Upload
others
View
16
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
i
LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Studi Marker Protein Prediktor Diabetes Melitus pada Individu
dengan Pre-Diabetes
Disusun oleh:
dr. Asri Werdhasari, M.Biomed dan Tim
PUSAT PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN
BIOMEDIS DAN TEKNOLOGI DASAR KESEHATAN
BADAN PENELITIAN DAN PENGEMBANGAN KESEHATAN
KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA
2017
ii
SURAT KEPUTUSAN (SK) PEMBENTUKAN TIM
PELAKSANA PENELITIAN
iii
iv
v
vi
vii
SUSUNAN TIM PENELITI
No Nama Keahlian/
Kesarjanaan
Kedudukan dalam
Tim Uraian Tugas
1. 1 dr. Asri Werdha
Sari, M. Biomed Biomed Ketua Penelitian
Bertanggung jawab pada
keseluruhan penelitian
(Bertanggung jawab atas
perencanaan, pelaksanaan,
kualitas dan evaluasi serta
laporan penelitian)
2. 2 drh. Win
Winarno,M.Kes. Dr hewan Peneliti
Bertanggung jawab pada
reviu internal pelaporan dan
diseminasi hasil penelitian
3. drh. Uly Alfi
Nikmah, M.Biomed. Biomed Peneliti
Bertanggung jawab atas
pengajuan etik, bahan
penelitian, membantu
penyelenggaraan pertemuan
koordinasi
penelitian/pelatihan,
pembuatan protokol,
penyusunan
RAB/RPD/RPK, pengajuan
etik, analisis data dan
pembuatan laporan
4. 3 dr. Frans Dany Dokter umum Peneliti
Bertanggung jawab atas
penelusuran jurnal,
pembuatan
protokol,pemisahan plasma
dan buffy coat, ekstraksi
DNA, pemeriksaan variasi
genetik (polimorfisme) dan
analisis hasil pemeriksaan
5. 4 drh. Risqa Novita,
M.KM. Dokter hewan Peneliti
Bertanggung jawab
penghubung administrasi,
penyelenggaraan pertemuan
koordinasi
penelitian/pelatihan,
membantu pengajuan bahan
penelitian dan pembuatan
laporan
6. 5 Holy Arif Wibowo,
S.Si Biologi Peneliti
Bertanggung jawab atas
ekstraksi DNA,
pemeriksaan variasi genetik
(polymorfism) dan analisis
hasil pemeriksaan
viii
7. drh. Putri Reno Intan Dokter hewan Peneliti
Bertanggung jawab atas
pemisahan buffycoat,
ekstraksi DNA dan
pemeriksaan protein
8. Rosa Adelina, M.Si,
Apt Biomedik Peneliti
Bertanggung jawab atas
pemisahan buffycoat,
ekstraksi DNA dan
pemeriksaan protein
9. Sehatman, S.Si,
M.Sc Biomedik Peneliti
Bertanggung jawab atas
pemisahan buffycoat,
ekstraksi DNA dan
pemeriksaan protein
10. Dwi Febriyana, S.Si Biologi Pembantu Peneliti Membantu pelaksanaan
pemeriksaan laboratorium
11. 1 Daryanto, S.Kom Sarjana
Komputer IT
Bertanggung jawab atas
manajemen data dan
spesimen
12. 1 Driya Shintia Dewi
Adianti, S.Biotech Bioteknologi Pembantu Peneliti
Membantu pelaksanaan
pemeriksaan laboratorium
13. 1 Wika
Sumartyaningsih,
S.Biotech
Bioteknologi Pembantu Peneliti Membantu pelaksanaan
pemeriksaan laboratorium
14. 1 Tati Febrianti, S.Si Biologi Pembantu Peneliti Membantu pelaksanaan
pemeriksaan laboratorium
15. 1 Primarasprabu IT Pembantu Peneliti Membantu dalam
manajemen sampel
16. 1 Anggi Aris Faisal Analis
kesehatan Pembantu Peneliti
Membantu dalam
manajemen sampel
17. 2 Kristina
Retnoningtyas
Palupi, S.Si
Biologi Pembantu Peneliti Membantu pelaksanaan
pemeriksaan laboratorium
18. 2 Rulina Novianti,
S.Si
Analis
kesehatan Pembantu Peneliti
Membantu pelaksanaan
pemeriksaan laboratorium
19. Juwita Kurniawati,
Amd. Ak.
Analis
kesehatan Pembantu Peneliti
Membantu pelaksanaan
pemeriksaan laboratorium
20. Adit Prasetyo Analis
kesehatan Pembantu Peneliti
Membantu pelaksanaan
pemeriksaan laboratorium
21. 2 Fri Handayani, Amd. SE Administrator Melaksanakan administrasi
keuangan
22. 2 Yuswanto SE Administrator Melaksanakan administrasi
keuangan
ix
PERSETUJUAN ETIK
x
xi
KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas selesainya penyusunan laporan
penelitian Studi Marker Protein Prediktor Diabetes Melitus pada Individu dengan
Pre Diabetes tahun 2017. Terima kasih tim peneliti haturkan pada Kepala
Puslitbang Biomedis dan Teknologi Dasar Kesehatan (PBTDK) dan seluruh
jajarannya sehingga penelitian ini dapat dibiayai melalui DIPA PBTDK tahun
2017. Terima kasih pula kepada tim Panitia Pembina Ilmiah PBTDK yang telah
memberi arahan substansial, kepada tim Komisi Etik Penelitian Badan Litbangkes
yang telah mengeluarkan Persetujuan Etik dan kepada ibu Dr. Efriwati, M.Si yang
telah mereviu dan memberi masukan membangun sehingga tersusunlah laporan
penelitian ini. Terima kasih kepada seluruh tim peneliti dan tenaga honor yang
ikut membantu dengan segenap daya upaya menyelesaikan penelitian ini dan
kepada seluruh pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberi masukan kepada program
penanggulangan penyakit tidak menular. Marker genetik dan protein yang
ditemukan secara statistik bermakna pada populasi penelitian, dapat dilakukan
eksplorasi lebih lanjut untuk dapat diterapkan sebagai salah satu mekanisme untuk
mendeteksi faktor risiko secara dini sebelum munculnya gejala.
Tim peneliti berharap penelitian ini dapat bermanfaat bagi masyarakat
dalam upaya pencegahan penyakit tidak menular, terutama diabetes melitus. Suatu
penyakit yang merupakan faktor risiko bagi munculnya penyakit lainnya.
Tim Peneliti
xii
RINGKASAN EKSEKUTIF
Diabetes mellitus tipe-2 (DM) merupakan faktor risiko dari penyakit tidak
menular lainnya, seperti kardiovaskuler, gagal ginjal dan lain-lain.Secara ekonomi,
DM menjadi penyakit yang mahal, karena prevalensi serta progresivitasnya yang
meningkat. Kondisi sebelum DM, yang ditandai dengan peningkatan kadar gula
darah puasa (GDPT) atau peningkatan kadar gula darah setelah pembebanan
glukosa (TGT) disebut pre-DM. Pre-DM ini telah menimbulkan adanya gangguan
metabolisme dan komplikasi. Hal ini telah menjadi beban bagi individu maupun
masyarakat dan pemerintah. Sehingga pencegahan pre-DM menjadi DM dan
mengembalikan kondisi pre-DM menjadi kembali normal sangatlah penting
dilakukan.
Salah satu cara yang sedang dikembangkan untuk pencegahan hal tersebut
adalah dengan penggunaan marker untuk deteksi dini pre-DM dan DM. Marker
tersebut diharapkan dapat digunakan sebagai prediktor pre-DM dan DM,
sehingga dapat menurunkan angka kejadian pre-DM dan DM. Single nucleotide
polymorphisms (SNPs) merupakan variasi sekuen DNA yang dapat dihubungkan
dengan kerentanan seseorang terhadap suatu penyakit seperti DM.
Penelitian ini ingin mengetahui hubungan variasi gen dan kadar protein
terkait terhadap kejadian DM dan pre DM pada suatu populasi, yaitu populasi .
yang sama dengan studi kohor untuk faktor risiko penyakit tidak menular (FR-
PTM). Dimana studi kohor FR-PTM ini merupakan studi berbasis masyarakat
yang dilakukan Badan Litbangkes sejak tahun 2011 untuk mengamati penyakit
stroke, jantung koroner (PJK), DM dan hipertensi. Data dasar berupa hasil
wawancara berisi riwayat, gejala penyakit, perilaku dan frekuensi diet, serta hasil
pemeriksaan fisik berupa antropometri, tekanan darah, elektrokardiografi, rontgen
dada dan neurologi sudah terkumpul dalam studi kohor FR-PTM sebelumnya.
Penelitian ini, berupa marker genetik DM diharapkan dapat melengkapi data studi
tersebut.
Biomarker yang dianalisis dalam studi ini adalah single nucleotide
polymorphisms (SNPs) pada 8 gen yaitu gen UCP2 rs660339, DUSP9/MKP4
rs5945326, SLC30A8 rs13266634, Resistin (RETN) rs3745367, IGF2BP2
xiii
rs16860234, KCNQ1 rs2237892, ADIPOQ rs6773957 dan KLF14 rs972283.
Selain itu, penelitian ini dilengkapi dengan pengamatan ekspresi variasi biomarker
genetik gen-gen tersebut berupa pengukuran kadar protein resistin, insulin,
c-peptide dan adiponektin.
Hasil penelitian menunjukkan alel gen DUSP9/MKP4, RETN, ADIPOQ
dan KLF14 mutan meningkatkan risiko timbulnya DM yang lebih tinggi
dibandingkan alel asal. Gen IGF2BP2, UCP2 dan KCNQ1 alel asal justru
meningkatkan risiko menjadi DM dibandingkan alel mutannya. Sementara itu,
ketidakseimbangan hukum Hardy-Weinberg dijumpai pada semua gen. Dengan
demikian, sebagian alel mutan dan alel asal menjadi faktor risiko timbulnya DM
dan terindikasi sudah berevolusi.
Gangguan kadar protein sudah dijumpai pada individu prediabetes, yaitu
protein adiponektin, resistin dan insulin. Kadar protein c-peptide paling rendah
dijumpai pada kelompok DM. Perubahan ekspresi sebagian protein yang paling
mencolok pada kelompok prediabetes dapat digunakan sebagai penanda genetik.
Biomarker tersebut dapat dikembangkan lebih lanjut sebagai prediktor dini
prediabetes.
xiv
ABSTRACT
Prevalence of type 2 diabetes mellitus (DM) continues to increase in
worldwide, including Indonesia based on Riskesdas 2007 and 2013 data. A
number of studies indicate genetic marker variations being determinants of blood
sugar metabolism impairment and some developed countries have started using
such biomarker screening as early detection or prevention. This research was
conducted to identifythose biomarkers and use them as DM predictor, hopefully
decreasingits incidence rate. This study used a cohort sample population in Bogor,
West Java. The biomarkers analyzed in this study were single nucleotide
polymorphisms (SNPs) on UCP2 rs660339, DUSP9/MKP4 rs5945326, SLC30A8
rs13266634, Resistin (RETN) rs3745367, IGF2BP2 rs16860234, KCNQ1
rs2237892, ADIPOQ rs6773957 and KLF14 rs972283 gene. Protein level of
resistin, insulin, c-peptide and adiponectin were also measured to complement the
findings on these genetic biomarker variation expression. RETN, DUSP9/MKP4,
IGF2BP2, ADIPOQ and KLF14 mutant gene alleles increased risk of developing
DM, at least compared to their normal counterparts. Meanwhile, Hardy-
Weinberg's inequilibriumwas found in all genes. Impaired protein levels are found
particularly in prediabetes individuals, except the lowest levels of c-peptide found
in the DM group. Thus, some mutant alleles became risk factors for DM and
seemed to evolve. However, the protein expression changes were most prominent
in the prediabetes group.Hence,thosebiomarker genetic markers can also be
further developed as prediabetes early predictors.
Keywords: diabetes mellitus, kohort, single nucleotide polymorphisms (SNPs),
Hardy-Weinberg, protein, Bogor
xv
ABSTRAK
Peningkatan prevalensi diabetes melitus (DM) tipe 2 terus terjadi di seluruh
dunia, termasuk di Indonesia. Berdasarkan data Riskesdas terjadi peningkatan dari
1,1% (tahun 2007) menjadi 2,1% (tahun 2013). Sejumlah studi menunjukkan
adanya variasi penanda genetik yang menjadi determinan timbulnya gangguan
metabolisme gula darah. Penelitian ini dilakukan untuk identifikasi biomarker
timbulnya DM dan digunakan sebagai prediktor DM untuk menurunkan angka
kejadian DM. Studi ini menggunakan populasi sampel studi kohor faktor risiko
Penyakit Tidak Menular (FR-PTM) di Bogor, Jawa Barat. Biomarker yang
dianalisis adalah single nucleotide polymorphisms (SNPs) pada gen UCP2
rs660339, DUSP9/MKP4 rs5945326, SLC30A8 rs13266634, Resistin (RETN)
rs3745367, IGF2BP2 rs16860234, KCNQ1 rs2237892, ADIPOQ rs6773957 dan
KLF14 rs972283. Selain itu pengukuran kadar protein resistin, insulin, c-peptide
dan adiponektin dilakukan untuk melengkapi temuan adanya ekspresi variasi
biomarker genetik gen-gen tersebut. Alel mutan gen RETN rs3745367,
DUSP9/MKP4 rs5945326, ADIPOQ rs6773957 dan KLF14 rs972283
meningkatkan risiko timbulnya DM yang lebih tinggi dibandingkan alel normal.
Namun sebaliknya, gen IGF2BP2 rs16860234, UCP2 rs660339 dan KCNQ1
rs2237892 alel asal justru meningkatkan risiko menjadi DM yang lebih tinggi
dibandingkan alel mutan. Ketidakseimbangan hukum Hardy-Weinberg dijumpai
pada semua gen. Gangguan kadar protein adiponektin, resistin dan insulin sudah
dijumpai pada individu prediabetes. Dengan demikian, sebagian alel mutan atau
bahkan alel asal dapat menjadi faktor risiko timbulnya DM dan terindikasi
berevolusi. Namun, perubahan ekspresi sebagian protein paling mencolok pada
kelompok prediabetes sehingga penanda genetik biomarker tersebut dapat juga
dikembangkan lebih lanjut sebagai prediktor dini prediabetes.
Kata kunci: diabetes melitus, kohort, single nucleotide polymorphisms (SNPs),
Hardy-Weinberg, protein, Bogor
xvi
DAFTAR ISI
SUSUNAN TIM PENELITI ................................................................................. vii
PERSETUJUAN ETIK .......................................................................................... ix
KATA PENGANTAR ........................................................................................... xi
RINGKASAN EKSEKUTIF ................................................................................ xii
ABSTRACT ........................................................................................................... xiv
ABSTRAK ............................................................................................................. xv
DAFTAR ISI ........................................................................................................ xvi
DAFTAR TABEL .............................................................................................. xviii
PENDAHULUAN ................................................................................................... 1
I.1. Latar Belakang ............................................................................................... 1
1.2. Perumusan Masalah ...................................................................................... 2
I.3. Tujuan Penelitian ........................................................................................... 2
I.3.1. Tujuan Umum ......................................................................................... 2
I.3.2. Tujuan Khusus ........................................................................................ 2
I.4. Manfaat dan Luaran Penelitian ...................................................................... 2
TINJAUAN PUSTAKA .......................................................................................... 3
METODE PENELITIAN ......................................................................................... 8
III.1. Kerangka Teori............................................................................................ 8
III.2. Kerangka Konsep ........................................................................................ 8
III.3. Desain dan Jenis Penelitian ......................................................................... 9
III.4. Tempat dan Waktu ...................................................................................... 9
III.5. Populasi dan Sampel ................................................................................... 9
III.5.1. Populasi ................................................................................................ 9
III.5.2. Sampel ................................................................................................ 10
III.5.3. Kriteria Inklusi dan Eksklusi .............................................................. 10
III.5.4. Estimasi Besar Sampel, Cara Pemilihan dan Penarikan Sampel ....... 10
III.5.5. Variabel .............................................................................................. 10
III.5.6. Definisi Operasional........................................................................... 11
III.6. Alur Penelitian .......................................................................................... 11
III.7. Bahan dan Prosedur Kerja ......................................................................... 11
III.7.1. Bahan dan alat .................................................................................... 11
III.7.2. Prosedur kerja..................................................................................... 12
xvii
III.8. Manajemen dan Analisis Data .................................................................. 20
III.9. Pertimbangan Etik Penelitian .................................................................... 21
III.10. Pertimbangan Izin Penelitian .................................................................. 21
HASIL PENELITIAN ............................................................................................ 22
PEMBAHASAN .................................................................................................... 49
KESIMPULAN & SARAN ................................................................................... 54
VI.1. Kesimpulan ............................................................................................... 54
VI.2. Saran ......................................................................................................... 55
UCAPAN TERIMA KASIH .................................................................................. 56
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................ 57
LAMPIRAN ........................................................................................................... 59
xviii
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre DM pada gen
UCP2 rs660339. ...................................................................................... 40
Tabel 2. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre DM pada gen
KCNQ1 rs2237892. ................................................................................ 40
Tabel 3. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre DM pada gen
RETN rs3745367. ................................................................................... 41
Tabel 4. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre DM pada gen
DUSP9/MKP4 rs5945326. ..................................................................... 41
Tabel 5. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre DM pada gen
SLC30A8 rs13266634. ........................................................................... 41
Tabel 6. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre DM pada gen
IGF2BP2 rs16860234. ............................................................................ 42
Tabel 7. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre DM pada gen
ADIPOQ rs6773957. .............................................................................. 42
Tabel 8. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre DM pada gen
KLF14 rs972283. .................................................................................... 42
Tabel 9. Larutan Standar Kadar C-peptide. .......................................................... 43
Tabel 10. Hasil Pemeriksaan Protein. ................................................................... 44
Tabel 11. Larutan Standar Adinponektin. ............................................................. 45
Tabel 12. Hasil Pemeriksaan Kadar Adiponektin dalam Plasma Darah
Responden. ............................................................................................ 45
Tabel 13. Larutan Standar Insulin. ........................................................................ 46
Tabel 14. Hasil Pemeriksaan Insulin. .................................................................... 47
Tabel 15. Larutan Standar Resistin. ...................................................................... 47
Tabel 16. Hasil Pemeriksaan Protein Resistin. ..................................................... 48
xix
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada gen UCP2 rs660339 pada
responden DM, Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota Bogor tahun
2016. .................................................................................................... 23
Gambar 2. Distribusi alel a/a, a/g dan g/g pada gen ucp2 rs660339 pada responden
normal, Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota Bogor, 2016. ............ 23
Gambar 3. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada gen UCP2 rs660339 pada
responden dengan pre DM, Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota
Bogor, 2016. ........................................................................................ 24
Gambar 4. Distribusi alel T/T, C/T dan C/C pada gen KCNQ1 rs2237892 pada
responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
............................................................................................................. 25
Gambar 5. Distribusi alel T/T, C/T dan C/C pada gen KCNQ1 rs2237892 pada
responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun
2016. .................................................................................................... 25
Gambar 6. Distribusi alel T/T, C/T dan C/C pada gen KCNQ1 rs2237892 pada
responden dengan pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor
tahun 2016. .......................................................................................... 26
Gambar 7. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen RETN rs3745367 pada
responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
............................................................................................................. 27
Gambar 8. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen RETN rs3745367 pada
responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun
2016. .................................................................................................... 27
Gambar 9. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen RETN rs3745367 pada
responden dengan pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor
tahun 2016. .......................................................................................... 28
Gambar 10. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen DUSP9/MKP4
rs5945326 pada responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota
Bogor tahun 2016. ............................................................................... 29
Gambar 11. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen DUSP9/MKP4
rs5945326 pada responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota
Bogor tahun 2016. ............................................................................... 29
Gambar 12. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen DUSP9/MKP4
rs5945326 pada responden pre DM, studi kohor faktor risiko PTM,
kota Bogor tahun 2016. ....................................................................... 30
Gambar 13. Distribusi genotipeC/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8 rs13266634
pada responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun
2016. .................................................................................................... 31
xx
Gambar 14. Distribusi alel C/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8 rs13266634
pada responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor
tahun 2016. .......................................................................................... 31
Gambar 15. Distribusi alel C/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8 rs13266634
pada responden pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor
tahun 2016. .......................................................................................... 32
Gambar 16. Distribusi genotipe A/A, A/C dan C/C pada Gen IGF2BP2
rs16860234 pada responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota
Bogor tahun 2016. ............................................................................... 33
Gambar 17. Distribusi genotipe A/A, A/C dan C/C pada Gen IGF2BP2
rs16860234 pada responden normal, studi kohor faktor risiko PTM,
kota Bogor tahun 2016. ....................................................................... 33
Gambar 18. Distribusi genotipe A/A, A/C dan C/C pada Gen IGF2BP2
rs16860234 pada responden pre DM, studi kohor faktor risiko PTM,
kota Bogor tahun 2016. ....................................................................... 34
Gambar 19. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden DM, studi
kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016. .............................. 35
Gambar 20. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden normal, studi
kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016. .............................. 35
Gambar 21. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden pre DM, studi
kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016. .............................. 36
Gambar 22. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada responden DM,
studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016. ..................... 37
Gambar 23. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada responden normal,
studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016. ..................... 38
Gambar 24. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada responden pre DM,
studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016. ..................... 39
Gambar 25. Kurva Standar C-peptide. .................................................................. 44
Gambar 26. Kurva Standar Adiponektin. .............................................................. 45
Gambar 27. Kurva standar Insulin. ....................................................................... 46
Gambar 28. Kurva Standar Resistin ...................................................................... 47
xxi
DAFTAR ISTILAH DAN SINGKATAN
PTM : Penyakit Tidak Menular
DM : Diabetes Mellitus
Pre DM : Kondisi gangguan metabolisme sebelum masuk pada
kondisi DM
TGT : Toleransi Glukosa Terganggu
GDPT : Glukosa Darah Puasa Terganggu
SNP : Single Nucleotide Polymorphisms
RT PCR : Real Time Polimerase Chain Reaction
Isolated IFG : Isolated Impaired Fasting Glucose; keadaan ketika
kadar glukosa darah puasa di atas normal tetapi tidak
cukup tinggi untuk memenuhi kriteria DM (GDP = 100-
125 mg/dL) tetapi kadar glukosa darah 2 jam pasca
pembebanan masih dalam kisaran normal (OGTT < 140
mg/dL)
Isolated IGT : Isolated Impaired Glucose Tolerance; keadaan ketika
kadar glukosa darah 2 jam pasca pembebanan di atas
normal tetapi tidak cukup tinggi untuk memenuhi
kriteria DM (OGTT = 140-199 mg/dL) tetapi kadar
glukosa darah puasa masih dalam kisaran normal (GDP
< 100 mg/dL
1
BAB I
PENDAHULUAN
I.1. Latar Belakang
Diabetes Melitus (DM) tipe 2 merupakan ibu dari beberapa penyakit
degeneratif lainnya, sehingga merupakan masalah kesehatan yang serius. Kondisi
gangguan metabolisme tubuh yang ditandai dengan kenaikan kadar gula darah
melebihi nilai ambang, dikenal dengan prediabetes. Pada kondisi ini risiko
terhadap penyakit kardiovaskuler dan kematian total juga meningkat hampir dua
kali lipat, karena dikaitkan dengan adanya komplikasi mikrovaskular.
Menurut data Riset Kesehatan Dasar (RKD) 2013 terdapat peningkatan
prevalensi DM dibandingkan dengan data sebelumnya (RKD 2007). Pada tahun
2007 prevalensi DM di area perkotaan Indonesia dari 5,7% dan menjadi 6,8%
pada tahun 2013 pada seluruh wilayah Indonesia.
Faktor risiko DM tipe 2 terutama disebabkan oleh pola hidup yang kurang
sehat serta riwayat DM dalam keluarga, sehingga dimungkinkan erat kaitannya
dengan faktor genetik. Oleh karena itu, upaya pencegahan perlu dilakukan sedini
mungkin dengan perubahan gaya hidup atau pengendalian faktor risiko yang
sudah ada.
Beberapa studi di negara maju sudah mempertimbangkan penggunaan
biomarker sebagai salah satu upaya skrining pencegahan awal penyakit metabolik,
mulai dari penanda genetik sampai protein. Penanda genetik yang digunakan
antara lain adanya Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs), yang merupakan
variasi sekuen DNA yang dapat dihubungkan dengan kerentanan seseorang
terhadap suatu penyakit, antara lain DM tipe-2. Namun, hasil sejumlah penelitian
menunjukkan adanya variasi marker tersebut yang dapat disebabkan perbedaan
etnis atau gaya hidup yang menyertainya.
2
1.2 Perumusan Masalah
Hasil penelitian SNPs pada berbagai etnis / daerah menunjukkan hasil yang
berbeda terhadap risiko kejadian DM. Perbedaan variasi alel pada SNPs dapat
dijadikan sebagai prediktor DM yang khas untuk populasi Indonesia. Hasil
penelitian ini diharapkan dapat menganalisis kandidat 8 gen SNPs yang diperiksa
dengan membandingkan SNPs yang dimiliki antar kelompok individu dengan
kriteria kadar glukosa darah normal, prediabetes dan DM.
I.3 Tujuan Penelitian
I.3.1. Tujuan Umum:
Menentukan marker genetik yang berpotensi sebagai prediksi kejadian DM.
I.3.2 Tujuan Khusus:
1. Menentukan prevalensi variasi genetik gen-gen pengkode faktor resiko
DM pada populasi studi kohor faktor risiko PTM.
2. Mendapatkan besaran asosiasi polimorfisme gen-gen tersebut terhadap
kejadian penyakit DM pada populasi studi kohor faktor risiko PTM.
3. Melengkapi data studi kohor faktor risiko PTM dari faktor risiko
genomik dan identifikasi protein penanda DM / pre DM.
I.4. Manfaat dan Luaran Penelitian
1. Dapat memberikan gambaran epidemiologi genetik yang berbasis
masyarakat di Kecamatan Bogor Tengah, Kota Bogor.
2. Data yang diperoleh dapat digunakan sebagai masukan untuk
merancang program pencegahan dan pengendalian PTM, khususnya
DM dengan mempertimbangkan aspek genomik.
3
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Diabetes melitus (DM) tipe 2 merupakan ibu dari beberapa penyakit
degeneratif lainnya, sehingga merupakan masalah kesehatan yang serius. Menurut
Konsensus Pengendalian dan Pencegahan DM tipe 2 di Indonesia tahun 2011,
kriteria DM apabila:
1. Terdapat gejala klasik DM, yaitu polifagia (banyak makan), polidipsi (banyak
minum) dan poliuria (banyak buang air kecil) dan kadar glukosa plasma > 126
mg/dL, atau
2. Kadar glukosa plasma pada TTGO (tes toleransi glukosa oral dengan
pembebanan glukosa 75 g) > 200 mg/dL
Kondisi gangguan metabolisme tubuh yang ditandai dengan kenaikan kadar
gula darah melebihi nilai normal namun belum mencapai tahap DM, dikenal
dengan prediabetes. Prediabetes meliputi Impaired Fasting Glucose (IFG) atau
Gula Darah Puasa Terganggu (GDPT)dan Impaired Glucose Tolerance (IGT) atau
Toleransi Glukosa Terganggu (TGT). Kriteria TGT yaitu kadar gula darah puasa
100-125 mg/dL dan 2 jam setelah pembebanan glukosa 140 – 199 mg/dL (ADA,
2011). Sedangkan prediabetes eksklusif meliputi Isolated Impaired Glucose
Tolerance/Isolated IGT atau TGT tersendiri dan Isolated Impaired Fasting
Glucose/Isolated IFG atau GDPT tersendiri, dengan kriteria:
1. Isolated IGT atau TGT tersendiri, yaitu glukosa plasma 2 jam setelah
pembebanan antara 140-199 mg/dL dan GDPT
4
prevalensi TGT sebesar 19,4%. Diperkirakan terdapat 314 juta orang dengan
prediabetes diseluruh dunia dan akan meningkat menjadi 418 juta pada tahun
2025 (Manaf,2013).
Kondisi risiko terhadap penyakit kardiovaskuler dan kematian total juga
meningkat hampir dua kali lipat karena dikaitkan dengan adanya komplikasi
mikrovaskular. Komplikasi baik prediabetes maupun DM berawal dari kerusakan
mikro maupun makrovaskular, sehinggaakan menampilkan komplikasi yang
multiple danyang menjadi penyebab kematian tersering adalah penyakit
kardiovaskular (Manaf 2013).
Faktor risiko DM tipe 2 terutama disebabkan oleh pola hidup yang kurang
sehat serta riwayat DM dalam keluarga, sehingga dimungkinkan erat kaitannya
dengan faktor genetik. Prediabetes juga merupakan faktor risiko yang kuat
terhadap DM.Prediabetes dapat berkembang menjadi DM, hipertensi, penyakit
jantung koroner, stroke dll. Siraj MAT (2010) dalam reviu artikel memperlihatkan
kira-kira sepertiga TGT menjadi DM, konversi diestimasi 5,8% pertahun.
Menurut hasil penelitian Zyriak dkk. (2013), individu dengan prediabetes secara
signifikan berhubungan dengan DM tipe 2. Sekitar 5-10% individu prediabetes
yang tidak tertangani akan berkembang menjadi diabetes atau menjadi normal
kembali (Zyriak, 2013).
Komplikasi tersebut merupakan beban bagi individu maupun masyarakat
dan pemerintah, maka dari itu pencegahan dari prediabetes menjadi DM sangat
penting.Karena itu, upaya pencegahan perlu dilakukan sedini mungkin dengan
perubahan gaya hidup atau pengendalian faktor risiko yang sudah ada.
Salah satu cara yang sedang dikembangkan untuk pencegahan tersebut
adalah penggunaan marker yang dapat dipercaya untuk deteksi dini DM. Marker
tersebut diharapkan dapat digunakan sebagai prediktor DM sehingga dapat
menurunkan angka kejadian prediabetes dan DM.
Salah satu penemuan dalam Human Genome Project adalah Single
Nucleotide Polymorphisms (SNPs). SNPs merupakan alel minor dengan
keberadaannya lebih dari 1%. Apabila SNPs terjadi pada gene coding regions bisa
mengakibatkan synonymous (tidak menyebabkan perubahan asam amino) atau
non synonymous. Akan tetapi pada penelitian beberapa tahun terakhir SNP
5
synonymous mendorong terjadinya evolusi yang mendorong terjadinya suatu
penyakit (Komar, 2009). SNP synonymous dapat mengubah struktur, fungsi dan
ekspresi protein. Polimorfisme synonymous dapat menyebabkan splicing RNA,
stabilitas dan struktur protein dapat rusak. Perubahan ini dapat menyebabkan efek
signifikan pada fungsi protein dan perubahan respon seluler. Sebagian besar SNPs
merupakan non coding region yang merupakan dasar variasi genetik pada manusia
dan mengacu pada perbedaan basa tunggal antar individu (Kwook, 2003).
Zachavora dkk. mendapatkan SNPs +45 T/G dan +276 G/T dari gen
adiponektin sebagai prediktor untuk konversi TGT menjadi DM.Pada individu
dengan DM akan mempunyai nilai adiponektin dalam darah yang rendah.
Hipoadiponektinemia berhubungan dengan resistensi insulin dan disfungsi
endotelium vaskuler, dan menyebabkan peningkatan stres oksidatif yang menjadi
penyebab penting aterosklerosis dan berlanjut pada kejadian penyakit
kardiovaskuler. Gen pengkode protein adiponektin adalah ADIPOQ, berlokasi di
kromosom 3q27. Gen ADIPOQ bervariasi pada posisi 11377 (11377 C>G) dan
diidentifikasi sebagai lokus yang rentan untuk sindrom metabolisme, DM dan
penyakit kardiovaskuler. Variasi tipe ADIPOQ telah diteliti berhubungan dengan
risiko kardiovaskular. Pada penelitian di Malaysia oleh Lau CH, et al. bahwa
SNP+1212A>G (rs6773957) berhubungan bermakna dengan penurunan kadar
adiponektin. Peningkatan kadar protein yang berhubungan dengan DM tipe 2
adalah Leptin dan Interleukin-6.
Lau CH, et al. (2009) juga melaporkan bahwa gen resistin (RETN) pada
+299(G>A) (rs3745367) berhubungan bermakna dengan hiperresistinemia.
Resistin menekan diferensiasi adiposit yang diduga berakibat penumpukan
ektopik asam lemak dan lipotoksisitas terhadap jaringan non-adiposit. Pada Studi
potong lintang di Singapura oleh Tan JT, et al. (2009) sebanyak 3734 responden
usia 18-69 tahun (2520 ras Tiongkok, 693 ras Melayu dan 521 ras India),
polimorfisme gen KCNQ1 (Rs 2237892, 2237892 dan 2283228) bermakna pada
ras Melayu. Hal ini sejalan dengan penelitian Genome Wide Association Study
(GWAS) oleh Saif-Ali R, et al. (2011) di Malaysia yang menggunakan 411
responden berusia 30-70 tahun (234 responden dengan DM dan 177 responden
normal).
6
Studi kasus kontrol menggunakan 620 sampel kontrol (254 ras Melayu, 204
ras Tiongkok, 162 ras India) dan 1107 responden DM yang mempunyai hasil
negatif untuk antibodi terhadap glutamic acid decarboxylase, terdapat asosiasi
kuat pada rs7651090, rs16860234 dan rs6777038 gen IGF2BP2 pada ras
Tiongkok. Gen IGF2BP2 diduga mengatur fungsi sel beta pankreas. Sementara
pada ras Melayu hanya rs16860234 yang bermakna (Saleem SD, 2012).
Penelitian polimorfisme gen yang berhubungan dengan DM pernah
dilakukan oleh kolaborasi peneliti dari Eijkman, Jakarta dan Universitas Udayana,
Bali di Bali. Penentuan Bali sebagai pilot project dengan alasan masyarakat Bali
cenderung tertutup, kebanyakan orang menikah dengan sesama suku Bali. Pada
pemeriksaan polimorfisme pada gen Uncoupling protein 2 (UCP2), tim peneliti
melaporkan bahwa polimorfisme gen UCP2 Ala55Val (C544T) berhubungan
dengan DM di Legian, Kuta, Bali (n=287) (Saraswati MR, 2012). Subjek yang
berada pada perkotaan dan memiliki polimorfisme pada gen UCP2G(âˆ‟866)A
and Ala55Val juga mempunyai body mass index (BMI) yang lebih tinggi
dibandingkan dengan subjek yang memiliki genotip yang sama namun berada
pada pedesA/An. Penelitian ini menunjukkan adanya kerentanan seseorang
terhadap kejadian DM dan obesitas jika individu tersebut melakukan gaya hidup
perkotaan (Oktavianthi, 2012). Peneliti mengakui penelitian ini belum sempurna
dan baru merupakan pilot project karena baru terbatas pada Bali dan dengan
jumlah sampel yang masih sedikit 603 responden (278 urban dan 325 rural).
Berbagai penelitian melaporkan bahwa variasi genetik ini berhubungan
dengan variasi etnik dan jenis kelamin. Skrining dilakukan berdasarkan penelitian
sebelumnya yang menyatakan bahwa variasi genetik berhubungan dengan variasi
etnik dan jenis kelamin (Gainer JV, et.al. 2001 & Palmer BR, et.al. 2003), maka
untuk populasi masyarakat Indonesia perlu dilakukan skrining terlebih dahulu.
Dengan mengetahui variasi genetik pada populasi di Indonesia, efektifitas kontrol
faktor-faktor risiko DM diharapkan dapat diprediksi. Data ini akan menjadi
masukan yang bermanfaat dalam merancang strategi yang tepat pada program
pencegahan dan pengendalian PTM, khususnya DM. Dengan demikian biaya
pengobatan dan kontrol faktor-faktor risiko DM dapat ditangani dengan lebih baik,
sehingga angka morbiditas dan mortalitasnya dapat ditekan.
7
Penelitian ini ingin diketahui bagaimana marker prediktor DM pada
populasi studi kohor FR-PTM.Penelitian ini bertujuan mencari besarnya
hubungan antara faktor penyakit DMyang tidak dapat diubah yaitu faktor genetik,
dalam hal ini adalah polimorfisme gen yang berkaitan dengan kejadian DM,
dengan kejadian penyakit DM. Penelitian ini juga bertujuan mendapatkan besaran
asosiasi polimorfisme gen-gen tersebut terhadap kejadian penyakit DM. Untuk itu,
karena DM merupakan penyakit yang sangat dipengaruhi oleh faktor lingkungan,
seperti gaya hidup berupa aktifitas fisik, pola makan, riwayat merokok dan minum
alkohol, maka data-data tersebut diperlukan untuk dapat mengukur besaran
asosiasi pengaruh gen terhadap kejadian DM. Munculnya penyakit atau faktor
risiko lain yang mempunyai pencetus yang sama juga sangat berpengaruh
terhadap prediksi kejadian DM, antara lain obesitas, terutama obesitas sentral,
hipertensi dan dislipidemia.
Studi kohor FR-PTM merupakan studi kohor prospektif untuk melihat
faktor-faktor risiko PTM (stroke, PJK, DM, hipertensi) berbasis masyarakat yang
dilakukan di Kota Bogor Tengah dan telah dimulai sejak tahun 2011 dengan
responden yang akan terus diikuti sampai dengan tahun 2019. Data yang
dikumpulkan berupa demografi, riwayat penyakit, faktor risiko perilaku,
kebiasaan makan, riwayat penyakit keluarga, pemeriksaan antropometri, tekanan
darah, elektrokardiografi, saraf, rontgen torak dan laboratorium (gula darah,
kolesterol total, LDL, HDL dan trigliserida) setiap dua tahun sekali. Jumlah
responden sebanyak sekitar 5000 responden dibagi menjadi 2 tahap (baseline data
tahap 1 dimulai tahun 2011 sebanyak 2100 responden dan tahap 2 tahun 2012
sebanyak 2900 responden). Sehingga penelitian ini dibagi dalam 2 tahap
pengambilan sampel, yaitu tahap 1 tahun 2015 yang dihadiri 1173 responden dan
tahap 2 pada tahun 2016 dihadiri oleh 2172 responden.
Hasil uji multinomial regresi logistik pada penelitian Variasi Marker
Genetik Prediktor DM tahun 2015 menunjukkan bahwa individu dengan alel
homozigot mutan A/A untuk SNP rs972283 pada gen KLF14 dan rs3745367
dalam gen RETN (resistin), serta genotipe G/G pada rs5945326 gen
DUSP9/MKP4 memiliki kecenderungan untuk menjadi DM sekitar 2 kali lipat
dibandingkan dengan individu alel homozigot asal.
8
BAB III
METODE PENELITIAN
III.1. Kerangka Teori
Keterangan: Karakteristik individu dan gaya hidup akan memicu faktor risiko
penyakit. Penelitian akan dilakukan dengan memeriksa gen-gen
pemicu dan yang berhubungan dengan DM.
III. 2. Kerangka Konsep
Keterangan: Individu normal dan prediabetes diantaranya mempunyai genetik
yang rentan terhadap DM, menjadi faktor resiko genetik. Faktor
risiko lain seperti umur, jenis kelamin, merokok, aktifitas fisik,
asupan makanan, sosial ekonomi, obesitas, hipertensi dan
dislipidemia, tidak dianalisis dalam penelitian ini karena sudah
diteliti oleh studi kohor PTM. Namun data penelitian ini akan
dihubungkan dengan data studi kohor PTM terutama yang terkait
dengan DM dan data genomik dan marker protein ini akan
Gen KCNQ1, IGF2BP2,
DUSP9/MKP4 Gangguan sekresi insulin
Gen UCP2, KLF14
Karakteristik individu Lifestyle
Jenis kelamin, usia,
TB/BB, Pekerjaan, Genetik Kurang olah raga, pola makan
tinggi kalori dan lemak
Gen RETN, SLC30A8
Obesitas DM
Resistensi insulin
Hipoadiponektinemia
Gen ADIPOQ
Gangguan metabolisme pada
jaringan adiposa
Gen Leptin Pengaturan rasa lapar
Pre-DM
Studi Kohor PTM:
- Identifikasi PTM dan faktor risiko PTM
- Data demografi, riwayat penyakit, pemeriksaan fisik,
EKG, rontgen & laboratorium
Studi Marker Genetik Prediktor
DM PBTDK:
- Pemeriksaan gen petanda DM
- Pemeriksaan protein penanda DM
Normal
DM
Output:
data faktor
risiko PTM
9
melengkapi dan memperkaya data studi kohor faktor risiko PTM
Badan Litbangkes.
III.3 Desain dan Jenis Penelitian
Penelitian ini dirancang menggunakan desain potong lintang non
eksperimental pada responden studi kohor PTM. Penelitian berbasis laboratorium
biologi molekular.
III.4 Tempat dan Waktu
Pemeriksaan menggunakan bahan biologis tersimpan (BBT) di
Laboratorium Penelitian Penyakit Infeksi (PPI) P3BTDK, Jakarta yang
merupakan sampel Studi Kohor FR-PTM.
III.5 Populasi dan Sampel
III.5.1. Populasi
Populasi penelitian ini adalah semua responden studi kohor faktor risiko
PTM (laki-laki dan perempuan umur 25 – 65 tahun).
Penelitian studi kohor PTM telah berjalan sejak tahun 2011 dengan
pengambilan sampel secara 2 tahap. Tahap pertama 2100 responden (direkrut
tahun 2011, kemudian diikuti kesehatannya dan dilakukan pemeriksaan
kesehatan pada tahun 2013 dan 2015). Tahap kedua 2900 responden (direkrut
tahun 2012, kemudian diikuti kesehatannya dan dilakukan pemeriksaan
kesehatan pada tahun 2014 dan 2016). Namun karena ada beberapa responden
drop out karena pindah domisili atau menolak dilakukan pemeriksaan
kesehatan), maka jumlah responden studi kohor PTM yang dilakukan
pemeriksaan kesehatan pada tahun 2015 berkurang menjadi 1173 responden
dan 2016 sebanyak 2172 responden.
Pemeriksaan marker genetik pada penelitian studi Variasi marker genetik
prediktor DM (tahap I) diambil dari responden studi kohor PTM tahap ke-1
tahun 2015 dan Studi Marker Protein Prediktor DM Pada Individu Dengan Pre-
Diabetes diambil dari responden studi kohor PTM tahap ke-2 tahun 2016.
10
III.5.2 Sampel
Responden studi kohor PTM yang menderita diabetes atau pre diabetes
dan kontrol normal (responden dengan kadar gula darah normal) yang dipilih
secara acak sesuai presentase jumlah diabetes dan pre diabetes.
III.5.3. Kriteria Inklusi dan Eksklusi
III.5.3.1. Kriteria Inklusi
Sampel responden studi kohor PTM yang tersimpan.
III.5.3.2. Kriteria Eksklusi
- Sampel rusak/ tidak mencukupi kadar/volumenya
- Tidak tersedia data kesmas (data gula darah/ riwayat DM)
III.5.4 Estimasi Besar Sampel, Cara Pemilihan dan Penarikan Sampel
Pemeriksaan genotyping pada seluruh sampel DM dan pre DM, serta
sebagian sampel normal sebagai kontrol, dengan jumlah seimbang. Karena
berdasarkan pemeriksaan gula darah didapatkan presentase DM sekitar 10%
dari jumlah populasi dan pre DM sekitar 30%, maka diambil kontrol normal
sebanyak 40% dari populasi. Sehingga dilakukan pemeriksaan genotyping pada
seluruh sampel DM dan pre DM, serta 40% dari sampel normal yang dipilih
secara acak. Total sebanyak 1475 sampel untuk pemeriksaan polimorfisme
pada gen UCP2 rs660339, DUSP9/MKP4 rs5945326, SLC30A8 rs13266634,
Resistin (RETN) rs3745367, IGF2BP2 rs16860234 dan KCNQ1 rs2237892.
Pemeriksaan protein resistin, insulin, c-peptide dan adiponektin
dilakukan pada sebagian sampel DM, pre DM dan normal, diambil secara acak
dengan total sampel 744 plasma.
III.5.5 Variabel
Variabel bebas/independen: individu normal, pre diabetes dan DM
Variable terikat/dependen:
- Marker genetik, yaitu: adanya SNP pada gen UCP2 rs660339,
DUSP9/MKP4 rs5945326, SLC30A8 rs13266634, Resistin (RETN)
11
rs3745367, IGF2BP2 rs16860234, KCNQ1 rs2237892, ADIPOQ
rs6773957 dan KLF14 rs972283.
- Marker protein, yaitu: kadar protein resistin, insulin, c-peptide dan
adiponektin
III.5.6 Definisi Operasional
Definisi operasional yang digunakan dalam penelitian ini adalah:
Diabetes
melitus
Kadar glukosa setelah 2 jam beban glukosa >200 mg/dL atau
pernah diagnosis DM
Prediabetes Yang tergolong TGT (Kadar glukosa plasma 2 jam setelah beban
antara 140 – 199 mg/dL) dan GDPT (Kadar glukosa plasma
puasa antara 100 – 125 mg/dL dan 2 jam beban glukosa
12
pemeriksaan kadar protein menggunakan kit elisa dari Sygma, pembacaan
menggunakan elisa reader dan berbagai bahan habis pakai.
III.7.2. Prosedur kerja
III.7.2.1. Pengambilan sampel
Sampel berupa Bahan Biologi Tersimpan (BBT) dari sampel studi
kohor FR-PTM yang telah diambil tahun 2016 dan diolah menjadi
buffycoat, DNA dan plasma, serta telah disimpan di biorepository
laboratorium penelitian penyakit infeksi Badan Litbangkes.
III. 7.2.2. Pengukuran kadar dan kemurnian DNA
Sampel DNA didapatkan dari biorepository Puslitbang Biomedis dan
Teknologi Dasar Kesehatan. Masing-masing sampel DNA yang akan
diperiksa, diambil 2µL untuk diukur konsentrasi dan kemurniannya dengan
alat kalkulator DNA NanoVue spectrofotometer (GE, USA). Tahapan
pemeriksaan ini dilakukan sebelum pemeriksaan polimorfisme gen. Tujuan
pemeriksaan untuk melakukan pengecekan terhadap kemurnian dan
konsentrasi DNA. Tahapan ini penting untuk melihat kemurnian DNA
terhadap kontaminan hasil ekstraksi. Selain itu, untuk mendapatkan hasil
konsentrasi dari DNA untuk menentukan pengenceran terhadap DNA untuk
pemeriksaan polimorfisme gen.
III.7.2.3. Persiapan Sampel
Sampel yang akan diperiksa harus diencerkan dulu konsentrasi
DNAnya sehingga dalam kisaran 1-10 ng/µl. Pengenceran dilakukan dengan
menambahkan nuclease free water dan menyamakan konsentrasi menjadi 5
ng/µl. Sampel yang memiliki konsentrasi DNA rendah (
13
III.7.2.4. Pemeriksaan Variasi Genetik (Polimorfisme)
Sebelum dilakukan pemeriksaan sampel dilakukan optimasi sampel
terlebih dahulu dengan mengambil beberapa sampel untuk diperiksa. Hal ini
dilakukan untuk menghindari hasil pemeriksaan yang buruk dan tidak
terbaca.
Pemeriksaan polimorfisme gen-gen yang dituju dilakukan dengan
menggunakan metode SNP TaqMan genotyping assay (Applied Biosystem,
USA). Dalam assay tersebut DNA responden akan direaksikan dengan
sepasang primer yang meliputi titik dimana nukleotida bermutasi, sepanjang
sekitar 100 basa. Di dalam reaksi SNP genotyping tersebut juga terkandung
dua (2) tipe probe, dimana keduanya mempunyai ikatan reporter
fluorochrome yang berbeda dan akan terikat pada target yang spesifik untuk
masing-masing probe; satu probe akan terikat pada alel asli (alel wild type)
dan probe lainnya pada alel yang telah bermutasi (alel mutan). Reaksi SNP
genotyping akan berjalan dalam mesin real time PCR, dengan menggunakan
enzim DNA polymerase dan suplai dNTPs. Hasil reaksi tersebut akan
berupa grafik yang akan menunjukkan type gen berdasarkan titik mutasi
nukleotida yang telah ditentukan untuk masing-masing gen. Sampel yang
digunakan adalah DNA hasil ekstraksi dengan konsentrasi 5 ng/ul sehingga
digunakan 10ng tiap reaksi dengan paduan master mix dan SNP genotyping
assay sesuai instruksi manual dari produk.
Analisa hasil reaksi SNP genotyping assay akan dilakukan dengan
memanfaatkan perangkat lunak dalam mesin real time PCR (Applied
Biosystem, USA) dan Taqman Genotyper.
Persiapan bahan
Master mix
Taqman genotyping assay master mix 12,5µl
Taqman genotyping SNP 1,25µl
RT PCR grade water 9,25µl
Sampel
Sampel yang telah diencerkan dengan nuclease free water 2 µl
Total volume persampel 25µl
14
Prosedur pemeriksaan :
Masukkan master mix terlebih dahulu 24,8µl ke dalam mikroplate 96
well 0,1 ml, kemudian sampel 0,2µl
Hindari terbentuknya bubble saat memasukkan master mix maupun
sampel
Atur alat sesuai ketentuan dalam kit
Baca hasil
Gen-gen yang akan diperiksa adalah sebagai berikut:
No. Gen Fungsi
1. ADIPOQ Mengatur produksi hormone adiponektin yang menginisiasi
pembakaran lemak dan proses penggunaan glukosa yang
berperan pada penurunan lemak dan peningkatan sensitivitas
insulin. Diperkirakan berkaitan dengan resistensi insulin dan
disfungsi endotel
SNP+1212A>G (rs6773957).
2. KLF14 Master regulator ekspresi gen pada jaringan adipose
rs972283
3. Uncoupling
protein 2
(UCP2) gene
Peran UCP berhubungan degan metabolisme energi dan
obesitas. UCP1 terekspresi di jaringan lemak coklat, UCP2 di
sistem limfe dan pankreas, berkaitan dgn pengaturan sekresi
insulin. UCP3 di otot rangka, berkaitan dgn metabolisme lipid.
rs660339
4. DUSP9/MKP4 Dual specificity Phosphatase atau mitogen-activatedprotein
kinase phosphatase-4, berfungsi sebagai negative regulator pada
pathway insulin-stimulated
rs5945326
5. SLC30A8 Solute carrier family 30 (zinc transporter) member 8,
merupakan gen yang mengkode transporter zink yang
berhubungan dengan sekresi insulin pada manusia
rs13266634
6. Resistin
(RETN)
Mengkode hormon (adipokin) resistin yang dihasilkan jaringan
lemak putih. Resistin menekan diferensiasi adiposit yang diduga
15
berakibat penumpukan ektopik asam lemak dan lipotoksisitas
terhadap jaringan non-adiposit.
SNP+299(G>A) (rs3745367).
7. IGF2BP2 gen ini diduga mengatur fungsi sel beta (IGF2BP2 and obesity
interaction analysis for type 2 diabetes mellitus in Chinese Han
population, Wu HH et al. 2014).
Ras Melayu: rs16860234
8. KCNQ1. Mengkode subunit α kanal kalium, yang terutama terekspresi di
jantung, tetapi juga terekspresi di organ lain seperti pankreas.
Melayu: rs2283228 dan rs2237892 (C>T)
III.7.2.5. Pemeriksaan Protein
Pemeriksaan protein dilakukan pada plasma responden dengan pre
diabetes dengan normal dan DM sebagai kontrol. Pemeriksaan protein
dilakukan dengan metode elisa menggunakan kit komersial dari Sigma
Aldrich berdasarkan petunjuk dari produsen dan hasil optimasi. Protein
yang diperiksa: Adiponektin, resistin, c-peptide, insulin.
Petunjuk penyimpanan, isi komponen kit dan pengenceran buffer
sama pada semua protein. Berikut ini contoh metode pengenceran buffer
yang diambil dari kit pemeriksaan protein insulin.
Keterangan produk:
Kit ELISA Insulin manusia untuk serum, plasma dan supernatan
sel kultur. Nomor Produk : RAB 0327. Lot No : 0313E0259.
Penyimpanan :
Kit disimpan pada freezer -20ºC. Masa aktif 1 tahun. Hindarkan
dari pengulangan thawing. Standar harus di simpan pada suhu -20ºC atau
70ºC (disarankan -70ºC ). Microplate strips atau reagen yang sudah
terbuka bisa disimpan sampai dengan 1 bulan pada suhu 2-8ºC. Taruh
kembali wells yang tidak terpakai pada kemasan yang bersih dan kering
dan tutup rekat sepanjang tepinya.
16
Komponen :
1. Human Insulin Antibody-coated ELISA Plate (Item A) – RAB0327A-
EA; 96wells (12 stripsx8 wells) coated with anti-Human Insulin.
2. 20x Wash Buffer (Item B) – RAB WASH4
3. Lyophilized Human Insulin Protein Standar (Item C) – RAB0327C-
1VL
4. Biotinylated Human Insulin DeteC/Tion Antibody (Item F) –
RAB0327D-1VL
5. HRP-Streptavidin (Item G) – RABHRP5
6. ELISA Colorimetric TMB Reagent (HRP Substrate, Item H) –
RABTMB3
7. ELISA Stop Solution (Item l) – RABSTOP3
8. ELISA 1x Assay/Sample Diluent Buffer A (Item D1) – RABELADA-
30ML
9. ELISA 5x Assay/Sample Diluent Buffer B (Item E1) – RABELADB-
15ML
Susun peta sampel di mikroplate yang akan digunakan untuk reaksi.
Sampel dan reagen yang akan digunakan sebaiknya ditempatkan pada
suhu ruang (18-250C). Letakkan reagen pada es selama persiapan reagen.
Biarkan plate pada suhu ruang sebelum membuka penutupnya (Persiapan,
langkah 1).
Pengenceran buffer untuk sampel/cairan assay (Persiapan, langkah2):
Assay/sampe buffer diluent B (item E1) harus diencerkan 5 kali dengan
air distillasi sebelum digunakan.
Pengenceran buffer untuk sampel / cairan assay (Persiapan, langkah 3):
Pengenceran buffer sampel A (item D1) digunakan untuk
pengenceran dari serum atau sampel plasma. Persiapan untuk dilusi
sampel. Sampel yang akan diuji memiliki konsentrasi yang berbeda-
beda. Saran pengenceran untuk serum/plasma normal adalah 2 – 10 kali
(Insulin), 20-200 kali (Resistin), dan 20.000 kali (Adiponektin). Untuk
pemeriksaan protein C-peptide, encerkan sampel dengan buffer sampel A
dan biotinylated C-peptidesebanyak 4 kali pengenceran dengan
17
menambahkan 2,5 µL biotinylated C-peptide yang telah diencerkan 10
kali, 185 µL buffer A dan 62,5 µL sampel.
Keterangan : level protein bisa bervariasi antara sampel yang berbeda.
Faktor pengenceran optimal dari tiap sampel harus
ditentukan oleh peneliti.
Hasil optimasi pengenceran sampel:
- Protein Insulin: Plasma tidak diencerkan.
- Protein Adiponektin: Pengenceran plasma dilakukan sebanyak 20000
kali. Urutan langkah yang dilakukan adalah: tambahkan 2 µl plasma
ke dalam tube dengan 398 µl larutan Human Acrp 30 antibody coated
elisa plate untuk menyiapkan pengenceran sampel sebanyak 200 kali.
Campur perlahan dan ambil 2 µl dari sampel yang sudah diencerkan
sebanyak 200 kali tersebut. Masukkan juga 198 µl larutan Human
Acrp 30 antibody coated elisa plate untuk mengencerkan sampel
menjadi 20000 kali.
- Protein Resistin: Pengenceran plasma dilakukan sebanyak 200 kali.
Urutan langkah yang dilakukan adalah: tambahkan 1 µl plasma ke
dalam tube antibody coated elisa plate dengan 198 µl larutan buffer A
untuk menyiapkan pengenceran sampel sebanyak 200 kali.
- Protein C-peptide: Plasma tidak diencerkan. Sebanyak 62,5 µL sampel
plasma ditambahkan 2,5 µL biotinylated C-peptide yang telah
diencerkan 10 kali dan 185 µL Buffer A.
Pengenceran masing- masing reagen yang akan digunakan, yaitu
Wash buffer,Enzyme conjugate, Biotnylated DeteC/Tion Antibody, dan
HRP- Streptavidin concentrate.
Penyiapan bahan standar (Persiapan, langkah 4):
Lakukan pemutaran (sentrifugasi) sebanyak satu buah vial item C,
tambahkan 400µl cairan assay A (untuk sampel serum/plasma) atau 1x
cairan assay B (untuk supernatan sel kultur) ke dalam vial item C untuk
membuat 1400 µlU/ml standar. Larutkan bubuk seluruhnya dan lakukan
pencampuran secara lembut. Tambahkan 150 µl standar insulin (1400
µlU/ml) dari vial item C, ke dalam tabung dengan 550 µl cairan assay A
18
atau 1x cairan assay B untuk mempersiapkan larutan standar. Pipet
sebanyak 300 µl cairan assay A atau 1x cairan assay B ke dalam tiap
tabung. Gunakan larutan standar sebanyak 300 µl untuk memproduksi
seri pengenceran/larutan (seperti pada gambar. Campur setiap tube
keseluruhan sebelum berpindah. Cairan assay A atau 1x cairan assay B
bertindak sebagai standar nol (0 µlU/ml).
Persiapan deteksi antibody Biotinylates (Persiapan, langkah 5) :
Lakukan pemutaran vial deteksi antibodi (ITEMF) sebelum
digunakan. Tambahkan 100 µl fari 1x cairan buffer B (Item E1) ke dalam
vial untu persiapan cairan konsentrat deteksi antibodi. Pipet dengan
menarik dan lepas untuk mencampur secara lembut (konsentrat dapat di
simpan pada suhu 4ºC selama 5 hari). Konsentrat deteksi antibodi harus
diencerkan 80 kali dengan 1x cairan Buffer B (Item E1) dan digunakan
pada prosedur, langkah 4.
Pengenceran HRP-Streptavidin konsentrat (persiapan, langkah 6) :
Lakukan pemutaran vial konsentrat HRP-Streptavidin dan campur
secara lembut menggunakan pipet sebelum digunakan, karena lapisan
endapan bisa terbentuk saat penyimpanan. Konsentrat HRP-Streptavidin
harus diencerkan 500 kali dengan 1x cairan buffer B (item E1).
Sebagai contoh : lakukan pemutaran vial (Item G) dan campur
dengan pipet secara lembut. Tambahkan 30 µl konsentrat HRP-
Streptavidin ke dalam tabung dengan 15 ml 1x cairan Assay B untuk
mempersiapkan pengenceran sebanyak 500 kali larutan HRP-
19
Streptavidin (jangan menyimpan larutan untuk digunakan keseokan
harinya). Campurlah dengan merata.
Prosedur Kerja:
1. Susun peta sampel pada masing- masing mikroplate
2. Pipet sebanyak 25 μL dari insulin standar, kontrol, dan sera dalam
masing- masing well
3. Tambahkan 100 μL dari “ Working Insulin Enzyme Conjugate” 1X
pada masing- masing well
4. Di canpurkan selama 10 detik
5. Inkubasi selama 60 menit pada suhu ruang (18-260C).
6. Buang cairan dari semua well dan cuci sebanyak 3 kali dengan
300μL dengan menggunakan 1x Wash Buffer.
7. Tambahkan 100 μL TMB Substrat pada masing- masing well
8. Inkubasi selama 15 Menit pada suhu ruang
9. Tambahkan 50 μL “Stop Solution” pada masing- masing well dan
dihomogenkan
10. Baca Absorban di Elisa Reader pada panjang gelombang 450 nm.
Typical Data
Sensitifitas :
Minimun dosis untuk deteksi human insulin yang ditentukan adalah
4 µlU/ml.
Dosis minimum yang dapat di deteksi didefinisikan sebagai
konsentrasi analit yang menghasilkan absorbansi yaitu 2 standar deviasi
yang lebih tinggi dari pada blanko (cairan buffer).
20
Recovery (perbaikan) :
Perbaikan ditentukan dengan mengacu pada level dari human
insulin yang bervariasi pada type sampel seperti pada daftar berikut.
Rata-rata perbaikan sebagai berikut :
Linearitas
Spesifisitas :
Kit ELISA ini tidak menunjukan reaktifitas silang dengan cytokine
yang sudah diuji yaitu : Human BDNF, BLC, ENA-78, IL-1 alpha, IL-1
beta, IL-2, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12p70, IL-
12p40,IL13,IL-15, I-309, IP-10, G-CSF, GM-CSF, IFN-gamma, Leptin
(OB), MCP-1, MCP-2, MCP-3, MDC, MIP-1 alpha, MIP-1 beta, MIP-1
delta, PARC, PDGF, RANTES, SCF, TARC, TGF-beta, TIMP-1, TNF-
alpha, TNF-beta, TPO, VEGF.
III.8. Manajemen dan Analisis Data
Data identitas, demografi dan riwayat penyakit serta hasil pemeriksaan
laboratorium akan didapatkan dari studi kohor PTM. Analisa data akan dilakukan
dengan mengunakan perangkat lunak SPSS dan Taqman Genotyper. Analisis
Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) dan odds ratio menggunakan software
online dari www.oege.org. Tingkat kemaknaan () ditentukan pada nilai
probabilitas (p) kurang dari 5%.
http://www.oege.org/
21
III.9. Pertimbangan Etik Penelitian
Data sosiodemografi dan spesimen darah diperoleh dari data dan spesimen
responden studi Kohor PTM, Badan Litbangkes. Dalam studi Kohor PTM,
responden telah dimintakan persetujuan setelah penjelasan dan di dalamnya telah
menyebutkan kesedeiaan diambil darah dan dilakukan pemeriksaan faktor risiko
genomik PTM, termasuk DM.
Persetujuan etik didapatkan dari Komisi Etik Penelitian Kesehatan Badan
Litbangkes No. LB.02.01/2/KE.235/2017tanggal 19 Juni 2017.
III.10. Pertimbangan Izin Penelitian
Tidak memerlukan izin penelitian khusus karena merupakan penelitian
laboratorium dan dikerjakan di laboratorium PPI, P3BTDK dengan sampel studi
Kohor PTM tahun 2016.
22
BAB IV
HASIL PENELITIAN
Spesimen darah yang diterima dari Studi kohort faktor risiko PTM sebanyak
2173 dan diproses menjadi plasma dan buffycoat. Spesimen buffycoat yang
terkumpul dilakukan ekstraksi DNA untuk dilakukan tahap pemeriksaan
selanjutnya. DNA dan buffycoat disimpan di repository Puslitbang Biomedis dan
Teknologi Dasar Kesehatan. Penelitian ini dilakukan terhadap spesimen tersimpan
dari responden yang menderita DM, pre DM dan sampel normal sebagai kontrol.
Pemeriksaan genotyping dilakukan pada seluruh responden dengan DM, pre
DM dan sebagian responden dengan gula darah normal yang dipilih secara acak,
sehingga berjumlah 1475 sampel. Namun tidak seluruh sampel menampilkan hasil
genotyping, sehingga jumlah data yang dianalisis pada tiap gen berbeda-beda.
Jumlah sampel DM sebanyak 199, pre DM 633 dan normal sebanyak 643 sampel.
Pemeriksaan protein resistin, insulin, c-peptide dan adiponektin dilakukan pada
sampel DM, pre DM dan kontrol normal dengan jumlah sampel DM sebanyak 88,
pre DM 280 dan normal sebanyak 376 sampel, total sampel 744 plasma.
Hasil Ekstraksi DNA
Nilai rerata konsentrasi DNA hasil ekstraksi adalah 213 ng/ul dan
kemurniannya 1,85. Hasil konsentrasi ini dijadikan rujukan untuk melakukan
pengenceran hingga 10 ng/ul untuk melakukan pemeriksaan SNP genotyping.
Nilai konsentrasi dan kemurnian tertuang dalam Lampiran 1.
Polimorfisme Gen UCP2 rs660339
Gen UCP2, yaitu salah satu gen yang berperan dalam metabolisme energi
dan terjadinya obesitas. UCP2 terekspresi di sistem limfe dan pankreas, berkaitan
dengan pengaturan sekresi insulin. Dijumpai polimorfisme G>A pada rs660339.
23
Gambar 1. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada gen UCP2 rs660339 pada responden DM,
Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota Bogor tahun 2016.
Gambar 1 menyajikan distribusi alel homozygot wildtype dan mutan serta
heterozygot pada rs660339 gen UCP2 pada kasus DM. Proporsi genotipe Gen
UCP2 dengan polimorfisme G>A pada responden DM terbesar adalah A/G
45,50%, dikuti G/G 36%, lalu A/A (mutan) 18,5%. Frequensi alel A adalah 41,3%
dan G 58,7%. Tidak ada perbedaan bermakna antara ketiga genotipe dengan p
value 0,413.
Gambar 2. Distribusi alel a/a, a/g dan g/g pada gen ucp2 rs660339 pada responden normal,
Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota Bogor, 2016.
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
24
Gambar 2 menyajikan distribusi alel homozygot wildtype dan mutan serta
heterozygot pada rs660339 gen UCP2 pada populasi normal. Terlihat proporsi
genotipe A/A paling sedikit, sebanyak 19%, G/G33,5% dan heterozygot A/G
paling banyak pada kelompok normal, yaitu sebesar 47,5%. Frekuensi alel A
42,8% dan alel G 57,2%. Tidak ada perbedaan bermakna antara ketiga genotipe
dengan p value sebesar 0,449.
Gambar 3. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada gen UCP2 rs660339 pada responden
dengan pre DM, Studi Kohor Faktor Risiko PTM, Kota Bogor, 2016.
Gambar 3 menyajikan distribusi alel homozygot wild dan mutan serta
heterozygot pada rs660339 gen UCP2 pada populasi pre DM. Proporsi homozygot
A/A paling sedikit sebesar 14,3%, heterozygot A/G 38,8%, sedangkan homozygot
G/G terbesar, yaitu 46,9%. Frekuensi alel A 33,7% dan G 66,3%. Nilai p value
0,008, menunjukkan terdapat perbedaan bermakna antara ketiga kelompok alel
tersebut pada kelompok pre DM.
Polimorfisme Gen KCNQ1 rs2237892
Gen KCNQ1 yang diduga mengatur fungsi sel beta pankreas mempengaruhi
produksi insulin. Dijumpai polimorfisme C>T pada rs2237892. Frekuensi
polimorfisme pada gen KCNQ1 rs2237892 pada kelompok DM disajikan dalam
Gambar 4.
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
25
Gambar 4. Distribusi alel T/T, C/T dan C/C pada gen KCNQ1 rs2237892 pada responden
DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Tampak dalam Gambar 4 frekuensi homozygot T/T paling sedikit, yaitu
10,1%, diikuti heterozygot C/T 32,3% dan yang paling banyak adalah homozygot
C/C (wildtype) pada kelompok DM, lebih dari separuh populasi yaitu 57,6%.
Frekuensi alel C 73,7% dan T 26,3%. Dengan nilai p sebesar 0,036 menunjukkan
terdapat perbedaan bermakna proporsi genotipe pada kelompok DM.
Gambar 5. Distribusi alel T/T, C/T dan C/C pada gen KCNQ1 rs2237892 pada responden
normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Keterangan:
Biru : T/T
Hijau : C/T
Merah : C/C
Keterangan:
Biru : T/T
Hijau : C/T
Merah : C/C
26
Gambar 5 menyajikan distribusi alel homozygot wild dan mutan serta
heterozygot pada rs2237892 Gen KCNQ1 pada responden normal. Terlihat
proporsi homozygot mutan T/T paling sedikit yaitu 15,6%, diikuti C/C 37,3% dan
heterozygot C/T paling banyak pada kelompok normal, yaitu 47,1%. Frekuensi
alel C 60,8% dan T 39,2%. Nilai p sebesar 0,6 menunjukkan tidak ada perbedaan
bermakna proporsi ketiga genotipe pada kelompok normal.
Gambar 6 menyajikan distribusi alel homozygot wild dan mutan serta
heterozygot pada rs2237892 Gen KCNQ1 pada reponden dengan pre DM.
Terlihat proporsi homozygot mutan T/T paling sedikit, yaitu 16,3%, diikuti C/T
sebesar 32,4% dan homozygot C/C paling banyak pada kelompok pre DM, yaitu
51,3%. Frekuensi alel C 67,5% dan T 32,5%. Nilai p pada kelompok ini sebesar
0,0 menunjukkan terdapat perbedaan bermakna antara ketiga genotipe.
Gambar 6. Distribusi alel T/T, C/T dan C/C pada gen KCNQ1 rs2237892 pada responden
dengan pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Polimorfisme Gen RETN rs3745367
Gen RETN, yaitu gen yang mengkode resistin, suatu sitokin atau faktor
sekretorik yang spesifik dihasilkan jaringan adiposa. Resistin diduga berperan
pada timbulnya obesitas dan diabetes melitus tipe 2. Dijumpai polimorfisme G>A
pada rs3745367. Frekuensi polimorfisme gen RETN rs3745367 pada penderita
DM disajikan dalam Gambar 7.
Keterangan:
Biru : T/T
Hijau : C/T
Merah : C/C
27
Gambar 7. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen RETN rs3745367 pada responden
DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Apabila dilihat proporsinya pada penderita DM, maka terlihat frekuensi
terbesar penderita DM pada studi ini adalah mempunyai genotipe A/G, yaitu
47,2%, diikuti G/G sebesar 40,7% dan terkecil genotipe A/A, yaitu 12,1%.
Frekuansi alel A pada kelompok DM sebesar 35,7% dan G 64,3%. Nilai p sebesar
0,681. Tidak terdapat perbedaan bermakna antara ketiga genotipe pada kelompok
DM. Sedangkan pada kelompok normal dan pre DM ditampilkan pada Gambar 8
dan 9.
Gambar 8. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen RETN rs3745367 pada responden
normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
28
Gambar 8 menunjukkan proporsi terbesar pasangan alel pada Gen RETN
rs3745367 pada responden normal adalah heterozygot A/G yaitu sebesar 55%,
sekitar separuh responden normal. Diikuti genotipe homozygot G/G sebesar
38,2% dan A/A terkecil yaitu 6,8%. Terdapat perbedaan bermakna antara ketiga
genotipe pada kelompok normal, dengan nilai p 0,0. Frekuensi alel A pada
kelompok normal sebesar 34,3% dan G sebesar 65,7%. Gambar 9 menyajikan
distribusi alel pada responden pre DM.
Gambar 9 menunjukkan proporsi terbesar pada kelompok pre DM adalah
heterozygot A/G, yaitu hampir separuh dari responden 54,5%. Diikuti G/G
sebesar 35,3% dan A/A 10,3%. Gambaran ini hampir sama dengan kelompok
normal, namun terdapat pola kecenderungan proporsi genotipe A/A semakin kecil
pada kelompok normal dan paling besar pada kelompok DM. Frekuensi alel A
37,5% dan G 62,5%. Nilai p 0,0 menunjukkan terdapat perbedaanyang bermakna
antara ketiga genotipe pada responden pre DM.
Gambar 9. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen RETN rs3745367 pada responden
dengan pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Polimorfisme gen DUSP9/MKP4 rs5945326
Salah satu gen yang berperan sebagai regulator negatif pada jalur stimulasi
penghasil insulin, yaitu gen DUSP9/MKP4. Terdapat polimorfisme A>G pada
rs5945326. Frekuensi pasangan alel pada rs5945326 gen DUSP9/MKP4 pada
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
29
kelompok DM disajikan dalam Gambar 10. Sedangkan pada kelompok normal
disajikan dalam Gambar 11.
Gambar 10. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen DUSP9/MKP4 rs5945326 pada
responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Pada Gambar 10 terlihat proporsi terbesar pada kelompok DM adalah
genotipeG/G yaitu 48,7% hampir separuh responden. Diikuti A/A 37% dan A/G
14,3%. Frekuensi alel A 44,2% dan G 55,8%. Nilai p sebesar 0,0 menunjukkan
terdapat perbedaan bermakna antara kelompok genotipe pada responden DM.
Gambar 11. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen DUSP9/MKP4 rs5945326 pada
responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
30
Gambar 11 menyajikan distribusi alel pada Gen DUSP9/MKP4 rs5945326
pada responden normal. Proporsi terbesar adalah genotipe G/G, yaitu 57,7% lebih
dari separuh responden. Diikuti A/G 33% dan A/A 29%. Nilai p 0,0 menunjukkan
terdapat perbedaan bermakna pada ketiga genotipe ini pada responden normal.
Frekuensi alel A 35,6% dan G 64,4%.
Gambar 12. Distribusi alel A/A, A/G dan G/G pada Gen DUSP9/MKP4 rs5945326 pada
responden pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Gambar 12 menyajikan distribusi genotipe DUSP9/MKP4 rs5945326 pada
responden pre DM. Terlihat proporsi terbesar adalah genotipe G/G, yaitu 53,1%
lebih dari separuh responden. Diikuti A/A 30,2% dan A/G 16,8%. Nilai p 0,0
menunjukkan terdapat perbedaan bermakna pada ketiga genotipe ini pada
responden pre DM. Frekuensi alel A 38,5% dan G 61,5%.
Polimorfisme Gen SLC30A8 rs13266634
Gen SLC30A8, yaitu transporter ion seng (Zn) yanng merupakan solute
carrier family 30 member 8, merupakan gen yang mengkode transporter Zn yang
berhubungan dengan sekresi insulin pada manusia. Dijumpai polimorfisme C>T
pada rs13266634. Distribusi genotipe gen SLC30A8 rs13266634 pada kelompok
DM disajikan dalam Gambar 13, sedangkan pada kelompok normal disajikan
dalam Gambar 14. Terlihat genotipe terbesar pada kelompok DM adalah C/T,
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
31
yaitu 40,7%. Diikuti C/C 31,9% dan T/T 27,4%. Nilai p 0,03 menunjukkan
terdapat perbedaan bermakna pada ketiga genotipe ini pada responden DM.
Frekuensi alel C 52,2% dan T 47,8%.
Gambar 13. Distribusi genotipeC/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8 rs13266634 pada
responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Terlihat pada Gambar 14 bahwa genotipe terbesar pada kelompok normal
pada gen SLC30A8 rs13266634 adalah C/C, yaitu 37,6%. Diikuti C/T 33,7% dan
T/T 28,7%. Nilai p 0,0 menunjukkan terdapat perbedaan bermakna antara ketiga
genotipe ini pada responden normal. Frekuensi alel C 54,5% dan T 45,5%.
Gambar 14. Distribusi alel C/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8 rs13266634 pada
responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Keterangan:
Biru : T/T
Hijau : C/T
Merah : C/C
Keterangan:
Biru : T/T
Hijau : C/T
Merah : C/C
32
Gambar 15 menyajikan variasi genotipe SLC30A8 rs13266634 pada
kelompok responden dengan pre DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada
kelompok pre DM adalah C/C, yaitu 39,2%. Diikuti C/T 36,8% dan T/T 24,1%.
Nilai p 0,0 menunjukkan terdapat perbedaan bermakna pada ketiga kelompok
genotipe ini pada responden pre DM. Frekuensi alel C 57,5% dan T 42,5%.
Gambar 15. Distribusi alel C/C, C/T dan T/T pada Gen SLC30A8 rs13266634 pada
responden pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Polimorfisme Gen IGF2BP2 rs16860234
Gen IGF2BP2 yang diduga mengatur fungsi sel beta pankreas
mempengaruhi produksi insulin. Dijumpai polimorfisme A>C pada rs16860234.
Distribusi genotipe pada gen IGF2BP2 rs16860234 disajikan dalam Gambar 16
untuk kelompok DM, Gambar 17 pada kelompok normal dan Gambar 18 pada
kelompok pre DM.
Keterangan:
Biru : T/T
Hijau : C/T
Merah : C/C
33
Gambar 16. Distribusi genotipe A/A, A/C dan C/C pada Gen IGF2BP2 rs16860234 pada
responden DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Gambar 16 menyajikan variasi gen IGF2BP2 rs16860234 pada kelompok
responden dengan DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada kelompok DM
adalah A/C, yaitu 47,6%. Diikuti A/A 41,9% dan C/C 10,5%. Nilai p 0,429
menunjukkan tidak terdapat perbedaan bermakna pada ketiga kelompok genotipe
ini pada responden DM. Frekuensi alel A 65,7% dan C34,4%.
Gambar 17. Distribusi genotipe A/A, A/C dan C/C pada Gen IGF2BP2 rs16860234 pada
responden normal, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016
Keterangan:
Biru : C/C
Hijau : AC
Merah : A/A
Keterangan:
Biru : C/C
Hijau : AC
Merah : A/A
34
Gambar 17 menyajikan variasi genotipe IGF2BP2 rs16860234pada
kelompok responden normal. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada kelompok
normal adalah A/C, yaitu 49,7%. Diikuti A/A 44,2% dan C/C 6,1%. Nilai p 0,449
menunjukkan tidak terdapat perbedaan bermakna pada ketiga kelompok genotipe
ini pada responden DM. Frekuensi alel A 69,0% dan C 31,0%.
Gambar 18. Distribusi genotipe A/A, A/C dan C/C pada Gen IGF2BP2 rs16860234 pada
responden pre DM, studi kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Gambar 18 menyajikan variasi genotipe IGF2BP2 rs16860234pada
kelompok responden dengan pre DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada
kelompok pre DM adalah A/C, yaitu 38,9%. Diikuti A/A 52,4% dan C/C 8,6%.
Nilai p 0,430 menunjukkan tidak terdapat perbedaan bermakna pada ketiga
kelompok genotipe ini pada responden pre DM. Frekuensi alel A 71,9% dan C
28,1%.
Polimorfisme Gen KLF14 rs972283
Gen KLF14, yaitu salah satu gen yang berperan sebagai master regulator
ekspresi gen pada jaringan adipose pada rs972283 dijumpai polimorfisme A>G.
distribusi genotipe pada gen KLF14 rs972283 di kelompok responden dengan DM
disajikan dalam Gambar 19.
Keterangan:
Biru : C/C
Hijau : AC
Merah : A/A
35
Gambar 19. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden DM, studi kohor faktor
risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Gambar 19 menyajikan variasi genotipe KLF14 rs972283 pada kelompok
responden DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada kelompok DM adalah
A/G, yaitu 43,2%, hampir separuh responden DM. Diikuti G/G37,9% dan
A/A18,9%. Nilai p 0,136 menunjukkan tidak terdapat perbedaan bermakna pada
ketiga kelompok genotipe ini pada responden DM. Frekuensi alel A 40,5% dan
G59,5%.
Gambar 20. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden normal, studi kohor faktor
risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
36
Gambar 20 menyajikan variasi genotipe KLF14 rs972283 pada kelompok
responden normal. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada kelompok normal
adalah A/G, yaitu 53,3%, lebih dari separuh responden normal. Diikuti G/G
35,9% dan A/A 10,6%. Nilai p 0,0 menunjukkan terdapat perbedaan bermakna
pada ketiga kelompok genotipe ini pada responden normal. Frekuensi alel A
37,4% dan G 62,6%.
Gambar 21 menyajikan variasi genotipe KLF14 rs972283 pada kelompok
responden dengan pre DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada kelompok pre
DM adalah G/G, yaitu 65,1%. Diikuti A/G 20,6% dan A/A14,3%. Nilai p 0,0
menunjukkan terdapat perbedaan bermakna pada ketiga kelompok genotipe ini
pada responden pre DM. Frekuensi alel A 24,6% dan G75,4%.
Gambar 21. Distribusi genotipe KLF14 rs972283 pada responden pre DM, studi kohor
faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Polimorfisme Gen ADIPOQ rs6773957
Gen ADIPOQ, mengatur produksi hormon adiponektin yang menginisiasi
pembakaran lemak dan proses penggunaan glukosa yang berperan pada penurunan
lemak dan peningkatan sensitivitas insulin. Diperkirakan berkaitan dengan
resistensi insulin dan disfungsi endotel. Dijumpai polimorfisme A>G pada
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
37
rs6773957. Distribusi genotipe pada gen ADIPOQ rs6773957 disajikan dalam
Gambar 22 untuk responden DM, Gambar 23 untuk responden normal dan
Gambar 24 untuk responden pre DM.
Gambar 22. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada responden DM, studi kohor
faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Gambar 22 menyajikan variasi genotipe ADIPOQ rs6773957 pada
kelompok responden DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada kelompok DM
adalah A/A, yaitu 38,4%. Diikuti A/G 33,8% dan A/A 27,8%. Nilai p 0,0
menunjukkan terdapat perbedaan bermakna pada ketiga kelompok genotipe ini
pada responden DM. Frekuensi alel A 55,3% dan G 44,7%.
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
38
Gambar 23. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada responden normal, studi
kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Gambar 23 menyajikan variasi genotipe ADIPOQ rs6773957 pada
kelompok responden normal. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada kelompok
normal adalah A/A, yaitu 56,3%, lebih dari separuh responden normal. Diikuti
A/G 25,4% dan G/G18,3%. Nilai p 0,0 menunjukkan terdapat perbedaan
bermakna pada ketiga kelompok genotipe ini pada responden normal. Frekuensi
alel A 69% dan G 31%.
Keterangan:
Biru : G/G
Hijau : A/G
Merah : A/A
39
Gambar 24. Distribusi genotipe gen ADIPOQ rs6773957 pada responden pre DM, studi
kohor faktor risiko PTM, kota Bogor tahun 2016.
Gambar 24 menyajikan variasi genotipe ADIPOQ rs6773957pada kelompok
responden dengan pre DM. Terlihat bahwa genotipe terbanyak pada kelompok pre
DM adalah A/A, yaitu 56%. Diikuti A/G 28,3% dan G/G15,7%. Nilai p 0,0
menunjukkan terdapat perbedaan bermakna pada ketiga kelompok genotipe ini
pada responden pre DM. Frekuensi alel A 70,2% dan G 29,8%.
Analisis Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) dan Odds Ratio
Analisis Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE) dan odds ratio menggunakan
software online dari www.oege.org. Seluruh gen yang diperiksa pada populasi
Studi Kohor Faktor Risiko PTM tidak dalam kesetimbangan HWE. Dimana nilai
p pada rs660339 dan rs16860234 sebesar 0,001-0,005; pada rs2237892,
rs3745367, rs5945326, rs6773957, rs972283 dan rs13266634 p
40
Tabel 1. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre DM pada gen UCP2
rs660339.
Test Odds Ratio 95% CI Chi sq p TestOdds
Ratio95% CI Chi sq p Test
Odds
Ratio95% CI Chi sq p
Het vs
Common
Hz
0,88 0,62-1,25 0,49 >0,05
Het vs
Common
Hz
0,58 0,46-0,74 18,65 0,05
Rare Hz vs
Het0,95 0,71-1,28 0,10 >0,05
Rare Hz vs
Common
Hz
0,91 0,58-1,42 0,19 >0,05
Rare Hz vs
Common
Hz
0,54 0,39-0,75 13,78
41
Tabel 3. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre DM pada gen RETN rs3745367.
Test Odds Ratio 95% CI Chi sq p TestOdds
Ratio95% CI Chi sq p Test
Odds
Ratio95% CI Chi sq p
Het vs
Common
Hz
0,80 0,58-1,12 1,64 >0,05
Het vs
Common
Hz
1,07 0,84-1,36 0,29 >0,05
Het vs
Common
Hz
0,99 0,79-1,23 0,01 >0,05
Rare Hz vs
Het2,07 1,21-3,54 7,37 0,005-0,01
Rare Hz vs
Het1,54 1,02-2,32 4,25 0,01-0,05
Rare Hz vs
Het1,67 1,14-2,44 7,13 0,005-0,01
Rare Hz vs
Common
Hz
1,67 0,97-2,87 3,44 >0,05
Rare Hz vs
Common
Hz
1,64 1,07-2,51 5,30 0,01-0,05
Rare Hz vs
Common
Hz
1,65 1,12-2,44 6,40 0,01-0,05
Normal vs DM SNP374 Normal vs PreDM SNP374 Normal vs (PreDM+DM) SNP374
Hasil analisis OR gen DUSP9/MKP4 rs5945326 menunjukkan genotipe
mutan G/G berisiko 1,5x lebih besar daripada genotipe A/A untuk menjadi DM,
dengan p yang bermakna. Hal ini disajikan dalam Tabel 4.
Tabel 4. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre DM pada gen
DUSP9/MKP4 rs5945326.
Test Odds Ratio 95% CI Chi sq p TestOdds
Ratio95% CI Chi sq p Test
Odds
Ratio95% CI Chi sq p
Het vs
Common
Hz
1,25 0,78-2,01 0,87 >0,05
Het vs
Common
Hz
1,37 0,99-1,9 3,72 >0,05
Het vs
Common
Hz
1,34 0,99-1,81 3,69 >0,05
Rare Hz vs
Het1,21 0,74-1,99 0,58 >0,05
Rare Hz vs
Het0,82 0,58-1,17 1,17 >0,05
Rare Hz vs
Het0,92 0,66-1,27 0,27 >0,05
Rare Hz vs
Common
Hz
1,52 1,08-2,14 5,73 0,01-0,05
Rare Hz vs
Common
Hz
1,13 0,88-1,46 0,91 >0,05
Rare Hz vs
Common
Hz
1,23 0,98-1,55 3,13 >0,05
Normal vs DM SNP594 Normal vs PreDM SNP594 Normal vs (PreDM+DM) SNP594
Hasil analisis OR genotipeSLC30A8 rs13266634terhadap kejadian DM
maupun pre DM menunjukkan tidak ada yang bermakna, dengan nilai p >0,05 dan
95%CI melewati angka 1. Hal ini disajikan dalam Tabel 5.
Tabel 5. Odds ratio antara genotipe dengan kejadian DM atau pre DM pada gen SLC30A8
rs13266634.
Test Odds Ratio 95% CI Chi sq p TestOdds
Ratio95% CI Chi sq p Test
Odds
Ratio95% CI Chi sq p
Het vs
Common
Hz
1,44 0,99-2,08 3,72 >0,05
Het vs
Common
Hz
1,05 0,81-1,37 0,15 >0,05
Het vs
Common