Laboratorijska dijagnostika plodnosti muškaraca

Dr.sc. Patrik Stanić , kl inički embriolog

Laboratorijska dijagnostika plodnosti muškaraca

HKMBtečaj:Planiranjeinadzortrudnoće-mul8disciplinarnipristup,17.11.2018.

Neplodnost (15 – 18% parova)

OAT, OA, NOA

(40-45%)

Tubarni čimbenik ,

endometrij (25-30%)

Idiopatska neplodnost (5-10%)

PCOS, slaba rezerva jajnika,

ostali uzroci (20-25%)

Uzroci muške neplodnosti

§ Tes%kularni(čimbenicikojištetnodjelujunaspermatogenezu)◦ prirođeneabnormalnos%:◦  Klinefelterovsindrom(47XXY)◦ mikrodelecijeYkromosoma◦  kriptorhizam◦  varikokela

◦ stečeniporemećaji:◦  orhi%s◦  ionizirajućezračenje◦  traumeitorzijesjemenika◦  lijekovi(metrotreksat,nitrofurantoin,hormonskiprepara%)◦  toksiniizokoliša(kadmij,olovo,živa)


§ Post-tes%kularni(čimbenicikojioštećujuprovodnekanaleilidovodedospolnedisfunkcije)◦  CBAVDiCUAVD◦  epididimi%s◦  prosta%%s◦  vazektomija◦  impotencija◦  hipospadija◦  epispadija



§ Pre-tes%kularni(hipotalamičko-hipofizniporemećajiiostaleendokrinopa%je)◦  Kallmanovsindrom(nedostatakGnRH,KAL-1naX-kromosomu)◦  hipogonadizam(slaborazvijenesekundarnespolneosobine)◦  tumorihipofizeihipotalamusa

§ Genitalnourinarneinfekcije

§ Imunološkičimbenici

§ Način/s%lživota◦  alkohol,pušenje,prekomjernadebljina,nošenje%jesneodjeće,dugevožnjebiciklom,predugiboravakusaunama



Dijagnostički testovi za utvrđivanje muške plodnosti § Spermiogram(analizaejakulata)

§ Određivanjehormona◦  testosteroniFSH;LH,prolak%niinhibinB

§ Dodatnitestovisjemeneanalize◦  vitalnost◦  protuspermijskaprotu%jela◦ mikrobiološkaanaliza◦  biokemijskaanalizasjemenetekućine◦  prostata(kiselafosfataza,citrat,ZniMg)◦  sjemenimjehurići(fruktoza,prostaglandini)◦  pasjemenik(neutralnaα-glukozidaza)


Dijagnostički testovi za utvrđivanje muške plodnosti § Genetskitestovi◦  kariogram◦ mikrodelecijeYkromosoma◦  CFTRgeno%pizacija

§ Specijaliziranitestovi–testovifunkcijespermija◦  CASA(computer-aidedspermanalysis)računalnaanalizakine%kespermija◦  HBA(hyaluronanbindingassay)test-zrelostspermija◦  testDNKfragmentacijespermija◦  određivanjestanjaakrosoma


SPERMIOGRAM

Volumen ejakulata

Broj spermija Pokretljivost spermija

Građa spermija

World Health Organization (2010). WHO laboratory manual for the examination of human semen and sperm-cervical mucus interaction.

E J A K U L A T

Sekreti sjemenika, pasjemenika i vas deferensa

Sekreti prostate, sjemenih mjehurića i bulbouretralnih žlijezda

S P E R M I J I

Sjemena analiza 2 - 7 dana apstinencije

Makroskopska analiza sjemena § likvefakcija§  15min.na37oC→početakanalizenakon30min.

§ boja§  crveno-smeđa→hematospermia§  žuta→pyospermia

§ volumen§  laganaaspiracijaupipetu§  nekoris%%špricuiigle§  normalnovišeod1,5ml§  hypospermia:<1,5mlhyperspermia:>6,0ml

§ pH§  indikatorpapir6-9§  normalanpH–višiod7,2


Mikroskopska analiza sjemena § koncentracijaspermija§  normalno-≥15x106/ml§  Polyzoospermia,Oligozoospermia,Cryptozoospermia,Azoospermia

§ pokretljivostspermija§  a–brzalinearnaprogresivnagibljivost§  b–progresivnagibljivost§  c–namjestupokretnispermiji§  d–nepokretnispermiji§  normalno-≥32%spermijasprogresivnomgibljivošću(a+b),ili≥25%linearnoprogresivnihspermija(a)§  Asthenozoospermia

§ građaspermija§  normalno-30%ilivišespermijanormalnihoblikapremakriterijimaSZO(1999.)§  normalno-≥4%premastriktnimkriterijimaSZO(2010.)§  Teratozoospermia


Mikroskopska analiza sjemena § vitalnost§  normalno-≥58%živihspermija§  hipoosmotskitestbubrenjarepaspermija(HOS-test)

§  fazno-kontrastnimikroskop

§  bojanjeeozin/nigrozin§  mikroskopsasvijetlimpoljem,100xuljniobjek%v

§  diferencijacijanepokretnihspermijauživeilimrtve

§ protu%jelanaspermije§  spermijskaprotu%jelausjemenojtekućini:IgAiIgG§  testmiješanean%globulinskereakcije(MAR)§  čes%celateksaobavijeniprotu%jelima%paIgAiliIgG+an%serumzahumaniIgAiliIgG

§  testimunihkuglica(IB)§  plas%čnekuglicekovalentnopovezaneskunićjimprotu%jelimanahumaneimunoglobuline


Određivanje građe spermija

 GrađaspermijaodređivanametodombojanjapoGiemsi

 GrađaspermijaodređivanametodombojanjapoSpermacu


Vitalnost spermija – eozin nigrozinski test

 Bijeloobojenaglavaspermija=eozinnega%vnispermij,cjelovitastaničnamembranaglave;

 Crvenoobojenaglavaspermija=eozinpozi%vnispermij,oštećenastaničnamembranaglave.


Analiza DNK fragmentacije u spermijima

 Halospermtest

  SPERMIJIBEZDNKFRAGMENTACIJE◦  spemijisvelikomaurom:širinaaurejednakailivećaodmanjegpromjerajezgre◦  spermijisasrednjomaurom:veličinaaureizmeđuonihsvelikomionihsmalomaurom

  SPERMIJISFRAGMENTIRANOMDNK◦  spermijismalomaurom:širinaaurejejednakailimanjaod1/3manjegpromjerajezgre◦  spermijibezaureidegradirani:kojinepokazujunikakvuauruikodkojihjejezgranepravilnoilislaboobojena


Određivanje stanja akrosoma

 MembranaakrosomaobojenapomoćuPisumsa(vumaglu%ninakonjugiranogsfluoresceinizo%ocijanatom(FITC-PSA)ie%dijhomodimera-1


Referentne vrijednosti (SZO, 2010) § volumen-≥1,5ml

§ pH-≥7,2

§ brojspermijaumlejakulata-≥15x106/ml

§ ukupanbrojspermija-≥39x106/ejakulat

§ pokretljivost-≥32%progresivniili≥25%brzilinearnoprogresivni

§ građaspermija-≥4%normalnihoblika


Referentne vrijednosti (SZO, 2010) § vitalnost-≥58%živihspermija

§ HBAtest-≥80%zrelihspermija

§ DNKfragmentacija-<30%

§ leukoci%-<1x106/ml

§ testovinaspermijskaprotu%jela-<50%spermijavezanihzakuglice


Dijagnoze (SZO)

§ Normozoospermia–normalanejakulat§ Oligozoospermia–konc.spermija<15x106/ml§ Asthenozoospermia-<32%spermijasbrzompokretljivošću§ Teratozoospermia-<4%spermijasnormalnomgrađom§ Oligoasthenoteratozoospermia

§ Azoospermia–nemaspermijauejakulatu§ Aspermia–nemaejakulata


Metode medicinski pomognute oplodnje

§ Intrauterinainseminacija(IUI)§ Intratubarnainseminacija(ITI)§ Invitrofer%lizacija(IVF)§ Intracitoplazmatskainjekcijaspermija(ICSI)• PICSI(physiologicalICSI)• IMSI(intracytoplasmicmorphologicallyselectedsperminjec%on)

§ Invitromaturacija(IVM)


NO azoospermia nasljedne bolesti

ejakulatorna disfunkcija smanjena kvaliteta sjemena imunološki faktor cervikalni faktor

A I D Artificial Insemination by Donor

INSEMINACIJA

A I H Artificial Insemination by Husband

Priprema hranilišta i otopina

IVF/ICSI Izdvajanje oocita

Aspiracija folikula

Izdvajanje i koncentriranje

spermija

Prikupljanje ejakulata

Kultivacija 18-20 h

Potvrda oplodnje (2PRN)

Promjena hranilišta

Kultivacija 24 h

Broj i morfologija zametaka

Kultivacija 24 h

Transfer embrija 2/3 dan

Promjena hranilišta

Kultivacija 24-48 h Transfer morula/blastocista

Kriopohrana

Kultivacija gameta i zametaka (IVF/ICSI)

Stimulacija jajnika

Kriopohrana

Sekundarni ICSI

Transfer odmrznutih embrija (FET)

Kriopohrana

Obrada spermija za metode medicinski pomognute oplodnje § Ejakulat§ Pasjemenik(PESAiMESA)§ Sjemenik(TESA,TESEiMicro-TESE)§ Urin

§ CiljobradespermijazaMPOpostupke:§  odvoji%spermijeodsjemenetekućine§  izolira%pokretnespermije

§ TehnikeobradeipripremespermijazametodeMPO§ metodaispiranja§ metodaisplivavanja(“swim-up”)§  diskon%nuiranigradijentgustoće


AZOOSPERMIA  Nemaspermijauejakulatuinakoncentrifugiranja Učestalostazoospermije-8%neplodnihmuškaraca

Opstruktivna azoospermija (OA) – 40%

Neopstruktivna azoospermija (NOA) – 60%

spermiji >98% spermiji ~50%

Priprema zamrznutog TESE uzorka za ICSI postupak

§  Otapanje zamrznutog TESE uzorka / uklanjanje krioprotektora / inicijalno ispiranje

§  A) Maceracija TESE uzorka (15-30 min) §  B) Enzimatska razgradnja kolagenazom

(1-2 h)

§  Ispiranje u mediju / centrifugiranje / x 300g – 10 min

Obrada TESE uzorka u IVF laboratoriju §  Dio parenhima sjemenika dobivenog nakon

TESE

§  TESE uzorak pri povećanju x40

§  Pregled sjemenskih kanalića

TESE - ICSI

§  Priprema Petrijeve zdjelice za izolaciju testikularnih

spermija

§  Obrađeni uzorak TESE nakon ispiranja pri povećanju x400

§  Invertni mikroskop / HOS test / ICSI (OA-5 min; NOA-12 min)

PVP

TESE

HEPES

HOS


HVALA NA PAŽNJI


Documents

Laboratorijska dijagnostika plodnosti muškaraca