Upload
rifaatul-mahmudah
View
1.511
Download
31
Embed Size (px)
Citation preview
LAPORAN PRAKTIKUM
PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI ASAM AMINO
NAMA : RIFA’ATUL MAHMUDAH M.
NIM : H 311 08 272
KELOMPOK : II (DUA)
HARI/TGL PERC. : SENIN/27 SEPTEMBER 2010
ASISTEN : NURLAIDA
LABORATORIUM BIOKIMIAJURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAMUNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR2010
BAB I
PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Protein merupakan polimer alami yang terdiri dari sejumlah unit asam
amino yang berikatan satu dengan lainnya lewat ikatan amida (atau peptida).
Peptida ialah oligomer dari asam amino yang memiliki peranan penting dalam
banyak proses biologis. Protein merupakan biomolekul yang sangat penting.
Beberapa fungsi protein adalah sebagai katalisator (enzim), pengangkut dan
penyimpanan, penyebab gerakan, pendukung sistem kekebalan, pembentuk dan
transmisi implus saraf, pengontrol pertumbuhan dan deferensasi, pendukung
kekuatan struktural, dan lain-lain. Protein ini disusun oleh asam-asam amino
yang juga mempunyai peranan penting dalam metabolisme zat hidup.
Seperti yang telah kita ketahui sebelumnya bahwa secara umum ada tiga
gugus yang reaktif pada asam amino yaitu gugus karboksil, gugus amino, dan
gugus rantai samping. Ketiga gugus ini dapat diidentifikasi melalui uji spesifik,
diantaranya adalah dengan melalui tes ninhydrin, dan sebagainya. Akan tetapi,
selain uji spesifik berdasarkan ciri khas reaksi kimianya, asam amino dapat pula
diidentifikasi bahkan dipisahkan dengan beberapa metode, salah satunya adalah
melalui kromatografi lapis tipis (KLT).
Pada kromatografi partisi, kertas digunakan sebagai pendukung air (fase
stasioner). Campuran komponen-komponen tersebut yang akan dipisahkan
ditempatkan pada fasa stasioner (zat padat), kemudian dihubungkan dengan fasa
mobile (zat cair), maka fasa mobile akan melalui fasa stasioner, sambil membawa
komponen-komponen tersebut, dimana perbandingan kecepatan perpindahan
komponen dengan kecepatan permukaan fasa mobile merupakan dasar untuk
mengidentifikasi komponen-komponen yang dipisahkan.
Berdasarkan teori inilah, maka dilakukanlah percobaan ini untuk
mengaplikasikan, membuktikan dan menguji kebenaran dari teori tersebut agar
dapat lebih mudah untuk dipahami dan dipelajari.
1.2. Maksud dan Tujuan Percobaan
1.2.1.Maksud Percobaan
Maksud dari percobaan ini adalah untuk mengetahui dan memahami cara
pemisahan dan identifikasi asam amino melalui metode kromatografi lapis tipis.
1.2.2.Tujuan Percobaan
Tujuan dilakukannya percobaan ini yakni:
1. Untuk menghitung nilai Rf dari asam amino alanin, glisin, serin, dan sampel.
2. Untuk mengidentifikasi jenis asam amino yang terkandung dalam sampel
berdasarkan nilai Rf.
1.3. Prinsip Percobaan
Identifikasi asam amino berdasarkan perbedaaan nilai Rf dengan
menggunakan metode kromatografi lapis tipis yang fase geraknya terdiri dari
campuran n-butanol, asam asetat, dan air.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Protein adalah makromolekul yang paling berlimpah di dalam sel hidup
dan merupakan 50% atau lebih berat kering sel. Protein ditemukan dalam semua
sel dan semua bagian sel. Protein juga amat bervariasi, ratusan jenis yang berbeda
dapat ditemukan dalam satu sel. Semua protein, baik yang berasal dari bakteri
yang paling tua atau yang berasal dari bentuk kehidupan tertinggi, dibangun dari
rangkaian dasar yang sama dari 20 jenis asam amino yang berikatan kovalen
dalam urutan yang khas. Karena masing-masing asam amino mempunyai rantai
samping yang khusus, yang memberikan sifat kimia masing-masing individu,
kelompok 20 molekul unit pembangun ini dapat dianggap sebagai abjad struktur
protein. Yang paling istimewa adalah bahwa sel dapat merangkai ke-20 asam
amino dalam berbagai kombinasi dan urutan, menghasilkan peptida dan protein
yang mempunyai sifat-sifat dan aktivitas berbeda. Dari unit pembangun ini
organisme yang berbeda dapat membuat produk-produk yang demikian bervariasi,
seperti enzim, hormon, lensa protein pada mata, bulu ayam, jaring laba-laba, dan
sebagainya (Lehninger, 1982).
Jika protein dimasak dengan asam atau basa kuat, asam amino unit
pembangunnya dibebaskan dari ikatan kovalen yang menghubungkan molekul-
molekul ini menjadi rantai. Asam amino bebas yang terbentuk merupakan
molekul yang relatif kecil, dan struktur masing-masing telah diketahui. Asam
amino yang pertama kali ditemukan adalah aspargin, pada tahun 1806 dan yang
paling terakhir adalah treonin, yang belum teridentifikasi sampai tahun 1983.
semua asam amino mempunyai nama biasa atau umum, yang kadang-kadang
diturunkan dari sumber pertama nama molekul ini diisolasi. Semua asam amino
yang ditemukan pada protein mempunyai ciri yang sama, gugus karboksil dan
gugus amino diikiat pada atom karbon yang sama. Masing-masing berbeda satu
dengan yang lain pada rantai sampingnya, atau gugus R, yang bervariasi dalam
struktur, ukuran, muatan listrik, dan kelarutan di dalam air (Lehninger, 1982).
Kromatografi kertas merupakan salah satu jenis kromatografi partisi yaitu
pemisahan beberapa zat berdasarkan perbedaan kelarutan dalam dua pelarut yang
tidak dapat bercampur. Cara melakukan pemisahan dengan kromatografi ini
cukup sederhana. Campuran beberapa asam amino sebagai hasil hidrolisis
diteteskan sedikit pada kertas kromatografi pada titik tertentu dan kemudian ujung
kertas dicelupkan ke dalam pelarut tertentu. Pelarut ini akan naik berdasarkan
proses kapilaritas dan akan membawa senyawa-senyawa dalam campuran
tersebut. Asam amino yang mudah larut dalam pelarut tertentu itu, misalnya
pelarut organik, akan terbawa naik lebih jauh dari pada yang sukar larut. Setetlah
mencapai bagian atas atau garis akhir, kertas diangkat dari pelarut dan dibiarkan
mengering dengan sendirinya di udara. Dengan proses ini asam-asam amino akan
terpisah satu sama lainnya, dan dengan penyemprotan dengan pereaksi ninhidrin
pada kertas kromatografi tersebut akan tampak noda-noda biru yang membuktikan
adanya asam amino yang terpisah itu. Jarak yang telah ditempuh oleh suatua asam
amino tertentu (b) dibandingkan dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari
garis awal sampai garis akhir (a) diberi lambang Rf (Poedjiadi dan Supriyanti,
2006).
Ninhidrin merupakan reagen yang berguna untuk mendeteksi asam amino
dan menetapkan konsentrasinya dalam larutan. Senyawa ini merupakan hidrat dari
triketon siklik, dan bila bereaksi dengan asam amino, menghasilkan zat warna
ungu (Hart, dkk., 2003).
Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan olen Egan Stahl
dengan menghamparkan penyerap pada lempeng gelas, sehingga merupakan
lapisan tipis. KLT merupakan kromatografi serapan, tetapi dapat juga merupakan
kromatografi partisi karena bahan penyerap telah dilapisi air dari udara. Sistem ini
segera populer karena memberikan banyak keuntungan, misalnya peralatan yang
diperlukan sedikit, murah, sederhana, waktu analisis cepat dan daya pisah yang
cukup baik. Sebagian besar dasar teori kromatografi kolom juga dapat diterapkan
pada KLT. Konsep “lempeng teori” lebih sukar digambarkan di sini, tetapi
jelaslah bahwa pemisahan itu dilakukan oleh keseimbangan bermuatan cuplikan
dalam dua fasa, satu diantaranya bergerak terhadap yang lainnya. Terjadi proses
penyebaran molekul cuplikan karena proses nonideal. Derajat retensi pada
kromatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai faktor retensi, Rf (Soedjadi,
1988).
Harga Rf yaitu b/a merupakan ciri khas suatu asam amino pada pelarut
tertentu. Dengan menggunakan standar asam-asam amino yang telah diketahui
macamnya pada kromatografi kertas seperti yang dilakukan di atas maka dapat
diketahui macam asam amino yang diperiksa. Penentuan macam asam amino
R f = Jarak yang ditempuh senyawa terlarutJarak yang ditempuh pelarut
dapat pula dilakukan dengan menghitung harga Rf masing-masing asam amino,
dan dibandingkan dengan harga Rf asam amino yang telah ada (Poedjiadi dan
Supriyanti, 2006).
Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembang akan bergerak
sepanjang fase diam karena pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik
(ascending) atau karena pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun
(descending). Kromatografi lapis tipis dalam pelaksanaannya lebih mudah dan
lebih murah dibandingkan dengan kromatografi kolom. Demikian juga peralatan
yang digunakan. Dalam kromatografi lapis tipis, peralatan yang digunakan lebih
sederhana dan dapat dikatakan hampir semua laboratorium dapat melaksanakan
setiap saat secara cepat (Gandjar dan Rohman, 2007).
Selain untuk mengidentifikasi kandungan asam amino, metode
kromatografi lapis tipis juga digunakan untuk mengidentifikasi kandungan
senyawa yang terdapat di dalam tumbuhan. Analisa kromatografi lapis tipis
dilakukan untuk menentukan eluen yang akan digunakan pada kromatografi
lapis tipis preparatif. Noda memisah dengan baik setelah eluen yang
digunakan kloroform : heksan (8:1/2). Pemisahan terhadap ekstrak n-heksan
dengan pelarut kloroform terdapat tujuh noda yang terpisah dengan baik
sehingga pemisahan selanjutnya dilakukan secara kromatografi lapis tipis
preparatif. Pemisahan Secara Kromatografi Lapis Tipis Sebanyak 2,50 gram
ekstrak pekat n-heksan dilarutkan dalam 8 ml pelarut kloroform sehingga
ekstrak dapat larut sempurna. Cuplikan ini selanjutnya ditotolkan berupa garis
pada jarak 2 cm dari tepi bawah plat kromatografi lapis tipis. Plat
kromatografi lapis tipis dielusi dengan campuran pelarut kloroform : heksan
(8:1/2) dalam ruang pengembang (chamber). Plat yang sudah dielusi
dikeluarkan dari ruang pengembang dan pelarut dibiarkan menguap di udara
terbuka dan disinari dengan lampu UV (Nohong, 2009).
Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-
macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa
gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa
cairan ataupun suatu padatan. Pada kromatografi padatan cair (LSC), teknik
kerjanya tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben yang polar
seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis (TLC) adalah salah satu
bentuk dari LSC. Dalam KCKT kolom dipadati atau dipak dengan partikel-
partikel micro or macro particulate or pellicular (berkulit tipis 37 -44 µ).Sebagian
besar dari KCKT sekarang ini dibuat untuk mencapai partikel-partikel
microparticulate lebih kecil dari 20µ. Teknik ini biasanya digunakan untuk zat
padat yang mudah larut dalam pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini
terutama sangat kuat untuk pemisahan isomer-isomer (Putra, 2004).
TLC digunakan untuk memantau kemajuan reaksi dan untuk mengenali
komponen tertentu. Teknik ini sering dilakukan dengan lempengan gelas atau
plastik yang dilapisi fase diam. Fase gerak cair adalah pelarut. Campuran yang
akan dianalisis diteteskan pada dasar lempengan, dan pelarut akan bergerak naik
oleh gaya kapiler (Bresnick, 2004).
BAB III
METODE PERCOBAAN
1.4. Bahan Percobaan
Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini, antara lain eluen (n-
butanol : asam asetat : aquadest = 2,5 mL : 0,6 mL : 2,6 mL), larutan penyemprot
ninhidrin 2%, dan larutan asam amino (glisin 0,1 M, serin 0,1 M, alanin 0,1 M
dan larutan sampel), aseton, sabun, dan tissu roll.
1.5. Alat Percobaan
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini antara lain chamber, kertas
kromatografi lapis tipis, botol semprot, pipa kapiler 0,5 L, gelas ukur 10 mL,
pipet volume 1 mL, pipet volume 5 mL, inkubator, pensil, selotip, dan penggaris.
1.6. Prosedur Percobaan
Eluen dibuat dengan cara dicampurkan n-butanol, asam asetat, dan air
dengan perbandingan 2,5 mL : 0,6 mL : 2,6 mL. Kemudian larutan eluen
dimasukkan ke dalam chamber dan ditutup rapat dengan selotip hingga chamber
jenuh dengan larutan eluen, kurang lebih selama beberapa menit. Kemudian
sebuah plat KLT dibuat garis dengan pensil sejauh kira-kira 1 cm pada bagian
bawah plat dan kira-kira 1 cm dari tepi atas plat. Selanjutnya, plat KLT
dimasukkan ke dalam inkubator dengan suhu 90 oC selama 5 menit. Setelah itu,
plat KLT ditotolkan larutan asam amino (glisin, serin, alanin, dan larutan sampel)
dengan menggunakan pipa kapiler dengan jarak yang sama. Lalu, plat KLT
dimasukkan ke dalam chamber yang sudah jenuh dengan larutan eluen, tetapi
totolan larutan asam amino tidak boleh dicelupkan ke dalam larutan eluen. Elusi
dihentikan setelah eluen menempuh jarak yang telah ditentukan sebelumnya yaitu
garis ditandai dengan pensil. Plat KLT dikeluarkan dari chamber lalu dikeringkan
dalam inkubator. Dengan hati-hati, kertas disemprot dengan larutan ninhidrin 2%
kemudian dikeringkan di dalam inkubator kurang lebih pada suhu 60 oC selama
beberapa menit. Noda yang timbul diberi lingkaran dengan pensil. Diukur jarak
dari tempat totolan sampai ke noda yang terpisah. Dihitung Rf dari setiap noda.
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
1.1. Hasil Pengamatan
Tabel 1
Noda Jarak Eluen (cm) Jarak noda (cm) Rf (cm)
Sampel X 3,3 0,5 0,15
Sampel Y 3,3 0,4 0,12
Serin 3,3 0,4 0,12
Alanin 3,3 0,6 0,18
Glisin 3,3 0,5 0,15
1.2. Pembahasan
Percobaan kali ini dilakukan untuk mengidentifikasi adanya larutan yang
mengandung asam amino dengan menggunakan teknik kromatografi lapis tipis,
yang melibatkan perhitungan nilai Rf dari masing-masing larutan yang
mengandung asam amino.
Pada percobaan ini kita menggunakan kertas kromatografi lapis tipis,
kertas harus kering agar mampu menyerap noda larutan sampel dengan baik,
proses penotolan dilakukan dengan menggunakan pipa kapiler karena sampel
yang akan dianalisis hanya dibutuhkan sedikit (uji kualitatif) serta dilakukan
secara hati-hati dan diusahakan noda tidak melebar di absorben, teknik double
spotting dilakukan agar ketelitian proses pengukuran Rf dapat ditingkatkan. Eluen
yang terdapat di dalam gelas merupakan campuran dari n-butanol, asam asetat,
dan air dengan perbandingan 2,5 mL : 0,6 mL : 2,6 mL. Campuran ini berfungsi
agar setiap asam amino dengan gugus yang berbeda dapat diidentifikasi. Adapun
dipilih campuran dari bahan tersebut karena memiliki perbedaan kepolaran
dengan urutan kepolaran yaitu air > n-butanol > asam asetat. Setiap asam amino
memiliki koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu. Asam amino
yang memiliki afinitas terhadap fasa gerak (pelarut) yang lebih besar akan
tertahan lebih lama pada fasa gerak, sedangkan zat terlarut yang afinitasnya
terhadap fasa gerak lebih kecil akan tertahan lebih lama pada fasa diam. Dengan
demikian asam amino dapat dipisahkan akibat perbedaan migrasi di dalam fasa
gerak dan fasa diamnya. Prinsip percobaan KLT ini didasarkan pada sifat fisik dan
kimia asam amino. Sifat fisik ditunjukkan oleh kecepatan bergerak pada fase diam
dari kertas kromatografi dan sifat kimianya berdasarkan pada warna yang timbul
ketika disemprot dengan larutan ninhidrin.
Pada percobaan ini proses elusi berjalan cukup lambat, namun karena
waktu yang sedikit, maka kertas diambil terlebih dahulu sebelum mencapai tanda
batas. Setelah kertas diangkat dari eluen, kemudian dikeringkan pada suhu kamar
dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin, maka akan muncul dua warna
dominan dalam identifikasi asam amino, yaitu ungu dan jingga yang merupakan
warna senyawa kompleks yang dibentuk oleh larutan asam amino dan sampel
yang diidentifikasi. Untuk memperjelas noda yang terbentuk maka absorben
dimasukkan ke inkubator dengan suhu 60°C, selama beberapa menit, kemudian
dilakukan proses pengukuran jarak eluen dan jarak noda dari tempat penotolan.
Dari percobaan dapat diketahui bahwa sampel X memiliki Rf yang hampir
sama dengan glisin yaitu 0,15, dapat diambil sebuah hipotesa bahwa sampel X
adalah glisin atau senyawa asam amino yang mempunyai gugus fungsi mirip
dengan glisin. Begitupun juga dengan sampel Y yang mempunyai nilai Rf hampir
sama dengan serin yaitu 0,12 maka dapat disimpulkan bahwa sampel itu adalah
serin.
Adapun kesalahan dalam percobaan ini yaitu nilai Rf yang tidak sesuai
dikarenakan pembuatan eluen yang tidak tepat perbandingannya atau mungkin
karena larutan yang sudah tidak murni. Selain itu, kami menggunakan data dari
kelompok kedua , hal ini karena cara memasukkan kertas kromatografi ke dalam
chamber tidak baik sehingga tanda batas juga terkena percikan eluen.
1.3. Reaksi
1.3.1.Serin
1.3.2.Glisin
1.3.3.Alanin
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
1.1. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang dilakukan, dapat disimpulkan bahwa:
1. Nilai Rf asam amino glisin adalah 0,15, asam amino serin 0,12, asam amino
alanin 0,18, sampel X adalah 0,15, dan sampel Y adalah 0,12
2. Berdasarkan nilai Rf yang diperoleh, maka dapat diidentifikasi bahwa larutan
sampel X merupakan asam amino glisin dan larutan sampel Y merupakan
asam amino serin.
1.2. Saran
Untuk praktikum sebaiknya larutan contoh yang diidentifikasi diperbanyak
agar dapat diketahui Rf dari asam amino selain glisin, serin dan alanin dan juga
gunakan teknik identifikasi dan pemisahan asam amino yang lain.
Untuk laboratorium agar kebersihannya tetap terjaga dan kalau bisa asam
amino yang disediakan beragam.
Untuk asisten kinerjanya sudah sangat baik dalam menjelaskan kepada
kami praktikannya tentang prosedur percobaan yang akan dilakukan, saya harap
dapat dipertahankan.
DAFTAR PUSTAKA
Bresnick, S., 2004, Intisari Kimia Organik, diterjemahkan oleh Hadian Kotong, Hipokrates, Jakarta.
Gandjar, I. G. dan Abdul Rohman, 2007, Kimia Farmasi Analisis, Pustaka Pelajar, Yogyakarta.
Hart, H., Craine, L. E., dan Hart, D. J., 2003, Kimia Organik: Edisi Sebelas, diterjemahkan oleh Suminar Setiati Achmadi, Erlangga, Jakarta.
Lehninger, A. L., 1982, Dasar-Dasar Biokimia jiid 1, diterjemahkan oleh Maggy Thenawidjaja, Erlangga, Jakarta.
Nohong, 2009, Jurnal Pembelajaran sains, Skrining Fitokimia Tumbuhan Ophiopogon jaburan Lodd dari Kabupaten Kolaka Provinsi Sulawesi Tenggara (online), 5(2), 175, (http://jurnal.unhalu.ac.id/download/nohong/Skrining%20Fitokimia%20Tumbuhan%20Ophiopogon%20jaburan%20Lodd%20dari%20Kabupaten%20Kolaka%20Provinsi%20Sulawesi%20Tenggara.pdf, diakses tanggal 28 september 2010, pukul 17.08 WITA).
Poedjiadi, A. dan Supriyanti F. M. T., 2006, Dasar-Dasar Biokimia edisi revisi, UI-Press, Jakarta.
Putra, Effendi D. L., 2004, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi (online), http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/3616/1/farmasieffendy.pdf(diakses tanggal 28 september 2010, pukul 08.47 WITA).
Soedjadi, 1988, Metode pemisahan, Penerbit Kanisius, Yogyakarta.
Lampiran 1: Perhitungan Nilai Rf
Noda Jarak Eluen (cm) Jarak noda (cm) Rf (cm)
Sampel X 3,3 0,5 0,15
Sampel Y 3,3 0,4 0,12
Serin 3,3 0,4 0,12
Alanin 3,3 0,6 0,18
Glisin 3,3 0,5 0,15
Rf = Jarak noda dari tempat penotolanJarak yang ditempuh oleh pelarut
1. Sampel X : Rf =0,5
3,3=0 , 15
2. Sampel Y :Rf = 0,4
3 ., 3=0 , 12
3. Serin :Rf =0,4
3,3=0 ,12
4. Alanin :Rf =0,6
3,3=0 ,18
5. Glisin : Rf =0,5
3,3=0 , 15
Lampiran 2 : Bagan Kerja
- Digunting dan diberi tanda
- Dikeringkan dalam oven untuk mengaktifkan lapisan tipis
- Ditotolkan larutan contoh dan sampel
- Dikeringkan
- Dimasukkan ke dalam chamber yang berisi eluen (n-butanol : asam
asetat : air = 2,5 L : 0,6 mL : 2,6 mL) yang telah jenuh.
- Dielusi sampai tanda batas yang telah ditentukan
- Dikeluarkan dari chember dan dikeringkan
- Disemprot dengan larutan ninhidrin 2 %
- Dikeringkan dalam oven selama beberapa menit pada suhu 60 oC.
- Ditandai dengan diberi lingkaran dengan menggunakan pensil
- Diukur jarak noda dari tempat penotolan
- Diukur jarak tempuh eluen
- Dihitung nilai Rf-nya
-
Noda
Data
Plat KLT
Lampiran 3: Daftar Nilai Rf 20 Asam Amino
Amino acid Rf value
alanine 0.38
arginine 0.20
asparagine 0.5
aspartic acid 0.24
cysteine 0.4
glutamine 0.13
glutamic acid 0.30
glycine 0.26
histidine 0.11
isoleucine 0.72
leucine 0.73
lysine 0.14
methionine 0.55
phenylalanine 0.68
Proline
not a true amino acid - shows up as yellow0.43
serine 0.27
threonine 0.35
tryptophan 0.66
tyrosine 0.45
valine 0.61
LEMBAR PENGESAHAN
Makassar, 1 Oktober 2010
Asisten Praktikan
( NURLAIDA) (RIFA’ATUL MAHMUDAH M.)