5-15%. Гораздо реже встречаются де-фекты других ферментов, метаболизирующих го-моцистеин.

Умеренное повышение гомоцистеина в кро-ви выявляется примерно в 10% случаев всех ве-нозных тромбозов. Рассчетное повышение рискатромбообразования составляет 2,5 раза. Тяжелаягипергомоцистеинемия (с уровнем гомоцистеинаболее 100 мкмоль/л) ассоциируется с рецидиви-рующими артериальными и венозными тромбо-зами, проявляющимися с детства. Приобретеннаягипергомоцистеинемия связана с недостаточнымпоступлением с пищей кобаламина, фолиевойкислоты или пиридоксина, применением лекар-ственных препаратов, нарушающих функции фер-ментов или обмен витаминов.

Для гипергомоцистеинемии характерно воз-никновение как артериальных, так и венозныхтромбозов. Патогенез развития тромбофилии при


Рис. 137. Метаболические пути сучастием гомоцистеина в тканях.Знаком X обозначены генетическиедефекты, связанные с нарушениемобмена гомоцистеина и развитиемтромбоэмболических осложнений.При недостаточности фермента ци-статионин-р-синтазы происходит на-рушение превращения гомоцистеинав цистеин. У таких больных при выра-женной гомоцистеинемии и гомоци-стеинурии развиваются тромботичес-кие нарушения с тромбозами в верх-нем сагиттальном синусе, нижнейполой вене, портальной вене, а так-же окклюзия почечных, мозговых и ко-ронарных артерий. Морфологичес-кие изменения сосудистой стенкисходны с атеросклеротическими. Примутации гена МТГФР наблюдаетсястойкая гипергомоцистеинемия, вы-сок риск развития сердечно-сосуди-стых заболеваний и склонность к тром-бообразованию, МТГФР - метилентет-рагидрофолатредуктаза, МАТ - мети-онинаденозилтрансфераза

гипергомоцистеинемии изучен недостаточно.Есть данные, что происходит нарушение антико-агулянтных свойств эндотелия за счет десквама-ции эндотелиальных клеток, снижения экспрес-сии тромбомодулина и гепарансульфатов, ПГI2,ингибируется тканевой активатор плазминогена,активируется экспрессия тканевого фактора иф.Х. Кроме того, вторичные производные гомо-цистеина (например, гомоцистеин-тиолактон),уровень которых в крови возрастает при гипер-гомоцистеинемии, вызывают активацию тромбо-цитов и выделение ТхА2. Активно обсуждаетсяповреждающий механизм оксидативного стресса,возникающего при гипергомоцистеинемии и при-водящего к неферментативным окислительно-вос-

становительным реакциям. В процессе окислениясульфгидрильных групп гомоцистеина и гомоци-стеин-тиолактона образуются перекисные анионы(O- , ОН-) и Н2О2, которые инициируют перекис-ное окисление липидов. Это сопровождается по-вреждением мембран эндотелиальных клеток иобразованием окисленных липопротеидов. Пере-кисные радикалы могут переводить вазодилататорNO в форму пероксинитритов OONO- (NO-), необладающих вазодилататорными свойствами.

Лабораторная диагностика: исследованиесодержания гомоцистеина в плазме, молекуляр-ный анализ генов, участвующих в метаболизмегомоцистеина, в том числе метилентетрагидрофо-латредуктазы.



Больной 20 лет. Заболел остро. На фонеудовлетворительного самочувствия после незна-чительной физической нагрузки появились болив левой голени, через сутки - отек голени, через4 дня отек распространился на бедро, боли уси-лились.

В семейном анамнезе: у бабушки по отцу -тромбозы глубоких вен нижних конечностей, упрадедушки - острый инфаркт миокарда, у де-душки - ишемический инсульт, у отца - тромбозглубоких вен нижних конечностей.

Обследование: на ретроградной илеокавагра-фии определялся тромбоз илеофеморального сег-мента слева с пристеночным тромбозом нижнейполой вены. Дальнейшее обследование выявило:правосторонний нефроптоз II степени, системнаяангиодисплазия - увеличенный диаметр вен, дис-

плазия органных протоков (печени, поджелудоч-ной железы). Была начата антикоагулянтная те-рапия.

При исследовании системы гемостаза былвыявлен гиперагрегационный синдром (спонтан-ная агрегация тромбоцитов составила 32%, приконтрольном показателе - до 20%, стимулирован-ная агрегация на АДФ - 90%, адреналин - 94%,коллаген - 92%). Дополнительно обнаружен по-вышенный уровень гомоцистеина в сыворотке -12,6 мкмоль/л.

Таким образом, у больного выявлена гема-тогенная тромбофилия с умеренной гипергомо-цистеинемией и гиперагрегационным синдромом.Из анамнеза можно сделать вывод о семейном(наследственном) характере тромбофилии.

Назначена специфическая антикоагулянтнаятерапия, даны рекомендации по долгосрочнойпрофилактике тромбозов.

Гиперлипопротеинемия (а)

Липопротеид (а) [ЛП(а), Lp(a)] - липопроте-ид-ассоциированный антиген. Апо(а) - апопро-теин, состоящий из 4529 аминокислот; соединя-ясь с липопротеидом низкой плотности (ЛПНП)дисульфидным мостиком, образует ЛП(а). ЛП(а) -сходная с ЛПНП, обогащенная ХС и белком час-тица, содержит молекулу Апо(а) в дополнение кмолекуле Апо-В (рис. 138).

Концентрация ЛП(а) в сыворотке широковарьирует от 2 до 1200 мг/л. Особый интереспредставляет выявление сходства в аминокис-лотной последовательности Апо(а) и плазмино-гена. Плазминоген содержит 791 аминокислоту,включая пять богатых цистеином последователь-ностей из 80-114 аминокислот каждая, называе-мых «kringle», и участок обладающей активнос-тью сериновой протеазы. Апо(а) содержит 37 ко-пий 4 «kringle» плазминогена, за которыми сле-дует 5-й «kringle» и участок протеазы. Апо(а),тем не менее, не обладая ферментативной актив-ностью сериновой протеазы, не способен превра-щаться в активный плазминоподобный фермент.Увеличение концентрации ЛП(а) в крови счита-ют независимым фактором риска атеросклеро-за и инфаркта миокарда. Концентрация ЛП(а)выше 300 мг/л связана с 2-кратным повышениемриска ИБС и 5-кратным увеличением риска ИБС,

если одновременно повышена концентрацияЛПНП. У детей выраженная гиперлипопротеи-немия также может приводить к развитию ате-росклероза и ранним проявлениям атеротромбо-за. Последние данные указывают, что гиперли-

Рис. 138. Липопротеид (а) имеет в структуре Апо(а) и Апо-В-100, которые соединены между собой дисульфиднымимостиками. Апо(а) имеет структурное сходство с плазми-ногеном, что, вероятно, определяет связь между атероге-незом и тромбозом


попротеинемия является независимым факторомриска венозного тромбогенеза у детей. Причи-на атерогенности ЛП(а) выяснена не до конца.Наиболее вероятно, что атерогенность обуслов-лена высокой способностью ЛП(а) взаимодей-ствовать с белками клеточного матрикса, таки-ми, как фибронектин и протеогликаны. Образу-ющиеся комплексы активно поглощаются моно-цитами, макрофагами и гладкими мышечнымиклетками, в результате клетки трансформируют-ся в пенистые. ЛП(а) может ингибировать фиб-ринолиз, повышая риск развития тромбоза и ате-росклероза. Структурное сходство между Апо(а)и плазминогеном, возможно, и определяет связьмежду атерогенезом и тромбозом. В то же времяпрямого влияния ЛП(а) на развитие тромбофи-лии не показано, однако повышенный уровеньЛП(а) существенно увеличивает вероятностьпроявления тромбофилии в комбинации с дру-гими факторами риска.

Лабораторная диагностика: определение ко-личества ЛП(а) иммунохимическими методами(турбидиметрия, нефелометрия и др).

Высокая активность фактора VIII и фактораВиллебранда

Значение высокой активности ф.УШ и vWF,как независимого фактора риска патологическо-го тромбообразования, изучается. Примерно у25% пациентов с венозными тромбозами выявле-но повышение ф.VIII. У 16% лиц с тромботичес-кими эпизодами выявлено повышение активнос-ти ф.VIII выше 150%. В целом при исследованииевропейской популяции у 11% людей была опре-делена активность ф.VIII выше 150%. Расчетыпоказали, что риск тромбоза у лиц с активнос-тью ф.VIII в пределах 100-150% в 2,7 раза выше,чем в среднем в популяции, а при активностивыше 150% риск возрастает в 6 раз.

В ряде работ изолированное значение высо-кой активности ф.VIII и vWF ставится под со-мнение, так как эти белки повышаются при вос-палении, а их высокая активность у лиц с тром-бозами может быть следствием посттромботи-ческого воспаления и не являться генетически де-терминированным фактором. Однако было по-казано, что высокая активность ф.VIII не кор-релирует с повышением других белков острой

фазы воспаления. Следовательно, высокая ак-тивность ф.VIII может быть независимым гене-тически детерминированным фактором рискатромбоза.

Сверхвысокомолекулярный фактор Вилле-бранда, содержащийся в депо (тромбоцитах и эн-дотелиоцитах), после выброса расщепляется доформ с нормальной молекулярной массой. Нару-шение этого процесса вследствие мутации само-го vWF или редуцирующих его молекулярнуюмассу металлопротеаз может быть причиной па-тологической агрегации тромбоцитов в кровенос-ном русле и вести к тромбозам.

Лабораторная диагностика: исследованиеактивности ф.VIII и vWF, анализ мультимеровфактора Виллебранда.

Дисфибриногенемия

Описано около 45 различных мутаций фиб-риногена, приводящих к тромботическим прояв-лениям. Протромботическая дисфибриногенемиявстречается у взрослых, имевших тромботическиеэпизоды примерно в 1% случаев. Причинами раз-вития тромбоза при тромботических дисфибри-ногенемиях являются: снижение фибринолиза из-за нарушения связи тканевого активатора плаз-миногена (t-PA) и плазминогена с аномальнымфибрином, аномальная сборка фибрина, дефектактивации плазминогена аномальным фибрином,сформированным из аномального фибриногена.

Клинически для тромботических дисфибри-ногенемий характерны венозные и артериальныетромбозы и тромбоэмболии легочных артерий.Гомозиготные дисфибриногенемии очень редкии проявляются в детском возрасте инсультами,тромбозами брюшной аорты и постоперацион-ными тромбозами.

Другие врожденные аномалии,предрасполагающиек патологическому тромбообразованию

Дефекты тромбомодулина. В некоторых ис-следованиях было показано, что около 5% семейс наследственной тромбофилией имеют дефектодного из генов ТМ. Также есть сообщения о том,что полиморфизм гена ТМ повышает риск арте-риального тромбоза, особенно в сочетании с дру-


гими факторами патологического тромбогенеза.Изучение активности ТМ затруднено из-за того,что он связан с мембраной эндотелиоцитов и от-сутствует в кровотоке.

Мутации гена тромбоцитарного рецептораGPIIIa, ингибитора активатора плазминогена. Ихзначение в развитии тромбозов, распространен-ность в популяции и механизм развития тромбо-филии изучаются, однако известно, что эта мута-ция приводит к возрастанию риска артериальныхи венозных тромбозов.

Пароксизмалъная ночная гемоглобинурия, ви-димо, может расцениваться как фактор, предрас-полагающий к тромбозам.

Возраст и атеросклероз. Чрезвычайно важ-ные факторы патологического тромбообразова-ния. По мере старения организма риск тромбо-тических осложнений значительно возрастает.Растущая атеросклеротическая бляшка вызыва-ет местную дисфункцию и десквамацию эндоте-лия с развитием атеротромбоза.

Сосудисто-тромбоцитарный гемостаз при действии факторов рискасердечно-сосудистых заболеваний

Нарушения сосудисто-тромбоцитарного ге-мостаза могут быть причиной сердечно-сосудис-тых заболеваний - ускоренного развития атеро-склероза, клинически проявляться нарушениямикоронарного, мозгового кровообращения, крово-тока в периферических органах.

Тромбоатерогенез

Липидные пятна и атеросклеротические бляш-ки на поверхности магистральных сосудов, выпи-рающие в просвет (рис. 139), приводят к резкомуувеличению сил бокового сдвига на поверхнос-ти, которые могут вызывать механическое по-вреждение поверхностного слоя гликокаликса и

деэндотелизацию с последующим пристеночнымтромбообразованием.

Особенно опасны лопающиеся атеросклеро-тические бляшки, так как в момент разрывавскрываются внутренние слои стенки, которыеобладают выраженными прокоагулянтнымисвойствами. Кроме того, активные метаболиты,выделяющиеся из адгезированных тромбоцитови лейкоцитов, могут в этот момент вызвать ло-кальный спазм, тем самым дополнительно сужаяпросвет артерии. Это сочетание - локальныйтромбоз и одновременный спазм - является при-чиной острой сосудистой, в частности коронар-ной, недостаточности и внезапной смерти.

Рис. 139. Повреждение сосудистой стенки при атерогенезе: А - липидные пятна, выпирающие в просвет аорты,Б - атеросклеротическая бляшка, поверхность которой подвергается деэндотелизации за счет сил бокового сдвига,В - лопнувшая атеросклеротическая бляшка в коронарной артерии, которая явилась причиной активного присте-ночного тромбообразования и острой коронарной недостаточности


Клинический пример 13Больной 58 лет. Атеросклероз, эндартериит

нижних конечностей. Состояние после пластикибедренной артерии с установкой протеза типа

Гортекс. В качестве профилактического средстваот повторной окклюзии протеза больной в тече-ние года принимает ацетилсалициловую кислотув дозе 0,125 1 раз в день.

Коагулограмма для решения вопроса об адекватности антиагрегационной терапии

Катетеры центральных вен

Среди приобретенных факторов риска тром-боза на первом месте у детей всех возрастов сто-ит катетеризация центральных вен. В более стар-шем возрасте значение этого фактора относи-тельно снижается, но его актуальность остает-ся. Дети с обширными тромбозами вследствиекатетеризации центральных вен имеют серьез-ный риск длительно сохраняющихся осложне-ний, включая посттромботический синдром. Вбольшинстве случаев тромбозы, связанные с ус-тановкой катетеров, возникают в системе верх-ней полой вены и в сердце. Система нижней по-лой вены может страдать при установке катете-ра в пупочную вену.

Катетер-зависимые тромбозы описывалисьдаже у лиц с гемофилией, у которых катетер на-ходился более 48 месяцев. Этот факт указываетна возрастание риска тромбоза пропорциональ-но длительности установки катетера.

Антифосфолипидный синдром и волчаночныйантикоагулянт

Термин «антифосфолипидный синдром»(АФС, английская аббревиатура - APS) исполь-зуется для обозначения состояния, сопровожда-ющегося накоплением антител против анионныхфосфолипидов (ФЛ), белков, связанных с ФЛ,

или кофакторных белков в отсутствии фосфоли-пидов. Основное проявление АФС - тромбозыразличной локализации. Часто эти антитела обо-значают как волчаночные антикоагулянты из-затого, что они изначально определены у больныхс системной красной волчанкой (СКВ, английс-кая аббревиатура - SLE - systemic lupus erythe-matosus).

Развитие волчаночных антикоагулянтовпроисходит при системных заболеваниях со-единительной ткани и ревматических заболева-ниях (СКВ, ревматоидный артрит), при первич-ном АФС, при различных инфекциях, злокаче-ственных новообразованиях, на фоне приема не-которых лекарственных препаратов (прокаина-мид, хлорпромазин, хинидин). Частота АФС уженщин и мужчин соотносится как 9:1, а при пер-вичном АФС -2:1. Клинически АФС представ-ляет собой васкулопатию, для которой характер-ны окклюзивные и тромботические пораженияартерий и вен (рис. 140). При этом отсутствуютпризнаки воспалительных и дегенеративных из-менений глубоких слоев стенки сосудов, в про-цесс вовлечен только поверхностный слой эндо-телия. Почти у 80% пациентов с АФС выявля-ются изменения в сердце и сосудах. Примерно у30% пациентов с антифосфолипидными антите-лами развиваются тромбозы, особенно часто -тромбозы глубоких вен бедра, эмболия легочной


артерии, тромбозы коронарных или мозговыхсосудов. АФС лежит в основе ряда церебровас-кулярных нарушений, синдрома Бадда-Киари,синдрома Рейно, тромботического неинфекци-онного эндокардита, асептического некроза го-ловок бедренных костей. При АФС имеетсяочень высокий риск спонтанных абортов, мерт-ворождения или внутриутробной гибели плода.Тромбоцитопения развивается у 20-25% паци-ентов с АФС, редко бывает тяжелой и почти ни-когда не осложняется кровотечениями.

Анионные фосфолипиды являются ключевы-ми компонентами основных этапов коагуляцион-ного каскада и вовлечены в регуляцию антикоа-гулянтной системы протеина С. Ранее считалось,что волчаночные антикоагулянты прямо направ-лены против фосфолипидов. Согласно последнимисследованиям плазменные белки β2-гликопроте-ин 1 (β2-GP1) и протромбин являются мощнымикофакторами взаимодействия аутоантител с фос-

фолипидной поверхностью. Структура (3 -гликоп-ротеина 1 представлена на рис. 141. Это основ-ной кофактор распознавания анионных фосфо-липидов антителами. По-видимому, β2-GPl уча-ствует в удалении анионных фосфолипидов пос-ле апоптоза клеток, тем самым предотвращаетгиперкоагуляцию.

Антифосфолипидный синдром сопровожда-ется присутствием в сыворотке аутоантителклассов IgM, IgA и IgG. Это поликлональныеантитела, которые связываются с кардиолипи-ном клеточных мембран тромбоцитов и эндо-телиальных клеток, поэтому получили названиекардиолипиновых антител. Связывание антителна поверхности эндотелиальных клеток приво-дит к активации эндотелия. В результате про-исходит гиперэкспрессия клеточных молекуладгезии, увеличивается адгезия моноцитов кэндотелию, повышается прокоагулянтная ак-тивность эндотелия, индуцируется апоптоз эн-

Рис. 140 (А, Б, В). Анти-фосфолипидный синд-ром. Всгскулопатии с окк-люзивными и тромботичес-кими поражениями вен иартерий

Рис. 141. Структурная организация (А) и функцио-нальное взаимодействие (Б) β2-гликопротеина 1 сфосфолипидной мембраной. β2-GPl - высокоглики-рованный одноцепочечный белок (250 кДа), состоящийиз 5 доменов и 326 аминокислот


дотелиоцитов. Патогенез развития тромбозапри АФС изучен недостаточно. Возможно, ан-тифосфолипидные антитела снижают анти-тромботический потенциал эндотелия за счетуменьшения экспрессии тромбомодулина (ТМ),снижения синтеза простациклина (ПГI2), ткане-вого активатора плазминогена и гепарина; по-вышают экспрессию тканевого фактора и ин-гибитора активатора плазминогена. У больныхс АФС выявлено снижение активности АТIII,протеина С, свободного протеина S, активациятромбоцитов. Мишенью для антител к кардио-липину могут явиться белки, экспрессированныена мембранах эндотелиальных клеток, такие, какрецепторы протеина С, протеина S, тромбомо-дулин. При этом повышается резистентность кактивированному протеину С (РАПС). Появле-ние антител могут индуцировать лекарственныепрепараты (фенитоин, хинин, гидралазин, про-каинамид, фенотиазины, α-интерферон, кока-ин), бактериальные и вирусные инфекции, опу-холи, частые аборты, другие повреждающиефакторы. Очень часто кардиолипиновые анти-

Клинический пример 14Больной 13 лет. Заболевание началось остро.

Без видимых провоцирующих обстоятельств лет-ним вечером ребенок почувствовал тяжесть в об-ласти правой ноги. Семейный анамнез по тром-бофилии не отягощен.

Обследование показало наличие тромбозаподколенной, глубокой бедренной и подвздош-ной вены справа.

Коагулологическое обследование: незначитель-ная тромбоцитопения 116 х 109/л, ПВ 16 с (норма),тромбиновое время 15с (норма 15-20 с), фибрино-ген 4,5 г/л, АТШ 100%, протеин С 95%, протеин S

тела появляются при ревматических заболева-ниях, системных коллагенозах, аутоиммунныхэндокринных заболеваниях.

Лабораторная диагностика антифосфолипид-ного синдрома была описана выше.

Лечение АФС включает использованиекортикостероидов, таких, как метилпреднизо-лон, непрямых антикоагулянтов, дезагрегантовили гепарина и плазмаферез. Лабораторныйконтроль за непрямыми антикоагулянтами у та-ких больных затруднен, так как используемыйтромбопластин часто чувствителен к волча-ночным антикоагулянтам.

Не все случаи АФС сопровождаются лабора-торными признаками наличия волчаночногоантикоагулянта. В то же время более чем в 20%случаев присутствия волчаночных антител в плаз-ме крови может не быть лабораторных данныхза АФС. АФС встречается у 5-15% лиц с веноз-ными тромбозами. Риск тромбоза у лиц с волча-ночным антикоагулянтом в 9 раз выше, чем всреднем в популяции.

110%, АЧТВ 45,9 с (норма 28-40 с), активность ф.IХ68%, ф.ХI 80%, ф.ХII 96%, ф.VIII 120%, скринин-говый тест на волчаночный антикоагулянт поло-жительный.

Был сделан вывод о тромбозе вследствие раз-вившегося волчаночного антикоагулянта. Имму-нологическое обследование подтвердило наличиепервичного антифосфолипидного синдрома.Проводилось продолжительное лечение антифос-фолипидного синдрома, длительно назначалисьантикоагулянты с MHO около 2 и терапия Дет-ралексом. Рецидивов тромбозов не было, тром-бированная вена реканализировалась через год.

Приобретенные состояния,предрасполагающие к развитию тромбозов.Аутоиммунные заболевания

Пациенты с аутоиммунными заболевания-ми имеют повышенный риск развития тромбо-за. Механизм этого явления изучен недостаточ-но. Возможно, явления микроваскулита и мик-ротромбозов, связанные с аутоиммунными за-болеваниями, играют роль в патогенезе тром-бофилии.

Злокачественные заболевания

Злокачественные заболевания и их химиотера-пия, в частности L-аспарагиназа, преднизолон,хорошо известны как факторы, предрасполагаю-щие к развитию тромбозов, в том числе у детей.Врожденные факторы развития тромбоза и внут-ривенные катетеры, устанавливаемые для дли-тельной терапии - дополнительные факторы рис-ка патологического тромбогенеза при злокаче-ственных новообразованиях.



Больная 43 лет.Диагноз: полипоз матки. Направляется на

оперативное лечение.Коагулологическое обследование: АЧТВ 31 с

(норма 35-45 с), ПИ 87%, ТВ 25 с (норма 28-30 с),фибриноген 7,3 г/л, РФМК 11 мг/дл (норма до4 мг/дд), лизис эуглобулиновой фракции >250 мин(норма 140-240 мин).

Заключение: на фоне значительного гипофиб-ринолиза ускорение протромбинообразования повнутреннему пути. Тромбинемия. Снижение фиб-ринолитической активности. Состояние гиперкоагуляции.

На гистологическом исследовании - злокаче-ственная опухоль.

Нефротический синдром

Риск тромбоза при нефротическом синдромедовольно высок. Частота тромбоэмболическихосложнений у детей достигает 28%, у взрослыхможет быть выше. Наиболее часто при нефроти-ческом синдроме поражаются почечные вены.Кроме того, описаны поражения артерий и вен

Клинический пример 16Больная, возраст 51 год. Находится в отделе-

нии гемодиализа.Диагноз: нефротический синдром. Повторные

тромбоэмболии легочной артерии (ТЭЛА). Про-водилась гепаринотерапия 10 000 ед/сут, отмене-на 2 дня назад.

Коагулологическое обследование: тромбоци-ты 300 х 109/л, СОЭ 45 мм/ч, АЧТВ 29 с (норма

других регионов сосудистого русла. Механизмтромбофилии, связанной с нефротическим синд-ромом, изучается. По-видимому, повышение привоспалении некоторых прокоагулянтов, таких, какфибриноген, и потеря низкомолекулярных белков,например АТIII, играют определенную роль. Наи-более часто тромбозы возникают в течение пер-вых трех месяцев после установления диагноза.

35-45 с), ПИ 98%, ТВ 32 с (норма 28-30 с), фиб-риноген 4,1 г/л, лизис эуглобулиновой фракции>250 мин (норма 140-240 мин), агрегация сАДФ 100%.

Заключение: нарушение (ускорение) протром-бинообразования по внутреннему пути. Сниже-ние фибринолитической активности. Резкое уси-ление агрегационных свойств тромбоцитов. Со-стояние гиперкоагуляции.

Прием оральных контрацептивовЭстроген-содержащие оральные контрацеп-

тивы, применяемые для регуляции менструально-го цикла, являются фактором риска развитиятромбозов. Выявлены следующие изменения ге-мостаза у женщин, принимающих эстрогены:• Относительно низкое содержание свободно

го протеина S и антитромбина, однако, какправило, в пределах нормы.

• Некоторое повышение факторов II, VII, VIII,XII и фибриногена, но тоже в пределах нормы.

• Приобретенное повышение резистентности кпротеину С, без мутации ф.V Лейдена.

• Повышение активности фибринолиза.Учитывая все перечисленные изменения,

нельзя сделать однозначного вывода о механизмеразвития протромботического состояния при при-

еме эстроген-содержащих препаратов. Тем не ме-нее прием оральных контрацептивов у взрослыхповышает риск тромбоза приблизительно в 4 раза,а при наличии врожденных факторов, таких, какф.V Лейден и мутация протромбина 20210 - в 35 и16 раз соответственно.

Инфекции

Описаны тромботические осложнения приветряной оспе в виде ДВС, фульминантной пур-пуры и различных тромбозов. В основе патоге-неза этих осложнений лежит образование специ-фических антител к протеину S. Определенныйвклад вносит волчаночный антикоагулянт. ВИЧ-инфекция также может проявляться тромбозамиразличной локализации.


Гнойный тромбофлебит внутренней ярем-ной вены, или синдром Лемьера. - редкое про-явление тромбозов у детей, однако тромбоэмбо-лические осложнения и смертность около 20%требуют своевременно распознавать это заболе-вание.

Гипофибринолиз

Недостаточность фибринолиза может бытьсвязана с:• Дефицитом тканевого активатора плазмино-

гена (t-PA), урокиназы (u-РА) или плазмино-гена.

• Нарушением освобождения t-PA из эндотелия (дефект синтеза или пула хранения).

• Повышенной концентрацией α-антиплазми-на или PAI-1.

• Дефицитом факторов контактной активации -ф.ХП, прекалликреина, высокомолекулярногокининогена, что сопровождается недостаточной активацией и-РА.Встречается (достаточно редко) врожденный

гипофибринолиз, связанный с мутацией фибри-на, у которого утеряна способность стимулиро-вать t-PA-зависимую активацию плазминогена.Этиологическая значимость этого фактора дис-кутируется. До настоящего времени отсутствуютсерьезные клинические наблюдения, подтвержда-ющие значение гипофибринолиза в развитии па-тологического тромбообразования.

Лечение тромбозов

Основная терапия тромбозов включает при-менение антикоагулянтов.

Антикоагулянты делятся на прямые и непря-мые, или антагонисты витамина К.

Прямые антикоагулянты. Гепарин

Как правило, антикоагулянтную терапиюначинают с применения гепарина. Это позволяетбыстро создать необходимый антикоагуляцион-ный потенциал и блокировать патологическоетромбообразование. При наличии данных за де-фицит AT совместно с гепаринотерапией рацио-нально использовать свежезамороженную плаз-му (СЗП) или концентраты АТIII. В настоящее

время препаратами выбора являются нефракци-онированные и низкомолекулярные гепарины(табл. 19 ирис. 50).

Лабораторный контроль терапии нефракцио-нированными гепаринами проводится на основа-нии оценки изменения АЧТВ. Хотя различныереактивы неодинаково чувствительны к гепари-ну, а изменения АЧТВ неоднозначно коррелиру-ют с его клинической эффективностью, этот тестна практике применяется наиболее часто. Приподкожном введении через сутки от начала лече-ния терапевтические дозы гепарина в крови дос-тигаются примерно у 40% пациентов, а у получа-ющих непрерывную инфузию - у 70%. При лече-нии тромбозов считается, что терапевтическаяконцентрация гепарина достигнута, если АЧТВудлинилось в 1,5-2,3 раза.

Терапия низкомолекулярными гепаринами.Особенностью низкомолекулярных гепариновявляется низкая активность в отношении тром-бина и высокая активность в отношении ф.Ха.Несмотря на высокую стоимость препаратов, онинаходят все большее применение для лечениятромбозов. Их несомненные плюсы заключаютсяв меньшем риске развития осложнений, болеедлительном периоде выведения, что позволяетвводить их 1 раз в сутки.

Лабораторный контроль терапии низкомоле-кулярными гепаринами основан на определениианти-Ха-активности плазмы (табл. 20).

Осложнения терапии гепаринами - кровотече-ния и гепарин-индуцированная тромбоцитопения.

Гепарин-индуцированная тромбоцитопениянаблюдается примерно у 2% больных, получаю-щих свиной гепарин, а при использовании гепа-рина из других источников частота ее значитель-но ниже. Механизм развития гепарин-индуциро-ванной тромбоцитопении связан с появлениемантител к комплексу гепарин - тромбоцитарныйфактор 4. Помимо тромбоцитопении, стимуляцияантителами тромбоцитарных гликопротеиновприводит к активации тромбоцитов, и может воз-никнуть тромбоз (рис. 132).

Терапия оральными (непрямыми)антикоагулянтами

Антикоагулянты непрямого действия широ-ко используются в медицинской практике для


длительной профилактики тромбозов у пациен-тов с протромботическими состояниями.

Механизм действия. Антикоагулянты непря-мого действия блокируют в клетках печени ко-нечный этап синтеза (γ-карбоксилирование) ви-тамин-К-зависимых факторов VII, X, IX, про-тромбина, а также двух антикоагулянтов - про-теинов С и S. Эти препараты действуют как кон-курентные ингибиторы витамин-К-редуктазы ивитамин-К-эпоксидредуктазы (рис. 142). Подвлиянием антикоагулянтов непрямого действияобразуются неактивные белковые молекулы фак-торов VII, X, IX и II PIVKA (PIVKA ProteinsInduced by Vitamin K Absence or Antagonists) -протеины, индуцированные отсутствием витами-на К или наличием его антагонистов. PIVKA об-ладают теми же иммунологическими свойства-ми и аминокислотным составом, что и активные

факторы, но не способны участвовать в процес-се свертывания крови. Наиболее корректное на-звание для PIVKA-белков - акарбоксибелки. Врезультате формирования акарбоксибелков сни-жается интенсивность активации протромбинаи соответственно риск развития патологическо-го тромбоза. Гипокоагуляция при использова-нии антагонистов витамина К развивается мед-ленно, эти препараты отличаются продолжи-тельным действием и обладают кумулятивнымэффектом.

Скорость снижения концентрации витамин-К-зависимых факторов зависит от периода ихциркуляции в организме: сначала уменьшаетсясодержание фактора VII (время полувыведения -t1/2 = 4-6 ч), затем IX (t1/2 = 15-30 ч), X (t1/2 = 24-40 ч) ипротромбина (t1/2 = 48-96 ч). Через 4-7 дней кон-центрация витамин-К-зависимых факторов

Рис. 142. Механизм действия антикоагулянтов непрямого действия, которые ингибируют витамин-К-редуктазу и вита-мин-К-эпоксидредуктазу в цикле восстановления витамина К. Витамин К, в свою очередь, необходим для карбоксилиро-вания глютаминовой кислоты при синтезе факторов II, VII, IX и X и протеинов С и S


устанавливается на низком, примерно одинако-вом уровне, обеспечивающем необходимый ан-тикоагулянтный эффект.

Антагонисты витамина К имеют целый рядпреимуществ по сравнению с антикоагулянтамипрямого действия (препаратами гепарина и гиру-дина), в том числе:• Препараты применяются внутрь, не требуют

инъекционного введения, поэтому могут применяться самим пациентом.

• Препараты малотоксичны и могут применяться для длительной (годы) профилактикитромбозов.

• Разработана эффективная технология мониторинга дозировок антикоагулянтов непрямогодействия на основе использования стандартизированных тромбопластинов. Использованиемеждународного стандартизованного индекса и расчета международного нормализованного отношения (MHO) позволяет однозначно интерпретировать результаты, независимоот места их проведения и используемых реактивов. Это значительно снизило риск развития у больных геморрагических осложненийи частоту случаев недостаточной эффективности препаратов.

• Создана методика контроля эффективноститерапии непрямыми антикоагулянтами поанализу цельной капиллярной крови, котораяпозволяет проводить мониторинг в амбулаторных условиях, в том числе на дому самимпациентом.

• При вторичной профилактике тромбозов вусловиях правильного мониторирования антикоагулянтов непрямого действия эффективность этих препаратов не уступает эффективности терапии прямыми антикоагулянтами.

• Стоимость непрямых антикоагулянтов нижестоимости аналогичного по эффективностикурса гепаринотерапии.

• Имеется прямая зависимость гипокоагуляци-онного эффекта от дозы препарата. Большаяширота терапевтического эффекта позволяет подбирать и поддерживать необходимуюстепень гипокоагуляции.После многих операций на коронарных со-

судах и клапанах сердца, после хирургическихвмешательств у ортопедических, онкологическихбольных необходима длительная, часто пожиз-

ненная профилактика, и антикоагулянты непря-мого действия для этого наиболее удобны.

Применяемые в настоящее время в медицин-ской практике антикоагулянты непрямого дей-ствия подразделяют на две основные группы:1) кумарины, к которым относятся дикумарол,пелентан, синкумар, варфарин (кумадин, маре-ван) и 2) индандионы, представителями которыхявляются фенилин и омефин. Препараты второйгруппы во всем мире вышли из употребления всвязи с нестабильностью их действия, токсичнос-тью, рядом серьезных побочных эффектов. Одна-ко в России и странах СНГ они все еще применя-ются, так как до недавнего времени в арсеналеотечественной фармации не было современныхстандартизированных кумаринов.

Препараты применяются per os, поэтому час-то обозначаются как пероральные или оральныеантикоагулянты. Поскольку препараты конкури-руют с витамином К за включение в ферменты,степень их действия и соотношение активных инеактивных ферментов гемостаза зависят от дозыпринимаемого антикоагулянта.

Мониторинг терапии непрямыми антикоагу-лянтами

Для мониторинга терапии непрямыми анти-коагулянтами используют определение протром-бинового времени (ПВ), результат которого вы-ражается в виде MHO - международного нор-мализованного отношения (см. раздел «Про-тромбиновое время»). ПВ следует определятьежедневно (в крайнем случае, через день) до техпор, пока не будет подобрана индивидуальнаяподдерживающая доза и не станут стабильны-ми показатели теста. Затем ПВ оценивают 1 разв неделю в течение первого месяца лечения, вдальнейшем 1-2 раза в месяц и реже.

В табл. 63 приводятся значения MHO приклинических ситуациях, требующих приема па-циентами антикоагулянтов непрямого дей-ствия.

Во время подбора дозы антикоагулянта не-прямого действия следует периодически опреде-лять АЧТВ: оптимальными считаются значенияв 1,5-2 раза превышающие верхнюю границу ре-ферентной величины. Меньшие результаты сви-детельствуют о недостаточном уровне гипокоа-гуляции, что может наблюдаться при гиперак-


Таблица 63

тивации факторов внутреннего пути, чаще фак-тора VIII. В этом случае следует несколько уве-личить дозу препарата или временно усилить ле-чение назначением гепарина. Увеличение АЧТВболее чем в 2 раза резко усиливает риск крово-течения, что требует снижения дозы препаратаили прекращения терапии непрямыми антикоа-гулянтами.

При необходимости быстрого достиженияантикоагулянтного эффекта одновременно назна-чают гепарин и несколько большую дозу непря-мого антикоагулянта. В этом случае необходиммониторинг гепаринотерапии по АЧТВ и ежед-невный мониторинг терапии антикоагулянтомнепрямого действия по MHO. По достижениинеобходимого терапевтического уровня значенийПВ переходят на поддерживающую дозу препа-рата, а гепарин отменяют только тогда, когдаподдерживающая доза непрямого антикоагулян-та не менее 2 дней подряд обеспечивает необхо-димый уровень гипокоагуляции.

Осложнения терапии непрямыми антикоагу-лянтами

Наиболее тяжелым осложнением являетсяусиление тромбоза или возникновение тромбо-за подкожных сосудов с развитием некроза тка-

ней - «кумудинового некроза». Возникают этиосложнения у лиц с низкой активностью проте-инов S и С. Поскольку эти белки являются вита-мин-К-зависимыми, их активность быстро сни-жается после начала приема непрямых антикоа-гулянтов, тогда как их субстрат - факторы V иVIII - не меняет своей активности. Нарушениесоотношения фактор-ингибитор может приво-дить к усилению тромбозов и развитию «куму-динового некроза».

Лечение «кумудинового некроза» заключа-ется в назначении прямых антикоагулянтов исвежезамороженной плазмы как источника про-теинов С и S.

Другая группа осложнений - геморрагичес-кие проявления при передозировке антикоагу-лянтов. При этом возможны выраженные кож-ные геморрагические проявления, преимуще-ственно по гематомному типу, носовые крово-течения, кровотечения из мест инъекций, гема-томы мягких тканей, желудочно-кишечные, по-чечные кровотечения и даже внутричерепныекровоизлияния.

Лечение геморрагических проявлений заклю-чается в снижении дозы или временной отмененепрямых антикоагулянтов, применении свеже-замороженной плазмы, криопреципитата или не-


активированных препаратов протромбиновогокомплекса.

Фибринолитическая терапия

Фибринолитические препараты широко ис-пользуются при инфаркте миокарда: на протяже-нии многих лет применяли стрептокиназу и уро-киназу. Однако эти препараты малоэффективныпри лечении эмболии легочной артерии и массив-ного тромбоза глубоких вен бедра. Существен-ным ограничением применения фибринолитичес-ких препаратов являются геморрагические ослож-нения, особенно церебральные геморрагии. При-рода геморрагических осложнений связана нестолько с лизисом фибриновой пробки, сколькос появлением большого количества продуктовдеградации фибрина/фибриногена (ПДФ), кото-рые способны повреждать сосудистую стенку,особенно эндотелий, влиять на функции тромбо-цитов. Поэтому природа геморрагии при исполь-зовании фибринолитических препаратов комп-лексная. Существенное улучшение результатовфибринолитической терапии достигнуто привнедрении тканевого активатора плазминогена(t-PA), особенно при введении его через катетерпри инфаркте миокарда.

В настоящее время в качестве препаратовприменяются:• Стрептокиназа - бактериальный белок, про

дукт жизнедеятельности (3-гемолитическогострептококка (стрептодеказа).

• t-PA - специфический активатор плазминогена, нарабатываемый рекомбинантной технологией (альтеплаза) или генной инженерией как дериват t-PA с увеличенным временем

полувыведения из системы циркуляции (ре-теплаза, ланотеплаза) или как другой дери-ват t-PA с устойчивостью к ингибированиюPAI-1 (тенектеплаза).

• Урокиназа - рекомбинантный препарат u-РАили проурокиназы (саруплаза).Фибринолитическую терапию часто сочетают сгепаринотерапией. В результате достигаетсяэффект системного или локального гиперфиб-ринолиза, что может оказать благоприятный эф-фект по лизису фибринового тромба и реканали-зации окклюзированных сосудов.

Частично деградированный фибриноген спо-собствует снижению вязкости крови и уменыне-

Рис. 143. Гиперфибринолиз сопровождается образова-нием избыточного количества продуктов деградации фиб-рина (ПДФ), которые способны вступать во взаимодействиес фибрин-мономерами, нарушая полимеризацию фибри-на. При этом образуются растворимые комплексы моно-меров фибрина (РКМФ) и проявляется гипокоагулянтныйэффект ПДФ

Таблица 64Влияние тромболитической терапии на показатели коагулограммы


нию адгезии и агрегации тромбоцитов. Крометого, ПДФ оказывают потенциально антикоагу-лянтное действие, так как, вступая во взаимодей-ствие с фибрин-мономерами, вызывают образо-вание растворимых комплексов мономеров фиб-рина (РКМФ) и нарушение полимеризации фиб-рина (рис. 143).

Побочным эффектом тромболитической тера-пии могут быть кровотечения. Однако современ-ные схемы применения тромболитических препа-ратов и модернизация самих препаратов значи-тельно снизили частоту таких осложнений. Влия-ние тромболитической терапии на некоторые ла-бораторные показатели представлены в табл. 64.

Вторичные комплексные нарушения гемостаза

ДВС-синдром

Крайним проявлением активации системы ге-мостаза с включением всех его звеньев являетсяразвитие диссеминированного внутрисосудисто-го свертывания (ДВС). Комплекс в первую оче-редь клинических, а затем функциональных и ла-бораторных показателей, возникающих при ДВС,обозначают как ДВС-синдром. Диагноз ДВС-син-дром ставится клиницистами. Лабораторные ис-следования предоставляют клиницисту объектив-ные данные о состоянии системы гемостаза. Впервом приближении можно сказать следующее:если система гемостаза и организм в целом спо-собны скомпенсировать действие инициаторовсвертывания, то имеет место гиперкоагуляция иограниченное тромбообразование (рис. 1). Еслиразвивается декомпенсация, то это состояниеможно трактовать как ДВС-синдром (рис. 144).

Под ДВС понимают процесс усиленной внут-рисосудистой коагуляции, при которой:• в крови присутствует значительное количе

ство тромбина, вызывающего системную активацию и последующее потребление «факторов-субстратов» (фибриногена, протромбина, факторов V и VIII и др.), антикоагулянтов и тромбоцитов;

• имеется частичная обструкция наиболее мелких сосудов с ишемическими нарушениями ворганах;

• обнаруживается реактивный фибринолиз.

Этиология и патогенез ДВСДВС-синдром возникает обычно в результате

поступления в кровь или образования в ней веществ,инициирующих свертывание крови. Основополага-ющее событие в генезе острого ДВС-синдрома -

чрезмерная активация свертывающей системы кро-ви с образованием избытка тромбина, сопровож-дающаяся падением уровня тромбоцитов и факто-ров свертывания крови. К этому синдрому чащевсего могут приводить следующие состояния:1.

Повреждение тканей (массивный контакткрови с тканевым фактором):• Механическая травма (краш-синдром,

проникающие повреждения, напримерповреждения мозга).

• Термальные повреждения (ожоги, обморожения).

• Асфиксия и гипоксия.• Оперативные вмешательства.• Ишемия органов, инфаркты.

Рис. 144. ДВС-синдром - состояние, при котором разви-вается декомпенсация, динамическое равновесие не до-стигается из-за чрезмерной активации факторов, вызыва-ющих гиперкоагуляцию


• Жировая эмболия.• Гиповолемический/геморрагический/

анафилактический шок.• Гипертермия.

2. Онкология (контакт с онкологическими про-коагулянтами, тканевым фактором, факторомнекроза опухоли, клеточными протеазами):• Солидные опухоли.• Лейкозы.

3. Инфекция (воздействие эндотоксинов, повреждение эндотелиальных клеток, активация тромбоцитов):• Бактериальные инфекции, вызванные ме

нингококками, Е. coli, Salmonella, Pseudo-monas, Haemophilus, Pneumococcus,Hemolytic streptococci, Staphylococcus.

• Вирусные инфекции, вызванные Dengue,Lassa, Ebola, Marburg, Hantaan, Rubella,Herpes и др.

• Протозойные - малярия.• Другие - кандидозы, аспаргиллезы, кло-

стридиозы, туберкулез.• Токсический шок.• Грамотрицательный сепсис.

4. Патология сосудов и циркуляторные нарушения(поражение эндотелия, активация тромбоцитов):• Гигантская гемангиома, сосудистые опу

холи.• Аневризма аорты.• Хирургические вмешательства на сосу

дах, внутрисосудистые манипуляции.• Опухоли сердца.• Операции шунтирования сосудов сердца.• Острый инфаркт миокарда.• Васкулиты.• Эмболия легочной артерии.

5. Иммунологические нарушения (активациякомплемента, экспозиция тканевого фактора):• Анафилактические реакции.• Аллергические реакции.• Острые гемолитические посттрансфузи-

онные реакции.• Гепарин-индуцированная тромбоцито-

пения.• Реакция отторжения трансплантата.• Болезнь Кавасаки.

6. Прямая активация ферментов:• Панкреатит.• Укусы ядовитых змей.

7. Другие расстройства:• Фульминантный некроз печени.• Синдром Рейе.• Цирроз печени.• Респираторный дистресс-синдром у

взрослых.• Инфузия концентратов протромбиново-

го комплекса.• Гемолитико-уремический синдром.• Воспалительные заболевания кишечника,

перитонит.• Саркоидоз, амилоидоз.• Геморрагический шок.• Гомозиготный дефицит протеинов С и S.

8. Осложнения беременности:• Преждевременная отслойка плаценты.• Эмболия амниотическими водами.• Эклампсия и преэклампсия.• Индуцированные аборты.• Внутриутробная гибель плода или неза

конченный аборт.• Сросшаяся плацента.• Разрыв матки.• Хроническая трубная беременность.• Дегенеративная фибромиома.• Внутриутробная гибель одного из одно

яйцевых близнецов.9. ДВС у новорожденных:

• Инфекции.• Асфиксия в родах.• Болезнь гиалиновых мембран.• Аспирационный синдром, апноэ, ателек

таз, пневмония.• Легочное кровотечение.• Переохлаждение.• Глубокая недоношенность.• Тромбозы крупных сосудов.• Фульминантная пурпура.• Некротизирующий энтероколит.• Новообразования у плода и лейкозы.• Повреждение головного мозга (некрозы

и кровоизлияния).• Фетальный эритробластоз.• Поражение печени.• Врожденное нарушение толерантности к

фруктозе.Основные патогенетические механизмы за-

пуска ДВС:• Нарушение или повреждение эндотелия, со-

провождающееся высвобождением прокоагу-


лянтов и контактом крови с тканевым фак-тором.

• Активация моноцитов с экспрессией тканевого фактора и прокоагулянтов моноцитов.Именно чрезмерная активация и дегрануля-ция моноцитов-макрофагов, обладающихполноценным кровяным тромбопластином,часто рассматривается как центральное звено ДВС-синдрома при сепсисе.

• Контакт с тканевым фактором клеток злокачественных опухолей. ДВС особенно часто возникает при аденокарциноме поджелудочной и предстательной желез, продуцирующей муцин, при остром промиелоцитар-ном лейкозе, при котором гипергранулярные лейкозные клетки высвобождают изгранул материал, подобный тканевому фактору.

• Массивное поступление в кровь физиологических прокоагулянтов при различных повреждениях, массивных травмах, эмболии идр. Травмы головы с нарушением гематоэн-цефалического барьера и контактом крови стканью мозга - мощный источник тканевоготромбопластина. Осложнения беременности,при которых материал, обладающий активностью тканевого фактора, попадает из полости матки в кровь матери (преждевременная отслойка плаценты, аборт, задержка мертворожденного плода или эмболия околоплодной жидкостью).

• Шок с выпадением функции органов и развитием полиорганной недостаточности.

• Введение факторов протромбинового комплекса, особенно активированных (переливание несовместимой крови).

• Массивное поступление в кровь бактериальных прокоагулянтов. В капсиде бактерийприсутствует большое количество липополи-сахаридов (эндотоксин, рис. 145), способныхрезко активировать моноциты-макрофагисистемы циркуляции.

• Прямая активация ферментами змеиныхядов.Ведущую роль в запуске патологических про-

цессов при ДВС, как правило, играет внешнийпуть активации протромбина. Активизация кон-тактных факторов при ДВС-синдроме в первуюочередь приводит к гипотонии и вазодилатации.

Рис. 145. Эндотоксин капсида бактерий. Особенно егомного у грамотрицательных бактерий. Эндотоксин вызыва-ет массивную активацию с дегрануляцией моноцитов-мак-рофагов и освобождение в кровь большого количества кро-вяного тромбопластина, который индуцирует гиперкоагу-ляцию и развитие ДВС-синдрома

Еще одним звеном развития патологическогосвертывания крови и особенно синдрома потреб-ления является повреждение тромбоцитов и эрит-роцитов. Кислые фосфолипиды, в норме находя-щиеся на внутренней поверхности клеточной мем-браны, являются важным фактором активациипроцессов свертывания крови. Их появление вциркулирующей крови в большом количествеприводит к значительному усилению процессасвертывания крови и потреблению прокоагулян-тов. Возможно, что активация системы компле-мента также усиливает процесс потребления, ноболее вероятно, что это лишь два параллельныхпроцесса.

Имеются данные, что у пациентов с коагуло-патией потребления снижена функция тканевыхмакрофагов и содержание фибронектина. Этоприводит к снижению активности удаления мак-рофагами ретикулоэндотелиальной системы мик-роагрегатов фибрина, обломков коллагена и, воз-можно, бактерий и продуктов их жизнедеятель-ности.

Виды ДВС-синдрома

Лабораторные показатели, характеризующиесостояние гиперкоагуляции и внутрисосудисто-го свертывания, меняются в зависимости от тече-


ния и стадии процесса. По течению ДВС-синдромподразделяют на:• Острый, включая молниеносную (катастро

фическую) форму. Острый ДВС-синдром проявляется комплексом аномалий, включающим нарушение микроциркуляции, повреждение сосудистой стенки, тромбоцитопениюи тромбоцитопатию, анизоцитоз и гемолизэритроцитов, нейтрофильную реакцию, гиперкоагуляцию и геморрагический синдромна фоне коагулопатии и тромбоцитопатиипотребления, нарушения в системах фибри-нолиза, антикоагулянтов, калликреин-кини-новой и других протеолитических систем.Фазы острого ДВС-синдрома:1) гиперкоагуляция и гиперагрегация;2) коагулопатия и тромбоцитопатия по

требления с активацией фибринолитичес-кой системы;

3) генерализация фибринолиза;4) восстановление.

• Подострый с длительным периодом гиперкоагуляции и/или гиперагрегации тромбоцитов.Подострый ДВС-синдром, характеризующийся вялотекущим, скорее хроническим течением, лабораторно проявляется тромбоци-топенией, нормальным или несколько удлиненным ПВ, укорочением АЧТВ, нормальным или несколько сниженным фибриногеном и повышением уровня в плазме продуктов деградации фибрина (ПДФ). Следует отметить, что фибриноген, как острофазныйбелок, при инфекционных и травматическихформах ДВС может быть повышенным. Этосостояние может приводить к тромбоэмболи-ческим осложнениям, в том числе к тромбозам вен, артериальной тромбоэмболии. Кровоточивость встречается нечасто.

• Хронический. Для хронической формы ДВС-синдрома характерно постоянное, но менеесильное активирующее воздействие на систему гемостаза. Это обуславливает малую скорость генерации тромбина, однако достаточную для развития микроциркуляторных нарушений. Хроническая форма ДВС-синдрома наблюдается при хронических заболеваниях легких, почек, атеросклерозе, сахарномдиабете, артериальной гипертензии и другихзаболеваниях.

Тромбоцитарно-сосудистый гемостазпри ДВС-синдроме

Ведущим механизмом патологических измене-ний при ДВС являются нарушения в системе мик-роциркуляции. Выпадение фибрина в мелких сосу-дах сопровождается замедлением кровотока, сбор-кой эритроцитов в монетные столбики, травмати-зацией с изменением формы эритроцитов, увеличе-нием анизоцитоза и появлением клеточного дебри-са (рис. 146). Количественной характеристикой ани-зоцитоза эритроцитов является увеличение показа-теля RDW, определяемого гематологическими ана-лизаторами и рассчитываемого как коэффициентвариации объема клеток. Травматизация эритро-цитов сопровождается внутрисосудистым гемоли-зом. Симптомокомплекс внутрисосудистого гемо-лиза: повышение свободного НЬ, неконъюгирован-ного билирубина и ретикулоцитоз. ДВС с внутри-сосудистым гемолизом характеризуется более тяже-лым течением, чем без гемолиза, так как гемолизусиливает свертывание из-за освобождения АДФ изэритроцитов, который дополнительно активируеттромбоциты. Кроме того, поврежденные эритроци-ты являются источником эритрофосфатидов.

Тромбоциты при ДВС всегда вовлечены в раз-витие патологических реакций. При ряде форм ДВСтромбоциты являются основным субстратом дей-ствия патологического фактора: при эндотоксино-вых формах поражения, сепсисе, вызванном грамот-рицательными бактериями, ДВС развивается черезактивацию тромбоцитарно-сосудистого гемостаза(рис. 147); системные васкулиты перерастают в ДВСчерез тромбоцитарные нарушения.

Рис. 146. Анизоцитоз эритроцитов и клеточный дебриспри ДВС


Тромбоцитопения (<150 тыс./мкл) возникаетв результате потребления тромбоцитов. Тромбо-цитопатия развивается в результате реактивноговыброса в кровоток незрелых тромбоцитов и по-требления наиболее полноценного пула тромбо-цитов.

Основным лабораторным показателем нару-шения тромбоцитарно-сосудистого гемостаза приДВС-синдроме является острое снижение в кро-ви тромбоцитов при одновременном повышенииспонтанной агрегации. Однако при значительнойтромбоцитопатии агрегация, как спонтанная, таки индуцированная, будет сниженной.

гемостаза при ДВС-синдроме, представлен втабл. 65.

Помимо данных, указанных в табл. 62, в рядеслучаев ДВС определяется сниженная активностьпротеина С.

Активация системы гемостаза, которая при-водит к тромбозу, сопровождается появлениемв крови специфических маркеров. Гиперкоагу-ляция в плазменном звене проявляется в первуюочередь избыточной активацией тромбина, чтоопределяется несколькими лабораторными тес-тами (рис. 148).

Плазменный гемостаз при ДВС-синдроме

Комплекс лабораторных показателей, харак-теризующих состояние активации плазменного

Рис. 147. Повреждение эндотелиального покрова присепсисе грамотрицателы-юй бактериальной флорой, выз-вавшее развитие ДВС

Рис. 148. Продукты гиперактивации плазменного гемо-стаза, которые не обнаруживаются в норме, но характер-ны для ДВС-синдрома. ПДФ - продукты деградации фибри-ногена/фибрина, ТАТ - тромбин-антитромбиновый комп-лекс, ПАП - комплекс плазмин-антиплазмин, ФПА - фиб-ринопептид А, РФМК - растворимые фибрин-мономерныекомплексы, F1 + 2 - фрагменты протромбина, PF4 - фак-тор 4 тромбоцитов, P-TG - (3-тромбоглобулин

Лабораторные показатели, характеризующие состояние гиперкоагуляциии фазы ДВС-синдрома

Таблица 65

Удл - удлинение теста, Удл/°° - удлинение / тест не определяется в течение времени измерения.


Однако все эти тесты могут проявляться нетолько в стадии гиперкоагуляции при ДВС-син-дроме, но и при тромбообразовании, при массив-ной тромболитической терапии. Например, принестабильной стенокардии и остром инфарктемиокарда несколько маркеров активации гемос-таза, как правило, дают положительную инфор-мацию. Это тесты на фибринопептид А (ФПА),комплекс тромбин-антитромбин (ТАТ), продук-ты паракоагуляции, D-димеры. При врожденной

тромбофилии из-за дефицита протеина С или Sпримерно у 1/4 пациентов выявляют увеличениеТАТ или других маркеров активации гемостазадаже без каких-либо признаков острых тромбо-зов. В то же время часто при наличии тромбов неопределяются маркеры тромбообразования. По-этому лабораторные тесты, даже в совокупнос-ти, играют вспомогательную роль в постановкедиагноза ДВС-синдром.

Клинический пример 17Больная 59 лет. Острый промиелоцитарный

лейкоз. ДВС (?).В области верхних, нижних конечностей ге-

матомы.Коагулологическое обследование: НЬ 118 г/л,

тромбоциты - единичные, АЧТВ 65 с (норма 35-45 с), ПИ 49%, ТВ >60 с, фибриноген 0,7 г/л,лизис эуглобулиновой фракции 75 мин (норма

140-240 мин), ПДФ (латекс-тест) 10-40 мг/мл(норма - отр.), агрегация тромбоцитов с АДФотсутствует.

Заключение: на фоне резкой гипофибриноге-немии отмечается значительное замедление про-тромбиназообразования по внешнему и внутрен-нему путям. Активация фибринолиза. Агрегацияна фоне выраженной тромбоцитопении отсут-ствует.

Диагностика ДВС-синдромаДиагностика острого ДВС-синдрома начина-

ется с оценки клинической ситуации. При подо-зрении на возможность развития острого ДВСрекомендуется срочно исследовать число тромбо-цитов и содержание фибриногена, что позволитизбежать ошибочных выводов, так как часто припатологических состояниях, приводящих к раз-витию острого ДВС, уровень тромбоцитов и фиб-риногена может быть повышен. В этих случаяхснижение числа тромбоцитов и уровня фибри-ногена до нормальных величин является серь-езным основанием для подозрения на начало ДВС.В этом случае рационально, кроме числа тромбо-цитов и концентрации фибриногена, провести об-щие скрининговые тесты - ПВ, АЧТВ и ТВ, а так-же исследовать активность естественных антико-агулянтов, прежде всего антитромбина. Однакопри трактовке общих скрининговых тестов сле-дует помнить, что на показатели ПВ и АЧТВ взначительной степени влияет тромбин. После-дний в избытке имеется в плазме больных с ост-рым ДВС и может стать причиной нормальныхрезультатов даже на фоне значительного сниже-ния прокоагулянтов. Поэтому для подтверждениядиагноза ДВС рекомендуется провести специаль-

ные тесты на повышенное образование тромби-на и плазмина.

Диагностика хронического ДВС-синдроматребует тщательной оценки клинических и лабо-раторных данных. Для хронического ДВС-синд-рома характерно повышение маркеров тромби-немии, в том числе D-димеров.

Основные тесты, указывающие на активациюсвертывающей системы, - это тесты, выявляемыеиммунохимическими методами. Моноклональ-ные антитела, используемые в этих тестах, позво-ляют идентифицировать состояние факторов как«активное» или «неактивное» или как «заблоки-рованное ингибиторами», что бывает очень важ-ным с точки зрения диагностики. Методы ELISA,иммунофлуоресценции или турбидиметрии и не-фелометрии существенно расширяют возможно-сти клинико-диагностической лаборатории вкомплексной оценке и выявлении механизмов ак-тивации системы гемостаза. Ручные методы ла-текс-агглютинации также достаточно широкоиспользуются в диагностике механизмов наруше-ния гемостаза, но они постепенно заменяются ав-томатизированными методами иммунохимии.Все более активно в клинику внедряются эксп-ресс-тесты прикроватной диагностики (D-диме-


ры, фибринопептиды, ТАТ), основанные на прин-ципе иммуно диффузии.

Определение D-димеров имеет высокую ди-агностическую чувствительность, но относитель-но низкую специфичность для ДВС-синдрома(табл. 66). Высокая чувствительность - показательнаибольшей надежности; использование этого те-ста гарантирует выявление ДВС. Низкая специ-

фичность обусловлена ложноположительными ре-зультатами, объясняется это тем, что данный тестфактически выявляет продукты деградации по-перечно-сшитого фибрина, который составляет ос-нову любых тромбов и не зависит от причины ихобразования. Поэтому этот тест выявляет лизиснерастворимого фибрина, а реактивный фибри-нолиз - практически обязательный элемент ДВС.

Таблица 66Сравнительная характеристика специфичности и чувствительности диагностики ДВС-синдрома

Локализованное внутрисосулистое свертывание крови (ЛВС)

ЛВС - патологическое состояние, связанное спотреблением факторов свертывания крови, проис-ходящим в строго анатомически ограниченном уча-стке, как правило, в области сосудистых аномалий.

Лабораторные изменения при ЛВС характе-ризуются тромбоцитопенией, гипофибриногене-мией, повышением количества продуктов дегра-дации фибриногена/фибрина или D-димеров. Со-стояние почти никогда не связано с окклюзиеймикроциркуляторного русла и ишемией органов.

Основные патологические состояния, кото-рые приводят к ЛВС:1. Аневризма аорты. Синдром потребления при

аневризме аорты может быть значительновыражен и приводить к развитию геморрагических проявлений.

2. Гемангиомы. Выраженность синдрома потребления часто зависит от размеров опухоли. Геморрагический синдром в этих случаяхсвязан не только с коагулопатией и тромбоцитопенией, но и с повышенной кровоточивостью из измененных сосудов.

3. При некоторых заболеваниях почек, особенно при возникновении реакции отторжения

аллогенного почечного трансплантата, возни-кает процесс потребления фибриногена, прикотором лабораторно находят повышениепродуктов деградации фибриногена/фибринав моче, тогда как в крови эти показатели по-вышены незначительно или нормальные.

Сахарный диабет

Микро- и макроангиопатии при сахарном диа-бете сопровождаются существенными поврежде-ниями сосудистого эндотелия (рис. 149). При хро-нической гипергликемии гликопротеины сосуди-стого гликокаликса, тромбоцитов и других кле-ток крови подвергаются неферментативному гли-кированию, что сопровождается нарушением ихфункциональных свойств. Очевидно, с этим свя-зано нарушение системной сосудистой проница-емости, потеря антиадгезивных свойств сосудис-того эндотелия, усиление тромбообразования и,в результате, формирование микро- и макроан-гиопатии, сопровождающееся лабильностью всейсистемы гемостаза. У больных сахарным диабе-том, особенно страдающих ретино- и нефропати-


ями, должен проводиться контроль состояния со-судисто-тромбоцитарного гемостаза.

Повышенное артериальное давление игемодинамическое напряжение сдвига

Повышенное артериальное давление и напря-жение сдвига могут быть причиной повреждениясосудистой стенки и активного пристеночноготромбообразования. Турбулентные потоки кро-ви в местах бифуркации, участках отхождениябоковых артерий от аорты (рис. 150), выступаю-щих в просвет атероматозных бляшек, наиболееуязвимы для развития атеротромбоза. При хро-ническом повышении системного давления рискпатологического тромбообразования существен-но возрастает.

Тромботическая тромбоцитопеническаяпурпура, гемолитико-уремический синдром

Тромботическая тромбоцитопеническаяпурпура и гемолитико-уремический синдром -два близких заболевания, характеризующихсядиффузной окклюзией артериол и капилляров,вызывающей ишемическую дисфункцию многихорганов.

Этиология:• Шигатоксин-продуцирующие Е. coli - наибо-

лее распространенная причина развития ге-

Рис. 149. Эндотелиальный покров пупочной вены боль-ной некомпенсированным сахарным диабетом. Много-численные аргирофильные клетки свидетельствуют о нару-шении целостности и проницаемости эндотелиального по-крова. На эндотелии часто обнаруживаются адгезирован-ные тромбоциты и лейкоциты

молитико-уремического синдрома у малень-ких детей, однако может служить причинойтромботической тромбоцитопенической пур-пуры и гемолитико-уремического синдромав любом возрасте.

• Другие инфекции, в частности S. dysenterie(тип I), Shigella.

• Лекарства, чаще всего хинин, митомицин Си циклоспорины.

• Трансплантация костного мозга.• Онкологические заболевания.• Осложнения беременности и родов, особен

но преэклампсия.• Аутоиммунные заболевания.

Патогенез обоих заболеваний. В основе обо-их заболеваний лежит, по-видимому, высвобож-дение сверхвысокомолекулярного фактора Вил-лебранда из депо вследствие поражения эндоте-лия и тромбоцитов. Фактор Виллебранда сосверхвысокой молекулярной массой связываетсяс тромбоцитами, активирует их, вызывает обра-зование тромбоцитарных микросгустков и ихотложение в микроциркуляторном русле с разви-тием ишемии и органной симптоматики. Разли-чие в патогенезе этих двух заболеваний заключа-ется в том, что у пациентов с тромботическойтромбоцитопенической пурпурой снижена актив-ность плазменных металлопротеаз, редуцирую-щих фактор Виллебранда, а у пациентов с гемо-литико-уремическим синдромом их активностьнормальная. Разрушение эритроцитов при этих

Рис. 150. Повреждение эндотелиального покрова в об-ласти гемодинамического напряжения у места отхож-дения межреберных артерий от аорты


состояниях является следствием повреждающеговоздействия на них сил тока крови. На участкахмикроциркуляторного русла, частично обтуриро-ванных микротромбами, повышается интенсив-ность механического воздействия на клетки кро-ви, что приводит к внутрисосудистому гемолизу.В табл. 67 даны сравнительные характеристикитромботической тромбоцитопенической пурпурыи гемолитико-уремического синдрома.

Помимо поражения почек и ЦНС, для паци-ентов с тромботической тромбоцитопеническойпурпурой и гемолитико-уремическим синдромомхарактерны микроангиопатическая гемолитичес-кая анемия, тромбоцитопения, нарушения со сто-роны желудочно-кишечного тракта (боль, диарея,тошнота, рвота).

Лабораторная картина. Исследование мазковкрови выявляет нарастающую фрагментациюэритроцитов (в первые часы признаков фрагмен-тации может не быть или она минимальна) итромбоцитопению. При исследовании на гемато-логическом анализаторе характерно увеличениепоказателя RDW, уменьшение MCV и PLT. В био-химическом анализе крови - изменение непрямо-

го билирубина, повышение активности лактатде-гидрогеназы пропорционально интенсивности ге-молиза.

Приобретенные нарушения гемостаза,ассоциированные с парапротеинемиями

Приобретенные нарушения гемостаза, ассо-циированные с парапротеинемиями, возникаютпри множественной миеломе, макроглобулине-мии Вальденстрема, хроническом лимфолейко-зе, злокачественной лимфоме, моноклональныхгаммапатиях, амилоидозе, реже при некоторыхдругих заболеваниях.

Патогенез этих нарушений следующий. Выра-батываемые опухолями моноклональные иммуно-глобулины связываются с тромбоцитами и белка-ми. Фиксированные на тромбоцитах антитела при-водят к тромбоцитопении, нарушению функциитромбоцитов или к их сочетанию. В том числе мо-жет возникать приобретенный синдром Виллебран-да. Клинически эти нарушения могут проявлятьсяповышенной кровоточивостью по микроциркуля-торному типу, значительным удлинением тромби-

Таблица 67Сравнительная характеристика тромботической тромбоцитопенической пурпуры

и гемолитико-уремического синдрома


нового времени, однако геморрагических проявле-ний может и не быть. Влияние парапротеинов накоагуляционное звено гемостаза чаще выражаетсяв нарушении полимеризации фибрина, кроме того,

описаны случаи ингибирования фактора VIII, дру-гих факторов свертывания крови, белков системыфибринолиза и возникновение лабораторного фе-номена волчаночного антикоагулянта.

Приобретенные нарушения гемостаза у новорожденных и детей первого полугода жизни

Геморрагическая болезнь новорожденныхГеморрагическая болезнь новорожденных воз-

никает вследствие дефицита витамина К. Основ-ное проявление геморрагической болезни - гемор-рагический синдром, преимущественно по гема-томному типу за счет значительного снижения ви-тамин-К-зависимых белков в плазме. В табл. 68представлены классификация и характеристикигеморрагической болезни новорожденных.

Диагностика геморрагической болезни но-ворожденных основана на наличии геморраги-ческого синдрома и лабораторных данных одефиците витамин-К-зависимых факторовсвертывания крови. Дифференциальная диаг-ностика геморрагических состояний в перио-де новорожденности, основанная на скринин-говых лабораторных тестах, представлена втабл. 69.

Характеристика геморрагической болезни новорожденныхТаблица 68

Клинический пример 18Мальчик 2 мес. Поступил с жалобами на дли-

тельные кровотечения из травм кожи. В анамне-зе: у матери токсикоз в течение всей беременнос-ти, ребенок родился на 4 недели раньше срока.После рождения поставлен диагноз: внутриутроб-ное инфицирование плода. Однако из роддомародители с ребенком ушли домой. В течение пер-

вых 2 месяцев отмечалось небольшое отставаниев весе. За 2 недели до поступления перенес ОРЗ.Получал дома лечение препаратами Називин,Амброгексал, Сумамед. После выздоровлениябыл взят анализ капиллярной крови из пальца.Кровотечение из места прокола продолжалосьболее 2 суток. Геморрагических проявлений уродственников не было.


Таблица 69Дифференциальная диагностика геморрагических состояний у новорожденных и

грудных детей на основании данных лабораторного скрининга

При поступлении: состояние средней тяжес-ти, на коже единичные геморрагические элемен-ты - экхимозы и петехии. Из места прокола кожинезначительное кровотечение.

В этом случае необходимо проводить диф-ференциальный диагноз между тромбоцитопе-нией, врожденным нарушением функции тром-боцитов, геморрагической болезнью новорож-денных, некоторыми врожденными коагулопа-тиями. Провести подробное коагулологическоеисследование в момент поступления было невоз-можно, выполнили коагулологический скри-нинг.

Результаты скрининга: время кровотечениязначительно удлинено (не определяется), количе-ство тромбоцитов 220 х 109/л, АЧТВ 80 с (норма

до 43 с), протромбиновое время более 60 с (нор-ма 10-14 с), фибриноген 1,8 г/л.

Учитывая результаты скрининга, необходимопроводить дифференциальный диагноз между гемор-рагической болезнью новорожденных, изолирован-ным дефицитом факторов X или II, врожденнымзаболеванием печени с нарушением синтеза белков.

Для уточнения диагноза было проведено иссле-дование активности факторов VIII -120%, IX -15%,V - 80%, VII - 6%, X - 8%, II - 25%. Эти результатыпозволили подтвердить диагноз: геморрагическаяболезнь новорожденных. Проведено лечение концен-тратом протромбинового комплекса, витамином К.Кровотечение было остановлено. Подробное коагу-лологическое исследование, проведенное через 3 дня,показало нормальные результаты всех тестов.

ДВС-синдром

ДВС в период новорожденности возникаетотносительно часто, поскольку содержание инги-биторов свертывания крови (протеинов С и S)ниже, чем в более старшем возрасте. Лаборатор-ные маркеры активации свертывания крови повы-шаются так же, как и в более старшем возрасте.

Тромбоцитопении

Трансиммунная тромбоцитопеническая пурпу-ра у детей первого полугодия жизни является след-

ствием чресплацентарного проникновения антителк тромбоцитам из материнской крови. Это состоя-ние, как правило, не вызывает тяжелых геморраги-ческих проявлений и редко нуждается в коррекции.Тромбоцитопения проходит до 6-месячного возра-ста. Диагностика аналогична описанной в разделе,посвященном тромбоцитопениям.

Тромбозы у новорожденных детей

Распространенность в первом полугодии жиз-ни тромботических эпизодов оценивается как5,1:100 000 новорожденных, а после 6 месяцев сред-


няя частота встречаемости тромботических эпизо-дов у детей колеблется от 0,7 до 1,9 на 100 000 в год.Литературные данные не позволяют сделать одно-значных выводов о соотношении артериальных ивенозных тромбозов у детей, однако последниевстречаются примерно в 2 раза чаще. Причина от-носительно большей частоты тромбозов у детейпервых месяцев жизни кроется, по-видимому, в низ-ком соотношении активности протеинов С и S к ак-тивности факторов V и VIII. Однако тромбозы удетей почти всегда связаны с комплексным нару-шением гемостаза. Исключение составляют случаигенетически обусловленного значительного сниже-ния активности естественных ингибиторов сверты-вания крови - протеинов С, S, антитромбина III.

Наиболее значимые факторы патологическо-го тромбообразования у детей первого полугодияжизни

Наследственные факторы риска тромбообра-зования у детей:• Дефицит антитромбина III.• Дефицит протеина С.

• Дефицит протеина S.Приобретенные факторы риска:

• Катетеризация вен, особенно длительное нахождение катетера в вене.

• Повышение вязкости крови (полицитемия,потеря жидкости).

• Инфекции.• Врожденные пороки развития сердца и сосу

дов.• Заболевания печени.

Диагностика и контроль терапии тромботи-ческих состояний у детей аналогичны таковым увзрослых с учетом возрастных норм активностикомпонентов гемостаза, возможностей лаборато-рии и состояния пациента. Наибольшая труд-ность заключается в ограниченном количествематериала для анализа, так как у новорожденныхи недоношенных детей нельзя забрать много кро-ви. Поэтому врач должен выбирать наиболее ин-формативные тесты, исходя из клинической си-туации.

Приложение

ПРИЛОЖЕНИЕ

Таблица 1Тесты коагуляционного скрининга, активность факторов свертывания крови у плодов различного

срока гестации, здоровых доношенных новорожденных и взрослых

Вне скобок даны средние показатели. В скобках - минимальные и максимальные результаты 95% обследован-ных; п - число обследованных; * - р < 0.05, ! - р < 0.01 по отношению к нормам взрослых людей (Reverdiau-Moalic P, Delahousse В, Body G, et al. Evolution of blood coagulation activators and inhibitors in the healthy humanfetus. Blood 1996; 88: 900-906).

Таблица 2Уровень ингибиторов свертывания крови у плодов, доношенных новорожденных и взрослых

Вне скобок даны средние показатели. В скобках - минимальные и максимальные результаты 95% обследован-ных; п - число обследованных; * - р < 0.05 по отношению к нормам взрослых людей (Reverdiau-Moalic P,Delahousse В, Body G, et al. Evolution of blood coagulation activators and inhibitors in the healthy human fetus.Blood 1996; 88: 900-906).


Таблица 3Референтные интервалы результатов коагулологических тестов у здоровых недоношенных детей,

родившихся на 30~36-й неделях гестации в течение первых 6 месяцев жизни

Активность всех факторов, за исключением фибриногена, выражена в международных единицах на миллилитр(МЕ/мл) при условии, что нормальная контрольная плазма содержит активность факторов 1 МЕ/мл. Вне скобок данысредние показатели, в скобках - минимальные и максимальные результаты 95% обследованных. Для всех показателей удетей исследовалось от 40 до 96 образцов плазмы; * - интервалы у новорожденных, достоверно не отличимые отинтервалов взрослых (Andrew M, Paes В, Milner R, et al. Development of the human coagulation system in the healthypremature infant. Blood 1988; 72: 1651-1657).


Таблица 4Референтные интервалы результатов коагулологических тестов у здоровых доношенных

новорожденных в первые 6 месяцев жизни

Активность всех факторов, за исключением фибриногена, выражена в международных единицах на милли-литр (МЕ/мл) при условии, что нормальная контрольная плазма содержит активность факторов 1 МЕ/мл. Внескобок даны средние показатели, в скобках - минимальные и максимальные результаты 95% обследованных.Для всех показателей у детей исследовалось от 40 до 77 образцов плазмы; * - интервалы у новорожденных,достоверно не отличимые от интервалов взрослых (Andrew M, Paes В, Milner R, et al. Development of the humancoagulation system in the full-term infant. Blood 1987; 70: 165-172).


Таблица 5Референтные интервалы результатов исследования ингибиторов коагуляции удетей

в течение первых 6 месяцев жизни

Активность всех факторов выражена в международных единицах на миллилитр (МЕ/мл) приусловии, что в нормальной контрольной (пулированной) плазме активность факторов составляет 1МЕ/мл. Вне скобок даны средние показатели, в скобках - минимальные и максимальные результаты95% обследованных. Для всех показателей у детей исследовалось от 40 до 75 образцов плазмы; * -уровни, достоверно не отличающиеся от таковых у взрослых; ! - уровни, отличные от тех жепоказателей у доношенных детей (Andrew M, Paes В, Johnston M. Development of the hemostaticsystem in the neonate and young infant. Am J Pediatr Hematol Oncol 1990; 12: 95-104).


Таблица 6Референтные уровни результатов исследования компонентов фибринолитической системы

у детей первых 6 месяцев жизни

Единицы активности плазминогена исчислялись методом, рекомендованным Комитетом по тромболитичес-ким агентам. Уровень тканевого активатора плазминогена выражался в нанограммах на миллилитр. Актив-ность ос2-антиплазмина выражалась в международных единицах на миллилитр (МЕ/мл), при значении актив-ности в контрольной нормальной (пулированной) плазме, равном 1 МЕ/мл. Активность ингибитора актива-тора плазминогена-1 исчислялась в международных единицах на миллилитр плазмы, где 1 ME определяласькак количество ИАП-1, которое ингибирует 1 ME человеческого одноцепочечного тканевого активатора плаз-миногена (Andrew M, Paes В, Johnston M. Development of the hemostatic system in the neonate and young infant.AmJPediatr Hematol Oncol 1990; 12: 95-104).


Таблица 7Референтные уровни результатов коагулологических тестов детей от 1 до 16лет

по сравнению с взрослыми

Активность всех факторов, кроме фибриногена, выражена в международных единицах на миллилитр(МЕ/мл) при условии, что в нормальной контрольной (пулированной) плазме активность факторовсоставляет 1 МЕ/мл. Вне скобок даны средние показатели, в скобках - минимальные имаксимальные результаты 95% обследованных. Для всех показателей у детей исследовалось от 20до 50 образцов плазмы; * - результаты, достоверно отличающиеся от аналогичных у взрослых(Andrew M, Paes В, Johnston M. Development of the hemostatic system in the neonate and younginfant. Am J Pediatr Hematol Oncol 1990; 12: 95-104).

Таблица 8Референтные уровни результатов исследования ингибиторов свертывания детей от 1до 16 лет

по сравнению с взрослыми

Активность всех факторов, кроме фибриногена, выражена в международных единицах на миллилитр(МЕ/мл) при условии, что в нормальной контрольной (пулированной) плазме активность факторовсоставляет 1 МЕ/мл, кроме протеина S, активность которого в среднем составляет 0.4 МЕ/мл. Внескобок даны средние показатели, в скобках - минимальные и максимальные результаты 95%обследованных. Для всех показателей у детей исследовалось от 20 до 30 образцов плазмы; * -результаты, достоверно отличающиеся от аналогичных у взрослых (Andrew M, Vegh P, Johnston M,et al. Maturation of the hemostatic system during childhood. Blood 1992; 80: 1998-2005).


Таблица 9Референтные уровни результатов исследования фибринолитической системы здоровых детей в

возрасте от 1 до 16 лет по сравнению с взрослыми

Единицы активности плазминогена исчислялись методом, рекомендованным Комитетом по тромболитичес-ким агентам. Уровень тканевого активатора плазминогена выражался в нанограммах на миллилитр. Актив-ность а2-антиплазмина выражалась в международных единицах на миллилитр (МЕ/мл), при значении актив-ности в контрольной нормальной (пулированной) плазме, равном 1 МЕ/мл. Активность ингибитора актива-тора плазминогена-1 исчислялась в международных единицах на миллилитр плазмы, где 1 ME определяласькак количество ИАП-1, которое ингибирует 1 ME человеческого одноцепочечного тканевого активатора плаз-миногена (Andrew M, Vegh P, Johnston M, et al. Maturation of the hemostatic system during childhood. Blood 1992;80: 1998-2005).

Библиография

БИБЛИОГРАФИЯ

1. Балу да В, П., Балу да М.В., Голъдберг А. П. и др. Предтромботическое состояние // Тромбоз и егопрофилактика. М.-Амстердам: Зеркало-М, 1999.

2. Баркаган 3. С, Момот А.П. Основы диагностики нарушений гемостаза. М.: Ньюдиамед АО, 1999.3. Баркаган 3. С, Суханова Г. А. Геморрагические мезенхимальные дисплазии: основные нарушения

в системе гемостаза и принципы их коррекции // Консилиум. 2000. № 6 (16).4. Насонов Е.Л., Баранов А.А., Шилкина Н.П. Васкулиты и васкулопатии. Ярославль: Верхняя Вол

га, 1999.5. Папаян Л.П. Новое в представлении процесса свертывания крови // Трансфузиология. 2004. Т. 5,

№ 3.С. 7-22.6. Петрищева Н.Н., Папаян Л.П. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики

основных форм геморрагических заболеваний: Учебное пособие. СПб., 1999.7. Шевченко О.П., Олефиренко Г.А., Червякова Н.В. Гомоцистеин. М.: Реафарм, 2002.8. Шитикова А. С. Тромбоцитарный гемостаз. СПб.: ГМУ, 2000.9. Hemophilia. Editor E. Berntorp. 2004.10. Hemostasis and Thrombosis. Basic Principles and Clinical Practice. Editors: Robert W. Colman and

others. 2001.11. Henry J.B. Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. Twentieth Edition. W.B. Saun-

ders Company, 2001.12. Kasper Carol K. Von Willebrand disease. 2004.13. Kolde H.-J. Haemostasis. Physiology, Pathology, Diagnostics. Pentapharm Ltd., Basel, 2001.14. Nathan and Oski's Hematology of Infancy and Childhood. Sixth Edition. 2003.15. Thomas L. Clinical Laboratory Diagnostics. Use and assessment of clinical laboratory results. TH-

Books/Frankfurt/Main, Germany, 1998.16. Lutze G. Useful Facts about Coagulation. Questions/Answers. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,

2004.

Содержание

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................ 3ВВЕДЕНИЕ .................................................................. 5ХАРАКТЕРИСТИКА СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА .... 6

Общее представление о гемостазе,гемостатический баланс ............................................. 6

СОСУДИСТАЯ СТЕНКА............................................ 8Структура и функции сосудистой стенки ................... 8Эндотелий................................................................... 9

Характеристика эндотелиального покрова............ 9Антикоагулянтная активность интактногоэндотелия .............................................................. 10

Гликокаликс ....................................................... 10Контроль активности тромбоцитов ................ 11Молекулярный каскад образованияпростациклина и тромбоксана .......................... 12Тромбомодулин .................................................. 13

Прокоагулянтная роль эндотелия, регуляциясосудистого тонуса ............................................... 15

Роль эндотелия в регуляции сосудистоготонуса ................................................................ 15

Субэндотелий ........................................................... 17Тканевой фактор................................................ 18Коллаген ............................................................. 18

ТРОМБОЦИТЫ ........................................................ 20Тромбоцитопоэз........................................................ 20Жизненный цикл тромбоцитов ................................ 21Структура тромбоцитов ........................................... 22

Мембрана и цитоскелет тромбоцитов ................. 23Рецепторы мембраны тромбоцитов.................. 24Рецепторы для высокомолекулярныхбелков ................................................................. 25Интегрины ......................................................... 25Рецепторы для физиологическихстимуляторов .................................................... 27

Органеллы тромбоцитов ...................................... 27Тромбоцитарные факторы ................................... 28

Антигепариновый фактор тромбоцитов(фактор 4 тромбоцитов, ф.4, PF4) .................. 28$-тромбоглобулин (β-ТГ, β-TG) ........................ 28Фактор роста тромбоцитов (PDGF) .............. 29Фибриноген ......................................................... 29Фактор V........................................................... 29Фактор XIII....................................................... 29

Функция тромбоцитов .............................................. 30Адгезия тромбоцитов ........................................... 30

Молекулы адгезии............................................... 31Активация тромбоцитов ................................... 34

Агрегация тромбоцитов ....................................... 36Ретракция сгустка крови................................... 37

РОЛЬ ЛЕЙКОЦИТОВ В ГЕМОСТАЗЕ ................ 38Участие нейтрофилов в пристеночномтромбообразовании .............................................. 38Участие моноцитов в свертывании крови ........... 39

ПЛАЗМЕННЫЕ БЕЛКИ ГЕМОСТАЗА.................. 41Система свертывания плазмы .................................. 42

Витамин-К-зависимые белки ............................... 44Неферментные активаторы свертываниякрови ..................................................................... 44

Классический коагуляционный каскадактивации тромбина................................................. 44

Внешний путь образования протромбиназы ........ 45Внутренний путь образованияпротромбиназы. Факторыконтактной активации.......................................... 46Конечный этап свертывания плазмы -образование фибринового сгустка ....................... 48

Тромбин.............................................................. 48Фактор XIII....................................................... 49Фибриноген. Формированиегемостатического тромба................................. 49

Роль кофакторов и микроокруженияв процессе свертывания крови.............................. 51Роль кальция в гемостатических реакциях........... 51

Ингибиторы системы свертывания плазмыкрови......................................................................... 52

Ингибиторы ферментов системы гемостаза......... 52Антитромбин и гепарин .................................... 53Комплекс тромбин-антитромбин ..................... 54Кофактор гепарина II........................................ 54С1-ингибитор ..................................................... 54а2-макроглобулин................................................. 54

Ингибиторы коферментов .................................... 55Система протеина С ......................................... 55Протеин С.......................................................... 55Протеин S ..........................................................56С4-связывающий протеин ...................................56

Ингибиторы активных комплексов ..................... 57СИСТЕМА ФИБРИНОЛИЗА .................................. 59

Компоненты фибринолиза........................................ 59Плазминоген .........................................................60Активатор плазминогена тканевого типа ............ 60Урокиназный активатор плазминогена ............... 61Другие активаторы плазминогена ...................... 61

Механизм активации фибринолиза .........................61Внутренний путь активации фибринолиза ...........62Внешний путь активации фибринолиза ...............62

Ингибиторы фибринолиза ........................................63α2-антиплазмин, α2,-макроглобулин,α2 -антитрипсин......................................................63


Ингибиторы тканевого активатораплазминогена (PAI) .............................................. 64Активируемый тромбином ингибиторфибринолиза (TAFI) ............................................. 64Другие элементы системы фибринолиза .............. 64

Лизис фибринового сгустка. Продуктыдеградации фибрина/фибриногена и D-димеры ....... 65Плазмин-независимый фибринолиз.......................... 66

РЕОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ГЕМОСТАЗА ..... 67Особенности реологии крови .............................. 67Функция тромбоцитов в различныхгемодинамических условиях ................................ 68Влияние сил потока крови на процесс коагуляции... 69Гемодинамическое воздействиена функцию сосудистой стенки ............................ 69

СОВРЕМЕННАЯ ТЕОРИЯ СВЕРТЫВАНИЯКРОВИ........................................................................ 71

Каскадно-матричная теория свертывания крови ..... 72ОСОБЕННОСТИ ФИЗИОЛОГИИИ ИССЛЕДОВАНИЯ ГЕМОСТАЗАУ ПЛОДОВ, НОВОРОЖДЕННЫХИ ДЕТЕЙ РАННЕГО ВОЗРАСТА ............................. 75

Тромбоциты ......................................................... 75Антикоагулянтные свойства сосудистойстенки .................................................................... 76Коагуляционное звено гемостаза ......................... 76

ОСОБЕННОСТИ ФИЗИОЛОГИИ ИИССЛЕДОВАНИЯ ГЕМОСТАЗА УЖЕНЩИН ПРИ МЕНСТРУАЦИИИ БЕРЕМЕННОСТИ ................................................. 79

Менструальные кровотечения.............................. 79Изменения гемостаза при беременности............... 79

ОБЕСПЕЧЕНИЕ ДИАГНОСТИКИНАРУШЕНИЙ ГЕМОСТАЗА В КДЛ .................... 81

Общие подходы ........................................................ 81Преаналитический этап ........................................ 82

Взятие крови ...................................................... 82Капиллярная кровь .............................................. 82Венозная кровь .................................................... 83Положение тела................................................. 85Влияние физической нагрузкии эмоционального стресса...................................85Влияние пищи на показатели гемостаза.............85Интерферирующие лекарственныепрепараты ..........................................................86Подбор антикоагулянтов...................................87Сыворотка..........................................................89Хранение и центрифугирование ..........................89Проверка исследуемых образцовперед выполнением тестов .................................90

Тесты для оценки сосудистого и тромбоцитарногокомпонентов гемостаза.............................................90

Время кровотечения ..............................................90Динамический анализ функции тромбоцитов ......91Тромбоцитарные показатели................................92

Число тромбоцитов (Platelets, PL, PLT) .........92Средний объем тромбоцита (МР V) .................92Дисперсия распределения тромбоцитовпо объему (PDW) ...............................................92Тромбоцитокрит (РСТ) ...................................93

Агрегация тромбоцитов ....................................... 93Агрегация с АДФ ................................................ 94Агрегация с адреналином .................................... 94Агрегация с тромбином...................................... 94Агрегация с арахидонатом................................. 95Исследования агрегации тромбоцитовв образцах цельной крови .................................... 96

Тромбоэластография ............................................ 97Молекулярно-биологические методы .................. 99

Методические основы лабораторной оценкиплазменного гемостаза ............................................. 99

Коагуляционные методы ...................................... 99Ручные методы .................................................. 99Автоматизированные коагулометры .............. 100Механические коагулометры ........................... 101Оптико-механические коагулометры.............. 101Турбидиметрические коагулометры ................ 101Нефелометрические коагулометры ................. 102

Амидолитические методы с использованиемхромогенных и флуорогенных субстратов ......... 104Иммунохимические методы ............................... 106

Латекс-агглютинация ...................................... 106Метод ELISA................................................... 106Радиальная иммунодиффузия............................ 107«Ракетный» иммуноэлектрофорез.................... 107

Скрининговые тесты оценки плазменногозвена гемостаза .............................................................107

Активированное частичноетромбопластиновое время (АЧТВ) ..................... 109

Лабораторные условия, влияющие на АЧТВ ..... 109Диагностическое значение АЧТВ ..................... ПОВыявление дефицита факторовс использованием принципа заменных проб........ 111Использование А ЧТВ для выявленияволчаночного антикоагулянта.......................... 112Использование А ЧТВ для контролягепаринотерапии............................................... 113Контроль за лечением низкомолекулярнымфракционированным гепарином ........................113Контроль лечения гирудином ............................114Скрининговый тест на основе А ЧТВдля оценки антикоагулянтной активностипротеина С .......................................................115

Протромбиновое время ......................................115Протромбиновый тест (ПТ) по Квику............116Протромбиновое время, выраженноечерез международное нормализованноеотношение (MHO) ..........................................117Контроль за лечением непрямымиантикоагулянтами ...........................................117Ограничения использования MHO ....................117Интерпретация результатов............................117Выявление дефицита факторовс использованием принципа заменных пробв тесте ПВ .......................................................117

Тромбиновое время .............................................118Рептилазное время (батроксобиновое время) .... 119

Отдельные факторы гемостаза...............................120Референтные диапазоны содержания факторов ..120Принцип дифференцирования истинногодефицита факторов и действия ингибиторов ......122


Определение фибриногена ................................. 123Определение по Клауссу ................................... 123Турбидиметрический метод ............................ 123Иммунохимические методы.............................. 123Интерпретация результатов ........................... 124

Определение фактора Виллебранда (vWF) ........ 124Определение фактора X с использованиемхромогенного субстрата ..................................... 125Определение фактора VIII с использованиемхромогенного субстрата ..................................... 125Определение фактора VII с использованиемхромогенного субстрата ..................................... 126Определение протромбина (фактора II)с использованием хромогенного субстрата ........ 127Определение фактора XIII.................................. 127

Фотометрический метод................................. 128Инкорпорирующий метод................................. 128

Тесты для определения гепарина........................ 129Определение гепарина с помощьюхромогенных субстратов................................. 129Определение гепарина с помощьюкоагуляционных методов.................................. 129Преаналитические факторы, влияющие нарезультаты определениягепарина............................................................ 130

Методы для определения резистентности кактивированному протеину С, активностипротеина S, антитромбина,антифосфолипидных антител ............................. 130

Резистентность к протеину С ........................ 130Тест резистентности фактора Va к А ПСна основе модифицированного АЧТВ ................ 131Тест для диагностики фактора V Лейден........ 131Определение протеина С .................................. 132Определение протеина S................................... 134Определение антитромбина............................. 135Лабораторная диагностикаантифосфолипидного синдромаи волчаночного антикоагулянта ...................... 136Определение антифосфолипидныхантител (АФА) .............................................. 137

Тесты для исследования фибринолитическойсистемы................................................................138

Спонтанный эуглобулиновый лизис ..................138Определение плазминогена................................139Определение α2-антиплазмина ..........................139Определение ингибитора активатораплазминогена типа 1 (PAI-1) ..........................140Определение тканевого активатораплазминогена (t-PA) ........................................141

Тесты активации свертывания крови..................142Определение D-димеров ....................................142Продукты деградациифибрина/фибриногена (ПДФ) ...........................143Тромбин-антитромбиновыйкомплекс (ТАТ) ................................................143Фрагменты протромбина F1+2........................143Фибринопептид А (ФПА, FPA) .......................144Растворимые фибрин-мономерныекомплексы (РФМК) .........................................145Паракоагуляционные тесты ............................145

Обеспечение качества лабораторнойоценки системы гемостаза...................................... 147

Стандартные образцы (калибраторы)................ 147Стандарты ВОЗ .............................................. 148

Внутрилабораторный контроль качества........... 148Внелабораторный контроль качества ................ 149

ПАТОЛОГИЯ ГЕМОСТАЗА.................................. 150Задачи лабораторной службы при ведениипациентов с подозрением на нарушениясистемы гемостаза............................................... 152

Врожденные геморрагические заболевания ........... 152Наследственные геморрагическиекоагулопатии....................................................... 152

Гемофилия А ....................................................153Гемофилия В ..................................................... 158Дефицит фактора XI....................................... 158Врожденный дефицит фактора VII(гипопроконвертинемия) ................................. 159

Дефицит фактора X(болезнь Стюарта-Прауэра) ..........................159Дефицит фактора V(гипопроакцелеринемия, или парагемофилия) ... 160Дефицит фактора II(гипопротромбинемия).....................................161Афибриногенемия, гипофибриногенемияи дисфибриногенемия ........................................161Дефицит факторов контактной активации.... 162Комбинированный врожденный дефицитфакторов свертывания.....................................162

Врожденные нарушения функциитромбоцитов ........................................................163Наследственная болезнь Виллебранда................166

Классификация и патогенезболезни Виллебранда .........................................166Псевдоболезнь Виллебранда .............................166Клиническая характеристикаболезни Виллебранда .........................................167Лабораторная диагностикаболезни Виллебранда .........................................168Алгоритм диагностикиболезни Виллебранда .........................................170Соотношение активностифактора Виллебранда и группы крови ...............170Лечение болезни Виллебранда............................171

Приобретенные геморрагические заболевания .......173Приобретенные нарушениятромбоцитарного звена.......................................173

Тромб оцитопении .............................................173Иммунная тромбоцитопеническаяпурпура (ИТП) .................................................174Неонатальная аллоиммуннаятромбоцитопения.............................................175Гаптеновые (гетероиммунные)тромб оцитопении ............................................175Тромбоцитопения, вызванная гепарином..........175

Приобретенный дефицит факторовсвертывания крови ..............................................177

Развитие специфического ингибитора .............177Приобретенный ингибитор к фактору VIII(приобретенная гемофилия А) .........................177Приобретенный ингибитор к ф.IХ ....................178


Ингибитор к фактору Виллебранда(приобретенная болезнь Виллебранда,приобретенный синдром Виллебранда) ............ 178Приобретенный ингибитор к фактору V......... 178Приобретенные ингибиторы к протромбину,факторам VII и X ............................................ 178Приобретенный дефицит витамина К ............. 179Лечение антикоагулянтами непрямогодействия, отравление антагонистамивитамина К ...................................................... 179Гепариноподобные антикоагулянты ................ 180Заболевания печени ........................................... 180Системный фибринолиз.................................... 180Геморрагические мезенхимальные дисплазии .... 181Нарушения структуры коллагена.................... 182Кровотечения, связанные с массивнойкровопотерей .................................................... 182Нарушения гемостаза, связанныес патологией почек ........................................... 183Амилоидоз ......................................................... 183

Тромботические заболевания ............................. 184Тромбоцитоз .................................................... 184Тромбофилии. Общее представление................. 184Патогенез тромбофилии .................................. 184Лабораторные тесты при тромбофилии ........ 185

Маркеры тромбоцитофилии............................... 186Мутация фактора V (ф. V Лейден, Leiden) ..... 186Дефицит протеина С ....................................... 187Дефицит протеина S........................................ 188Мутация протромбина 20210А ........................ 189Дефицит антитромбина .................................. 189Гипергомоцистеинемия..................................... 190Гиперлипопротеинемия (а)............................... 192Высокая активность фактора VIIIи фактора Виллебранда ....................................193Дисфибриногенемия...........................................193Другие врожденные аномалии,предрасполагающие к патологическомутромбообразованию..........................................193

Сосудисто-тромбоцитарный гемостазпри действии факторов рискасердечно-сосудистых заболеваний .....................194

Тромбоатерогенез ............................................194

Катетеры центральных вен............................. 195Антифосфолипидный синдроми волчаночный антикоагулянт ......................... 195Приобретенные состояния,предрасполагающие к развитию тромбозов.Аутоиммунные заболевания ............................. 197Злокачественные заболевания .......................... 197Нефротический синдром .................................. 198Прием оральных контрацептивов.................... 198Инфекции ......................................................... 198Гипофибринолиз................................................ 199Лечение тромбозов........................................... 199Прямые антикоагулянты. Гепарин .................. 199Терапия оральными (непрямыми)антикоагулянтами........................................... 199Фибринолитическая терапия............................ 203

Вторичные комплексные нарушениягемостаза................................................................. 204

ДВС-синдром ...................................................... 204Этиология и патогенез ДВС ............................ 204Виды ДВС-синдрома......................................... 206Тромбоцитарно-сосудистый гемостазпри ДВС-синдроме ............................................ 207Плазменный гемостаз при ДВС-синдроме ....... 208Диагностика ДВС-синдрома ............................ 209

Локализованное внутрисосудистоесвертывание крови (ЛВС) .................................. 210

Сахарный диабет ............................................ 210Повышенное артериальное давлениеи гемодинамическое напряжение сдвига............ 211Тромботическая тромбоцитопеническаяпурпура, гемолитико-уремический синдром ...... 211Приобретенные нарушения гемостаза,ассоциированные с парапротеинемиями ........... 212

Приобретенные нарушения гемостазау новорожденных и детей первого полугодажизни ................................................................... 213

Геморрагическая болезнь новорожденных ........ 213ДВС-синдром .................................................... 214Тромбоцитопении ............................................. 214Тромбозы у новорожденных детей................... 214

ПРИЛОЖЕНИЕ........................................................ 216БИБЛИОГРАФИЯ ................................................... 223

Documents

Labaratornaya Diagnostika Narushyeniy Gyemostaza. v.v. Dolgov