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25/07/2011
1
Le processus de cicatrisation
pathologique, interactions entre
clinique et recherche
Prof B Pittet - Laboratoire expérimental
Service de Chirurgie Plastique et Reconstructive,
Hôpitaux Universitaires de Genève
Faculté de Médecine, Université de Genève
University Hospitals of Geneva
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2
Groupe « plaie et cicatrisation »
infirmières spécialistes cliniques
médecins :
- dermatologie
- gériatrie
- paraplégiques
- chirurgie plastique
et reconstructive
Protocoles de soins
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Comprendre la plaie pour
choisir le traitement adapté…
Traitement conservateur: pansements
Traitement chirurgical
- geste chirurgical + pansements
- fermeture, couverture de la plaie
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Le processus de cicatrisation comprend 4 phases:
– phase inflammatoire ou exsudative
– phase proliférative
– phase de contraction et d’épithélialisation
– phase de remodelage de la cicatrice
Connaître la physiologie du
processus de cicatrisation,
et ces dérèglements ….
plaie
1. phase inflammatoire ou exsudative
2. phase proliférative
formation de tissu de granulation
3. phase de contraction et
d’épithelialisation
fermeture de la plaie
4. phase de remodelage de la cicatrice
cicatrice
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1. phase inflammatoire:
- cascade de coagulation, aggrégation plaquettaire
PDGF
cellules inflammatoires,
monocytes macrophages
2. phase de prolifération:fibroblastes cellules
endothéliales
myofibroblastes néovaisseaux
matrice extra-cellulaire
TISSU DE GRANULATION
bFGF, VEGF
TGFb
bFGF
GM-CSF
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tissu de granulation
Myofibroblastes
Prof G Gabbiani
Presence of modified fibroblasts in
granulation tissue and their possible role in
wound contraction
Gabbiani G, Ryan GB, Majno G
Experimentia, 1971
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3. phase de contraction …
-actine muscle lisse
fibroblastes myofibroblastes
fibroblaste: RER myofibroblaste: filaments contractiles
rapprochement des
berges de la plaie
Myofibroblasts: Cells with MUSCLES
Fibroblast Myofibroblast
α-smooth muscle actin
immunohystochemistry
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HOW TO ASSESS MYOFIBROBLAST DIFFERENTIATION ?
IMMUNOFLUORESCENCE
-actin / nuclei (DAPI) / α-smooth muscle actin
Myofibroblastes
Fibroblast Myofibroblasts
Myofibroblastes
contraction sur feuille de silicone
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3. phase de contraction …
…et d’épithélialisation :
prolifération des cellules épitheliales à
partir des berges et des annexes EGF
étanchéité de la plaie
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prolifération des cellules épitheliales
à partir des berges et des annexes
Martin, P. (1997): Science 276, 75-81
4. phase de remodelage :
tissu de granulation
apoptose
cicatrice
Histo: - diminution du nombre des
cellules et des capillaires
- disparition des myofibroblastes
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Etude1: Quantification des myofibroblastes
( -actine muscle lisse) dans différents
processus de cicatrisation pathologique
-actine muscle lisse
• plaie +
• escarre -
• plaie chronique -
• cicatrice -
• cicatrices hypertrophiques +
Lab Invest 1989
Situations Characterized by the Presence of Myofibroblasts
Normal tissues (e.g. pulmonary alveolar septa)
Kapanci et al., J. Histochem. Cytochem. 40:1995, 1992
Schmitt-Gräff et al., Virchows Arch.(B) 57:291, 1989
Normally healing granulation tissueGabbiani et al., Experentia 27:549, 1971
Darby et al,. Lab.Invest. 63:21, 1990
Desmoulière et al., Am. J. Pathol. 146:56, 1995
AsthmaRoche W.R., Clin. Exp. Allergy 21:545, 1991
Hypertrophic scarsEhrlich et al., Am. J. Pathol. 145:105, 1994
Pittet et al., Plast.Reconstr. Surg. 93:1224, 1994
Dupuytren’s disease and fibromatosesGabbiani and Majno, Am. J. Pathol. 66:131, 1972
Tomasek and Haaksma, Anat. Rec. 230:175, 1991
Lung fibrosisAdler et al., Lab. Invest 60:473, 1989
Zhang et al,. Am. J. Pathol. 145:121, 1995
Kidney fibrosisJohnson et al., J. Clin. Invest. 87:847, 1991
Diamond et al., Am. J. Pathol. 146:121, 1995
Liver cirrhosis
Ramadori et al., J. Clin. Invest. 87:847, 1991
Schmitt-Gräff et al., Am. J. Pathol. 138:1233, 1991
Friedman, New Engl. J. Med. 328:1829, 19931
Heart fibrosisSun et al., J. Mol. Cell Cardiol. 29:2001, 1997 Stroma reaction to epithelial tumors
Cintorino et al., Int. J. Cancer 47:316, 1991
Ronnov-Jessen et al., J. Clin. Invest. 95:859, 1995
Chiavegato et al., Virchows Arch. 426:77, 1995
Vitreo-retinopathyBochaton-Piallat et al., IOVS 41:2136-2142, 2000
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Cicatrisation pathologique
1. phase infammatoire ou exsudative
2. phase proliférative
plaie atone
3. phase de contraction et d’épithélialisation
• plaie chronique
4. phase de remodelage de la cicatrice
cicatrice hypertrophique, kéloïde
Stopper la contraction de la
cicatrice
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Etude 2: Effet de l’application locale de
l’interféron gamma (IFN ) sur les cicatrices
hypertrophiques
Cicatrices hypertrophiques myofibroblastes
néovaisseaux
IFN fibroblaste: diminution de la prolifération et de la
synthèse de collagène
cellule musculaire lisse: diminution de l’expression de
l’ -actine muscle lisse
Plast Reconstr Surgery, 1994
Effet de l’application locale de l’IFN sur les
cicatrices hypertrophiques
Etude pilote:
• tolérance des infiltrations intra-lésionnelles de IFN 200 µg (6x10 U)
• évolution clinique des symptômes
• mesure de l’ -actine muscle lisse dans des
biopsies de cicatrices
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Plast Reconstr Surgery, 1994
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avant traitement 12 semaines après traitement
IFN 3/sem
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Effet de l’application locale de IFN sur les
cicatrices hypertrophiques
Conclusions
Diminution
• symptômes cliniques
• taille et volume des cicatrices
• nombre des myofibroblastes
Plast Reconstr Surgery, 1994
maturation de la cicatrice
Wound contraction
Healing wound
•Médicaments
•diabète
•radiothérapie
•cicatrice
•âge
Tissu de granultation
insuffisant
Plaies chroniques
Hypoxie
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Etude 4: Rôle des
myofibroblastes dans le retard
de cicatrisation des plaies
ischémiques
Modèle de plaie ischémique chez le rat
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10jrs
Taille de la plaie au cours du temps
Expression de l’ -actine
muscle lisse par immuno-
histo-chimie
plaie contrôle plaie ischémique
J5 J5
J7 J7
J10 J10
j
r
s
jrs après la plaie
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Etude 4: Conclusion
• L’ischémie persistante empêche le
développement des myofibroblastes dans le
tissue de granulation
– retard d’apparition
– diminution du nombre absolu des myofibroblastes
• La diminution de la contraction de la plaie
ischémique joue un rôle important dans le
retard de cicatrisation
Etude : Effet de l’hypoxie sur les
myofibroblastes in vitro
Cellules: fibroblastes sous-cutané de rats (passages 2-7)
Culture: 5 jrs w/o medium changeà différents taux d’oxygène:
Normoxie 21% O2 ≈ 140 mmHg
Hypoxie 5% O2 ≈ 30 mmHg
Hypoxie sévère 2% O2 ≈ 15 mmHg
avec un inducteur des myofibroblastes TGFβ1
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0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
1
Cell
pro
life
rati
on
(a.u
.).
20%5%2%
Résultat: l’hypoxie stimule la prolifération des fibroblastes
2% O220% O2 5% O2
Ce
ll p
rolif
era
tio
n
** p<0.01 vs. 20%
****
Myofibroblastes et hypoxie
nuclei (DAPI)
20% 2%5%
Résultats: l’hypoxie réduit l’expression d’α-SMA
20% O2 2% O25% O2
** **-SM
A / D
AP
I
** p<0.01 vs. 20%
Vimentin
-SMA
20% 2%5%
20% 2%5%
α-SMA / DAPI
Myofibroblastes et hypoxie
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Silicone coated with collagen
add SCF
grow cells 7 days+ TGFβ
Myofibroblastes et hypoxie
Résultats: l’hypoxie réduit la contraction des myofibroblastes
20% O2 2.5% O2
-T
GF
40 % wrinkling 20 % wrinkling
5% O2
10 % wrinkling
+ T
GF
50% wrinkling80 % wrinkling 40 % wrinkling
Myofibroblastes et hypoxie
Résultats: l’hypoxie réduit la contraction des myofibroblastes
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Réversibilité des effets induits par l’hypoxie
20% PO2 2% PO2 20% PO22% PO2 2% PO2 20% PO2
Résultats: le rétablissement de la normoxie permet la restauration de la
fonction du myofibroblaste
Réversibilité en clinique
Rétablissement de la normoxie?
?
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Micromechanical forces
“Mechanical tension controls granulation tissue contractile activity and myofibroblast differentiation” Hinz et al. Am J Pathol 2001
Shockwave
V.A.C.
Fibroblast Myofibroblast
Réveribilité: rôle des forces mécaniques
TGF-
β
Réversibilité: rôle des forces mécaniques
J10 VAC
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P +: 510
P -: 90 Temps
Pression [bar]
33 ns
1 μs
Ondes de choc (Shock waves)
02468
1012141618
Controls 200 Pls 400 Pls 800 Pls
α-SMA
Contr
ol
200pls
400pls
1000pls
Contr
ol
200pls
4%
4%
4%
4%
5% 6% 6%
6% 9% 13%
Control 200 400 1000
2
10
6
% m
yo
fib
rob
laste
s
14
18
Fig 1: Differentiation des
fibroblastes en myofibroblastes
Fig 2: Influence de la rigidité du substrat sur la différentiation des
myofibroblastes
1kPa 5kPa 15kPa 50kPa 1MPa
Substats souples (~ plaies aigues) Substats rigides (~ plaies chroniques)
0
10
20
30
40
50
60
Controls SW 200 SW 400 SW 800Control 200 400 1000
0
20
40
60
Co
ntr
acti
on
gel (%
)
Fig 3: Contraction
*
*
*
*
Effet des ondes de choc in vitro
Résultats: 1. Ondes de choc stimulent la différentiation des myofibroblastes,
d’une manière dose-dépendante (fig 1.) et seulement sur des substrats rigides (fig 2.)
2. Ondes de choc stimulent la contraction du gel de culture, d’une manière dose-dépendante (fig 3.)
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24
-20
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
D7 D14 D31
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
D7 D14 D31
0
20
40
60
Co
ntr
ac
tio
n p
laie
(%
)
80
100
0
20
40
60
Fe
rme
ture
pla
ie (
%)
80
100
d31
d31
d31
Contr
ol
OC
-IO
C-R
7 14 31
Temps après création de la plaie (jours)
**
**
control
OC-début Immediat
OC-debut Retardé à 1 semainemoyenne ± SEM. * p < 0.05 vs controle
Effet des ondes de choc in vivo
Résultats: Ondes de choc stimulent la contraction de la plaie, seulement après 31
jours - temps où le lit de la paie devient cohésif/rigide.
Mechanical stretch
Hypoxia + stretch 24hHypoxia
Effet des forces mécaniques sous
hypoxie in vitro
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Hypoxia Hypoxia
Effet des forces mécaniques sous
hypoxie in vivo
Augmente la contraction de la plaie
d 10
Effet des forces mécaniques sous
hypoxie in vivo
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α-S
MA
Quantificatio
n (
px)
Hypoxia Hypoxia + V.A.C.
Effet des forces mécaniques sous
hypoxie in vivo
Ethiopathogénie
hypoxie (2% - 5%): in vivo et in vitro
proliferation cellulaire
différentiation des fibroblastes en myofibroblastes
contraction
Conclusions: Myofibroblasts et hypoxie
caisson hyperbare?rétablissement de la normoxie
application de forces mécaniques : Vac, Shock waves
restaure la fonction des myofibroblastes
Traitement
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Laboratoire expérimental
de chirurgie plastique:
• N Alizadeh
• A Modarressi
• G Pietramaggiori
• M Tobalem
• E Vigato
• B Hinz• H Majd
Département de Pathologie • G Gabbiani
• ML Piallat
Remerciements
• 3 fonds
Thank you
Hôpitaux Universitaires de Genève