METODOLOGÍAS PARA LA DETECCIÓN Y EL TIPAJE DE MICROORGANISMOS TRANSPORTADOS POR ALIMENTOS

Durante la década pasada, se han observado muchas mejores en los métodos tanto convencionales como modernos para la detección de bacterias patogénicas en alimentos. Las modificaciones y la automatización de los métodos convencionales en la microbiología de los alimentos incluyen la preparación de muestras, técnicas de plaqueo, conteo e identificación.

Las técnicas de bioluminiscencia de ATP son usadas con mayor frecuencia para la medición de la eficiencia de superficies limpias y utensilios. Métodos de conteo celular, incluyendo la citometría de flujo y la técnica directa de filtro epifluorescente son técnicas adecuadas para la rápida detección de microorganismos, especialmente en líquidos. Los sistemas automatizados basados en Impedimetría son capaces de analizar un número elevado de muestras basado en el recuento bacteriano diario.

Los inmunoensayos en una amplia gama de formatos hacen que la detección rápida de muchos posibles patógenos. Recientemente, se han producido avances importantes en el uso de ensayos basados en ácidos nucleicos para la detección y tipificación de patógenos transmitidos por los alimentos. La sensibilidad de estos métodos se ha aumentado de manera significativa por el uso de la reacción en cadena de la polimerasa y otras técnicas de amplificación. Los métodos alternativos y rápidos deben cumplir una serie de requisitos relativos a la precisión, la validación, la velocidad, la automatización, la matriz de la muestra, etc Ambos métodos convencionales y rápidos se utilizan en programas de puntos críticos de control de análisis de riesgos. Otras mejoras, especialmente en inmunoensayos y métodos genéticos se pueden esperar, incluyendo el uso de biosensores y la tecnología de los microarreglos (Microarrays).1,2

CUESTIONARIO

1. ¿EN UNA MUESTRA DE YOGURT, AL QUE SE LE AGREGA FRUTAS QUE PUEDEN CONTENER SACAROSA, GLUCOSA O LEVULOSA, DURANTE LA PRUEBA DE COLIFORMES, LA PRODUCCIÓN DE GAS PUEDE DEBERSE A LA FERMENTACIÓN BACTERIANA DE LA LACTOSA DEL MEDIO DE CULTIVO O TAMBIÉN DE LA SACAROSA, GLUCOSA O LEVULOSA DE LA MUESTRA ANALIZADA, CÓMO DEBE REALIZARSE LA PRUEBA CONFIRMATORIA?

La norma peruana no hace referencia al tipo de producto fermentado (yogurt) que se pueda presentar bajo su forma comercial. Por norma, el análisis microbiológico de leches fermentadas involucra el estudio de Coliformes, Mohos y Levaduras3. Solo para el caso de coliformes en el cual el método del Número Más Probable consiste en dos pruebas consecuentivas, la prueba preliminar que involucra el uso de Caldo Lactosado o Caldo EC, y una prueba confirmatoria que se basa en el uso del Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis 2%, el hecho de que la muestra a analizar posea un ingrediente análogo a los componentes del cultivo no debería afectar el resultado. Si dicho alimento ha sido expuesto a una mala praxis de higiene durante su tratamiento, ya sea durante el procesado o el almacenamiento, el resultado debe ser siempre el mismo, si es que se tratara de un yogurt frutado o un yogurt normal.

La presencia de estos sustratos (frutas en el yogurt) constituyen un riesgo adicional para la preparación y conservación del alimento, por lo que los microorganismos oportunistas se pueden ver favorecidos por las condiciones adicionales que existen en un yogurt frutado, sin embargo, la prueba para coliformes debe revelar de forma coherente la presencia y la cantidad más probable de estos microorganismos

2. ¿EN QUÉ CONSISTE LA TÉCNICA DE LA IMPEDANCIA EN LECHE, UTILIZANDO EL BACTÓMETRO?5

Actualmente, existe una serie de laboratorios que han diseñado sus propios instrumentos de evaluación y monitoreo por el método de la Impedancia. La impedancia en Microbiología (o denominada Microbiología de la Impedancia o Espectroscopía dieléctrica) constituye un conjunto de técnicas que permiten detectar, monitorear, cuantificar e identificar microorganismos en muestras del interés de cada analista.

La impedancia (En física denominada como Z) es la tensión generada que se opone al paso de la corriente alterna. Generalmente aplicado al campo de los condensadores en los cuales se ven involucradas variables como Conductancia, capacitancia y otros. Se trata, así, de un concepto físico que ha sido trasladado al campo de la microbiología aplicada, útil para microbiología clínica, de los alimentos y molecular.

La técnica consiste en realizar mediciones de los componentes de impedancia (por ejemplo conductancia, capacidad, módulo de impedancia o ángulo de fase) empleando el método bipolar con dos electrodos sumergidos en una celda que contiene un medio de cultivo inoculado, el cual es mantenido a condiciones definidas de la evaluación (P. Ej. Prueba de coli-aerógenes, 37° C ± 1, 24hrs). Se ha subdividido en dos tipos dependiendo del fundamento que cada uno presenta.

Impedancia DirectaImpedancia

Indirecta

La detección de microorganismos por Impedancia Directa se basa en la capacidad de los microorganismos de metabolizar las moléculas del medio de cultivo, para crecer. Los nutrientes del medio de cultivo (glúcidos, proteínas...) son moléculas eléctricamente neutras o están débilmente ionizadas.

Estas moléculas son metabolizadas por los microorganismos en crecimiento, y transformadas en moléculas más pequeñas, con polaridad y/o carga eléctrica, como por ejemplo ácido láctico, acético, cítrico, aminoácidos...

El efecto final de esta actividad metabólica es un incremento de la conductividad eléctrica del medio de cultivo, medible mediante dos electrodos sumergidos en el medio de cultivo.

Algunos microorganismos, como los mohos y levaduras, de crecimiento lento, pueden ser detectados más rápidamente registrando la producción de CO2 debida a su metabolismo.

Para registrar la producción de CO2 la muestra se inocula en un vial junto con el medio de cultivo. Este vial se introduce a su vez en una celdilla que contiene una solución de KOH (potasa).

El CO2 generado por los microorganismos se irá disolviendo en la potasa, modificando su impedancia.La reacción química entre el CO2 y el KOH se basa en la siguiente reacción química:

CO2+2OH−¿→CO 3

−2+H 2O¿

El BacTrac registra en continuo los cambios producidos generando una curva que permite cuantificar los microorganismo presentes en función de la generación de CO2.

La Interpretación de los resultados mostrados por el equipo (Bactómetro) es dependiente del ritmo de crecimiento de los microorganismos, los cuales están sujetos a su curva de crecimiento normal. Existen 3 fases marcadas claramente:

Fase Inicial, es aquella en la cual los microorganismos se adaptan a los nutrientes hallados en el medio y preparan la maquinaria enzimática para

3. DESCRIBA UNA TÉCNICA PARA LA DETECCIÓN DE LISTERIA MONOCYTOGENES EN ALIMENTOS, MENCIONA LA FUENTE4.

La Interpretación de los resultados mostrados por el equipo (Bactómetro) es dependiente del ritmo de crecimiento de los microorganismos, los cuales están sujetos a su curva de crecimiento normal. Existen 3 fases marcadas claramente:

Fase Inicial, es aquella en la cual los microorganismos se adaptan a los nutrientes hallados en el medio y preparan la maquinaria enzimática para

El equipo está compuesto por unos lectores electromagnéticos los cuales son capaces de cuantificar las señales eléctricas manifestadas en el medio de cultivo. El diagrama de abajo muestra cómo se da el fenómeno físico de conductancia. Este fenómeno está sujeto a las leyes del electromagnetismo anclado en su pilar fundamental:

C=QV

, donde C es capacitancia, Q es carga eléctrica

y V es la tensión eléctrica o diferencia de voltajes.

La metodología señalada es la que el Bacteriological Analysis Manual, publicado por la FDA, señala en el capítulo 10: Listeria monocytogenes.

Este manual se ha alimentado del Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, 9th edition, el cual lista a 8 especies en el género Listeria: L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii, L. grayi, L. murrayi, L. denitrificans. Sin embargo, el BAM sugiere unas salvedades menores para facilitar la interpretación de resultados durante la identificación de estas especies, por lo que resume su clasificación de la siguiente forma:

Solamente Listeria monocytogenes es capaz de causar enfermedad en los humanos. En la metodología presentada por el BAM para el aislamiento de L. monocytogenes, los alimentos sospechosos son muestreados para luego tomar una muestra analítica, la cual señala la BAM que debe ser de 25g (01 unidad analítica, aunque existe todo un plan de muestreo dependiendo del tipo de alimento del que se trate).

Las muestras analíticas (25g) son enriquecidas para especies de listeria en un caldo selectivo de enriquecimiento a 30° C por 48 horas. El cultivo enriquecido es sembrado por estriamiento (durante 24 a 48 horas) en dos diferentes, pero complementarios, agares diferenciales para aislar a listeria.

Estos organismos aislados en los cultivos son purificados en agares nuevos no selectivos, para luego ser diferenciados por pruebas bioquímicas, o puede ser preliminarmente identificado como miembros del género Listeria por medio de ELISA o sondas de DNA específicas para el género.

La serotipificación, el test de virulencia y la enumeración de Listeria por conteo directo en agar selectivo o por el método del Número Más Probable son métodos opcionales de identificación y cuantificación.

Enriquecimiento

Aislamiento

Identificación

La base de agar Columbia suplementado con sangre de carnero al 5% es fundamental para el crecimiento de microorganismos exigentes. La esculina es uno de los indicadores bioquímicos que permite diferenciar la presencia de Listeria. El uso de la cicloheximida permite evitar el crecimiento de hongos, mohos y/o levaduras, la fosfomicina y la fosfomicina permite inhibir el crecimiento de la flora acompañante que podría inhibir el crecimiento de Listeria.

Agar Oxford4

4. EXPLIQUE CÓMO SE REALIZA LA DETECCIÓN DE ANTIBIÓTICOS EN LECHE4

Cabe resaltar que el Bacteriological Analysis Manual (BAM) plantea dos métodos, uno cualitativo y otro cuantitativo, para el estudio de residuos lactámicos (derivados de anillos Beta lactámicos) en leche.

Preenriquecimiento

Caldo lactosado, Caldo de enriquecimiento (BAM)

Agar OxfordAgar LPM / LPM + Esculina/Fe+3

PALCAM Agar

Crecimiento de colonias típicas en TSA o TSB suplementado con Extracto de levadura al 0.6%.SerologíaTest de CAMP

El método del plato cilindro es considerado el método oficial cuantitativo para la detección de residuos lactámicos, descrito en el capítulo 16 de Productos lácteos, en el Official Methods of Analysis. El método del disco es considerado el método oficial para la detección cualitativa de sustancias inhibitorias en la leche, siendo este una modificación del método aprobado por la International Dairy Federation para la detección cualitativa de penicilina en leche.

5. MENCIONE LOS BROTES DE ETA CUYO ALIMENTO IMPLICADO FUE LA LECHE O LOS PRODUCTOS LÁCTEOS, INDICANDO EL LUGAR, LA FECHA, EL PATÓGENO.

La brucelosis en humano, ha sido diagnosticada en todos los continentes y se estima que afecta aproximadamente a unas 500.000 personas cada año en todo el mundo. De acuerdo al

MÉTODO CUALITATIVO Método del disco de papelMétodo oficial para la detección cualitativa de sustancias inhibitorias en lecheBacillus stearothermophilus

MÉTODO CUANTITATIVO Método del plato cilindroMétodo oficial para la detección cuantitativo de residuos lactámicos en leche.Micrococcus luteus

Preparación del estándar de Penicilina G

Preparación de Micrococcus luteus

Preparación de la placa

Preparación de la curva estándar

Preparación de la muestra

Evaluación de la potencia

Preparación de Bacillus stearothermophilus

Preparación de la solución de leche estándar

Preparación de la placa

Ensayo preliminar

Ensayo confirmatorio

informe estadístico de Salud Mundial de la OMS, los países que notificaron el mayor número de casos fueron la antigua Unión Soviética, España, Italia, Irán, Grecia, Perú, Argentina, México, Francia, Portugal, Estados Unidos, Polonia, Australia y Nueva Zelanda, es importante hacer notar que México, Perú y Argentina son los tres países en América Latina que tienen Brucella melitensis

La situación epidemiológica de la brucelosis en España, según los datos del Sistema de Enfermedades de Declaración Obligatoria (EDO) y del Sistema de Brotes presenta una tasa de incidencia en 2011 de 0,22 casos/100.000 habitantes. En ese año se produjo un brote por consumo de leche infectada y tres brotes por contacto con animales enfermos. Esta zoonosis está asociada fundamentalmente al ámbito rural y ganadero, y su incidencia ha disminuido de forma notable los últimos años debido a las campañas de saneamiento.5

Brotes de brucelosis humana declarados en España, por categoría de transmisión, 1996-2011

La incidencia anual de brucelosis en México se calcula de 28.7 casos por millón de habitantes, En México, la enfermedad está relacionada con rebaños de cabras, donde la seroprevalencia fue de 9.8% para el estado de Michoacán, así como mayor en rebaños de más de 34 animales, rebaños en hacinamiento y animales mayores de 24 meses de edad; similar a lo reportado

para el Valle de Mexicali.13,14 Asimismo, es más común en mujeres entre 29 y 39 años de edad, en primer lugar Brucella melitensis seguida de Brucella suis.6

La Brucelosis en el Perú como en otros países en desarrollo, tiene características epidemiológicas peculiares; no es una enfermedad ocupacional, afecta a personas de cualquier edad y sexo, es endémica con brotes epidémicos ocasionales y es producida por Brucella melitensis. En nuestro país, ocupa el décimo lugar dentro de las enfermedades reportables de declaración obligatoria y es transmitida al ingerir leche cruda de cabra o sus derivados, particularmente queso fresco.7

La brucelosis tiene una tasa de incidencia anual promedio para 1958-1967 de 20.47 por 100,000 habitantes en el territorio nacional y tasas tan altas como de 205:34 por 100,000 habitantes en el departamento de Ica; 136.99 en el Callao; 21.57 en Lima, y 6.62 en Ancash. Todos estos departamentos están ubicados en la costa, dentro de la zona endémica. En el país, especialmente en el litoral, son varias las especies animales que sirven como fuentes de infección en el hombre-el ganado bovino porcino y principalmente el caprino-mediante ingestión, contacto, inhalación e inoculación. En un estudio realizado en 1967 se descubrió que de 86 cepas tipificadas el 93% era de Br. melitensis; un 4% Br. abortus, y un 2% Br. suis, lo cual ha sido también constatado por otros autores. Un factor asociado a los brotes epidémicos de la enfermedad en el hombre (primavera y verano), es la migración de rebaños de caprinos de la serranía al litoral del Perú para aprovechar los pastos de las Lomas y los rastrojos de los cultivos de algodón, arroz, maíz, sorgo y chala.8

Brucelosis humana en el Perú, por departamentos, 1958-1967.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Enne de Boer et al. Methodology for detection and typing of foodborne

microorganisms. International Journal of Food Microbiology, Volume 50, Issues 1-

2, 15 september 1999, Pages 119-130.

2. Niederhauser C., et al. Use of Polymerase Chain Reaction for Detection of Listeria monocytogenes in Food. Applied and Environmental Microbiology, May 1992, p. 1564-1568

3. NTS N° - MINSA/DIGESA-V.01. Norma sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano.

4. Food and Drug Administration (FDA). Bacteriological Analysis Manual. Chapter 10: Listeria monocytogenes. Chapter 20A: Inhibitory Susbtances in Milk.

5. Yadollah, Zafari & Martin, W. Comparison of the BACTOMETER Microbial Monitoring System with Conventional Methods for Detection of Microorganisms in Urine Specimens. Journal of Clinical Microbiology, May 1977, p. 545 – 547.

6. SITUACIÓN DE LA BRUCELOSIS HUMANA EN ESPAÑA. Boletín epidemiológico semanal, Vol 20, No 17 (2012). Disponible en http://revista.isciii.es/index.php/bes/article/view/761/867

7. Uveítis anterior como manifestación de brucelosis: Reporte de un caso y revisión de literatura. ENF INF MICROBIOL 2010 30 (2): 66-69.

8. GOTUZZO Eduardo, CARRILLO Carlos, SEAS Carlos, GUERRA Jorge, MAGUIÑA Ciro*.Características Epidemiológicas y clínicas de la Brucelosis en 50 grupos familiares. Disponible en: http://www.upch.edu.pe/famed/rmh/1-2/v1n2ao2.pdf

9. Juan Zapaiel’ y Hernán Málaga. EPIDEMIOLOGIA DE LA BRUCELOSIS CAPRINA EN EL PERU. Disponible en: http://hist.library.paho.org/spanish/Bol/v71n2p121.pdf