Laboratorio No. 4 Biotecnología agrícola AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATÓGENOS Prof. Diana Cárdenas Caro

Yenny Lorena Patiño Ramírez. Cód.1610312 Luisana Cristina Villamizar Flórez. Cód.1610250 Ana María Arismendy Pabón.Cód.1610319

INTRODUCCION

Para controlar una enfermedad es indispensable conocer su agente causal. De lo contrario cualquier estrategia de control podría ser infructuosa o eventualmente agravar el estado sanitario del cultivo. Si no se conoce el fitopatógeno (causante de la enfermedad en la planta) podría estarse utilizando un mecanismo inapropiado contra algo desconocido. Un correcto diágnostico provee una cantidad considerable de información básica para seleccionar métodos acordes al organismo o condición que esta causando el problema.

Un diágnostico preciso se inicia siempre con una muestra representativa y la observación apropiado del entorno de la planta. En el laboratorio la muestra es sometida a diferentes análisis en busca de evidencias, pistas o la identificación definitiva del agente causal. En el procedimiento se incluyen exámenes macroscópicos, microscópicos, cultivo, pruebas bioquímicas, serólogicas, o patológicas. En muchos casos los simples exámenes preliminares responden a la incógnita, pero a veces se requiere realizar procedimientos específicos para obtener el resultado preciso.

OBJETIVOS

Objetivo general: Realizar el diágnostico de enfermedades en plantas ocasionadas por hongos.

Objetivos específicos: Conocer y describir los principales síntomas de enfermedades fúngicas en las plantas. Realizar los procedimientos preliminares de identificación del agente causal de la enfermedad vegetal.Proponer algunos controles para las enfermedades encontradas.

Equipos, Materiales y otros Reactivos.

Estudiante:Muestras de órganos de plantas con lesiones, deformaciones de tejido, decoloraciones, pudriciones así (llevar en cámara húmeda según el ítem 4 Metodología),Frutos de naranja con pudrición y con moho verde,Frutos de fresa con pudrición y moho gris, Bulbos de cebolla con pudrición y moho blanco, Hojas y tallos de plantas de tomate con lesiones de color marrón y con moho del mismo color, Hojas de rosa con presencia de polvo blanco, Hojas de planta de tomate con lesiones redondeadas de color marrón, Hojas de plantas de papa con lesiones de color negro, Plántulas de hortalizas (repollo, brócoli, coliflor, apio, tomate o pimentón) con pudrición en el cuello del tallo y presencia de moho blanco.Bisturí estéril

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(hojilla), cinta transparente, guantes, cofia, tapabocas, bata, cuaderno de

laboratorio, portaobjetos y cubreobjetos, alcohol de 90 º.

Laboratorio:Cajas de agar PDA, Hipoclorito de sodio y alcohol, Agua destilada, Azul de lactofenol, Incubadora, Microscopio y estereoscopio, Mechero

METODOLOGÍA

Tomar la muestra de la planta infectada y colocarla en un recipiente con algodón embebido en agua, taparlo con vinipel con el objeto de que se desarrolle el hongo y no se afecten sus estructuras.

Observación directa por presencia de signos en el tejido: Utilizando tinción simple con azul de lactofenol, observe las estructuras al microscopio describiendo el género al cual pertenece el agente causal de la enfermedad.

Aislamiento del agente causal a partir de tejido enfermo: Realizar pequeños cortes de la zona de avance de la infección, donde el patógeno está en activo desarrollo. Los trozos son desinfectados superficialmente con alcohol de 70º y luego con una solución de hipoclorito a 1% durante 2 minutos, enjuagados 2 veces con agua destilada estéril y sembrados en cajas de Petri con medio de cultivo para hongos PDA. Se incuban a 28ºC por 4 a 7 días.

Identificación microscópica de los aislamientos: Realice montajes con tinción azul de lactofenol y observe al microscopio para describir las estructuras

que permitan identificar el género del hongo causante de la enfermedad.

PROCEDIMIENTO

Tomamos los frutos y cortamos con el bisturí las partes infectadas.

Remolacha, Papaya, Guanábana, Cacao.

Realizamos la observación directa por presencia de signos en el tejido, para ello identificamos diferentes estructuras en el microscopio.

Finalmente realizamos el aislamiento del agente causal a partir de tejido enfermo, realizando la siembra en cajas de petri con el medio de cultivo PDA, el utilizado para el aislamiento de hongos.

RESULTADOS

OBSERVACIÓN DIRECTA POR PRESENCIA DE SIGNOS EN EL TEJIDO

Observación macroscópica

Remolacha

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Características: Hongo blanco algodonoso. Presencia de un hongo negro, también de aspecto algodonoso.

Papaya

Características: Hongo gris de aspecto algodonoso, que presenta un hongo blanco en el centro de este.

Cacao

Características: el tejido enfermo presenta hongo de color balnco Observación microscópica:

Remolacha

Nombre del hongo: Rhizopus sp.

Características: Hifa no septada o hialina. Color negro o verde pardo. Se observa el esporangióforo. Produce esporas sexuales y asexuales.

Naranja

Nombre del hongo: Penicillum digitatum.

Características: Hifas septadas hialinas. Los conidióforos son simples o ramificados, que terminan en racimos de fiales en forma de botella. Conidias sueltas.

Papaya

Nombre del hongo: Clodosporium cladosporoidesCararterísticas: Hifa no sepatada.Color verde oscuro. Se observa el esporangióforo. Se trata de conidios hialinos, multicelulares y con forma característica de media luna.

Cacao

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Nombre del hongo: Monilopthora roreri

Características: Hifas septadas hialinas siempre phialides. Conidias sueltas, hialinos, pigmentados, globosos o cilíndricos.

AISLAMIENTO DEL AGENTE CAUSAL A PARTIR DE TEJIDO ENFERMO:

OBSERVACIÓN MACROSCÓPICA:

Remolacha

Características:

Se observan colonias de distintos tipos de hongos:

Hongo verde claro de textura algodonosa.

Hongo verde oscuro de textura algodonosa.

Elevación. Hongo blanco de textura

algodonosa.Se observa el agente causal Rhizopus sp.

Papaya

Características:

Hongo Blanco de textura algodonosa.

Hongo blanco de textura aterciopelada.

Naranja

Se observa un hongo blanco de textura algodonosa que cubre toda la superficie del fruto.

Cacao

Características

Hongo verde oscuro de textura algodonosa.

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Hongo blanco de textura algodonosa que se extiende sobre la caja de petri.

OBSERVACION MICROSCOPICA

Remolacha

Características: se observa claramente el agente causal de la enfermedad, Rhizopus sp.

Papaya

Características: se observa el agente causal de la enfermedad, Clodosporium cladosporoides

Naranja

Características: se observa el agente causal de la pudrición en la naranja, Penicillium digitatum

Cacao

Características: se observa el agente causal de la moniliasis, Monilopthora roreri

DISCUSIONES DE LOS RESULTADOS

En los resultados obtenidos en el laboratorio se observo que en las cajas sembradas con agar PDA las cuales tenían tejidos enfermos de cacao; se presento crecimiento de un hongo el cual se observa micelio de color blanco y manchas de color marrón en diferentes partes del fruto del cacao; después de sacar las cajas de Petri con los tejidos enfermos se observo crecimiento del micelio de color blanco, la moniliasis se presenta principalmente en cultivos que no tengan buen índice de humedad, sombra, estén sometidos a descensos bruscos de temperatura, mal drenaje del suelo y falta de poda.

En la caja de Petri con tejidos enfermos de papaya se observo crecimiento del micelio de color blanco y textura algodonosa del hongo Cladosporium cladosporoides; este hongo generalmente se encuentra en el suelo, plantas pero casi no es nocivo al se humano; sus hifas se encuentran organizadas en pequeñas cadenas que son ovaladas.

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En la caja de Petri con tejidos de remolacha se observo crecimiento del micelio de Rhizopus sp el cual era de verde claro y textura algodonosa; en su observación microscópica se observa un condioforo llenos de pequeñas espora; Rhizopus generalmente se encuentra en plantas marchitas o con cierto grado de pudrición. Las enfermedades en plantas con este hongo se caracterizan por presentar en la parte inferior del capítulo, manchas acuosas irregulares, de tamaño variable que posteriormente son de color marrón. La consistencia del receptáculo se torna esponjosa y se cubre de micelio y esporangios de color gris negruzco o negro, fácilmente visibles en las partes infectadas.

En la caja de petri que contenia tejidos enfermos de naranja se observo crecimiento del micelio del hongo Penicillium digitatum el cual era de color blanco y textura algodonosa; este hongo causa pudriciones en los cítricos sobre todo la naranja; este hongo crea un moho verde; este patógeno ataca a la ruta solo si esta presenta algún tipo de herida o lesión en su superficie, difícilmente se propaga por contacto; las fuentes de infección puede suelo, del aire, envases, etc.

CONCLUSIONES

En la realización de la práctica de laboratorio se observo microscópicamente la presencia de el hongo Cladosporium cladosporoides en tejidos enfermos de papaya y tomate de árbol; Cladosporium se caracteriza por ser un hongo que se encuentra en la carne, el cuelo, plantas, textiles y pinturas; es un hongo que no son patógenos para los humanos salvo en

algunos casos que es capaz de desencadenar reacciones alérgicas a algunas personas sensibles. Las esporas de Cladosporium se encuentran formando simples o ramificadas cadenas que pueden tener forma ovoide, oblonga o esférica.

En la observación microscópica de tejidos enfermos de remolacha se observo la presencia del hongo Rhizopus sp; el cual se encuentra clasificado dentro de las clase de los Zygomicetes debido a que producen esporas asexuales no móviles contenidas en cuerpos fructíferos denominados esporangios. Sexualmente producen esporas denominadas zigosporas.

En la observación microscópica de tejidos enfermos de cacao se encontro presencia del hongo Moniliopthera roreri; el cual se caracteriza por ser la plaga que más ataca a cultivo de cacao, pero únicamente ataca a la mazorca del cacao es decir el fruto; sus conidias se encuentran distribuidas como en pequeñas cadenas de forma ovalada.En la observación micróscópica de tejidos de naranja se encontro la presencia del hongo Penicillium digitatum el cual se caracteriza por ser el hongo que mas coloniza frutas cítricas en especial la naranja en la cual se observa un moho verde; que es el micelio del hongo; microscópicamente se observaron las hifas septadas hialinas del hongo.

CUESTIONARIO

1. ¿Cuáles síntomas reconoció en las muestras recolectadas?

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Pudrición blanda bacteriana. Tizón tardío Pudrición casera

2. ¿Cuáles microorganismos encontró?

Rhizopus oligosporus es un hongo de la familia de las Mucoraceae, ampliamente usado como levadura (cultivo arrancador) para la producción casera de tempeh. Las esporas producen un micelio blanquecino, esponjoso, uniendo a los granos de soja y creando una "torta" comestible de granos de soja parcialmente fermentados.

Rhizopus oligosporus produce un antibiótico inhibidor de bacterias gram-positivas, incluyendo a la potencialmente dañina Staphylococcus aureus y a la benéfica Bacillus subtilis (presente en nattō), aún después de que Rhizopus se consuma.

Algunas spp de Rhizopus son agentes oportunistas de cigomicosis humana. Pueden causar serias (y con frecuencia fatales) infecciones en humanos y en animales debido a su rápido crecimiento a relativamente altas temperaturas. Algunas especies son patógenos vegetales. Dos son usados en fermentación: Rhizopus oligosporus, en la producción de tempeh, un alimento fermentado derivado de grano de soja; R. oryzae se usa en la producción de bebidas alcohólicas.

Fruto que ataca: Melón

Penicillum digitatum, es un hongo que crece muy rápido y es uno de los más frecuentes que causa pudriciones en frutos. Ataca principalmente frutos de naranja, en los cuales causan lesiones graves.

Cultivo que ataca: Naranja.Enfermedad: Moho verde de los citrus.Agente causal: Penicillum digitatum

Fusarium sp, es un hongo que causa graves daños en diferentes cultivos, especialmente en cultivo de manzana, pera, aguacate, plátano y maiz.

Micelio y esporas de Fusarium sp. en fruto de zapallo.

Conidios septados de Fusarium sp. Se trata de conidios hialinos, multicelulares y con forma característica de "banana"

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Cultivo que ataca: maíz.Enfermedad: Pudrición de la raíz y tallo.Agente causal: Fusarim spp

Cultivo que ataca: PlátanoEnfermedad: Mal de PanamáAgente causal: Fusarium oxisporum f. sp

Acremonium sp, hongo de morfología simple, largo. Hialino, erecto. Phialides derivaos de hifas. El género Acremonium incluye patógenos, que en pocas ocasiones son patógenos de humanos.

Aureobasidium pullulans, Las colonias son de crecimiento rápido, suave, cubierto con viscosa masa de conidias, crema o rosado a marrón o negro. Hifas son hialinas y septadas, con frecuencia cada vez marrón oscuro con la edad y en holothallic transformación para formar cadenas de 1 - 2-celled, de paredes gruesas, oscura pigmentada arthroconidia comúnmente se llama chlamydoconidia. Estos arthroconidia en realidad representan la Scytalidium anamorfo de Aureobasidium y sólo son de importancia secundaria en el reconocimiento de los miembros de este género. Conidias se producen

sincrónicamente en densos grupos de cicatrices o indistinta de corto denticles en indiferenciada, hialino a sub-hifas hialinas. Conidias son hialinas, de paredes lisas, de un solo celled (ameroconidia), elipsoidales, pero de forma y dimensiones variables (8-12 x 4-6 um), a menudo con un indistinto hilo (una marca o cicatriz en el punto de fijación). Rango de temperatura para el crecimiento 2-35C; óptimo 25C; máximo 35C (superior en algunos patógenos humanos aislados).

Esta especie tiene dos variedades: A. pullulans var. pullulans, con una colonia que sigue siendo de color rosa, marrón claro, amarillo o por lo menos tres semanas, y A. pullulans var. melanogenum que pronto se convierte en negro o negro-verdoso debido a la oscuridad hifas que a menudo quedan al margen en celdas separadas.

Cultivo que ataca. YucaEnfermedad: PudriciónAgente causal: Aureobasidium pullulans,

Helminthosporium sp, es un hongo que ataca diferentes tipos de cultivos en especial de guayabo (psidium guajaval)

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Algunas especies también atacan el maiz causando tizón tardío de las hojas del maíz.

3. ¿Qué medidas de control recomendaría para estas enfermedades?

Para el moho verde de los cítricos:

Adelantar la cosecha de la fruta, despojando el árbol completamente.

La recolección de la fruta vieja y manchada antes de fumigar y recoger la fruta del suelo después de la cosecha.

Desinfectar el equipo, las cajas y los vehículos.

Implementar un buen control en base a incremento de la población de los enemigos naturales

Para el Mal de Panamá en el plátano:

Uso de material de plantación libre de enfermedad.

Plantar en suelos que no alberguen la enfermedad en ese momento, o en caso de existir antecedentes de plantas afectadas, no realizar movimientos de tierra en las

zonas donde se hayan detectado plantas enfermas.

Realizar enmiendas al suelo si fuese necesario, principalmente aportando calcio a unos niveles adecuados (entre 1 y 2 Kgrs/planta de yeso agrícola o tiosulfato cálcico a los niveles adecuados). 

No deshijar aquellas plantas afectadas hasta el verano, para evitar el periodo de máxima incidencia y procurando que en esta labor se rompan las mínimas  raíces, además de desinfectar la barreta con lejía después de cada uso.

Eliminar los tratamientos nematocidas, a no ser que exista un ataque severo de nemátodos corroborado por un análisis previo.

Aplicar productos estimulantes de los mecanismos de defensa de la planta. Optimizar todas las prácticas de cultivo, especialmente el riego y el abonado.

Para la pudrición de la raíz y el tallo:

La baja incidencia de la enfermedad no amerita control químico; sin embargo, se recomienda el entresaque de las plantas enfermas. 

El control de Fusarium se ha logrado satisfactoriamente mediante resistencia genética. Actualmente se cuenta con diversos materiales comerciales que poseen resistencia a las razas 1, 2  y 3.

Usar suelos con buen drenaje, semilla y plántulas libres del patógeno.

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Rotar los terrenos por al menos cinco años, solarizar el suelo y/o fumigarlo.

Adicionar materia orgánica (estiércol y pajas o residuos de plantas que liberen productos tóxicos para los patógenos como la col, lechuga, neem y otros), microorganismos o agentes de control biológico (Trichoderma lignorum (Biotrol),  Gilocladium, Fusarium, Penicillium, Funiculosum, Bacillus spp, la micorriza Glomus intraradices, entre otros), tener un buen balance de nutrientes (los cuales se pueden incrementar con el uso de extractos  de algas marinas) y excelente raíz, tratar la madera, hilo o metales, las charolas de poliuretano y la desinfección de los invernaderos, entre otras.  

¿En qué otras plantas podrían estar presentes?

Penicillum digitatum:

Ataca cítricos en general.

Variedades como Penicillium expansum causa una pudrición blanda de manzanas. Podrido La parte de la manzana contiene una micotoxina producida por patulina llamado por el hongo. Si tal se ven las manzanas para jugo entonces persiste la patulina en el zumo. Por lo tanto, las manzanas con la podredumbre parda no debe ser nunca utiliza el zumo de manzana.

Acremonium sp:

Ataca cultivos de importancia comercial como el melón.

El cultivo del melón es una planta anual, originaria de Asia occidental y África, se cultiva para el aprovechamiento de los frutos que poseen un sabor delicioso, delicado y apetecido, especialmente en la época de mucho calor, presentan diferentes tipos de pulpa desde color naranja, verde y salmón.

Igualmente ataca cultivos como el plátano, especialmente el hartón (Musa AAB) que es un cultivo de vital importancia en el sector del Zulia.

Aureobasidium pullulans:

Esta presente en cultivos como el tomate de árbol, sin embargo no causa daños en este sino que sirve como controlador

El tomate de árbol es una baya aromática de forma oboidal, punteada en su extremo inferior.

BIBLIOGRAFÍA

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