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Le proteine si possono Le proteine si possono PURIFICAREPURIFICARE sfruttandosfruttando
DIMENSIONEDIMENSIONE
SOLUBILITASOLUBILITA’’
CARICA ELETTRICACARICA ELETTRICA
AFFINITAAFFINITA’’ PER ALTRE MOLECOLEPER ALTRE MOLECOLE
L'invenzione della L'invenzione della cromatografiacromatografia viene attribuita viene attribuita
al biochimico russo al biochimico russo MikhailMikhail CvetCvet che riuscche riuscìì, nel , nel
19061906, a separare la , a separare la clorofillaclorofilla da un estratto da un estratto
vegetale.vegetale.
Con il termine Con il termine cromatografiacromatografia oggi si indicano oggi si indicano
tutte le varie tecniche separative e/o analitiche tutte le varie tecniche separative e/o analitiche
che si basano sulla distribuzione fra due fasi: che si basano sulla distribuzione fra due fasi:
una fase una fase stazionariastazionaria (fissa) ed una (fissa) ed una mobile mobile
che passa attraverso la fase stazionaria.che passa attraverso la fase stazionaria.
CROMATOGRAFIA
Metodica separativa
Cromatografia
liquidaGas
Cromatografia
Biomolecole
Proteine
Peptidi
Acidi nucleici
Vitamine e cofattori
Carboidrati
Lipidi
Qualitativa
Quantitativa
Preparativa
Ogni singola molecola è contraddistinta
da sue proprie e peculiari caratteristiche:
Peso molecolare (ingombro sterico)
Presenza/assenza di gruppi ionizzabili
Presenza/assenza di regioni idrofobiche
Struttura tridimensionale
Solubilità in determinati solventi
…
�� EE’’ il metodo cromatografico maggiormente il metodo cromatografico maggiormente
adoperatoadoperato
�� La fase stazionaria La fase stazionaria èè immobilizzata su unaimmobilizzata su una
matrice adatta (un supporto inerte ed matrice adatta (un supporto inerte ed
insolubile) ed impaccata allinsolubile) ed impaccata all’’interno di una interno di una
colonna di vetro o di metallo colonna di vetro o di metallo
�� La fase mobile liquida La fase mobile liquida èè fatta passare nella fatta passare nella
colonna per gravitcolonna per gravitàà, tramite un sistema di , tramite un sistema di
pompe, oppure applicando gas sotto pompe, oppure applicando gas sotto
pressione pressione
Metodica SeparativaI costituenti di una miscela vengono separati attraverso il passaggio in una colonna
cromatografica…
Colonna cromatografica
FASE
STAZIONARIA
FASE
MOBILE
M
FASE
STAZIONARIA
FASE
MOBILE
M
Ripartizione delle molecole tra le due fasi
Cosa determina la ripartizione tra le due fasi?
1) Le interazioni che si stabiliscono fra le molecole e le due fasiINTERAZIONI di TIPO NON COVALENTE
Legami idrogenoInterazioni elettrostatiche
Forze di van der WaalsInterazioni idrofobiche
2) L’accessibilità differenziale alla fase stazionariaDimensioni delle molecole
FASE
STAZIONARIA
FASE
MOBILE
M1
Ripartizione differenziale delle molecole tra le due fasi
M2
Perché e quando due molecole si separano?
Perché le interazioni e/o l’accessibilità della molecola M1 con le due fasi
(STAZIONARIA e MOBILE) sono diverse rispetto a quelle della molecola M2
FASE
STAZIONARIA
COO-
COO-
COO-COO-
COO-
COO-
PRGKKRGK
GGILVFTEDD
FASE
MOBILE
H2O con tampone fosfato pH 7.4Gruppi carbossilici immobilizzati
(pKa: 4)
5+ / 1-
1+ / 4-
Ripartizione differenziale delle molecole tra le due fasi
PRGKKRGK => K > 1 – alta “affinità” per la fase stazionaria
GGILVFTEDD => K < 1 – bassa “affinità per la fase stazionaria
Coefficiente di Distribuzione (K)
K = [M]s / [M]m
Nelle condizioni indicate precedentemente si può ritenere che:
COO-
COO-
COO-COO-
COO-
COO-
PR
GK
KR
GK GGILVFTEDD
H2O con tampone fosfato pH 7.4
Gruppi carbossilici immobilizzati
(pKa: 4)
Ripartizione differenziale delle molecole tra le due fasi
Coefficiente di Distribuzione (K)
K = [M]s / [M]m
FISSO nel TEMPO VARIABILE nel TEMPO
Sistema cromatografico fisso nel tempo
FASE MOBILE e FASE STAZIONARIA
non cambiano
Sistema cromatografico variabile nel tempo
FASE MOBILE e FASE STAZIONARIA
cambiano
CROMATOGRAFIA di TIPO
ISOCRATICA IN GRADIENTEL’entità delle interazioni che si stabiliscono tra le fase mobile e stazionaria e le molecole
Rimangono invariate nel tempo Si modificano nel tempo
K = [M]s/[M]m =1
Fase MOBILE
Fase STAZIONARIA
Equilibrio Spostamento
Equilibrio
tempo
SpostamentoEquilibrio
K = [M]s/[M]m =1
K = [M]s/[M]m =4
FS
FS
FM
FM
Qu
an
tità
asso
luta
Qu
an
tità
asso
luta
I II III IV V
I II III IV V
K=1
K=4
Le molecole si separano grazie a differenze nella loro K
Separazione
Le colonne cromatografiche possono immaginarsi costituite da Le colonne cromatografiche possono immaginarsi costituite da
un certo numero di un certo numero di zone adiacenti in ognuna delle quali zone adiacenti in ognuna delle quali
cc’è’è spazio a sufficienza spazio a sufficienza affinchaffinchèè il soluto raggiunga un il soluto raggiunga un
completo equilibramento tra fase mobile e stazionaria completo equilibramento tra fase mobile e stazionaria
Ecco come il numero di piatti teorici influenza la distribuzioneEcco come il numero di piatti teorici influenza la distribuzione
di un soluto con coefficiente di distribuzione pari ad 1 di un soluto con coefficiente di distribuzione pari ad 1
Un picco ben risolto nonUn picco ben risolto non
èè ll’’equivalente di unaequivalente di una
sostanza purasostanza pura
A paritA paritàà di volume di fase di volume di fase
stazionaria, colonne pistazionaria, colonne piùù lunghe e lunghe e
strettestrette determinano una separazione determinano una separazione
migliore (migliore (risoluzionerisoluzione) di proteine ) di proteine
simili.simili.
Quando lQuando l’’analitaanalita si muove in colonna, esso si distribuisce in una si muove in colonna, esso si distribuisce in una
banda che presenta una distribuzione gaussiana banda che presenta una distribuzione gaussiana
In alcuni casi, però, il picco risulta asimmetrico, mostrando unIn alcuni casi, però, il picco risulta asimmetrico, mostrando un allargamento siaallargamento sia
della parte iniziale sia della parte finale (della parte iniziale sia della parte finale (tailingtailing))
LL’’asimmetria dei picchi può essere dovuta a numerosi fattori asimmetria dei picchi può essere dovuta a numerosi fattori
Il caricamento in colonnaIl caricamento in colonna
di concentrazioni troppodi concentrazioni troppo
elevate di elevate di analitaanalita
LL’’imperfetto impaccamento imperfetto impaccamento
della colonnadella colonna
UnUn’’applicazione del applicazione del
campione mal eseguitacampione mal eseguita
La presenza di La presenza di
interazioni interazioni
solutosoluto--supportosupporto
�� ColonnaColonna
�� Serbatoio per la fase mobileSerbatoio per la fase mobile
�� Dispositivo che consente lDispositivo che consente l’’identificazione degliidentificazione degli analitianaliti a mano a mano
a mano che essi lasciano la colonnaa mano che essi lasciano la colonna nellnell’’eluatoeluato
�� RegistratoreRegistratore
�� Raccoglitore di frazioniRaccoglitore di frazioni
La cromatografia liquida su colonna si divide in diversi La cromatografia liquida su colonna si divide in diversi
tipi a seconda della pressione generata alltipi a seconda della pressione generata all’’interno interno
del dispositivo durante il processo di separazione del dispositivo durante il processo di separazione
�� Cromatografia liquida a bassa pressioneCromatografia liquida a bassa pressione (LPLC: (LPLC: low low pressurepressure liquidliquid chromatographychromatography):):
le pressioni sono inferiori ai 5 bar (1 bar = 0.1 le pressioni sono inferiori ai 5 bar (1 bar = 0.1 MPaMPa) poich) poichéé la resistenza opposta dalla la resistenza opposta dalla
fase stazionaria (per la sua natura fisica) al flusso della fase stazionaria (per la sua natura fisica) al flusso della fase mobile fase mobile èè minimaminima
�� Cromatografia liquida a media pressioneCromatografia liquida a media pressione (MPLC: (MPLC: medium pressure medium pressure liquidliquid chromatographychromatography))::
si generano pressioni tra 6 e 50 barsi generano pressioni tra 6 e 50 bar
�� Cromatografia liquida ad alta pressioneCromatografia liquida ad alta pressione (HPLC: (HPLC: high high pressurepressure liquidliquid chromatographychromatography): si ): si
lavora con pressioni superiori ai 50 barlavora con pressioni superiori ai 50 bar
Nella pratica le differenze tra MPLC ed HPLC sono insignificantiNella pratica le differenze tra MPLC ed HPLC sono insignificanti e vengono adoperate le e vengono adoperate le
stesse apparecchiature e procedure.stesse apparecchiature e procedure.
Entrambe le tecniche forniscono un eccellente grado di risoluzioEntrambe le tecniche forniscono un eccellente grado di risoluzione, per cui si preferisce ne, per cui si preferisce
definirle con il termine didefinirle con il termine di cromatografia liquida ad alta risoluzionecromatografia liquida ad alta risoluzione..
Tempo di ritenzione (Tempo di ritenzione (ttRR)):: tempo impiegato da ciascun tempo impiegato da ciascun analitaanalita per emergere dalla colonnaper emergere dalla colonna
Volume di eluizione o ritenzione (VVolume di eluizione o ritenzione (VRR)): volume di fase mobile richiesto per eluire l: volume di fase mobile richiesto per eluire l’’analitaanalita
I due parametri sono in relazione lI due parametri sono in relazione l’’uno con luno con l’’altro tramite la altro tramite la velocitvelocitàà di flussodi flusso ((FcFc) della ) della
fase mobile in colonna:fase mobile in colonna:
VVRR = = ttRRFFcc
La velocitLa velocitàà di flusso dipende dalle dimensioni della colonna (diametro indi flusso dipende dalle dimensioni della colonna (diametro interno, lunghezza),terno, lunghezza),
dalle caratteristiche fisiche delle particelle che compongono ladalle caratteristiche fisiche delle particelle che compongono la fase stazionaria (dimensioni,fase stazionaria (dimensioni,
forma, porositforma, porositàà) e dalla viscosit) e dalla viscositàà della fase mobile. della fase mobile.
Generalmente si assume che lGeneralmente si assume che l’’area sottesa da ciascun picco sia proporzionale area sottesa da ciascun picco sia proporzionale
alla quantitalla quantitàà delldell’’analitaanalita corrispondente che corrispondente che èè stato eluitostato eluito
LL’’area del picco può essere calcolata area del picco può essere calcolata
misurandone lmisurandone l’’altezza (haltezza (hpp) e la sua ) e la sua
larghezza a metlarghezza a metàà delldell’’altezza (altezza (wwhAhA).).
Il prodotto di queste due dimensioni si Il prodotto di queste due dimensioni si
assume essere pari allassume essere pari all’’area del picco.area del picco.
In alternativa, si può ritagliare il picco In alternativa, si può ritagliare il picco
dalla carta del registratore e pesarlo,dalla carta del registratore e pesarlo,
assumendo che area e peso assumendo che area e peso
siano linearmente correlati. siano linearmente correlati.
I calcoli sono piI calcoli sono piùù efficacemente efficacemente
eseguiti da eseguiti da integratoriintegratori appositiappositi
Matrici utilizzateMatrici utilizzate
��AgarosioAgarosio Polisaccaride cosituito da residui alternati di D-galattosio e 3,6-anidro-L-
galattosio. Disponibile commercialmente come Sepharose, Superose, Bio-Gel A
Limiti di esclusione 10-40000 kDa
��CellulosaCellulosa Polimero di unita’ glucosidiche unite da legami ββββ-1,4 (legami crociati
tramite epicloridrina)
��DestranoDestrano Polimero di residui di glucosio uniti da legami ββββ-1,6. E’ presente in
commercio con il nome di Sephadex (legami crociati tramite epicloridrina). Limiti di
esclusione 0.7-800 kDa. Il Sephacryl e’ costituito da destrano che forma legami crociati
con N,N’-metilene bisacrilammide. Limiti di esclusione 1-8000 kDa. Il Superdex e’ un gel
composito costituito da destrano covalentemente legato ad agarosio.
��PoliacrilaPoliacrilammmidemide Polimero di acrilammide e N,N’-metilenbisacrilammide. Disponibile
in commercio come Bio-Gel P, limiti di esclusione tra 0.2 e 400 kDa
��PolistirenePolistirene Polimero di stirene legato con divinilbenzene
��SiliceSilice Polimero prodotto a partire dall’ acido ortosilicico. I molti gruppi silanolo (Si-
OH) rendono la matrice altamente idrofilica
SUPPORTO INERTE PER LASUPPORTO INERTE PER LA
FASE STAZIONARIAFASE STAZIONARIA
IMPACCAMENTO DELLA FASE IMPACCAMENTO DELLA FASE
STAZIONARIA IN COLONNASTAZIONARIA IN COLONNA
��Viene di norma eseguito introducendo con delicatezza in coViene di norma eseguito introducendo con delicatezza in colonna (avendo cura di lonna (avendo cura di
tenere chiusa ltenere chiusa l’’uscita) una sospensione della fase stazionaria nella fase mobileuscita) una sospensione della fase stazionaria nella fase mobile
�� Nel corso dellNel corso dell’’impaccamento impaccamento èè necessario agitare la parte superiore della sospensione necessario agitare la parte superiore della sospensione
e/o tappare la colonna per assicurare che non rimae/o tappare la colonna per assicurare che non rimangano bolle dngano bolle d’’aria nella fase aria nella fase
stazionariastazionaria
�� La sospensione di fase stazionaria La sospensione di fase stazionaria èè versata in colonna fino a quando non viene versata in colonna fino a quando non viene
raggiunta lraggiunta l’’altezza desiderataaltezza desiderata
�� A tal punto la colonna A tal punto la colonna èè messa in flusso con fase mobile aprendone lmessa in flusso con fase mobile aprendone l’’uscita sino a uscita sino a
completo impaccamentocompleto impaccamento
�� EE’’ opportuno posizionare sulla superficie della colonna un diopportuno posizionare sulla superficie della colonna un dispositivo di protezione spositivo di protezione
adeguato, come un filtro di carta o una garza di adeguato, come un filtro di carta o una garza di nylonnylon
�� Nessuna parte della colonna deve essere lasciata andare a seccoNessuna parte della colonna deve essere lasciata andare a secco
�� Un impaccamento insufficiente produce un flusso irregolare in cUn impaccamento insufficiente produce un flusso irregolare in colonna (olonna (channelingchanneling) ed ) ed
una minore risoluzioneuna minore risoluzione
CARICAMENTO DEL CAMPIONECARICAMENTO DEL CAMPIONE
�� Si rimuove dalla superficie della resina la maggior parte della Si rimuove dalla superficie della resina la maggior parte della fase mobile, aspirandola,fase mobile, aspirandola,
e facendo flussare il rimanente in colonna. Il campione e facendo flussare il rimanente in colonna. Il campione èè poi applicato con una pipetta poi applicato con una pipetta
e fatto entrare in colonna. Un volume minimo di fase mobile fatto entrare in colonna. Un volume minimo di fase mobile serve infine a lavare le e serve infine a lavare le
pareti della colonna dallpareti della colonna dall’’eventuale residuo di campione rimasto. Un volume pieventuale residuo di campione rimasto. Un volume piùù cospicuo cospicuo
di fase mobile di fase mobile èè stratificato sulla superficie della colonna.stratificato sulla superficie della colonna.
�� In alternativa, la densitIn alternativa, la densitàà del campione può essere incrementata aggiungendovi del campione può essere incrementata aggiungendovi
saccarosio in concentrazione 1% circa. Quando questa soluziosaccarosio in concentrazione 1% circa. Quando questa soluzione ne èè stratificata sul liquido stratificata sul liquido
che ricopre il letto della colonna, automaticamente si dche ricopre il letto della colonna, automaticamente si disporrisporràà sul fondo ed entrersul fondo ed entreràà
rapidamente in colonna. La metodica rapidamente in colonna. La metodica èè valida solo se il saccarosio non interferisce con lavalida solo se il saccarosio non interferisce con la
successiva separazione ed analisi del campione. successiva separazione ed analisi del campione.
�� Un terzo metodo prevede lUn terzo metodo prevede l’’utilizzo di un tubo capillare e/o una siringa, oppure una utilizzo di un tubo capillare e/o una siringa, oppure una
pompa peristaltica per portare direttamente il campione sulpompa peristaltica per portare direttamente il campione sulla superficie della colonna. la superficie della colonna.
SVILUPPO DELLA COLONNASVILUPPO DELLA COLONNA
I componenti contenuti nel campione caricato sono separatiI componenti contenuti nel campione caricato sono separati ll’’uno dalluno dall’’altro altro
dal passaggio del solvente (fase mobile) nella colonna.dal passaggio del solvente (fase mobile) nella colonna.
EE’’ fondamentale che lfondamentale che l’’eluizione avvenga a velociteluizione avvenga a velocitàà costante, ciò che costante, ciò che èè
facilmente raggiunto eluendo per gravitfacilmente raggiunto eluendo per gravitàà..
POMPE PERISTALTICHEPOMPE PERISTALTICHE
Le pompe piLe pompe piùù comuni utilizzano tubi di silicone, polivinilcloruro o fluorurocomuni utilizzano tubi di silicone, polivinilcloruro o fluoruro che, che,
compressi a velocitcompressi a velocitàà costante da un disco rotante, rilasciano la fase mobile con costante da un disco rotante, rilasciano la fase mobile con
la velocitla velocitàà di flusso desiderata.di flusso desiderata.
Le pompe ed i tubi, di diametro noto, devono essere preventivameLe pompe ed i tubi, di diametro noto, devono essere preventivamente tarati per nte tarati per
determinare la velocitdeterminare la velocitàà di flusso. di flusso.
ELUIZIONE ISOCRATICAELUIZIONE ISOCRATICA
Sviluppo della colonna con Sviluppo della colonna con
ll’’utilizzo di un solo solventeutilizzo di un solo solvente
ELUIZIONE IN GRADIENTEELUIZIONE IN GRADIENTE
Si operano variazioni continue di pH, concentrazione Si operano variazioni continue di pH, concentrazione
o polarito polaritàà
SISTEMI DI RIVELAZIONESISTEMI DI RIVELAZIONE
La rivelazione puòLa rivelazione può basarsi sullbasarsi sull’’assorbimento nella zona dellassorbimento nella zona dell’’ultraviolettoultravioletto, sulla, sulla
spettroscopia a fluorescenzaspettroscopia a fluorescenza, su, su variazioni dellvariazioni dell’’indice di rifrazioneindice di rifrazione,,
sullsull’’emissione di radioattivitemissione di radioattivitàà..
I sistemi di rivelazione piI sistemi di rivelazione piùù comuni registranocomuni registrano ll’’assorbimento di luce assorbimento di luce
nellnell’’ultraviolettoultravioletto. Gli strumenti migliori rivelano le proteine nell. Gli strumenti migliori rivelano le proteine nell’’intervallointervallo 190 190 ––
220 220 nmnm e e 260 260 –– 280 nm280 nm..
RACCOGLITORI DI FRAZIONIRACCOGLITORI DI FRAZIONI
Funzionano in modo tale da riempire ogni provetta con una certa Funzionano in modo tale da riempire ogni provetta con una certa quantitquantitàà didi
eluato, prima di passare automaticamente a quella successiva.eluato, prima di passare automaticamente a quella successiva.
La quantitLa quantitàà di eluato raccolta in ogni provetta può essere regolata in vadi eluato raccolta in ogni provetta può essere regolata in vario rio
modo.modo.
Si può utilizzare un sistema di sifoni che convoglia un determSi può utilizzare un sistema di sifoni che convoglia un determinato volume, inato volume,
oppure un dispositivo elettronico che controlla il numero di goppure un dispositivo elettronico che controlla il numero di gocce di eluato occe di eluato
che cadono nella provetta.che cadono nella provetta.
Una possibilitUna possibilitàà ulteriore di raccolta ulteriore di raccolta èè quella ad intervalli fissi di tempo. quella ad intervalli fissi di tempo.
Se varia la composizioneSe varia la composizione
delldell’’eluato, varia anche laeluato, varia anche la
tensione superficiale e latensione superficiale e la
dimensione delle goccioline dimensione delle goccioline
Se varia la velocitSe varia la velocitàà di flussodi flusso
in colonna, varia anche il volume in colonna, varia anche il volume
delle frazioni; in realtdelle frazioni; in realtàà ciò si ciò si
verifica di rado e quindi i verifica di rado e quindi i
raccoglitori a tempo fisso sono i raccoglitori a tempo fisso sono i
pipiùù utilizzati utilizzati
CROMATOGRAFIACROMATOGRAFIA FASE STAZIONARIAFASE STAZIONARIA FASE MOBILEFASE MOBILE
GelGel--filtrazionefiltrazione solidasolida--porosaporosa liquidaliquida
Scambio ionicoScambio ionico solidasolida-- liquidaliquida
gruppi carichi gruppi carichi
AffinitAffinitàà solidasolida-- liquidaliquida
ligandoligando immobilizzatoimmobilizzato
Fase inversa liquidaFase inversa liquida liquidaliquida//
gassosagassosa
�� Consente la separazione di molecole in base alle loro dimensioniConsente la separazione di molecole in base alle loro dimensioni
�� Il termine Il termine gel filtrazionegel filtrazione èè, infatti, impiegato per descrivere la separazione di , infatti, impiegato per descrivere la separazione di
molecole di dimensioni diverse utilizzandomolecole di dimensioni diverse utilizzando gelgel (composti organici polimerici che (composti organici polimerici che
possiedono una rete tridimensionale di pori che conferipossiedono una rete tridimensionale di pori che conferisce loro le proprietsce loro le proprietàà di di
un gel)un gel)
�� FASE STAZIONARIA FASE STAZIONARIA solida solida –– porosaporosa
FASE MOBILEFASE MOBILE liquida liquida
�� Nessuna interazione chimica tra le particelle di resina e le proNessuna interazione chimica tra le particelle di resina e le proteineteine
�� Le particelle di resina fungono da setacci molecolariLe particelle di resina fungono da setacci molecolari
SARANNO COMPLETAMENTE ESCLUSE SARANNO COMPLETAMENTE ESCLUSE
DAI PORI E QUINDI PASSERANNO ATTRAVERSO DAI PORI E QUINDI PASSERANNO ATTRAVERSO
GLI SPAZI INTERSTIZIALI E COMPARIRANNO GLI SPAZI INTERSTIZIALI E COMPARIRANNO
PER PRIME NELLPER PRIME NELL’’ELUATOELUATO
SI DISTRIBUIRANNO TRA LA FASE MOBILE SI DISTRIBUIRANNO TRA LA FASE MOBILE
ALLALL’’INTERNO ED ALLINTERNO ED ALL’’ESTERNO DEL SETACCIO ESTERNO DEL SETACCIO
MOLECOLARE E TRANSITERANNO IN COLONNAMOLECOLARE E TRANSITERANNO IN COLONNA
CON UNA VELOCITACON UNA VELOCITA’’ INFERIOREINFERIORE
NN°° della frazionedella frazione
(o volume dell(o volume dell’’eluato)eluato)
Co
nce
ntr
azi
on
e p
rote
ica t
ota
leC
on
cen
tra
zion
e p
rote
ica t
ota
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Attiv
itA
ttivit àà
Sp
ecificaS
pecifica
�� Se una molecola di Se una molecola di analitaanalita èè grande e perciò completamente esclusa dalla fase grande e perciò completamente esclusa dalla fase
mobile presente allmobile presente all’’interno del gel, il suo interno del gel, il suo KKdd èè pari apari a 00, mentre se l, mentre se l’’analitaanalita èè
sufficientemente piccolo da avere completo accesso alla fassufficientemente piccolo da avere completo accesso alla fase mobile interna, il suo e mobile interna, il suo
KKdd èè pari apari a 11
�� A causa della variabilitA causa della variabilitàà delle dimensioni dei pori tra le particelle di gel, solo unadelle dimensioni dei pori tra le particelle di gel, solo una
parte della fase mobile interna sarparte della fase mobile interna saràà accessibile agli accessibile agli analitianaliti di dimensioni intermedie; di dimensioni intermedie;
quindi i loro valori di quindi i loro valori di KKdd variano tra 0 e 1variano tra 0 e 1
�� Ciò rende possibile la separazione su un determinato gel di Ciò rende possibile la separazione su un determinato gel di analitianaliti in un intervallo di in un intervallo di
dimensioni estremamente ristrettodimensioni estremamente ristretto
Sephadex G-10 Destrano 0.05 - 0.7
G-25 Destrano 1 - 5
G-50 Destrano 1 - 30
G-100 Destrano 4 - 150
G-200 Destrano 5 - 600
Bio-Gel P-2 Poliacrilammide 0.1 - 1.8
P-6 Poliacrilammide 1 - 6
P-10 Poliacrilammide 1.5 - 20
P-30 Poliacrilammide 2.4 - 40
P-100 Poliacrilammide 5 - 100
P-300 Poliacrilammide 60 - 400
Sepharose 6B Agarosio 10 - 4000
4B Agarosio 60 - 20000
2B Agarosio 70 - 40000
Nome commercialeNome commerciale PolimeroPolimeroIntervallo di Intervallo di
frazionamento (frazionamento (kDakDa))
logP
Mlo
gP
M
Volume di eluizioneVolume di eluizione
�� Le colonne Le colonne SephadexSephadex GG--25 possono essere utilizzate per dissalare 25 possono essere utilizzate per dissalare
soluzioni di composti ad alto peso molecolaresoluzioni di composti ad alto peso molecolare
�� Le sostanze ad alto peso molecolare sono escluse dai pori, meLe sostanze ad alto peso molecolare sono escluse dai pori, mentre ntre
i composti a basso peso molecolare si muovono lentamentei composti a basso peso molecolare si muovono lentamente
�� Tale metodo Tale metodo èè adoperato per allontanare ladoperato per allontanare l’’ammonio solfato da ammonio solfato da
preparazioni proteiche ed i sali dai campionpreparazioni proteiche ed i sali dai campioni eluiti dopo i eluiti dopo
cromatografia a scambio ionico cromatografia a scambio ionico
VANTAGGIVANTAGGI
•• Semplice nellSemplice nell’’esecuzioneesecuzione
•• PrevedibilePrevedibile
•• Eluizione nel tampone di partenzaEluizione nel tampone di partenza
SVANTAGGISVANTAGGI
•• Bassa capacitBassa capacitàà (piccoli volumi, 1/40 (piccoli volumi, 1/40
del volume della colonna)del volume della colonna)
•• Sovrapposizione dei picchiSovrapposizione dei picchi
•• Diluizione del campioneDiluizione del campione
Cellule di Cellule di E. coliE. coli contenenti la contenenti la RNasiRNasi AA
Omogenato cellulareOmogenato cellulare
Sopranatante dellSopranatante dell’’omogenato cellulareomogenato cellulare
contenente la contenente la RNasiRNasi AA
Lisi mediante ultrasuoniLisi mediante ultrasuoni
((sonicazionesonicazione))
CentrifugazioneCentrifugazione
(eliminazione detriti cellulari)(eliminazione detriti cellulari)
Sopranatante dellSopranatante dell’’omogenato cellulareomogenato cellulare
Cromatografia per gel filtrazioneCromatografia per gel filtrazione
Resina SEPHADEX GResina SEPHADEX G--75 75
capacitcapacitàà di separazione 5di separazione 5--70 70 KDaKDa
DestranoDestrano: polimero di residui di glucosio uniti da legami ββββ-1,6
che presenta legami crociati con epicloridrina.
Limiti di esclusione 0.7-800 kDa.
Pompa Pompa
peristalticaperistaltica ColonnaColonna
Collettore di frazioniCollettore di frazioni
CONDIZIONI SPERIMENTALICONDIZIONI SPERIMENTALI
Volume della resinaVolume della resina: : 12 ml12 ml
Soluzione tamponeSoluzione tampone: Tris: Tris--Acetato 0,1 M, pH 8,4, contenente Acetato 0,1 M, pH 8,4, contenente NaClNaCl 0,3 M0,3 M
Campione di carico (miscela di 4 proteine)Campione di carico (miscela di 4 proteine)::
1. 1. RNasiRNasi A (PM = 13.7 A (PM = 13.7 kDakDa))
2. 2. αααααααα--amilasi (PM = 50 amilasi (PM = 50 kDakDa))
3. Emoglobina da plasma bovino (PM = 64 3. Emoglobina da plasma bovino (PM = 64 kDakDa) (4 ) (4 subunitsubunitàà da 16 da 16 kDakDa))
4. 4. Albumina da siero bovino (PM = 69 Albumina da siero bovino (PM = 69 kDakDa))
Volume del campione di caricoVolume del campione di carico = = 0,3 ml0,3 ml
Volume delle frazioniVolume delle frazioni = = 0,4 ml0,4 ml
Determinazione dellDeterminazione dell’’assorbanza nellassorbanza nell’’ultravioletto (ultravioletto (λλ = 278 = 278 nmnm) )
di tutte le frazioni ottenutedi tutte le frazioni ottenute
Riportando in grafico i valori di assorbanza in funzione Riportando in grafico i valori di assorbanza in funzione del del
numero delle frazioni (o del volume eluito) si otnumero delle frazioni (o del volume eluito) si ottiene il tiene il
cromatogrammacromatogramma
Cromatogramma gruppo PLR
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27
N° frazioni
Asso
rban
za a
278 n
m
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0 5 10 15 20 25 30 35
N°frazioni
As
so
rba
nza
a 2
78
nm
Cromatogramma Gaito-Pennacchio -Procentese
-0,2
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
CromatogrammaCromatogramma C.L.C.L.
NN°° frazionifrazioni
Ass
orb
an
za a
278
A
sso
rba
nza
a 2
78
nm
nm
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 20 21 23 25 27 29 31 33
CromatogrammaCromatogramma CapuanoCapuano
NN°° frazionifrazioni
Ass
orb
an
za a
278
A
sso
rba
nza
a 2
78
nm
nm
Le proteine si possono Le proteine si possono PURIFICAREPURIFICARE sfruttandosfruttando
DIMENSIONEDIMENSIONE
CARICA ELETTRICACARICA ELETTRICA
•• Le molecole cariche interagiscono con gruppi funzionaliLe molecole cariche interagiscono con gruppi funzionali
presenti sulla fase stazionariapresenti sulla fase stazionaria
•• La forza del legame proteinaLa forza del legame proteina--matrice dipende dalla caricamatrice dipende dalla carica
netta della proteina netta della proteina
•• La separazione si basa sulle differenze di carica netta (perLa separazione si basa sulle differenze di carica netta (per
valori di pH definiti) delle diverse proteinevalori di pH definiti) delle diverse proteine
•• FASE STAZIONARIA FASE STAZIONARIA solida solida –– gruppi carichigruppi carichi
FASE MOBILE FASE MOBILE liquida liquida
•• Le matrici adoperate possono essere di polistirene, cellulosa, Le matrici adoperate possono essere di polistirene, cellulosa,
destranodestrano ed ed agarosioagarosio
Si basa sullSi basa sull’’attrazione elettrostatica esistente tra attrazione elettrostatica esistente tra
proteine cariche e proteine cariche e GRUPPI IONICIGRUPPI IONICI di carica di carica
opposta presenti sulla opposta presenti sulla MATRICEMATRICE
Scambiatore cationicoScambiatore cationico Scambiatore anionicoScambiatore anionico
Il meccanismo dello scambio ionico Il meccanismo dello scambio ionico èè definito in termini di definito in termini di
cinque passaggi distinti:cinque passaggi distinti:
�� Diffusione dello ione sulla superficie di scambioDiffusione dello ione sulla superficie di scambio
�� Diffusione dello ione allDiffusione dello ione all’’interno della matrice fino al sito di scambiointerno della matrice fino al sito di scambio
�� Scambio degli ioni al sito di scambioScambio degli ioni al sito di scambio
�� Diffusione dello ione che Diffusione dello ione che èè stato scambiato sulla superficie dello scambiatorestato scambiato sulla superficie dello scambiatore
�� Distacco selettivo della molecola di interesseDistacco selettivo della molecola di interesse
1.1. Variazioni di pH e/o di forza ionicaVariazioni di pH e/o di forza ionica
2.2. EluizioneEluizione per affinitper affinitàà →→ èè introdotto nel sistema uno ione che presenta introdotto nel sistema uno ione che presenta
affinitaffinitàà maggiore per lo scambiatore rispetto allo ione legato maggiore per lo scambiatore rispetto allo ione legato
Proteine con carica +Proteine con carica +
Proteine con carica Proteine con carica --
-
--
--
-
--
-
--
- Scambiatore Scambiatore
Proteine con carica +Proteine con carica +
Proteine con carica Proteine con carica --
--
--
-
-
--
-
- Scambiatore Scambiatore
Proteine con carica +Proteine con carica +
Proteine con carica Proteine con carica --
--- -
-
-
- --
CENTRIFUGAZIONE CENTRIFUGAZIONE
- Scambiatore Scambiatore
Proteine con carica +Proteine con carica +
Proteine con carica Proteine con carica --
--- -
-
-
- --
Soluzione di lavaggioSoluzione di lavaggio
--- -
-
-
- --
Soluzione salina concentrataSoluzione salina concentrata
--- - --- -
EluizioneEluizione
R-CH2-COO-
R-CH2-COO-
R-CH2-COO-
R-CH2-COO-
R-CH2-COO-
R-CH2-COO-
+ +
+ + +
+
+ +
+
_ _
_ _ _
_
_ _
_ _ _
_
R-CH2-COO-
R-CH2-COO-
R-CH2-COO-
R-CH2-COO-
R-CH2-COO-
R-CH2-COO-
+ +
+ + +
+
Na+
Na+
Cl-
Cl- Na+
Na+
Na+
Cl-
Cl-
Na+
Na+
+ +
+
Cl-
Cl-
Cl-
R-CH2-COO-
R-CH2-COO-
R-CH2-COO-
R-CH2-COO-
R-CH2-COO-
R-CH2-COO-
+ +
+ + +
+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Na+
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl- Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
Cl-
--- - --- -
Cromatografia in Cromatografia in batchbatch
Cromatografia su Cromatografia su COLONNACOLONNA
[SALE]
[SALE]
RR--CHCH22--COOHCOOH == RR--CHCH22--COOCOO--
RR--CHCH22--CHCH22--CHCH22--SOSO33H = H = RR--CHCH22--CHCH22--CHCH22--SOSO33--
Gruppo Gruppo CARBOSSIMETILICOCARBOSSIMETILICO
scambiatore debole di cationiscambiatore debole di cationi
Gruppo Gruppo PROPILSOLFONICOPROPILSOLFONICO
scambiatore forte di cationiscambiatore forte di cationi
pKpKaa ~~ 4.54.5
pKpKaa < 1< 1
Effetti del pH sulla resina scambiatriceEffetti del pH sulla resina scambiatrice
R RR R| || |
RR--CHCH22--N:N: == RR--CHCH22--NHNH++
| || |R RR R
Gruppo Gruppo amminico terziarioamminico terziario
scambiatore debole di anioniscambiatore debole di anioni
pKpKaa ~~ 8.58.5
RR| |
RR--CHCH22--NN++--RR| | R R
Ammina quaternariaAmmina quaternaria
scambiatore forte di anioniscambiatore forte di anioni
Effetti del pH sulla resina scambiatriceEffetti del pH sulla resina scambiatrice
Effetti del Effetti del pH pH sulla carica delle molecole proteichesulla carica delle molecole proteiche
pHpH77 101044
pI = 5.5pI = 5.5
ProteinaProteinan+n+ ProteinaProteinann--
pHpH77 101044
pI = 8.5pI = 8.5
ProteinaProteinan+n+ProteinaProteinann--
Effetti del Effetti del pH pH sulla carica delle molecole proteichesulla carica delle molecole proteiche
�� Si definisceSi definisce capacitcapacitàà totale di scambiototale di scambio il numero di il numero di milliequivalentimilliequivalenti di ioni di ioni
scambiabili, riferito ai grammi di scambiatore secco o allscambiabili, riferito ai grammi di scambiatore secco o all’’unitunitàà di volume di volume
della resina idratatadella resina idratata
�� Elettroliti deboli, i quali sono ionizzati a valori estElettroliti deboli, i quali sono ionizzati a valori estremi di pH, potranno remi di pH, potranno
essere separati solo su scambiatori forti, in gessere separati solo su scambiatori forti, in grado di operare in un rado di operare in un
ampio intervallo di pHampio intervallo di pH
�� Per gli elettroliti forti si preferisce ricorrere a scambiatoriPer gli elettroliti forti si preferisce ricorrere a scambiatori deboli, i quali non deboli, i quali non
sono in grado di legare le impuritsono in grado di legare le impuritàà fornite di carica presenti nel fornite di carica presenti nel
campione e possiedono caratteristiche di eluizione miglioricampione e possiedono caratteristiche di eluizione migliori
�� Il pH del tampone adoperato deve essere di almeno una unitIl pH del tampone adoperato deve essere di almeno una unitàà inferiore o inferiore o
superiore al punto isoionico dei composti da separare superiore al punto isoionico dei composti da separare
•• Scambiatore cationico forteScambiatore cationico forte
•• pH 1pH 1--2 (tutti gli 2 (tutti gli aaaa si legano)si legano)
•• Eluizione tramite aumento di pH e forza ionica:Eluizione tramite aumento di pH e forza ionica:1.1. aaaa acidi (es. acidi (es. aspartatoaspartato e glutammato)e glutammato)
2.2. aaaa neutri (es. neutri (es. glicinaglicina e valina)e valina)
3.3. aaaa basici (es. lisina e basici (es. lisina e argininaarginina))
•• Rivelazione tramite Rivelazione tramite ninidrinaninidrina
VANTAGGIVANTAGGI
•• PossibilitPossibilitàà di caricare grandi volumidi caricare grandi volumi
•• Eluizione della proteina di interesse in un piccolo volumeEluizione della proteina di interesse in un piccolo volume
SVANTAGGI SVANTAGGI
• Esecuzione in due tempi
• Eluizione in un tampone a pH e forza ionica diversi dal
tampone iniziale
• Possibilità di selezionare solo molecole ionizzabili
Determinazione della concentrazione proteica Determinazione della concentrazione proteica
mediante METODO DI BRADFORDmediante METODO DI BRADFORD
Il colorante Il colorante CoomassieCoomassie®® BrilliantBrilliant Blue GBlue G--250 nella sua 250 nella sua
forma libera presenta un massimo di assorbimento a 465 forma libera presenta un massimo di assorbimento a 465
nmnm ((marronemarrone) ) →→ il legame alle proteine determina uno il legame alle proteine determina uno
spostamento del massimo di assorbimento del colorante a spostamento del massimo di assorbimento del colorante a
595 595 nmnm ((blublu))
La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla
quantità di proteine presenti nel campione in esame
L’incremento di assorbanza a 595 nm (intensità del colore
blu) è proporzionale alla concentrazione proteica
1 mg/ml 2 mg/ml 4 mg/ml 8 mg/ml 16 mg/ml
COSTRUZIONE DI UNA RETTA DI TARATURA
�� Proteina a concentrazione nota (BSA)Proteina a concentrazione nota (BSA)
�� Colorante (Colorante (BradfordBradford))
8
4
2
1
--
Camp.
µl
8
4
2
1
Bianco
Camp.
492
496
498
499
500
H20
µl
500
500
500
500
500
Bradford
µl
0,561,0000,9981,001
0,3660,8040,8110,796
0,2440,6820,6840,68
0,1810,6190,6390,598
0,4380,4530,423
µg/ml∆∆∆∆MAbs 595 nm
y = 0,0511 x
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 2 4 6 8
µµµµg di proteina
Ass
orb
an
za a
595
nm
10
10
10
10
10
8
4
2
1
Camp.
µl
#4
#3
#2
# 1
pool
8
4
2
1
Bianco
Camp.
490
490
490
490
490
492
496
498
499
500
H20
µl
500
500
500
500
500
500
500
500
500
500
Bradford
µl
0,561,0000,9981,001
0,3660,8040,8110,796
0,2440,6820,6840,68
0,1810,6190,6390,598
0,4380,4530,423
µg/µµµµl∆∆∆∆MAbs 595 nm
Le proteine si possono PURIFICARE sfruttando
DIMENSIONE
CARICA ELETTRICA
AFFINITAAFFINITA’’ PER ALTRE MOLECOLEPER ALTRE MOLECOLE
�� Si basa sulla specificitSi basa sulla specificitàà delle interazioni biologiche per ottenere la delle interazioni biologiche per ottenere la
separazione e la purificazione delle molecoleseparazione e la purificazione delle molecole
�� UnUn ligandoligando specifico per la molecola di interesse specifico per la molecola di interesse èè legato legato
covalentemente ad una matrice insolubilecovalentemente ad una matrice insolubile
�� EE’’ necessario che le molecole da isolare siano in grado di legare necessario che le molecole da isolare siano in grado di legare il il
ligandoligando in maniera specifica e in maniera specifica e reversibilereversibile
�� FASE STAZIONARIA FASE STAZIONARIA solida solida –– ligando immobilizzatoligando immobilizzato
FASE MOBILEFASE MOBILE liquida liquida
•• Deve possedere un numero sufficiente di gruppi chimici, ai qualDeve possedere un numero sufficiente di gruppi chimici, ai quali i
possa essere legato possa essere legato covalentementecovalentemente lo specifico lo specifico ligandoligando
•• Deve essere stabile nelle condizioni di legame e duraDeve essere stabile nelle condizioni di legame e durante la nte la
successiva eluizionesuccessiva eluizione
•• Deve interagire solo debolmente con le altre macromolecoDeve interagire solo debolmente con le altre macromolecole, le,
riducendo cosriducendo cosìì al minimo lal minimo l’’adsorbimento aspecificoadsorbimento aspecifico
•• Le matrici piLe matrici piùù utilizzate sono i utilizzate sono i destranidestrani ((SephacrylSephacryl SS), ), agarosioagarosio
((SepharoseSepharose, , BioBio--GelGel AA), ), poliacrilammidepoliacrilammide ((BioBio--GelGel PP), polistirene ), polistirene
((BioBio--BeadsBeads SS), cellulosa), cellulosa
�� Per evitare che il legame del Per evitare che il legame del ligandoligando alla matrice possa interferire con la sua capacitalla matrice possa interferire con la sua capacitàà
di legarsi poi alla macromolecola, di legarsi poi alla macromolecola, èè preferibile interporre unpreferibile interporre un braccio spaziatorebraccio spaziatore tra tra
ligandoligando e matricee matrice
�� La suaLa sua lunghezzalunghezza èè critica per lcritica per l’’efficienza della cromatografia (la lunghezza ottimale efficienza della cromatografia (la lunghezza ottimale èè
tra 6 e 8 atomi di carbonio):tra 6 e 8 atomi di carbonio):
1) Se troppo corto può ostacolare il legame tra il 1) Se troppo corto può ostacolare il legame tra il ligandoligando e la molecola da e la molecola da
purificarepurificare
2) Se troppo lungo può instaurare interazioni idrofobiche2) Se troppo lungo può instaurare interazioni idrofobiche con le molecole con le molecole
proteiche proteiche
GENERICOGENERICO: un : un ligandoligando che mostri unache mostri una selettivitselettivitàà di gruppodi gruppo, dal momento che , dal momento che
èè in grado di legare gruppi affini di molecole che possiedono unain grado di legare gruppi affini di molecole che possiedono una
similaritsimilaritàà chimica insita molto ampia, ad es. chimica insita molto ampia, ad es. polypoly--(U) per (U) per mRNAmRNA
SPECIFICOSPECIFICO: un : un ligandoligando che sia in grado di legare in maniera specifica una che sia in grado di legare in maniera specifica una
data molecola, ad es. un analogo di un substrato perdata molecola, ad es. un analogo di un substrato per purificare purificare
un enzima o ioni nickel per code di istun enzima o ioni nickel per code di istidinaidina
Legame di un Legame di un ligandoligando al braccio spaziatore al braccio spaziatore
legato alla matricelegato alla matrice
LL’’immobilizzazione può provocare limmobilizzazione può provocare l’’inattivazione del inattivazione del ligandoligando perchperchéé ne ne
altera la struttura tridimensionale o rende inaccessibile il sitaltera la struttura tridimensionale o rende inaccessibile il sito di legame o di legame
NON SPECIFICANON SPECIFICA::
si basa su variazioni di pH, della forza ionica o si basa su variazioni di pH, della forza ionica o
sullsull’’aggiunta di un agente denaturanteaggiunta di un agente denaturante
SPECIFICASPECIFICA::
si aggiunge un competitore, vale a dire un composto si aggiunge un competitore, vale a dire un composto
che ha una maggiore affinitche ha una maggiore affinitàà per la molecola da per la molecola da
purificare rispetto al purificare rispetto al ligandoligando legato legato covalentementecovalentemente
alla matricealla matrice
CROMATOGRAFIA DI AFFINITACROMATOGRAFIA DI AFFINITA’’
per purificare una ribonucleasiper purificare una ribonucleasi
Analogo del substratoAnalogo del substrato
legato legato covalentementecovalentemente
alla resinaalla resina
pirimidinapirimidina
o aggiunta del o aggiunta del
competitorecompetitore
VANTAGGI
• PossibilitPossibilitàà di caricare grandi volumidi caricare grandi volumi
•• Eluizione del composto di interesse in un piccolo volumeEluizione del composto di interesse in un piccolo volume
•• Elevata specificitElevata specificitàà di selezionedi selezione
SVANTAGGISVANTAGGI
• Esecuzione in piEsecuzione in piùù tempi tempi
•• Richiesta conoscenza delle caratteristiche della molecola Richiesta conoscenza delle caratteristiche della molecola
da selezionare (meccanismo dda selezionare (meccanismo d’’azione, affinitazione, affinitàà per altri per altri
ligandiligandi, ...), ...)
•• Eluizione in un tampone a pH e/o forza ionica diversi dal Eluizione in un tampone a pH e/o forza ionica diversi dal
tampone inizialetampone iniziale
•• In molti casi il campione eluito In molti casi il campione eluito èè contaminato dallcontaminato dall’’agente agente
““spiazzantespiazzante””
Cromatografia per interazione idrofobica
• PRINCIPIO: sfrutta l’idrofobicità superficiale delle proteine (residui Aa. non polari)
• FASE STAZIONARIA: matrice inerte a cui sono legati gruppi idrofobici (radicali o gruppi ottilici, fenilici, butilici
• FASE MOBILE tampone polare– A concentrazione salina decrescente (riduzione degli
effetti idrofobici)
– A concentrazione di detergente crescente
– Con variazione di pH
Cromatografia di ripartizione• Fase diretta• fase stazionaria: polare,
• eluente apolare
• Fase inversa• fase stazionaria apolare,
• eluente polare
Si – O – C18H37
Cromatografia liquido-solido o infase normale
FASE STAZIONARIA:Matrice di silica, allumina,
fasi legate a GRUPPI amino-, ciano-, o fenilici
FASE MOBILE NON POLARE
Come esano, isopropanolo
• Eccellente per analiti non polari,isomeri, separazione in gruppi omogenei in polarità
Cromatografia in fase inversa
Separazione basata sulla ripartizione• dell’analita in una fase stazionaria• idrofobica legata a gel di silice• FASE MOBILE polare come
miscele di metanolo/acetonitrile e acqua;
• Analiti polari eluiscono prima mentre i non polari sono piùritenuti
• Modo HPLC più comune
• Per analiti polari (solubili in acqua), di media polarità, e talvolta non-polari
Interazione idrofobica
• ELUIZIONE: • gradiente discendente di forza ionica• Gradiente ascendente di solventi organici
(alcoli)• In alcuni casi il legame è così forte che
si devono usare detergenti
• UTILE PER LA SEPARAZIONE DI PROTEINE DI MEMBRANA
High Performance Liquid
Chromatography (HPLC)
• Elevato numero di piatti teorici
• Ridotta dimensione delle particelle di
matrice
• Elevata pressione della colonna
Colonne per HPLC
Pressione fino a 55 MPa (550 Bar)
