Laporan Praktikum Genetika

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Widya Setyaningtyas*, Haniyya, I. Sobari, K.S. Juarna, N. Restiana, Nuruliawati, Annisa, M. Khaerulloh

Universitas Indonesia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Departemen Biologi

April 2012

Abstrak

Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik yang digunakan untuk memperbanyak atau amplifikasi sekuen

DNA yang spesifik secara in vitro sehingga menghasilkan jutaan copy DNA. Teknik PCR dilakukan setelah melakukan

isolasi DNA. Siklus PCR terdiri atas 3 tahap yaitu denaturasi (pemisahan), annealing (pelekatan) dan elongasi

(pemanjangan). Tahapan-tahapan pada siklus PCR dipengaruhi oleh suhu dan waktu yang berbeda-beda. Keberhasilan

pelekatan primer dan DNA template dipengaruhi oleh melting temperature (Tm). Komponen-komponen yang berperan

penting dalam reaksi PCR yaitu DNA template, PCR buffer, kation divalen, nuclease free water, Deoxynucleoside

Triphosphat (dNTP), enzim Taq DNA polymerase, primer. Setiap komponen memiliki fungsi dan kegunaan masing-

masing. Teknik PCR digunakan untuk diagnosis penyakit genetik, studi forensik (DNA fingerprinting), terapi gen, proyek

pemetaan genom serta berbagai aplikasi analisis genetik lainnya. Hasil praktikum didapatkan salinan sekuen DNA yang

spesifik.

Kata kunci : Polymerase Chain Reaction (PCR); DNA; DNA polymerase; melting temperature

1. Pendahuluan

Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan

suatu teknik molekular yang digunakan untuk

menggandakan jumlah molekul DNA pada target

tertentu secara in vitro dengan cara mensintesis molekul

DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA

target tersebut melalui bantuan enzim dan

oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermal

cycler (Russel 1996: 304). PCR pertama kali ditemukan

*) Kelompok 2A 1

oleh Kary Mullis pada tahun 1985 (Butler 2005: 63).

Prinsip kerja PCR adalah proses penggandaan

(amplifikasi) DNA target tertentu dibantu oleh enzim

DNA polymerase yang akan memperbanyak bagian

spesifik yang diinisiasi oleh primer dengan cara

menghubungkan dNTP-dNTP dalam suatu reaksi termal

(Wolfe 1993: 137).

Suatu reaksi PCR dilakukan dengan

menambahkan komponen- komponen penting kemudian

diencerkan menggunakan nuclease free water (pelarut)

sampai didapatkan konsentrasi yang diinginkan dari

setiap komponen tersebut (Butler 2005: 65). Komponen-

komponen penting yang dibutuhkan dalam reaksi PCR

adalah DNA template, larutan penyangga (PCR buffer),

enzim DNA polymerase, Deoxynucleoside Triphosphat

(dNTP),dan primer (Muladno 2010: 64). DNA template

adalah cetakan DNA yang terdiri dari empat nukleotida.

DNA template berfungsi untuk memastikan bahwa

reaksi PCR terjadi pada sekuen DNA spesifik yang

diinginkan. Larutan penyangga (PCR buffer) berguna

menjaga keseimbangan PH selama reaksi PCR

berlangsung. Enzim DNA polymerase yang paling

banyak digunakan adalah Taq DNA polymerase. Taq

DNA polymerase berasal dari sel bakteri Thermus

aquaticus yang hidup di lingkungan dengan panas yang

ekstrim (Butler 2005: 67-68). Deoxynucleoside

Triphosphat (dNTP) merupakan material utama untuk

membentuk basa komplementer pada hasil cetakan

DNA. Deoxynucleoside Triphosphat (dNTP) terdiri atas

dATP (Deoxyadenosine Triphosphat), dCTP

(Deoxycytosine Triphosphat), dGTP (Deoxyguanine

Triphosphat), dan dTTP (Deoxythymine Triphosphat).

Primer digunakan untuk mengidentifikasi DNA template

yang akan digandakan (Muladno 2010: 65).

Primer bagian yang berfungsi untuk mengapit ,

menentukan serta mengidentifikasi daerah spesifik dari

DNA target yang akan diamplifikasi. (Butler 2005: 65).

Primer yang berada sebelum DNA template disebut

sebagai primer forward dan primer yang berada setelah

DNA template disebut sebagai primer reverse. Primer

berukuran paling pendek sebanyak 16 basa dan biasanya

berkisar antara 18 sampai dengan 24 basa. Konsentrasi

primer yang dibutuhkan dalam proses PCR sekitar 1 μM

Primer merupakan pembatas fragmen DNA target yang

akan diamplifikasi dan berfungsi sebagai penyedia

gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang diperlukan

pada proses eksistensi DNA. Kandungan G+C atau

persentase jumlah G dan C sebaiknya sama atau lebih

besar dari kandungan G+C DNA target, karena primer

dengan persentase G+C yang lebih rendah tidak akan

mampu berkompetisi untuk menempel secara efektif

pada tempat yang dituju, sehingga akan menurunkan

efisiensi proses PCR. Primer yang baik juga harus

memiliki urutan nukleotida G atau C pada ujung 3’,

karena jika pada ujung 3’ terdapat urutan nukleotida A

atau T, maka primer tersebut dapat menurunkan

spesifitas primer itu sendiri. Primer yang baik juga harus

memiliki melting Temperature (Tm) yang berkisar

antara 50-65ºC (Muladno 2010: 64-65).

Satu siklus PCR terdiri atas 3 tahap yaitu

denaturasi (pemisahan), annealing (pelekatan), dan

elongasi (pemanjangan) (Stratchan & Read 1996: 129).

Denaturasi terjadi pada suhu 95oC selama waktu 30

detik. Tahapan denaturasi adalah tahapan untuk

menghentikan reaksi enzimatik yang tejadi sehingga

ikatan hidrogen terputus dan untai ganda DNA akan

terbuka menjadi untai tunggal. Tahapan annealing

terjadi pada saat suhu berkisar antara 50oC sampai

dengan 60oC. Primer forward yang berkomplemen

2

dengan salah satu untai tunggal akan menempel pada

posisi komplemennya dan juga primer reverse akan

menempel pada untai tunggal lainnya. Setelah kedua

primer tersebut menempel pada posisinya masing-

masing enzim Taq DNA polymerase mulai membantu

mensintesis molekul DNA baru. Proses ini disebut

sebagai tahapan elongasi yang terjadi pada suhu 72oC.

Tahapan elongasi ini akan membuat sekuen DNA

spesifik akan berlipat jumlahnya. Proses PCR biasanya

berlangsung hingga 30 sampai dengan 40 siklus

(Stansfield dkk. 2006: 84).

Keberhasilan pelekatan antara primer dan DNA

template ditentukan oleh Tm (melting temperature).

Temperatur penempelan yang digunakan biasanya 5oC ±

dari nilai Tm. Semakin panjang ukuran primer maka

semakin tinggi temperaturnya. Rumus untuk menghitung

nilai Tm adalah

Tm=4 (G+C)+2( A+T )

G adalah jumlah basa guanin, C adalah junlah basa

sitosin, A adalah jumlah basa adenin, dan T adalah

jumlah basa timin (Muladno 2010: 63).

Kelebihan metode PCR dibandingkan ddengan

teknik lain yaitu DNA template yang digunakan dapat

berjumlah sedikit dan diambil dari sel yang sama

kecilnya (Butler 2005: 80). Kelebihan yang dimiliki oleh

teknik PCR adalah teknik tersebut dapat bekerja pada

sampel yang sudah tua, langka, dan memiliki urutan

basa nukleotida yang sedikit (Lewis 2003: 186).

Kelebihan lainnya adalah kecepatan metode PCR lebih

cepat bila dibandingkan dengan Reaction fragment

length polymorphism atau dengan Southern analisis.

Reaksi yang dihasilkan metode PCR juga lebih spesifik

dan akurat serta mudah dilakukan secara otomatis (Dale

& Park 2004: 65). Kekurangan metode PCR yaitu DNA

template tidak dapat diamplifikasi karena adanya

inhibitor pada ekstraksi DNA (Butler 2005: 81). Metode

PCR juga memerlukan biaya yang cukup mahal, rentan

terhadap kontaminasi sehingga harus dilakukan kontrol

kualitas yang sangat ketat, dan tidak dapat mendeteksi

mutasi (Dale & Park 2004: 65).

Aplikasi dari PCR antara lain adalah untuk studi

forensik (DNA fingerprinting), terapi gen, diagnosa

penyakit genetik serta berbagai aplikasi analisis genetik

lainnya. DNA fingerprinting menggunakan prinsip tidak

ada individu yang memiliki sidik jari yang sama

sehingga sidik jari yang ditinggalkan di tempat kejadian

perkara (TKP) dapat menjadi bukti yang penting untuk

penyelidikan dan identifikasi pelaku kejahatan. Penyakit

gen dapat diobati dengan terapi gen. Penyakit genetik

dihasilkan dari fenotip yang terkena mutasi pada sel

somatik. Secara teori ada 2 tipe terapi gen yaitu terapi

sel somatik dan terapi sel gamet (Russell 1994: 310).

2. Metodologi

Alat yang digunakan pada praktikum PCR antara

lain micro tube, pipet mikro, tips, sarung tangan, dan

mesin thermal cycler. Bahan yang digunakan pada

praktikum PCR adalah DNA template (disc) danreaction

mix yang terdiri dari 14 μL ddH2O steril, Kapa 2G

Robust Buffer A dengan Mg 4 μL, 10 mm dNTPs 0.4 μL

, 20 μMprimer forward FvCRF 0.3 μL, 20 μMprimer

reverse FvCRR 0.3 μL, dan 2G Kapa Robust (5 U/μL).

Cara kerja pada praktikum PCR yaitu pertama

reaction mix yang terdiri atas komponen-komponen

penting dimasukkan ke dalam tube. Tahapan kerja

pembuatan reaction mixture diawali dengan pemberian

ddH2O steril dengan menggunakan mikropipet ke dalam

tabung PCR dengan volume masing-masing bagian 14

µl, sehingga diberikan 28 µl ke dalam tube tersebut. 5x

Kapa 2G Robust Buffer A with Mg ditambahkan ke

3

dalam tube tersebut dengan volume untuk masing-

masing bagian sebanyak 4 µl, sehingga diberikan dengan

volume 8 µl. Setelah itu, 10 mM dNTPs ditambahkan

dengan volume masing-masing 0.4 µl, sehingga

diberikan dengan volume 0.8 µl. Setelah ditambahkan

dNTPs, diberikan 20 µM primer FvCRF (forward) dan

20 µM primer FvCRR (reverse) untuk pembuatan satu

takaran reaction mixture, sehingga diberikan 40 µM

primer FvCRF dan 40 µM primer FvCRR ke dalam

tabung PCR tersebut. 2G Kapa Robust dengan takaran

0.5 U untuk satu reaksi, sehingga diberikan ke dalam

tabung tersebut sebanyak 1 U. Campuran tersebut dibagi

menjadi dua bagian yang sama ke dalam dua tube PCR

yang berbeda. Kedua, DNA template dimasukkan ke

dalam tube yang telah berisi reaction mix. Ketiga,

tahapan pembuatan program untuk siklus PCR dimulai

dari penekanan tombol [CREATE] jika ingin

memprogram ulang suhu dan waktu yang diinginkan

dalam siklus PCR. Keempat, program yang telah selesai

dibuat, disimpan dan tube dimasukkan ke dalam mesin

thermal cycle, setelah itu tekan tombol [RUN] untuk

menjalankan program. Mesin thermal cycler yang

digunakan dalam praktikum PCR adalah Perkin Elmer

9600.

3. Hasil dan Pembahasan

Tahapan kerja pembuatan reaction mixture PCR

yaitu pertama ddH2O steril sebanyak 14 μL dimasukkan

ke dalam tube, fungsinya adalah sebagai pelarut

sehingga komponen lain yang dimasukkan ke dalam

tube dapat langsung larut. Kedua, tambahkan komponen

lain seperti Kapa 2G Robust Buffer A dengan Mg 4 μL,

10 mm dNTPs 0.4 μL, 20 μMprimer forward FvCRF

0.3 μL, 20 μMprimer reverse FvCRR 0.3 μL, dan 2G

Kapa Robust (5 U/μL) ke dalam tube. Ketiga, setelah

semua komponen telah dimasukkan ke dalam tube,

thawing tube dengan perlahan agar semua komponen

larut sempurna. Keempat, reaction mixture siap

diletakkan pada mesin thermal cycler (Spormann 2009:

1).

Enzim DNA polymerase yang digunakan pada

saat proses perbanyakan atau ampifikasi DNA adalah

Taq DNA polymerase. Taq DNA polymerase berasal

dari sel bakteri Thermus aquaticus yang hidup di sumber

mata air panas (Butler 2005: 67). Bakteri Thermus

aquaticus mempunyai enzim termostabil sehingga dapat

hidup di lingkungan yang sangat panas. Enzim

termostabil digunakan dalam reaksi PCR karena enzim

tersebut tahan terhadap panas sehingga enzim tidak akan

terdenaturasi (Brown 1993: 412).

Praktikum reaksi PCR memiliki beberapa tahapan

yang harus diperhatikan kondisinya. Kondisi tersebut

mempengaruhi keefisienan kerja reaksi dan hasil reaksi.

Tahapan denaturasi yang harus diperhatikan adalah

suhu, tahap denaturasi harus terjadi pada suhu 95oC

selama 30 detik atau 97oC selama 15 detik. Denaturasi

yang tidak lengkap akan mengakibatkan DNA

mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda

lagi) secara cepat sehingga mengakibatkan gagalnya

proses PCR. Waktu dalam tahapan denaturasi juga harus

diperhatikan jangan sampai terlalu lama karena akan

mengurangi aktivitas enzim Taq DNA polymerase.

Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer

yang baik adalah primer tersebut sebaiknya berukuran

18-25 basa, dan mengandung 50-60% guanin dan

sitosin. Sekuen DNA kedua primer tidak boleh saling

berkomplemen karena akan menyebabkan terjadinya

penempelan antar primer yang kemudian membentuk

primer-dimer. Sekuen DNA di dalam masing-masing

4

primer sebaiknya juga tidak saling berkomplemen

karena akan mengakibatkan terbentuknya struktur

sekunder pada primer tersebut sehingga mengurangi

efisiensi PCR. Tahap elongasi harus terjadi pada suhu

72oC. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim Taq

DNA polymerase diperkirakan antara 35 sampai dengan

100 nukleotida per detik (Muladno 2010: 63-64).

Optimasi PCR perlu dilakukan agar reaksi PCR

dapat berlangsung secara efisien dan mendapatkan hasil

yang konsisten. Suhu dan waktu pada tahap denaturasi

dipengaruhi oleh enzim Taq DNA polymerasedan

bersifat permanen. Suhu penempelan antara primer dan

DNA template serta waktu yang diperlukan pada tahap

annealing dipengaruhi oleh panjang pendek primer.

Kecepatan penyusunan nukeleotida pada tahap elongasi

bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam, dan

molekul DNA target, sedangkan suhunya bersifat

permanen (Fraga dkk. 2008: 5--6).

Amplifikasi rantai DNA dimulai dari tahap

denaturasi, saat tahapan denaturasi untai ganda DNA

berpisah menjadi untai tunggal kemudian primer

menempel pada DNA template pada tahap annealing.

Tahapan elongasi yaitu setiap untai menghasilkan untai

yang panjang sehingga siklus pertama selesai. Proses

dari denaturasi, annealing, dan elongasi disebut sebagai

satu siklus. Siklus pertama tersebut menghasilkan 2

molekul DNA untai ganda. Saat siklus kedua berakhir, 2

molekul DNA untai ganda hasil amplifikasi pada siklus

pertama menjadi DNA templatedan kemudian masing-

masinguntai dilipatgandakan menjadi 4 molekul DNA

untai ganda yang baru. Siklus ketiga berakhir maka akan

terbentuk 4 molekul DNA untai ganda, kemudian

masing-masing untai dilipatgandakan menjadi 8 molekul

DNA untai ganda yang baru. Siklus keempat berakhir, 8

molekul DNA untai ganda hasil amplifikasi pada siklus

ketiga menjadi DNA template dan kemudian masing-

masing untai dilipatgandakan menjadi 16 molekul DNA

untai ganda yang baru. Siklus kelima berakhir, 16

molekul DNA untai ganda hasil amplifikasi pada siklus

keempat menjadi DNA template dan kemudian masing-

masing untai dilipatgandakan menjadi 32 molekul DNA

untai ganda yang baru. amplifikasi rantai DNA hingga

lima siklus menghasilkan 32 molekul DNA untai ganda

(Muladno 2010: 62).

4. Kesimpulan

Polymerase Chain Reaction (PCR ) adalah teknik

yang digunakan untuk memperbanyak sekuen DNA

spesifik secara in vitro sehingga menghasilkan jutaan

copy DNA. Reaksi PCR membutuhkan komponen-

komponen penting yaitu ddH2O steril sebagai pelarut,

Kapa 2G Robust Buffer untuk menjaga keseimbanagn

PH serta mengandung kation Mg yang berfungsi

sebagai kofaktor enzim yang mempercepat reaksi.

Enzim Taq DNA polymerase berfungsi untuk

menghasilkan pemanjangan cetakan DNA dengan

menghubungkan dNTP-dNTP. Amplifikasi pada setiap

siklus menghasilkan jumlah molekul DNA yang sesuai

rumus 2n, dengan n adalah jumlah siklus.

Daftar Pustaka

Brown, T.A. 1993. Genetics: a molecular approach, 2nd

ed. Fong & Sons Printers Pte Ltd., Singapore: xiii

+ 467 hlm.

Butler, J.M. 2005.Forensic DNA Typing, 2nd ed. Elsevier

Academic Press, New York: xvii + 660 hlm.

5

Dale, J.W. & S.F. Park. 2004. Molecular genetics of

bacteria. John Wiley & Sons Ltd., West Sussex: xi

+ 379 hlm.

Fraga, D., T. Meulia& S. Fenster. 2008. Real-Time PCR.

Journal of Current Protocols Essential Laboratory

Techniques 10(3): 1-34.

Lewis, Ricki. 2003. Human genetics concepts and

applications. 5th ed. The McGraw-Hill

Companies, New York: xviii + 454 hlm.

Muladno. 2010. TeknologiRekayasaGenetika. Ed. Ke-

2.IPB Press, Bogor: ix + 130 hlm.

Russel, P.J. 1996. Genetics. 4th ed. HarperCollins

College Publishers, New York: 784 hlm.

Russell, P. J. 1994. Fundamental of

Genetics. Harper Collins College Publisher, USA:

xvi + 528 hlm.

Spormann, A.M. 2009. Polymerase Chain Reaction

(PCR): 1 hlm.

http://www.stanford.edu/group/spormannlab/cgi-

bin/amslab/content/polymerase-chain-reaction-pcr

25 April 2012, pk. 06.52am.

Stansfield, W., R.J. Cano & J.S. 2006. Colome.

Schaum’s easy outlines: molecular and cells

biology. terj. dari

Strachan, T. & Read, A.P. 1996. Human Molecular

Genetics.John Willey& Sons, Inc., New York: x +

596hlm.

Wolfe, S.L. 1993. Molecular and cellular

biology.Wadsworth Publishing Company,

Belmont: xviii + 1145 hlm.

Lampiran

1. Hitunglah nilai Tm dari primer berikut menggunakan metode Wallace :

a. Primer Forward :

5’-GGAATTCGACATTAAGATGA-’3

b. Primer Reverse :

3’- GTGGTAGTGGTGGTGGT -’5

Primer Forward

Jumlah G = 5

Jumlah C= 2

Jumlah A= 8

Jumlah T= 5

Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)

Tm = 4( 5+2) + 2 (8+5)

6

Tm = 28 + 26

Tm = 54 oC

Primer Reverse

Jumlah G = 10

Jumlah C= 0

Jumlah A= 1

Jumlah T= 6

Tm = 4 (G+C) + 2 (A+T)

Tm = 4 (10+0) + 2( 1+ 6)

Tm = 40 + 14

Tm = 54 oC

7

8