Upload
others
View
5
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
1CHM 3102
Électrophorèse capillaire
Électrophorèse capillaire
2CHM 3102
Vue d’ensemble
DDéétecteurtecteur
ÉÉlectrodelectrode
ÉÉlectrodelectrode
TamponTampon
TamponTamponÉÉchantillonchantillon
Séparation basée sur la migration différentielle des solutés sous l’influence d’un champ électrique. Séparation s’effectue dans des tubes de silicefondue de petit diamètre (25µm to 75 µm id)Haut voltages (10 to 30 kV) et haut champs électriques (100 to 500 V/cm) sont appliquesaux extremités du capillaire.Haute résistance du capillaire limite la generation de courant et l’effet Joule. Grande efficacité (N>105 to 106) et rapiditéd’analyse.Détection “en ligne” (pas de cellule externe).Petit volume d’injection (1 to 50 nL)Différents modes de séparation et application. Séparation en milieu aqueuxAutomatisation
AlimentationAlimentationéélectriquelectrique
Électrophorèse capillaire
3CHM 3102
Support de séparation – silice
Matériel le plus utilisé pour les capillairesTubes résistants (polyimide) et de petit diamètreHaute constante diélectrique (isolant)Haute transmission UVFaible fluorescence
Gaine de polyimide(~15 µm)
Diamètreinterne(25-100 µm)
Diamètre externe(70-500 µm)
Électrophorèse capillaire
4CHM 3102
L’instrumentationCartouche avec capillaireà °T contrôlée
Détecteur (DAD)
Compartimentà °T contrôlée
Carrouseld’échantillonet de tampons
Agilent HP 3D Capillary electrophoresis system
Électrophorèse capillaire
5CHM 3102
Conversion des unités
1 Joule (J) = 1 kg.m2.s-2
1 centiPoise (cP) = 10-3 kg. m-1.s-1 = 10-3 Pa.s1 psi = 6.8948x103 Pa1 Coulomb (C) = 1 J.V-1 = 1 kg.m2.s-2.V-1
Électrophorèse capillaire
6CHM 3102
Notions de base – velocité
Champ électrique:
Force électromotrice et frictionnelle
ÉÉlectrodelectrode
ÉÉlectrodelectrode
TamponTampon
TamponTampon
AlimentationAlimentationéélectriquelectrique
DDéétecteurtecteur
Ld
Lt
cathodeanodeVV
dx
dVE
-==
Lt
Charge
Champ électrique (V/cm) Coefficient de friction
Vélocité(m s-1)
q E = f vet f = 6 π η ri
où q est la charge électrique possédée par un ion i (C),
E est le champ électrique (V/m),
f est le coefficient de friction (cP m), pour un ion sphérique
η est la viscosité du milieu (cP),
v est la vitesse linéaire de la particule i (cm/s), dans un champ électrique
ri est le rayon hydrodynamique (ionique) de la particule i, (une forme sphérique) (m).
Analytes
Électrophorèse capillaire
7CHM 3102
Notions de base – Mobilité ionique
Er
qfEq
vi
⋅=⋅
=πη6
On définit la mobilité électrophorètique de l’ion comme:
i
i
rqπη
µ6
ep. = en unités de m2V-1s-1
Caractéristique physico-chimique de l’ion d’intérêt
Donc: E v epep µ=
La mobilité électrophorètique, µep, et donc la vitesse électrophorètique, vep, dépend du milieu: pH et composition du tampon (force ionique, viscosité, etc.).
Électrophorèse capillaire
8CHM 3102
Notions de base – séparation
Temps
Mélange équimolaire Asp, Gly, et Lystampon tris, pH 6.0
Assigner les différents pics observés et justifier leurspositions relatives.
Électrophorèse capillaire
9CHM 3102
Notions de base – électro-osmose
La silice fondue (SiO2.H2O) possède des groupements silanols
ionisables lui confèrant des propriétés acides
La silice fondue en contacte avec le tampon formera une double couche électrique à la paroi du capillaire:
NaOAc + H2O Na+ + OAc - + H3O+ + OH-
Si
Si
Si
Si
O
O
O
O -
O -
O
pKa ~ 6 (pI ~ 1,5)
≡SiOH ≡SiO- + H+
Électrophorèse capillaire
10CHM 3102
Notions de base – électro-osmose
-------
++
++
+
Silice fondue avec cationsfortement adsorbés
Zone diffuse de la double coucheavec une prédominance de cations
Solution
+
-
Que se passe t’il suite àl’application du voltage ?
épaisseur de la double couche électrique
Distance à partir de la paroi du capillaire (nm)
Potentiel (mV)
couche diffuse
ζ
L’épaisseur de la couche diffuse estd’environ 10 nm pour une force ionique de 1 mM et 0.3 nm à 1 M.
Le potentiel Zeta correspond au potentiel associé àla couche diffuse
++
+
+
++
+
++
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
--
- -
--
-
La migration des cationssolvatés de la couche diffuse occasionne un déplacementvers la cathode, lequel estappellé électro-osmose
++
Électrophorèse capillaire
11CHM 3102
Notions de base – électro-osmose
où :µeo est la mobilité électro-osmotique (m2V-1s-1) ε est le constant diélectrique du milieu ζ est le potentiel Zeta (quelques mV) η est la viscosité du milieu (cP)
Le potentiel zeta associé à la couchediffuse est obtenue à partir de l’équation de Helmholtz
εµηπς eo 4
=
EEηπςεµ 4
v eoeo ==
Donc la mobilité électro-osmotique, µeo, et la vitesse électro-osmotique, vep sont obtenu par:
Électrophorèse capillaire
12CHM 3102
Notions de base – les mesures de mobilité
Le mouvement d’un soluté chargé à travers le capillaire est la somme des deux phénomènes : électrophorèse et électro-osmose.
E
app
)(v
vvv
eoepapp
eoep
eoepapp
µµ
µµµ
+=
+=
+=
) 4
et r 6
où ( eoep ηπςεµ
ηπµ ==
q
On définit la vélocité apparente (vélocité totale) d’un soluté, vapp , et la mobilité apparente µapp comme:
Électrophorèse capillaire
13CHM 3102
Notions de base – les mesures de mobilité
ÉÉlectrodelectrode
VLLL
t tdd
)(v donc
eoepappm µµ +
==
tm
d
LV
EtL
= et =vapp
ÉÉlectrodelectrode
TamponTampon
TamponTampon
DDéétecteurtecteur
Ld
LtAnalytes
E)(v eoepapp µµ +=
AlimentationAlimentationéélectriquelectrique
Électrophorèse capillaire
14CHM 3102
Notions de base – Caractéristique du débitélectro-osmotique
pressure driven
parabolic flow
voltage driven
electroosmotic
flow
temps
A
temps
A
Le débit électro-osmotique issu de la couche diffuse est uniforme et a un profile étroit contrairement à celui associé aux systèmes utilisant une pression appliquéepour éluer les analytes (HPLC). Le débit électro-osmotique ne cause pas un élargissement significatif de la bande.
Électrophorèse capillaire
15CHM 3102
Notions de base – l’ordre d’élution
eov
epv
++
+
-
-
appv
++
+
-
-
Mais aussi:+
+
+
+
Er
qv
i
⋅=πη6
Électrophorèse capillaire
16CHM 3102
Notions de base – calculs de mobilité
veo
(307 s)
(353 s)Séparation effectuée à 20 kV dans un
capillaire de 60 cm (50 cm au détecteur)
(416 s)
Temps
Quelle est la mobilité electrophorétique de chaqueacide aminé (ordre est le meme queprécédemment?
Électrophorèse capillaire
17CHM 3102
Notions de base – efficacité et plateau théorique
En chromatographie liquide
CuuB
AH ++=
Résistance au transfert de masse
Diffusion d’Eddy, chemin multiple
En electrophorèse capillaire
L’electro-osmose ne cause pas d’élargissement significatif mais affecte le temps auquel un ion prendra pour etre detecte. Seul la diffusion longitudinale a un impact important sur la diffusion des bandes.
Électrophorèse capillaire
18CHM 3102
Notions de base – efficacité et plateau théorique
et σ2 = 2Dm tm
VLL td
)( D 2
eoep
m2
µµσ
+=
VLLL
t tdd
)(v eoepappm µµ +
==
tLL
DN d
m•==
2V
HL app.d µ
et
coefficient de diffusion (m2s-1)
Aussi:
2
16 ⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛×=
b
m
wt
N
VDL
LH
app
mt
d .
22
µσ
==
Dm (x10-11 m2s-1)
Glycine 106.0Insulin 8.2Hemoglobin 6.3Catalase 4.1Urease 3.5Tob. mos. virus 0.53
Électrophorèse capillaire
19CHM 3102
Notions de base – résolution
( )AB
mAmB
wwtt
R+−
=2
VLL
tapp
td
)( .m µ
=et
⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛
+∆
eoep
ep
4=R
µµµN
tLL
DN d
m•=
2Vapp.µ
et
Électrophorèse capillaire
20CHM 3102
Facteurs affectant l’efficacité et sources de variance
σ2obs.= σdif.
2 + σinj.2 + σtemp.
2 + σads.2 + σdet.
2 + σ∆k2 ...
dif.: Diffusion longitudinale, limite fondamentale déterminée par le coefficient de diffusion
inj.: Longueur de la bande d’injection doit être moindre que la longueur associée àla diffusion. Contrainte de sensibilite nécessite bien souvent un compromis.
temp.: Effet Joule et gradient de °T avec augmentation de V
ads.: Interaction de l’analyte avec la paroi du capillaire
det.: Détecteur être relativement petit p/r à la largeur de pic.
∆k: Différence de conductivité entre l’analyte et le tampon
Électrophorèse capillaire
21CHM 3102
Température
Les effets d’échauffement peuvent causer un gradient de température non-uniforme, un changement local de viscosité, et une diffusion de l’analyte. L’augmentation de V peutavoir des effets néfaste lorsque l’effet Joule (augmentation de °T suite au passage de courant électrique celle-ci dépendant de la puissance = V.I).
0 25375 25 375390390
PolyimideSilice
Tampon
Environnementextérieur
r (µm) °T (paroi) ∆°T
25 299.0 0.5350 301.2 1.3975 304.2 3.14100 307.7 5.58125 311.6 8.72
°T
HPCE – An introductionD. Heiger
d (µm)
Électrophorèse capillaire
22CHM 3102
Volume d’injection
Variance associée a l’injection : σinj.2 = (∆tm)2/12
σ2dif. = 2Dm tm
Largeur de la banded’injection; doit être < à la déviation std associée à la diffusion
vD
H2
=
∆tmax: Largeur max. acceptable de la bandeeh: Accroissement acceptable de Hobs.
comparativement a Hmin (dif. seul.)mteDt hm24max =∆
E.Grushka, R. McCormick, J. Chrom., 471, 421 (1989)
Électrophorèse capillaire
23CHM 3102
Volume d’injection
10000
100000
1000000
10000000
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025
W/L
N
Glycine
insulin
Le nombre de plateau variesignificativement avec le volume d’injection. La variance associée à la diffusion représente la limiteminimale d’élargissement et Nmax. Celle-ci varieegalement avec Dm. De façon pratique on limite la longueur de la banded’injection à ~ 1% de L.
~5000000
~385000 L: 0.7 mtm: 600 s
Électrophorèse capillaire
24CHM 3102
Adsorption
La variance associée due l’adsorption à la surface ducapillaire est exprimée par:
( ) ⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛+
+=
dmd
deo
ads KDkr
kL
Lvk 24
'
'
' 2
22σ où: k’: Facteur de capacité
veo: vélocité électro-osmotiqueDm: Coeff. diffusionKd: Const. de dissociationr: Rayon du capillaire
HPCE – An introductionD. Heiger
On voit que qu’une augmentation significative de σ2
ads survient lorsque k’ (tm-teo/teo) augmente et ce même avec k’<1. La séparation de protéinesavec CE peut devenir problématique a cause de l’adsorption à la surface. Afin de limiter cettesource d’élargissement de pic on peut diminuerles charge effective à la surface en augmentant la force ionique, en diminuant le pH ou en modifiantla surface du capillaire.
Électrophorèse capillaire
25CHM 3102
Electrodispersion et différence de conductivité
La différence de conductivite, ∆k entre la zone de l’analyte et celle dutampon avoisinant est donnée par:
( )( )µµµµµ
−−=∆ CBCF
k où: C: Concentration de l’analyteF: Constante de Faradayµ: Mobilité de l’analyteµB: Mobilité de l’ion de même charge
que l’analyteµC: Mobilite de l’ion de charge
opposé à l’analyteke: Conductivité du tampon 22
2
16)(
⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ ∆=∆
e
e
k kkEtµσ
Hjerten, S. Electrophoresis, 11, 665 (1990)
Électrophorèse capillaire
26CHM 3102
Electrodispersion et différence de conductivité
++++
+++
+
+
+
Échantillon de faibleconductivité κ < κe
Échantillon de grandeconductivité κ > κe
Échantillon de conductivitécomparable κ ~ κe
++++
+++
+
+
+
++++
+++
+
+
+
+
+
+
+ ++- - -
Tampon
µPour un échantillon de faibleconductivité, l’analyte entrera dans la region du tampon moins rapidementcar le champ électrique est plus faible.
Pour un échantillon de grandeconductivité, l’analyte entrera dans la region du tampon plus rapidement car le champ électrique est plus grand.
Pour minimiser les effects de diffusion associes aux differences de conductiviteon ajuste le tampon pour avoir ∆ke/ke
<0.5%.