BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Pada dasarnya isolasi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen sel lainnya.  Proses tersebut meliputi tiga tahapan, yaitu: penghancuran sel, penghilangan protein dan RNA serta pemurnian DNA. Prinsip isolasi DNA adalah melisiskan sel, memisahkan DNA dari protein, mengendapkan DNA, melarutkan kembali DNA, menghitung jumlah DNA yang diperoleh dan menilai kemurnian DNA.

Untuk mengekstrak DNA diperlukan langkah-langkah laboratorium untuk memecahkan dinding sel dan membran inti, dan dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen sel yang lain.  Pada saat melakukannya harus dijaga agar DNA tidak rusak dan didapatkan DNA dalam bentuk rantai yang panjang.

PCR merupakan suatu reaksi in vitro untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut dengan bantuan enzim dan oligonukleotida sebagai primer dalam suatu thermocycler. Panjang target DNA berkisar antara puluhan sampai ribuan nukleotida yang posisinya diapit sepasang primer.

1.2 Tujuana. Untuk mengetahui pengertian isolasi DNA dan PCR.b. Untuk mengetahui uji kualitas DNA.c. Untuk mengetahui komponen dan tahapan PCR.d. Untuk mengetahui manfaat PCR.

1

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Pengertian Isolasi DNA dan PCR

a. Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel yaitu pada mitokondria dan kloroplas.

(Anonymous B, 2012)

b. Isolasi DNA adalah serangkaian proses untuk memisahkan DNA dari komponen sel lainnya. 

c. PCR adalah metode perbanyakan DNA secara enzimatik sehingga DNA yang diperoleh dapat digunakan untuk analisis / penelitian.

(Anonymous A, 2012)

d. PCR adalah suatu teknik yang melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah target DNA untai ganda.

(Handoyo, 2000)

e. Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan metode enzimatis untuk melipatgandakan secara eksponensial suatu sekuen nukleotida tertentu dengan cara in vitro.

2

2.2 Uji Kualitas DNA

Uji kualitas DNA dilakukan dengan horizontal elektroforesis, pengecekan hasil isolasi DNA pada gel agarose. Campur bahan untuk membuat 0,8 %, yaitu 0,32 mg agarose dan 40 ml buffer TBE dalam erlenmeyer. Kemudian larutan gel dihomogenkan dengan cara dipanaskan dalam microwave hingga larutan gel benar-benar homogen. Setelah tidak terlalu panas, larutan gel dituangkan pada cetakan dan didiamkan sampai memadat. Gel yang sudah memadat dipindah ke dalam mesin elektroforesis. Kemudian tuangkan buffer TBE ke dalam mesin elektroforesis hingga seluruh bagian gel terendam. DNA hasil amplifikasi (5 μl) dicampur dengan loading dye (1 μl) dengan cara pipeting, kemudian dimasukkan ke dalam sumuran/wells. Proses dilakukan selama 20 menit dengan tegangan listrik 100 V. Setelah proses elektroforesis selesai dilakukan, hasil elektroforesis direndam dalam larutan Ethidium Bromide selama ± 15 menit. Gel yang telah direndam dalam Ethidium Bromide diamati dengan UV transluminator dan didokumentasikan. Jika muncul pita berarti DNA hasil isolasi siap untuk digunakan sebagai template untuk PCR.

(Tim Dosen FP UB, 2011)

2.3 Komponen dan Tahapan PCR

Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah template DNA; sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat; dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates); buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim polimerase DNA.

a. DNA template adalah DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan. Urutan basa ini disebut juga urutan target (target sequence).

3

b. Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa. Polimerisasi primer dapat berlangsung karena adanya penambahan basa demi basa dari dNTP yang dikatalisasi oleh enzim DNA polimerase. Namun, pada PCR enzim DNA polimerase yang digunakan harus termostabil karena salah satu tahap reaksinya adalah denaturasi untai ganda DNA yang membutuhkan suhu sangat tinggi (± 95°C). Salah satu enzim DNA polimerase yang umum digunakan adalah Taq DNA polimerase, yang berasal dari bakteri termofilik Thermus aquaticus.

c. Enzim Taq Polymerase yang beredar saat ini terdiri atas dua macam, yaitu enzim alami (native) yang diisolasi dari sel bakteri Thermus aquaticus dan enzim rekombinan yang disintesis di dalam sel bakteri E. coli.

d. Deoxyribonucleoside Triphosphate (dNTPs) merupakan material utama yang dibutuhkan untuk sintesis DNA baru dalam proses PCR.

e. Larutan penyangga (buffer) yang biasa digunakan untuk reaksi PCR mengandung 10 mM Tris-HCl pH 8,3 50 mM KCl dan 1,5mM MgCl2.

Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1) pra-denaturasi DNA templat; (2) denaturasi DNA templat; (3) penempelan primer pada template (annealing); (4) pemanjangan primer (extension) dan (5) pemantapan (post extension). Tahap (2) sampai dengan (4) merupakan tahapan berulang (siklus), di mana pada setiap siklus terjadi duplikasi jumlah DNA.

Tiap putaran reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu denaturasi template, penempelan primer (annealing) dan ekstensi / polimerisasi primer yang masing-masing berlangsung pada suhu lebih kurang 95°C, 50°C dan 70°C. Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA template terpisah satu sama lain

4

karena terputusnya ikatan hidrogen antar basa-basanya sehingga menjadi untai tunggal. 

Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan ditempeli primer. Jadi, ada dua buah primer yang masing-masing menempel pada untai tunggal DNA template. Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju (forward primer) dan primer mundur (reverse primer). Sepasang primer tersebut akan berhibridisasi menjadi sekuen komplementer pada untai tunggal DNA. Pasangan primer tersebut dipilih sedemikian rupa agar satu primer bersifat komplementer terhadap salah satu ujung gen yang diinginkan pada salah satu rantai. Sementara itu, primer kedua bersifat komplementer dengan ujung yang lainnya pada untai DNA yang satu lagi. Primer akan membentuk ikatan hidrogen dengan sekuen komplementernya sehingga terbentuklah molekul untai ganda yang stabil. 

Setelah menempel pada untai DNA template, primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya hingga ujung 5’ DNA template (ingat: polimerisasi DNA selalu berjalan dari ujung 5’ ke ujung 3’ atau berarti dari ujung 3’ ke ujung 5’ untai template nya). Dengan demikian, pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh dua pasang untai DNA jika DNA template awalnya berupa sepasang untai DNA. 

Pasangan-pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi akan menjadi template pada putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan akan diperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2n-2n. Fragmen DNA pendek yang dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan jarak antara kedua tempat penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang merupakan ukuran target yang memang dikehendaki untuk digandakan (diamplifikasi).

5

2.4 Manfaat PCR

a. Digunakan untuk membuat fragmen pelacak yang dibuat secara in vitro menggunakan teknik PCR.

b. Untuk menggandakan urutan basa nukleotida tertentu secara in vitro.

c. Untuk menggandakan jumlah molekul DNA pada target tertentu dengan cara mensintesis molekul DNA baru yang berkomplemen dengan molekul DNA target tersebut dengan bantuan enzim dan oligonukleotida.

d. Digunakan pula untuk melipatgandakan dan melakukan kuantitasi molekul mRNA.

e. Pada kedokteran forensik, digunakan untuk diagnosis genetika dan mikrobiologis serta manipulasi dan rekayasa gen. Selain itu juga dapat digunakan untuk menganalisis penyakit, Duchenne’s muscular dystrophy, hemofilia A, untuk mendeteksi limfoma T pada manusia, Human immunodeficiency virus (HIV), virus hepatitis B, dan retinoblastoma serta untuk membuat DNA mutan dengan situs mutasi yang spesifik.teknik ini banyak digunakan baik untuk penelitian maupun diagnosa klinik karena cukup spesifik, efesien dan memiliki derajat keberhasilan yang tinggi.

6

BAB III

METODOLOGI

3.1 Alat dan Bahan

Alat : - Mortar & Pestle : untuk menghaluskan bahan.

- Tip :

- Gelas Ukur : untuk mengukur bahan.

- Tabung Eppendorf : untuk tempat/wadah bahan.

- Tissue : untuk membersihkan alat-alat.

- Gunting :

- Plastik Pembungkus

- Mikropipet : untuk mengambil larutan yg ukurannya µ liter/ 1000 µ.

- Spatula

- Erlenmeyer : untuk menampung larutan/bahan.

- Microwave : untuk memanaskan bahan agar homogen.

- Spektrofotometer : untuk mengukur nilai absorbansi.

- Mesin PCR : untuk visualisasi hasil & elektroforesis.

- Oven : untuk menginkubasi ekstrak dari bahan tsb.

7

- Mesin Vortex : untuk menghomogenkan.

- Timbangan Analitik : untuk menimbang

- Stirer : untuk mengaduk bahan.

- PH Meter

- Mesin Elektroforesis

- Mesin Centrifuge : untuk memisahkan larutan yang beda massa.

- Autoclave :

- Mesin UV Transluminator : untuk mengamati gel agarose.

- Lemari Es : untuk menginkubasi larutan DNA.

Bahan : - Daun tomat : untuk bahan isolasi DNA.

- Buffer Ekstraksi CTAB : untuk lisis membrane sel dan merusak dinding sel yang belum pecah.

- Nitrogen Cair : untuk mempermudah penggerusan (merusak sel tanpa merusak DNA).

- PVP (Polyvinilpirolidone) : untuk melindungi DNA agar tetap utuh/tidak rusak.

- CHISAM (Chloroform, Isoamilalkohol) / enzim proteinase : untuk menghilangkan kontaminasi protein.

8

- Buffer Pencuci : untuk mencuci endapan pellet / menghilangkan kontaminasi dan supernatan.

- Buffer TE : untuk meresuspensi endapan DNA.

- RNAse : untuk menghilangkan kontaminasi RNA.

- β Mercaptoethanol : untuk menghilangkan kontaminasi polisakarida.

- Isopropanol : untuk presipitasi (menggumpalkan kembali DNA).

- DNA Ladder :

- Agarosa : untuk menguji kualitas DNA.

- Buffer Elektroforesis (TAE/TBE) :

- Loading Dye : untuk memberi warna pada DNA .

- Ethidium Bromida : untuk memberi tanda adanya DNA dengan cara menyisipkan pada basa nitrogen.

- "PROMEGA " PCR Reaction Kit : untuk proses PCR.

- Primer Mikrosatelit SSR :

3.2 Langkah Kerja

Daun tomat 0,1 gr

+ 500 ml CHISAM

9

+ Buffer ekstraksi (CTAB) 1 ml

+ N2 cair & PVP

t = -1980C , gerus

Sentrifuge 6-8 x 103 Rpm 101

Sentrifuge 6-8 x 103 Rpm 101

+ Isopropanol 1x volume

Inkubasi freezer 30’

Sentifuge

Buffer Pencuci 2x (500 ml)

Resuspensi TE Buffer 200 ml

RNAse 1 ml

Inkubasi 370C 30’

Simpan freezer

10

Ambil supernatan

Ambil supernatan

Dokumentasi Langkah Kerja

3.3 Analisa Perlakuan

Menyiapkan alat dan bahan. Daun tomat disterilisasi dengan alkohol dan ditimbang 0,5 gram. Kemudian 0,5 gram daun tomat digerus dalam mortar dengan bantuan nitrogen cair dan ditambah PVP 10 mg, kemudian dimasukkan kedalam eppendorf yang sudah berisi 1 ml buffer ekstraksi CTAB dan 5 μl mercaptoethanol. Menambahkan nitrogen cair dan PVP dengan suhu -1980C tujuannya untuk membekukan fenol agar DNA tidak rusak, lalu digerus. Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen. Ekstrak daun tomat diinkubasi dalam suhu 65oC selama 30 menit sambil dibolak-balik tiap 10 menit. Kemudian ditambahkan 500 μl CHISAM. Setelah itu ekstrak daun divortex hingga homogen. Ekstrak daun kemudian disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm. Mengambil supernatant lalu dimasukkan pada tabung baru dan ditambahkan 30 μl CHISAM. Larutan supernatan dan CHISAM disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm. Fase atas dimasukkan tabung baru ditambah 1 ml isopropanol dingin. Larutan tersebut dibolak-balik perlahan hingga tampak benang-benang putih dalam larutan. Larutan diinkubasi dalam freezer selama 30 menit. Setelah diinkubasi, larutan disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm setelah itu supernatan dibuang dengan hati-hati agar endapan DNA pellet tidak ikut terbuang. Endapan DNA pellet dicuci dengan buffer pencuci dengan cara menambahkan 500 ml buffer pencuci ke

11

dalam tube, kemudian cairan di buang. Pencucian ini dilakukan 2 kali. Setelah itu endapan DNA pellet diresuspensi dengan 200 ml buffer TE lalu ditambah 1 ml RNAse. Larutan DNA yang sudah ditambah RNAse diinkubasi selama 30 menit pada Suhu 37oC.

BAB IV

PENUTUP

4.1 Kesimpulan

4.2 Saran

DAFTAR PUSTAKA

Anonymous A, 2012. http://miss-purplepharmacy.blogspot.com/ 2010/01/isolasi-dna.html

Anonymous B, 2012. http://catatankuliah-heri.blogspot.com/2011 /04/isolasi-dna.html

Handoyo, Darmo dan Ari Rudiretna. 2000. Prinsip Umum Dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction. Pusat Studi Bioteknologi. Universitas Surabaya. Unitas Vol 9 No 1. Surabaya.

12