Upload
oihane
View
41
Download
3
Embed Size (px)
DESCRIPTION
6 ième journées Steak Expert Saint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012. LES ESCHERICHIA COLI PRODUCTEURS DE SHIGA-TOXINES (STEC) Méthodes de détection disponibles. Dr. Estelle LOUKIADIS Laboratoire d’étude des microorganismes alimentaires pathogènes (LMAP)/ LNR STEC - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
LES ESCHERICHIA COLI PRODUCTEURS DE SHIGA-TOXINES (STEC)
Méthodes de détection disponibles
Dr. Estelle LOUKIADIS
Laboratoire d’étude des microorganismes alimentaires pathogènes (LMAP)/ LNR STEC
UR CALITYSS Equipe Ecologie microbienne et sécurité sanitaire des aliments 1
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
Tous les STEC ne sont pas tous pathogènes !!Tous les STEC ne sont pas tous pathogènes !!
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
Complexité génétique des STECComplexité génétique des STEC
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
E. coli potentiellement
pathogènes
E. coli pathogènes
stx + and eae + E. coli
Caractéristiques Caractéristiques phénotypiques et phénotypiques et
génotypiquesgénotypiques
En terme de santé publique, comment définir une souche STEC pathogène?
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
Définition des souches STECconsidérées comme pathogènes
5
Avis AFSSA du 15 juillet 2008précisé dans l’avis AFSSA du 27 mai 2010
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
6
Escherichia coli
STEC(gènes stx)
EHEC = STEC isolé desmalades
E. coli O157, O26, O103, O111 et O145
AEEC(gène eae)
EHEC typiques majeures
!
EAEC = isolés chez les malades
2011: STEC O104:H4
épidémique?
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
Dans les aliments
• des E. coli O157: NF EN ISO 16654:2001 et méthodes alternatives
Prise d’essai :25 g Enrichissement à 41,5°C
Billes magnétiques recouvertes d’Ac anti-O157
Milieu CT-SMAC
ne dégrade ni le sorbitol, ni le rhamnose
n’excrète pas de β-glucuronidase
Résistance au céfixime et au tellurite
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
8
Pas de caractéristique biochimique commune pour les distinguer des autres E. coli !
Détection des STEC non-O157 VTEC dans les aliments?
??
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
Dans les aliments
10
TS ISO 13136
• des STEC O26, O103, O111, O145 et O157: ISO TS 13136
Publication en 2012
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
11
http://www.vetagro-sup.fr/services/espace-entreprises/équipements-scientifiques/plateaux-techniques/lmap
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
ISO TS 13136
12
Si stx+ et eae+
DEPISTAGE
CONFIRMATION
Si un des 5 marqueurs
somatiques +
Détection des 5 antigènes de Détection des 5 antigènes de somatiques O157, O26, O103, O111 et somatiques O157, O26, O103, O111 et
O145O145
Immunoconcentration bactérienneImmunoconcentration bactérienne
Isolement sur gélosesIsolement sur géloses
Confirmation sur coloniesConfirmation sur coloniesCaractérisationCaractérisation
Prise d’essaiPrise d’essai
Enrichissement Enrichissement Dilution au 1/10Dilution au 1/10ème ème 18-24h 37°C18-24h 37°C
Détection des gènes Détection des gènes stx stx et et eae eae par par RT-PCRRT-PCR
Echantillons négatifs en 26h
Echantillons suspects en 30h
Echantillons confirmés en 48h
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
Complexité de la détection des STEC
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
La présence des gènes stx ne signifie pas systématiquement qu’il y ait une souche STEC dans l’échantillon(valeur prédictive positive dans les aliments faible voire nulle)
La présence du gène eae en combinaison avec les gènes stx est importante mais non suffisante = les marqueurs somatiques doivent être recherchés
Complexité de la détection des STEC
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
Screening PCR de plusieurs marqueurs= Les différents marqueurs recherchés (virulence/sérogroupes) peuvent être présents dans des bactéries différentes et il existe des phages Stx à l’état libre dans les aliments
La confirmation par isolement est nécessaire pour démontrer que tous les marqueurs détectés sont associés à une seule et même
souche d’E. coli viable.
ISO TS 13136
15
Si stx+ et eae+
DEPISTAGE
CONFIRMATION
Si un des 5 marqueurs
somatiques +
Détection des 5 antigènes de Détection des 5 antigènes de somatiques O157, O26, O103, O111 et somatiques O157, O26, O103, O111 et
O145O145
Immunoconcentration bactérienneImmunoconcentration bactérienne
Isolement sur gélosesIsolement sur géloses
Confirmation sur coloniesConfirmation sur coloniesCaractérisationCaractérisation
Prise d’essaiPrise d’essai
Enrichissement Enrichissement Dilution au 1/10Dilution au 1/10ème ème 18-24h 37°C18-24h 37°C
Détection des gènes Détection des gènes stx stx et et eae eae par par RT-PCRRT-PCR
Echantillons négatifs en 26h
Echantillons suspects en 30h
Echantillons confirmés en 48h
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
16
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
17
Immunoconcentration bactérienneImmunoconcentration bactérienne
Isolement sur gélosesIsolement sur géloses
Confirmation sur coloniesConfirmation sur coloniesCaractérisationCaractérisation
Prise d’essaiPrise d’essai
Enrichissement Enrichissement
Détection séquentielle des principaux Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux gènes de virulence associés aux
EHECEHEC
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
18
Exemple: Taille de la prise d’essai
Classiquement 25 g
Augmentation de la taille de la prise d’essai?
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
19
Immunoconcentration bactérienneImmunoconcentration bactérienne
Isolement sur gélosesIsolement sur géloses
Confirmation sur coloniesConfirmation sur coloniesCaractérisationCaractérisation
Prise d’essaiPrise d’essai
Enrichissement Enrichissement
Détection séquentielle des principaux Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux gènes de virulence associés aux
EHECEHEC
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
20
Etude de plusieurs paramètres: t°, durée, nature du milieu , nature et concentration en antibiotiques, effet matrice
Inoculation expérimentale de matrices (> cultures pures!)
Etude de plusieurs souches STEC différentes (effet sérogroupe, effet souches)
Exemple: Enrichissement des STEC O26 dans les fromages au lait cru
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
21
Immunoconcentration bactérienneImmunoconcentration bactérienne
Isolement sur gélosesIsolement sur géloses
Confirmation sur coloniesConfirmation sur coloniesCaractérisationCaractérisation
Prise d’essaiPrise d’essai
Enrichissement Enrichissement
Détection séquentielle des principaux Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux gènes de virulence associés aux
EHECEHEC
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
22
EHEC O157:H7/H- rfbE-O157 fliC-H7 stx1 et/ou stx2 eae γ1 (OI-122)*
EHEC O26:H11/H-
EHEC O103:H2/H-
EHEC O111:H8/H-
EHEC O145:H28/H-
wzx-O26
ihp1-O145
wzx-O103
wbdI-O111
fliC-H11
fliC-H2
fliC-H8
fliC-H28
stx1 et/ou stx2
stx1 et/ou stx2
stx1 et/ou stx2
stx1 et/ou stx2
eae β
eae γ1
eae θ
eae ε
(OI-122)*
(OI-122)*
(OI-122)*
(OI-122)*
Avis afssa 2008: critères génétiques principaux EHEC
Développement d’outils PCR en temps réel multiplex
Madic et al. JAM 2010. 109:1696-1705.Madic et al. AEM 2011. 77:2035-2041.Mazuy-Cruchaudet et al. Zoonoses and Public Health 2012
Exemple: Pertinence ajout facteurs de virulence
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
Prevalence of the 7 major serogroups of enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC)
in fresh minced beef in France:A novel real-time PCR strategy for their early
detection in food
C.Mazuy-Cruchaudet1, C. Bavai1, P. Fach2, E. Loukiadis1
1- Lyon University, VetAgro Sup, LMAP, French National Reference Laboratory for E. coli, FRANCE
2- French Food Safety Agency (ANSES)-Laboratoire de Sécurité des aliments, FRANCE
Results and discussion
N = 2476 samples (25g)
Markers/strains detected Nb of positive samples
stx+ eae+ 109
stx+ eae+ top 5+ 79
EHEC strains isolated (top 5) 6
Top 5 screening
4,4%
3,2%
0,2%
IntroductionObjectivesMaterials and methodsResults and discussionConclusion
ISO TS 13136
Results and discussion
N = 2476 samples (25g)
Markers/strains detected Nb of positive samples
stx+ eae+ 109
stx+ eae+ top 5+ 79
EHEC strains isolated (top 5) 6
Markers/strains detected Nb of positive samples
stx+ eae+ 109
stx+ eae+ nleB+ 88
stx+ eae+ nleB+ top 5+ 67
stx+ eae+ nleB+ top 5/eae assoc.+ 29
EHEC strains isolated (top 5) 6
Top 5 screening
4,4%
3,2%
0,2%
4,4%
3,6%
2,7%
1,2%
0,2%
New approach
GD1
GD2
IntroductionObjectivesMaterials and methodsResults and discussionConclusion
ISO TS 13136
Results and discussion
N = 2476 samples (25g)
Markers/strains detected Nb of positive samples
stx+ eae+ 109
stx+ eae+ top 7+ 84
EHEC strains isolated (top 7 ) 7
Markers/strains detected Nb of positive samples
stx+ eae+ 109
stx+ eae+ nleB+ 88
stx+ eae+ nleB+ top 7+ 71
stx+ eae+ nleB+ top 7/eae assoc.+ 29
EHEC strains isolated (top 7) 7
Top 7 screening
4,4%
3,4%
0,3%
4,4%
3,6%
2,9%
1,2%
0,3%
GD1
New approach
IntroductionObjectivesMaterials and methodsResults and discussionConclusion
ISO TS 13136 MLG 5B
GD2
! Variation with serotype
Results and discussion
Top 5 contamination rate: 6/2476 (0,2 % CI95 [0,09%- 0,5%])
IntroductionObjectivesMaterials and methodsResults and discussionConclusion
Year Type of minced beef Top 5 rate
2007 Frozen (production) 0,3% (11/3605)CI95 [0,2 – 0,5%]
2008 Frozen trims (production) 0,4% (15/4000)CI95 [0,2 – 0,6%]
2009 Fresh (at retail) 0,1% (2/1527)CI95 [0,04 – 0,5%]
• Low contamination rate• In accordance with previous results observed in France
• First data in French minced beef• Low contamination rate (comparison with other areas? USA: 0,2% CI95 [0,05 – 0,3%] (6/4133) (Bosilevac and Koohmaraie, 2011))
Top 7 contamination rate: 7/2476 (0,3 % CI95 [0,1%- 0,6%])
Results and discussion
Characteristics of the 7 EHEC strains isolated
Serotype stx genes eae variants
OI 122marker
Nb of strains isolated
EHEC O157:[H7] stx2 eae γ nleB 1
EHEC O26:[H11] stx1 eae β nleB 4
EHEC O103:H2/H¯ stx1 or stx2 eae ε nleB 0
EHEC O111:H8/H¯ stx1 or stx2 eae θ nleB 0
EHEC O145:[H28] stx1 eae γ nleB 1
EHEC O121:H19/H¯ stx1 or stx2 eae ε nleB 0
EHEC O45:[H2] stx1 eae ε nleB 1
Top 5
Top 7
IntroductionObjectivesMaterials and methodsResults and discussionConclusion
No EHEC O103, O111 nor O121
Only 1 EHEC O157:H7 and a majority of EHEC O26:H11 (4/7)
Prevalence of major EHEC in fresh minced meat in France
The 5 and the 7 major EHEC serogroups (top 5 and top 7) were detected at a low rate (0,2% and 0,3% respectively)
O26 was the main isolated EHEC serogroup in meatNone O111 nor O121 strains were isolated
A novel real-time PCR strategy for EHEC detection in foodusing OI122 marker and association of serotype with specific eae variants
A complementary approach to the ISO TS 13136A reliable strategy (specific and sensitive)A cost effective screening (reduce the number of PCR suspicions without increasing time analysis)
ConclusionIntroductionObjectivesMaterials and methodsResults and discussionConclusion
30
Immunoconcentration bactérienneImmunoconcentration bactérienne
Isolement sur gélosesIsolement sur géloses
Confirmation sur coloniesConfirmation sur coloniesCaractérisationCaractérisation
Prise d’essaiPrise d’essai
Enrichissement Enrichissement
Détection séquentielle des principaux Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux gènes de virulence associés aux
EHECEHEC
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
31
Immunoconcentration bactérienneImmunoconcentration bactérienne
Isolement sur gélosesIsolement sur géloses
Confirmation sur coloniesConfirmation sur coloniesCaractérisationCaractérisation
Prise d’essaiPrise d’essai
Enrichissement Enrichissement
Détection séquentielle des principaux Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux gènes de virulence associés aux
EHECEHEC
Possé et al., 2008
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
32
Exemple: Facteurs biotiques et abiotiques influençant la croissance et la survie de STEC
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
Caractérisation de l’impact sur la croissance
Quelles voies métaboliques sont en jeu ?
M. Cornu et al., Food Microbiology 28 (2011) 639e647
Prigent-Combaret et al. 2012
Pourquoi y a-t-il une sélection des bactéries dans les matrices alimentaires? Transfert à l’optimisation des méthodes de détection (géloses)
Pourquoi y a-t-il une sélection des bactéries dans les matrices alimentaires? Transfert à l’optimisation des méthodes de détection (géloses)
33
Immunoconcentration bactérienneImmunoconcentration bactérienne
Isolement sur gélosesIsolement sur géloses
Confirmation sur coloniesConfirmation sur coloniesCaractérisationCaractérisation
Prise d’essaiPrise d’essai
Enrichissement Enrichissement
Détection séquentielle des principaux Détection séquentielle des principaux gènes de virulence associés aux gènes de virulence associés aux
EHECEHEC
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
La première méthode de référence pour la recherche des STEC dans les aliments (comparaison des résultats possibles)
Méthode robuste (EILA UE et France)
Méthode compatible avec une accréditation ISO 17025
Optimisations méthodologiques nécessaires
! Sérotypes de STEC pathogènes non détectés (ex O104:H4 eae-)…mais modularités et flexibilité de la méthode.
6ième journées Steak ExpertSaint Barthélémy d’Anjou, 19-20 Juin 2012
Conclusion: ISO TS 13136
Le LNR STEC
Une équipe de 15 personnes
MERCI POUR VOTRE ATTENTION !
36