Les exopolysaccharides des bactéries lactiques ...theses.univ-oran1.dz/document/TH4529.pdf · 9.3. Résistance aux sels biliaires : 65 Résultats et méthodes: 1. Isolement et purification

الجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’enseignement Supérieure et de la Recherche Scientifique

Faculté des sciences de la nature et de la vie

Département de Biologie

Mémoire de fin d’études

En vue d’obtention du diplôme de magister

Option : Microbiologie fondamentale et appliquée

Intitulé:

Les exopolysaccharides des bactéries lactiques :

Optimisation et cinétique de production.

Présenté par : Mme. ZIDANI Hadjer

Président : Mr. Kihel Mebrouk (Professeur à l’université d’Oran Es-Sénia).

Examinateur: Mr .Heddadji Miloud ( Professeur à l’université d’Oran Es-Sénia)

Examinatrice : Mme. Belahcene Kheira (Professeur à l’université d’Oran Es-Sénia)

Promoteur: Mr.Guessas Bettache (Professeur à l’université d’Oran Es-Sénia).

2015/2016

Membres du jury: Soutenue le 29 Juin 2015

Table de matière :

Revue bibliographique :

Introduction 1

Chapitre I:

1.Vue générale sur les bactéries lactiques : 3

1.1. Caractéristiques principales du groupe : 3

1.2. Classification des bactéries lactiques : 3

1.3. Habitat : 4

1.4 .Le genre Lactobacillus : 7

1.5 .Différentes activités de bactéries lactiques 8

1.5.1. Activité acidifiante : 8

1.5.2. Activité protéolytique : 9

1.5.3. Activité lipolytique : 10

1.5.4. Activité antimicrobienne : 10

1.6. Applications technologiques des Lactobacilles : 15

Chapitre II:

2.Définition des polysaccharides : 16

3.Structure et composition générale des polysaccharides : 17

4.Classification des polysaccharides microbiens : 18

5.Les exopolysaccharides bactériens : 18

6.Les exopolysaccharides des bactéries lactiques : 19

7.Composition chimique des EPS produits par les bactéries lactiques : 21

8.Structure des exopolysaccharides des bactéries lactiques : 22

9.Classification des exopolysaccharides des bactéries lactiques : 23

10 .Organisation des gènes codant pour les EPS : 25

11.Régulation des gènes des EPS et biosynthèse : 26

La biosynthèse des sucres précurseurs : 28

L’assemblage des unités répétitives : 28

12. Fonctions et intérêts des exopolysaccharides bactériens : 29

13.Les facteurs essentiels affectant la biosynthèse des exopolysaccharides : 33

13.1 .Les conditions de production : 33

a. L’instabilité du phénotype : 33

b.Les plasmides : 34

c. Rendement de la production : 35

13.2 .Les conditions de culture : 35

a. La source de carbone : 35

b. Source d’azote 37

c. Certaines vitamines : 37

d. Stade de croissance bactérienne : 38

e. La température d’incubation : 38

f. Le pH: 38

g. Les enzymes dégradantes : 39

h. Les procédés de fermentation : 39

14.Méthodes culturelles d’optimisation de la production des EPS : 40

15.Détection des EPS : 41

15.1. Examen visuel : 41

15.2. Les colorations : 43

15.3 .Microscope électronique: 43

15.4 .Détection des EPS par mesure de la viscosité du milieu fermenté : 45

15.5. Méthodes de purification des EPS : 46

16.Quantification des EPS : 46

17.L’analyse des polysaccharides : 47

18.Utilisations des EPS des bactéries lactiques : 49

19.Les effets non souhaitables des EPS : 52

Matériel et méthodes:

1.Origine des échantillons : 53

2.Milieux et solutions biologiques utilisés : 53

3.Isolement et purification des souches de Lactobacillus : 53

4. Pré-identification des souches de Lactobacillus : 54

4.1. Le type fermentaire : 54

4.1. Croissance à différentes températures : 55

4.2. Test de l’arginine dihydrolase (ADH) : 55

4.3. Profils fermentaires des isolats : 55

4.4. La pré-identification sur API 50 CH et API 20 Strep : 55

5. Etude de quelques aptitudes technologiques des Lactobacilles isolés: 56

5.1. Etude de la thermorésistance : 56

5.2. Test de croissance à différentes concentrations en NaCl et à différends pH : 56

5.3. Pouvoir protéolytique : 56

5.4. Pouvoir lipolytique : 56

5.5. Production de composés aromatiques : 57

5.6. Utilisation de citrate en présence de sucre fermentescible : 57

5.7. Etude du pouvoir acidifiant : 57

5.8. Etude des interactions bactériennes : 58

5.9. Pouvoir texturant : 59

6. La cinétique de croissance des souches Lb. plantarum (Lbl26), Lb.plantarum (Lbl57) et Lb.

acidophilus (Lbl61) : 62

7. Optimisation des conditions de la production des EPS chez Lb.plantarum (Lbl26): 63

8. Etude de la cinétique de production des EPS en fonction de la croissance bactérienne chez

Lb.plantarum (Lbl26) : 64

9. Etude de quelques aptitudes probiotiques : 64

9.1. Résistance aux antibiotiques : 64

9.2. Tolérance à l’acidité : 64

9.3. Résistance aux sels biliaires : 65

Résultats et méthodes:

1. Isolement et purification des Lactobacilles : 66

2. Pré-identification des isolats de Lactobacilles : 67

3. Etude de quelques aptitudes technologiques des Lactobacilles isolés : 73

3.8. Etude des interactions bactériennes (antibiose) : 79

3.9. Etude du pouvoir texturant : 84

3.9.1. Recherche de la production des EPS : 84

3.9.2. Quantification des EPS purifiés: 93

4. Etude de la cinétique de croissance des souches Lb. plantarum (Lbl26), Lb.plantarum (Lbl57)et

Lb.acidophilus(Lbl61) : 94

5. Etude de la cinétique de production des EPS en fonction de la croissance bactérienne chez

Lb.plantarum (Lbl26): 94

6. Optimisation des conditions de la production des EPS chez Lb.plantarum (Lbl26) : 95

7. Etude de quelques aptitides probiotiques : 96

7.1. La résistance aux antibiotiques : 96

7.2. Tolérance à l’acidité : 97

7.3. Résistance aux sels biliaires : 98

Discussion générale 100

Conclusion 104

Références bibliographiques 106

Liste des abréviations :

ATC : acide trichloroacétique

ATF: acide trifluoroacétique

EPS : exopolysaccharides

E. Escherichia

En. Enterococcus

Fru: fructose

Gal: galactose

Glu: glucose

HePS :heteropolysaccharides

HoPS : homopolysaccharides

Lac : Lactose

L. Lactococcus

Lb. Lactobacillus

Lis. listeria

Lnc. Leuconostoc

N : Normalité

PM : poids moléculaire

Rha :rhamnose

S. Staphylococcus

Str.Streptococcus

SEM : Scanning electron microscopy : Microscopie électronique de balayage

Liste des figures :

Figure 1: Arbre phylogénique des bactéries lactiques : a : comparé avec les genres Aerococcus,

Listeria, Staphylococcus et Bacillus et b : avec d’autres gram positif (basée sur ARNr 16s). L'arbre

(non-raciné) est produit suivant la méthode de neighbor-joining. 4

Figure 2: voies métaboliques des bactéries lactiques. 8

Figure 3 : Mode d’action sur les pathogènes des acides organiques produits par les lactobacilles. 11

Figure 4 : schéma de la structure chimique proposée du kefiran, le polysaccharide hydrosoluble

des grains de kéfir. 20

Figure 5 : structure du Kéfiran. 20

Figure 6 : Structure de l’homopolymère : dextrane. 23

Figure 7 : classification des homopolysaccharides produits par Lactobacillus sp. 24

Figure 8 : schéma de comparaison fonctionnelle des gènes d’EPS des bactéries lactiques. 1,

Streptococcus thermophilus NCFB 2393 ; 2, Lactobacillus lactis NIZO B40 ; 3, Streptococcus thermophilus

Sfi6 ; 4, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Lif5. 25

Figure 9 : clivage du sucrose et synthèse de l’homopolysaccharide dextrane par la dextransucrase

chez certaines bactéries lactiques. 27

Figure 10 : représentation de la synthèse extracellulaire des Glucanes et des Fructanes. 27

Figure 11 : schéma représentatif des voies impliquées dans le catabolisme lactose/glucose 29

Figure 12 : localisation cellulaire des polysaccharides produits par les gram positif (CPS =

Capsular polysaccharides (capsule), EPS = exopolysaccharides (couche fine). 30

Figure 13 : les rôles biologiques des polysaccharides anti-adhésion. 31

Figure 14 : Colonies mucoïdes de Rhizobium alamii produites sur un milieu riche en glucose après 4

jours à 30°C et à l’obscurité. 42

Figure 15 : Culture en boite de Pétri de souches mucoïdes de bactéries hydrothermales

productrices d’EPS. 42

Figure16 : apparence macroscopique du filament visqueux formé par la masse cellulaire d’une

souche de bactéries lactiques commerciale productrice d’EPS en croissance sur le milieu gélosé de

Man Rogosa et Sharpe. 42

Figure 17 : distribution d’exopolysaccharides (en vert) dans la structure du lait fermenté. 44

Figure 18 : le lait fermenté par l’espèce Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus RR après agitation.45

Figure 19 : micrographes de microstructure et de morphologie de surface des KF5 EPS observées

par SEM. 45

Figure 20 : modèle de gomme arabique avant et après traitement avec la pronase. 46

Figure 21 : structure d’EPS de Lb.johnsonii 151. 49

Figure 22 : les applications potentielles du polysaccharide anti-adhésion : A.adjuvants, 51

Figure 23 : aspect macroscopique des colonies de bactéries lactiques : 1.dilution 10-4 ; 2.dilution 10-5

et 3.dilution 10-6 du MRS au CaCO3. 66

Figure 24 : pureté des souches sur milieu solide. 66

Figure 25 : aspects microscopiques après coloration de Gram des souches Lbl60 et Lbl23 (Gr X

1250). 67

Figure 26 : a et b, le type fermentaire des souches lactiques. 67

Figure 27 : test de l’ADH sur milieu M16 BCP des souches Lbl21 et dégradation de l’esculine. 68

Figure 28 : sucres témoins (à gauche) du profil fermentaire de la souche Lbl26 (à droite). 70

Figure 29 : test de fermentation des hydrates de carbone sur Api 50CH des souches Lbl26 et Lbl 60.73

Figure 30 : profil fermentaire de la souche Lbl63 sur API20 STREP. 73

Figures 31 : a. b. c. d. e. f : études des aptitudes technologiques des souches. 76

Figure 32 : A. cinétique d’acidification (en degré Dornic °D) et B. évolution du pH en fonction du

temps, des souches de Lb. plantarum (Lbl26, Lbl22, Lbl23, Lbl25, et Lbl26). 78


temps, des souches de Lb. cellobiosus (Lbl27 et Lbl28). 78

Figure 34: A. cinétique d’acidification (en degré Dornic °D) et B. évolution du pH en fonction du

temps, des souches de Lb. casei (Lbl56 et Lbl60). 78


temps, des souches de Lb. acidophilus (Lbl61 et Lbl62). 79


temps, des souches de Lb. curvatus (Lbl63 et Lbl64). 79


temps, des souches de Lb. helveticus (Lbl59). 79

Figure 38 : activité inhibitrice des souches isolées sur les souches indicatrices pathogènes : 80

1 –Listeria monocytogenes 33090, 2 –Staphylococcus aureus 25923, 3- Enterococcus faecalis 2035, 4-

Escherichia coli 25922, successivement. 80

Figure 39 : activité inhibitrice des surnageants natifs des souches isolées sur les souches

indicatrices pathogènes : 1-Listeria monocytogenes 33090, 2 –Staphylococcus aureus 25923, 3-

Enterococcus faecalis 2035, 4- Escherichia coli 25922, successivement. 82

Figure 40: activité inhibitrice des surnageants neutralisés des souches isolées sur les souches

indicatrices pathogènes : 1-Listeria monocytogenes 33090, 2 –Staphylococcus aureus 25923, 3-

Enterococcus faecalis 2035, 4- Escherichia coli 25922, successivement. 83

Figure 41 : interaction entre bactéries lactiques. 83

Figures 42 : a, b, c, d, e : recherche qualitative de souches productrices d’EPS. 87

Figure 43 f et g : recherche qualitative de souches productrices d’EPS sur milieu Chalmers. 88

Figure 44 : résultat du test estimatif de production des EPS. 89

Figure 45 : aspect du gel formé sur lait écrémé par les souches Lbl23, Lbl26 et Lbl 27. 91

Figure 46 : précipitation des EPS à l’éthanol. 93

Figure 47 : résultats du séchage des differents EPS après précipitation à l’éthanol. 93

Figure 48 A et B: cinétique de croissance et d’acidification sur MRS des souches : Lb. plantarum

(Lbl26), Lb. plantarum (Lbl57) et Lb. acidophilus (Lbl61). 94

Figure 49 : cinétique de la production des EPS en fonction de la croissance de la souche Lb.

plantarum (Lbl26) sur MRSs. 95

Figure 50 : étude de l’optimisation des conditions de la production des EPS chez Lb. plantarum

(Lbl26). 96

Figure 51: antibiogramme de la souche Lb. casei (Lbl60). 97

Figure 52 : résistance à l’acidité après 2h par la souche Lb. acidophilus (Lbl61). 98

Figure 53: viabilité de la souche : Lb. plantarum (Lbl23) sur MRS aux sels biliaires après 2h. 99

Figure 54 : viabilité des souches aux conditions extrêmes. 99

Liste des tableaux :

Tableau 1 : exemples d'utilisation des bactéries lactiques en industrie alimentaire 6

Tableau 2 : composition des exopolysaccharides de différentes bactéries lactiques 21

Tableau 3 : les méthodes analytiques majeures des carbohydrates 48

Tableau 4 : Profil physiologique et biochimique des souches isolées. 68

Tableau 5 : le profil fermentaire des differentes souches de Lactobacillus. 70

Tableau 6 : résultat des profils fermentaires sur API 50 CH 72

Tableau 7: résultats sur API 20 STREP. 73

Tableau 8 : activités protéolytique et lipolytique des Lactobacilles. 76

Tableau 9 : activité antagoniste des surnageants natifs des souches de Lactobacillus. 81

Tableau 10 : activité antagoniste des surnageants neutralisés : 82

Tableau 11 : interactions entre bactéries lactiques. 84

Tableau 12 : résultats de la recherche qualitative de production des EPS. 86

Tableau 13 : formation d’EPS sur milieu Chalmers agar modifié. 89

Tableau 14 : les résultats du test de Lingani et al., (2010). 90

Tableau 16 : caractères visqueux des EPS dans le lait fermenté par les Lactobacilles. 92

Tableau 15 : rendement en production des EPS en mg de masse sèche/ml. 93

Tableau17 : taux de production des EPS quantifiés selon Dubois (1956) (en g/l). 94

Tableau 18 : cinétique de la production des EPS en fonction de la croissance. 95

Tableau 19: résultats de la résistance et la sensibilité aux antibiotiques. 97

Tableau 20: survie des souches à pH 2. 98

Tableau 21: viabilité des souches sur milieu à 5% de sels biliaires. 99

امللّخص

ة ثفرز امبكذرياي انلبين .امطةيف جمال ضناػة مش خلات احلليب ٌسؼى املسدمثرون جاهدون الس خغالل خطائص امبكذرياي انلبنية اخل

ركّزت دراسدنا.أ مهية حكنوموجية ابمغة ملدرثه ػىل اسدبلاء املاء وضامن مزوجة املنخجات اخملّمرة وذ خاريجظبيؼيّا مذؼدد سكرايت

خونهوامش، (منب خمرث و لكيةل)احلليب : ػىل غزل ػّدة سالالت بكذرياي مبنيّة من أ هظمة بيئية خمخلفة ، ومخرية اخلزب اخملّمرة امًز

فراز مذؼد هخاج و ا مّت امخحطل ػىل أ ربؼني سالةل من . اخلاريجامسكرايتد و امؼمل ػىل الاهخلاء و امخؼًرف بأ كرثها كدرة ػىل ا

Lactobacillus ) مثاهية و غرشون سالةل) Enterococcus ،(سالمخان) ىل زالث أ هواع : امبكذرياي انلبنية ثنمتي أ ساسا ا

فراز مذؼدد امسكراّيت ابملائة 67. (غرش سالالت) و Leuconostoc اخلاريجمن امسالالت املؼزوةل أ ظهرت كدرة جيدة ػىل ا

ةفذؼًرفها و ثليمي خطائطها امخّكنومويج حير اخذريت جسع غرشة سالةل مت اس خغالمها ندّلراسة، Lactobacillus : ع خاضة هوو

نية نلمواد امّّت حتّومهاابمخّحدًد ىل بؼظ اخلطائص امربوبيوثيكيّة، املدرة امخّكًو ضافة ا ىل ابمخلًرب مّت ثؼًرف ػّدة اكئنات. ا اسدنادا ا

Lb. acidophilus : سالمخا, Lb. curvatus: ،سالمخا Lb. plantarum : سالالتمثان: خطائطها امظاهًرة و ابمخايل حّطلت

Lb. helveticus. خطائطية متّّياتػدة امسالالت ظهرتأ : سالةلو Lb. casei : سالالت أ ربع ، Lb. cellobiosus :اسالمت

هخاهجا ملخؼدد امسكرايت ظًرلة :خاضية اال فراز ػىل ظًرلذني س يق امبحر غن. اخلاريجحكنوموجية و بروبيوثيكية زايدة ػىل ا

أ ّما احفص .محر امّروثينيوم أ وسط زراغي حيخوي ػىلػىلو مؼّدل امّّتكيبة ،يف احلليب MRS، MRS ،MSE ػىل لّك من هوغيّة

ىل أ ن أ ظهر امفحص امّسالالت ظهرت مزجةأ غلبيّة . فس يق يف وسط مائع مؼدل امّّتكيبةمكّيال ػىل ال وساط املمّية ظاهراّي، ا

،Lb. plantarum (Lbl (25 26 ,27) هخاجيّة، بخفّوق اماكئنات : اممكّي ثفاوات بني امّسالالت من حير املدرة اال

هخاج.انلّّت/غ1 حرثّب غن حتسني رشوط ا :مع هخاجئ كياس يّة ثؼدت مكية .Lb. curvatus (Lbl63),Lb. acidophilus (Lbl61)

ػامل - مّت/غ10حركّيامسكروز- ° 23درجة حرارة: )حتت امخوافق (مّت/غ12,14 )مذؼّدد ّسكرايت خاريج أ فضل مردود

.Lb.plantarum (Lbl26) :دلى امسالةل (5.4: امحلوضة

Lactobacillus plantarum هخاج، ،حتسني اال هخاج خاريج مذؼدد سكرايت،بكذرياي مبنية: ًّةفذاحاملكامت امل ، حركية اال

.بروبيوثييك

12

Résumé

Les investisseurs de l’industrie laitière, désirent bénéficier des effets irremplaçables des

bactéries lactiques à caractères technologiques privilégiés. Les exopolysaccharides (EPS)

produits naturellement par certaines bactéries lactiques suscitent un intérêt technologique

du à leur capacité de rétention d’eau et celles de moduler la viscosité des produits

fermentés. Notre étude a pour but l’isolement de souches lactiques de différents

écosystèmes : lait (Raib et Klila), margines d’olive fermentées et du levain de panification ;

ainsi, la sélection et l’identification de celles productrices d’EPS. Quarante souches de

bactéries lactiques obtenues; appartenaient essentiellement à trois genres : Enterococcus

(dix souches), Leuconostoc (deux souches) et en grande partie à Lactobacillus (vingt huit

souches). Environ 67% des souches isolées ont exhibé une production d’EPS ; spécialement,

les souches de Lactobacilles. Cependant, dix neuves souches ont été retenues à identifier et

à évaluer leurs aptitudes technologiques, notamment, le pouvoir texturant. En plus, de

quelques aptitudes probiotiques. Différentes espèces ont été pré-identifiées selon leurs

caractères phénotypiques : 8 souches de Lb. plantarum, 4 souches de: Lb. casei, 2 souches

de: Lb .acidophilus et 2 souches de Lb. cellobiosus. Elles ont montré plusieurs performances

d’après l’étude des caractères technologiques et probiotiques ; mise à part leur production

d’EPS. La recherche de la production d’EPS a reposé sur deux types de tests : 1. Tests

qualitatifs (sur gélose MRS modifiée, milieu MSE, milieu au rouge de Rhuténium, milieu

Chalmers modifié), lait écrémé, et 2. Tests quantitatifs (bouillon MRS modifié). La quasi

totalité des souches ont montré un aspect très visqueux sur les milieux utilisés pour la

recherche de la production des EPS. Une sélection préliminaire était effectuée grâce au test

de Lingani. Néanmoins, la quantification a révélé une certaine inégalité en production

entre ces souches. Les souches les plus performantes sont Lb. plantarum (Lbl25, Lbl26 et

Lbl57), Lb. acidophilus (Lbl61) et Lb. curvatus (Lbl63) avec des taux de production trop

élevés, qui dépassent les 1 g/l. L’optimisation des conditions de la production des EPS

chez la souche Lb. plantarum (Lbl26), a donné le meilleur rendement avec la combinaison

(T°=23°C _ pH 5.4 _ MRS modifié à 10% de sucrose) : 12.14 g/l.

Mots clés : bactéries lactiques, exopolysaccharides, Lactobacillus plantarum, optimisation

de la production, cinétique de production, probiotiques.

13

Abstract

In the milk industry, the investors wish to profit from the non replaceable effects of lactic

acid bacteria thanks to their privileged technological characters. The naturally produced

exopolysaccharides (EPS) by certain lactic acid bacteria arouse a technological interest due

to their water holding capacity and to modulate the viscosity of the fermented products.

Our study was based on the isolation of lactic acid bacteria of various ecosystems: milk

(Raib and Klila), fermented margins of olive and sourdough; and so the selection and the

identification of those producing EPS. Forty strains of lactic bacteria obtained belonged

primarily to three genera: Enterococcus (ten strains), Leuconostoc (two strains) and mainly

Lactobacillus (twenty eight strains). About 67% of the strains produced EPS; especially

Lactobacillus strains. Whereas, ninety strains have been retained to be identified and to

evaluate their technological properties in particular texturing capacity. Furthermore to

some probiotic properties. Different species have been pre-identified based on their

phenotypic characteristics: 8 strains of:Lactobacillus plantarum, four strains of: Lb. casei,

two of: Lb .acidophilus, two of: Lb.curvatus, two of :Lb. cellobiosus and a species of Lb.

helvticus. They have shown many technological performances beside of probiotic ones;

instead of EPS production. The screening of EPS production rested on: qualitative (on

modified MRS agar, MSE medium, medium with the red of Rhutenium, modified Chalmers

agar), skimmed milk and on quantitative tests (modified MRS broth). Most strains

exhibited a ropy character on screening mediums for EPS production. A preliminary

selection was carried out thanks to the test of Lingani and others. Nevertheless, the

quantification revealed an inequality in production between strains. The most preferment

strains were: Lb. plantarum (Lbl25, Lbl26 and Lbl57), Lb. acidophilus (Lbl61) and Lb.

curvatus (Lbl63). With too high production rates, which exceed the: 1g/l. The optimization

of EPS production conditions at: Lb .plantarum (Lbl26), gave the best output with

combination (T°=23°C _ pH 5.4 _ MRS modified with 10% of sucrose): 12.14 g/l.

Key words: lactic acid bacteria, Lactobacillus plantarum, optimization of production

conditions, kinetic of production, probiotic.

Introduction

1

Traditionnellement, l'industrie alimentaire (comme la fermentation des produits laitiers)

cherche à améliorer la structure et la texture des aliments, pour optimiser la qualité du

produit à fabriquer; comme par exemple les yaourts. En faisant varier un ou plusieurs

facteurs à savoir la composition du mélange de départ, traitement par chauffage du

mélange avant la fermentation, modification de la composition des ferments et des

conditions d'incubation, manipulation du produit fini et ajout de stabilisants.

L'ajout de substances qui stabilisent les produits fermentés devient de plus en plus

réglementé et même interdit dans certains pays. Les consommateurs recherchent

davantage des produits naturels ou «biologiques» exempts d’additifs. De plus, les

substances stabilisantes peuvent affecter le goût et l'arôme du produit.

Des micro-organismes sont employés pour la production des métabolites spécifiques tels

que des acides, des alcools, des enzymes, des antibiotiques et des carbohydrates. Depuis

que l’on a interdit l’addition de stabilisateurs d’origine animale ou végétale dans le yaourt

naturel (Hutkins, 2006), nous avons pensé à exploiter les capacités des bactéries

considérées comme food-grade à produire un matériel polysaccharidique à sécrétion

naturelle en raison de leurs excellentes propriétés stabilisatrices et rhéologiques. La

stabilité de la production et la régularité de la structure des polymères produits par des

bactéries leurs en font des bioingrédients de choix dans différents domaines alimentaires.

Les bactéries lactiques sont à la base de la plupart de l’industrie des produits laitiers

(différents types de fromages, laits fermentés, yaourts), les légumes et la fermentation de

levain. Elles appartiennent principalement aux Lactobacilles et aux Pediocoques. Elles font

partie des cultures starter employées dans la fermentation de viande pour produire des

acides et des composés aromatiques souhaitables ; grâce à leurs nombreuses propriétés

métaboliques permettant de rendre une simple denrée alimentaire un produit fini à

caractères organoleptiques désirés. Ce qui, leur confère une omniprésence en leur faisant

intervenir pour ces applications. Notamment, les souches de S. thermophilus et Lb.

delbrueckii subsp. bulgaricus aptes à produire et secréter naturellement les EPS lors de la

fermentation du lait dans la production des yaourts. Mise à part, leurs effets bénéfiques

« probiotiques » améliorant l’état de santé personnelle après leur ingestion.

Introduction

2

Notre étude s’inscrit dans la thématique de recherche de notre laboratoire de microbiologie

fondamentale et appliquée, dont l’objectif est : la sélection, l’élaboration de souches de

bactéries lactiques issues de margines, lait caillé, Klila et levain de panification d’origines

locales, qui sont aptes à produire des exopolysaccharides et de comparer les différentes

conditions de leur production.

Revue bibliographique I. Les bactéries lactiques

3

1.Vue générale sur les bactéries lactiques :

Ce groupe de bactéries assez hétérogènes sur les plans physiologique et morphologique,

réunie plusieurs genres de bactéries dont le nom lui-même est évocateur de leur

caractéristique métabolique principale qui est la production d’importantes quantités

d’acide lactique à partir de l’hydrolyse du lactose et de la fermentation du glucose et/ou

du galactose ; autrement dit, c’est la conversion du pyruvate en acide lactique pour

régénérer le NAD+ utilisé au cours de la glycolyse. Ainsi, l’appellation « bactérie lactique »

est, cependant, souvent étendue à d'autres bactéries qui leur sont apparentées:

Bifidobacterium, Micrococcus, Brevibacterium et Propionibacterium avec la seule

différence ; leur tolérance à l’oxygène : anaérobies strictes (Bifidobacterium,

Propionibacterium) ou aérobies (Micrococcus, Brevibacterium).

Ce groupe comprend des bactéries en forme : de coques appartenant aux genres :

Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Vagococcus, Enterococcus, Pediococcus, Aerococcus,

Tetragenococcus, Leuconostoc, Atopobium, Weissella et Oenococcus et en forme de bacilles

appartenant aux genres : Lactobacillus, Carnobacterium et Bifidobacterium (Romain. H, 2011).

1.1. Caractéristiques principales du groupe :

Il assemble des cellules procaryotes à Gram-positif, ayant la forme : de coque, de bacille ou

de coccobacille, immobiles, asporulées, anaérobies, ne possèdent pas de catalase ni

cytochrome oxydase mais elles peuvent survivre en présence d’oxygène, hétérotrophes et

chimio-organotrophes, requièrent des molécules organiques complexes comme source

énergétique (acides aminés, peptides, sels, acides gras et glucides). Elles ne possèdent pas

de nitrate réductase. Ces microorganismes fermentent principalement les monosaccharides

« glucose » des disaccharides « lactose » et rarement un polysaccharide « amidon » (Rogers

et al., 2006 ; Prescott et al., 2010).

1.2. Classification des bactéries lactiques :

La classification de ce groupe D’après Ludwig et al., (2008), le phylum Firmicutes

comprend trois classes : Bacilles, Clostridium et Erysipelotrichi. Les bactéries lactiques

appartenant à la classe Bacilli, sont divisées en trois familles :


4

Famille des Lactobacillaceae comportant les Lactobacillus, Paralactobacillus et

Pediococcus.

Famille des Leuconostocaceae contenant les Leuconostoc, Oenococcus et Weissella.

Famille des Streptococcaceae comprenant les Streptococcus, Lactococcus et Lactovum.

Les révisions taxonomiques récentes présentes dans le manuel de Bergey Trust (2008) des

bactéries lactiques, montrent que ces dernières peuvent comprendre environ une

quarantaine de genres, les plus principaux sont ceux associées aux aliments dont on cite:

Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus,

Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus et Weissella (Figure1 : a et b)

Le genre Bifidobacterium y appartient au fait de son similarité physiologique, biochimique,

sa présence dans le même habitat écologique (tube gastro-intestinal), son utilisation dans

les aliments et son effet probiotique sur l‘organisme (Vandamme et al., 1996 ; Gevers, 2001 ;

Patrignani et al., 2006).

Figure 1: Arbre phylogénique des bactéries lactiques : a : comparé avec les genres Aerococcus, Listeria, Staphylococcus et Bacillus (Axelsson L.2004) et b : avec d’autres gram positif (basée sur ARNr 16s). L'arbre (non-raciné) est produit suivant la méthode de neighbor-joining (Hutkins.RW, 2006)

1.3. Habitat :

La possibilité de présence des bactéries lactiques dans divers habitats dépond directement

de la température et du substrat nutritionnel.

Fig.a Fig.b


5

Elles sont associées aux plantes (chou, maïs, orge, mâche, chou frisé), aux ensilages, aux

produits carnés (saucissons, jambons..etc) (James et al., 2005 ; Talon et al., 2007) ; aux

poissons (Kanmani et al., 2011), le Kéfir (Farnworth, 2005) et aux produits laitiers : les

différents types de fromages (tels : L. lactis, Lc. mesenteroides et Lb. Plantarum) (Cocolin et

Ercolini, 2008) et les yaourts (Zourari et al.,1992) ,

L’utilisation des bactéries lactiques pour une application industrielle donnée (tableau 1)

est déterminée par leurs propriétés fonctionnelles et technologiques qui recouvrent ces

propriétés :

— Activité acidifiante.

— Production de métabolites d’intérêt.

— Propriétés enzymatiques : les activités protéolytiques et peptidasiques sont

importantes car elles déterminent la capacité des bactéries lactiques à utiliser la

fraction azotée du milieu.

— L’activité lipolytique présente, de plus, un intérêt pour les applications fromagères.

— Propriétés probiotiques.

— Critères de performance: résistance aux bactériophages, aux traitements

mécaniques, à la congélation ou à la lyophilisation et au stockage. Ainsi que la

tolérance aux inhibiteurs de la croissance (acidité, éthanol, chlorure de sodium).


6

Tableau 1 : exemples d'utilisation des bactéries lactiques en industrie alimentaire (d’après Romain,

2011).

Genre Substrat Exemples de produits

Bifidobacterium Lait Laits fermentés

Lactobacillus Lait, Viande,

Végétaux,

Céréales

Yaourts, lait s fermentés, kéfirs, fromages Saucissons secs,

jambons secs Choucroute, olives, « yaourts » au lait de soja

Pain au levain, bières

Lactococcus Lait Fromages, kéfirs

Leuconostoc Végétaux, Lait Choucroute, olives, vin Fromages, kéfirs

Pediococcus Végétaux,

Viande

Choucroute Saucisses semi-séchées

Oenococcus Végétaux Vin

Streptococcus Lait Yaourts, lait s fermentés, fromages


7

1.4 .Le genre Lactobacillus :

Ce genre représente le groupe des Lactobacillaceae. Il a été créé en 1901 par le

microbiologiste hollandais Beijerinck, pour regrouper des bactéries à gram positif isolées

de produits laitiers et à métabolisme fermentaire. Des bâtonnets, non sporulés, parfois, de

0.5 _1.2 µM et 1.0_10 µM de dimensions, généralement immobiles. Leur morphologie

microscopique varie d’une espèce à l’autre de coccobacilles aux bacilles fins et allongés,

incurvés ou même ovoïdes, groupés en paires avec une formation de chaînes de cellules

qui est courante. La morphologie des colonies varie en fonction du milieu de culture utilisé.

Sur un milieu sélectif les colonies sont très petites, souvent sous forme « Smooth » ou

« Rough ».

Les Lactobacillus sont catalase (-) (certains ont une pseudo-catalase), micro-aérophiles ou

anaérobies. La plupart se multiplie dans une gamme de températures comprise entre 15 °C

et 42 °C. Tandis que, certaines souches de lactobacilles dites thermophiles restent viables à

55 °C. Ils ont un métabolisme fermentaire produisant de l’acide lactique (Prescott et al.,

2010). Le taxon est un groupe très hétérogène comprenant des espèces de large élasticité

phénotypique ; là où des variabilités dans les propriétés physiologiques peuvent être

adaptées dans une espèce. On cite plus de 60 espèces et sous espèces (Nigatu et al.,

2000).On les rencontre dans divers habitats : environnement (sur les surfaces de plantes),

Homme (au niveau de la cavité buccale, du tractus digestif et du tractus uro-génital,

notamment dans le vagin), dans les produits fermentés (viande et ses dérivés, laits et

produits latiers).

Certaines espèces sont homolactiques, utilisant la voie de la glycolyse ; les pentoses et le

gluconate ne sont pas fermentés (les espèces de: Lb. delbrueckii), d’autres hétérolactiques

produisant des acides volatils, de l’éthanol et du CO2 en plus de l’acide lactique. Parmi les

hétérofermentaires, certains sont facultatifs (par exemple les Lb. casei) ils utilisent la

glycolyse ou le cycle des pentoses. Les hétérofermentaires stricts (Lb. brevis) n’utilisent que

le cycle des pentoses (Rogers et al., 2006).


8

1.5 .Différentes activités de bactéries lactiques :

Différentes sont les activités des bactéries lactiques (figure 2) qui leur confèrent une

importance vu leur intérêt technologique très demandé. Or , les Lactobacillus sont bien

connus pour leur aptitude à produire différents composés : composés antimicrobiens :

H2O2, acides organiques, les antibiotiques (reutericycline) (Messens et De, 2002), les

bactériocines (Franz et al., 1998), les substances antifongiques (Belal et al., 2011, Laref et al.,

2013), les protéinases, aminopeptidases (Magboul et Mc Sweeney, 1999 ; Udomsil et al.,

2010 ; Roudj, 2010) et les exopolysaccharides (Cerning et al., 1994 ; Gorska et al., 2013 ;

Fguiri et al., 2015).

Figure 2: voies métaboliques des bactéries lactiques (D’après Danone ; 2009)

1.5.1. Activité acidifiante :

En industrie laitière, on cherche le plus souvent des souches rapidement acidifiantes ; alors,

trois critères sont à prendre en compte en l’occurrence : la quantité de lactate produite, la

nature de l’acide produit (D, L ou DL) et la vitesse d’acidification qui est un critère

important en technologie (le pH peut atteindre 4 à 4.5) (Luquet ,1994, ).


9

Le lactose est le sucre fermentescible majeur rencontré dans le lait à des taux de 40 à50 g/l.

la partie glucose est métabolisée rapidement sue la partie galactose du lactose par les

Lactocoques. Vers la fin de phase de croissance, moins de 0.5% du lactose est ainsi utilisée

et la fermentation produit da l’acide lactique L(+) (Annika, 2004).

Sur un autre substrat, comme exemple: dans la fabrication des produits carnés fermentés,

la chute du pH due à la production d’acide lactique résulte de l’utilisation des hydrates de

carbone par les bactéries lactiques provenant des matières premières ou de

l’environnement (Papamanoli et al., 2003). Cette acidification provoque la coagulation des

protéines musculaires et induit ainsi à la fermeté, à la cohésion et au découpage facilité de

la viande. En outre, l’accumulation des acides organiques produits inhibe la croissance des

bactéries pathogènes et celle de la flore d’altération de la viande

1.5.2. Activité protéolytique :

Toutes les protéines du lait y compris le lactosérum sont hydrolysables par les souches

starter. On prévoie la présence de protéines plus accessibles dans les micelles de caséine.

Lb. helveticus est montrée pour pouvoir attaquer la caséine αs et partiellement la caséine β,

Lb. bulgaricus dégrade la majorité des caséines notamment la caséine β. Les Lactocoques

hydrolysent les caséines K et β avant la caséine αs. Le pouvoir protéolytique des Str.

thermophilus est plus faible que celui des Lactocoques et n’affecte pas l’hydrolyse de la

caséine dans les fromages (Annika, 2004).

Sur des substrats autres que le lait on cite l’exemple de la viande : Les protéines du muscle

sont divisées en 3 groupes: protéines sarcoplasmiques (enzymes de glycolyse, pigments,

protéines des organelles), protéines myofibrillaires (actine, myosine) et protéines du tissu

conjonctif (collagène, élastine). Leur catabolisme consiste en ; la protéolyse (leur

dégradation en peptides puis dégradation des peptides en acides aminés) et le catabolisme

des acides aminés (Ammor, 2004). En général, les bactéries lactiques ont une faible

propriété protéolytique sur les protéines myofibrillaires (Molly et al., 1997). Toutefois,

certaines souches de Lb. casei, Lb. plantarum, Lb. curvatus et Lb. sakei participent à

l’hydrolyse des protéines sarcoplasmiques et par conséquent, contribuent à la

décomposition des peptides en acides aminés. Des peptidases issues de ces bactéries


10

lactiques hydrolysent des oligopeptides et de ce fait, produisent les substances

responsables de la flaveur et de la texture des produits fermentés (Ho Thi Nguyet, 2008).

1.5.3. Activité lipolytique :

Le genre Lactobacillus est faiblement lipolytique (Papamanoli et al., 2003). C’est à travers des

publications scientifiques, que les connaissances des activités estérasiques et lipolytiques

des bactéries lactiques restent encore fragmentaires. L’activité estéarique des lactocoques

est plus importante que celle des lactobacilles. Cependant on trouve que dans le groupe

des lactobacilles thermophiles, les activités lipolytiques de Lb. delbrueckii ssp. lactis et Lb.

acidophilus sont supérieures à celles de Lb. Delbrueckii ssp. bulgaricus et Lb. helveticus. et dans

le groupe des lactobacilles hétérofermentaires facultatifs : Lb. casei et Lb. plantarum,

possèdent un système estérasique plus actif que les hétérofermentaires strictes : Lb. brevis et

Lb. fermentum (Talon et al., 2006).

1.5.4. Activité antimicrobienne :

Ce sont essentiellement les bactéries lactiques (Lactobacillus , Leuconostoc ,Pediococcus et

Lactococcus) et des Bifidobactéries qui sont connus pour posséder de telles activités grâce à

leur capacité à produire lors de leur croissance des composés actifs ; à savoir, les acides

organiques qui acidifient le milieu (lactate ,acétate ..), des dérivés du métabolisme de

l’oxygène (H2O2), et des substances naturelles de nature protéique; douées d’une activité

antagoniste à l’encontre d’un grand nombre de germes d’altération, leur permettant de se

développer préférentiellement dans divers écosystèmes (Vandervoorde et al., 1991; Annika

et Marc, 2004 ; Herreros et al., 2005; Belal et al ., 2011).

Plusieurs études ont été réalisées dans ce contexte. On cite une étude faite mesurant

l’activité antagoniste des bactéries lactiques (Lb. bulgaricus, Bifidobacterium bifidum et

Streptococcus thermophilus) vis à vis aux trois souches Helicobacter pylori responsables des

maladies gastroduodénales, isolées à partir des biopsies gastriques des malades. Qui nous

ont démontré le pouvoir inhibiteur de ces bactéries lactiques contre les bactéries

pathogènes ; un but qui compte un pat de développement dans le domaine thérapeutique

(Tabak, 2007).


11

a. Les acides organiques :

Parmi lesquels l’acide lactique et l’acide acétique et tous ceux causant la diminution du pH

qui induit à une acidification du cytoplasme cellulaire (figure ci-dessous) ; en conséquence

les flores acido-sensibles (exemple: Pseudomonas) sont inhibées. Cependant, un grand

nombre de Lactobacillus produisent ces acides organiques (Annika.M.M et Marc.B, 2004).

On a observé que le mécanisme inclus dans l’invasion de cellules Caco-2 par Salmonella

enterica serovar Typhimurium sans modification de la viabilité des pathogènes, s’est arrêté

après neutralisation des cultures de Lb. casei rhamnosus GG a pH7. La croissance de

E.coliO157 :H7 était réduite sous l’effet de l’acide lactique et la diminution de pH causées

par Lb. lactis, Lb. casei Shirota ou Lb. acidophilus YIT0070. Comme on a découvert l’inhibition

de H. pylori in-vitro, effet apparemment du a la production de l’acide lactique et l’acide

acétique et l’acide hydrochlorique par les souches L. acidophilus, L. casei subsp. rhamnosus, L.

bulgaricus et B. bifidus (Alain, 2004) et l’inhibition de l’espèce S. aureus ATCC 25923,

Escherichia coli ATCC 25921 et Bacillus sp , par des souches de : Lb. plantarum (Mami. A et al.,

2011) .

Figure 3 : Mode d’action sur les pathogènes des acides organiques produits par les lactobacilles.

b. Le diacétyl et d’autres produits

Le diacétyl (C4H6O2) un des composants aromatiques essentiels du beurre synthétisé par

différents genres de bactéries lactiques comme Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus et

Pediococcus ; est produit suite à la dégradation du citrate, un composé inhibiteur à pH 5

plus actif contre les bactéries à Gram négatif, les levures et les champignons (200 mg/mL)


12

que contre les bactéries à Gram positif non lactiques (300 mg/mL) pour les non lactiques

(Jay, 1982; Smaoui, 2010) .Cependant, A pH 7 ce produit est très inefficace. Pseudomonas

présente la plus grande sensibilité à ce produit. Outre, il est à noter que les quantités

produites sont en général trop faibles pour être inhibitrices (Annika.M.M et Marc.B, 2004).

c. Le dioxyde de carbone

Le dioxyde de carbone est produit par des bactéries lactiques hétéro-fermentaires. Le

véritable mécanisme de son action antibactérienne reste indéterminé. Cependant, il peut

jouer un rôle dans la création d’un environnement anaérobique qui inhibe la

décarboxylation enzymatique, alors que son accumulation dans la bicouche lipidique de la

membrane peut causer un disfonctionnement de la perméabilité de celle-ci (Smaoui,

2010).il peut effectivement inhiber la croissance de nombreux germes d’altération et

essentiellement les germes psychrotrophes à Gram négatif.

d. Le peroxyde d’hydrogène

Il est depuis longtemps, reconnu comme un agent majeur de l'activité antimicrobienne des

bactéries lactiques en particulier celle des Lactobacilles qui peuvent le générer par

plusieurs mécanismes. Vu qu’elles soient catalase négatif et certaines souches peuvent

accumuler du peroxyde d’hydrogène lorsqu’elles sont cultivées en aérobiose ou en

microaérobiose ce qui induit l’oxydation des lipides membranaires et la destruction des

structures des protéines des cellules des différents microorganismes parmi en on cite

Staphylococcus aureus et Pseudomonas. spp. Sa production peut avoir lieu selon plusieurs

modes mettant enjeu des NADH peroxydases ou des flavoproteines oxydases (Ammor,

2004, Annika.M.M et Marc.B, 2004; Smaoui, 2010 ; Boumehira.Z, 2010).

e. La production d’antibiotiques

Il existe aussi les antibactériens non peptidiques, parmi lesquels la reuterine produite par

Lactobacillus reuteri : un antibiotique à large spectre, actif vis-à-vis des bactéries Gram-

positives et Gram-négatives, des levures, des moisissures et des protozoaires. Il s'agit d'un


13

dérivé du glycérol, le 3-hydroxypropionaldéhyde produit lors de la fermentation anaérobie

de ce dernier (Piard and Desmazeaud, 1991).

f. La production des bactériocines

Les bactériocines : un groupe hétérogène de molécules de nature protéique produites par

synthèse ribosomique dotées d'un site actif et qui ont un pouvoir antimicrobien ;elles

présentent une activité bactéricide ou bactériostatique contre les souches bactériennes

phylogénétiquement proches à la souche productrice (Piard et Desmazeaud, 1991; Muriane

et Klaenhammer, 1991; Tomomi et al., 2009): Lactococcus, Streptococcus, Staphylococcus,

Listeria et Mycobacterium (Alain,2004) ; avec un large spectre d’activité contre les germes

pathogènes gram positif et gram négatif( Paulraj et al ., 2011).

Il est établi que le point d’entrée de plusieurs bactériocines est les pores formés dans la

membrane cytoplasmique des bactéries sensibles relatif à l’efflux des ions et des composes

accumulés à cause de la dissipation du potentiel membranaire résultat de la déplétion en

ATP (selon la figure ci-dessous) (Alain, 2004). D’autres bactériocines ne forment pas de

pores mais interfèrent avec l’activité de certains enzymes des bactéries suspects.

Contrairement à la théorie qui dise que les bactériocines des Lactobacillus sont inactives sur

les organismes gram négatif, on a rapporté l’efficacité contre H.pylori des lacticins A164 et

BH5 (Alain, 2004)

Plusieurs genres de bactéries lactiques y compris Lactobacillus (klaenhammer, 1998)

Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, Lactococcus, Leuconostoc et Carnobacterium

produisent ces molécules. On a même caractérisé les bactériocines de plusieurs espèces

comme : Lb. fermentum, Lb. helveticus, Lb. acidophilus, et Lb. plantarum.

Klaenhammer a défini trois classes majoritaires de bactériocines. Récemment on en a ajouté

une quatrième classe (Alain ,2004 ; Paulraj et al., 2011, Stoyanova et al., 2012).

1.5.5. Activité antifongique :

On a pu isoler de différents environnements: levains, MaÏs (Doguiet et Denis, 2010),

fromages, laits, fruits , ensilages et de plusieurs produits fermentés (Belal et al., 2011) ; des


14

bactéries lactiques surtout du genre Lactobacillus qui avaient une activité antifongique

efficace en produisant des substances comme l'acide phényllactique (en quantités

inférieures à 7.5 mg/ml et l'acide 4-hydroxy-phényllactique isolés des souches de Lb.

plantarum 21B. Ces substances ont montré une activité inhibitrice contre :Aspergillus niger,

Aspergillus flavus , Penicillium cprylophilium , Penicillium requeforti , Penicillium expansum,

Fusarium graminearum (Doguiet et Denis,2010). On a même noté l’effet des mêmes

substances produite cette fois par la souche Lb. plantarum 20B contre Aspergillus, Penicillium

et Monilia (Kouakou et Philippe, 2011).

Par ailleurs, une gamme d'acides organiques tels que les acides: acétique, formique,

caproïque, propionique, butyrique et valérique libérées par Lb. sanfranciscensis CB1 et Lb.

plantarum, possèdent le même effet contre Aspergillus, Fusarium, Penicillium et Monilia. Ces

acides agissent d'une manière synergique (Kouakou et Philippe, 2011). D’autre part, des

souches de Lb. fermentum 007, Lb. paracasei D5, Lb. pentosus G004, Pediococcus pentosus Te010

ont été caractérisées pour posséder la capacité de produire des substances antifongiques

efficaces de nature protéique vis-à-vis Aspergillus niger, Aspergillus orizea (Belal et al., 2011)

Meanwhile et Schnurer (2001) ont attribué la production d’une bactériocine (la reuterine) à

spectre d’activité antimicrobienne limité à Lb. coryniformis , l’étude a été renforcé par la

publication de Adebayo et Aderiye, (2010) sur les bactériocines produite surtout par Lb.

plantarum EK1, Lb. plantarum EK4 et Lb. fermentum SG10, inhibant les champignons

d’altération Penicillium citrinum EK1, Aspergillus niger FF2 et Aspergillus flavus EB3 isolés de

produits alimentaires Nigériens fermentées (Adebayo et Aderiye, 2010) .

Comme on a prouvé l’effet antifongique de la bactériocine Nizine Z produite

par Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. Diacetylactis UL719envers certaines souches de

Candida (dont parmi Candida albicans) responsables des infections buccales qui occupent

une place importante en pathologie ORL (Oto-RhinoLaryngologie) (Lay ,2009).

Vanne et al.,(2000) a démontré que la croissance de champignons toxinogenes était limitée

in vitro par des bactéries lactiques par l‘effet combine entre l’acide lactique et des

bactériocines(Adebayo et Aderiye, 2010). Sur le même contexte, on a prouvé l’inhibition

d’organismes gram négatif Pantoea agglomerans VTT-E-90396 et de Fusarium avenaceum


15

VTT-D-8014par des composés a potentiel antimicrobien secrétés par L. plantarum VTT-E-

78076,dont :l’acide benzoïque , 5-methyle -2, 4-imidazolidinedione, tetrahydro-4-hydroxy-

4-methyl-2H-pyran-2-one et 3- (2-methylpropyl)-2,5-piperazinedione ;avec une activité de

ces derniers marquée optimale a la présence de l’acide lactique ce qui s’est avéré conscient

avec l’observation disant que le lactate rend la membrane des organismes gram négatif

perméable aux contenus extracellulaires permettant la pénétration et augmentant la

fonction de ces composés antimicrobiens produits par l’hôte (Alain, 2004).

Récemment, Laref et Guessas, (2013), ont prouvé l’effet antifongique des espèces de Lb.

plantarum et Lb. fraciminis vis-à-vis Aspergillus spp., Fusarium roseum, Trichoderma spp.,

Penicillium spp. and Stemphylium spp.

1.6. Applications technologiques des Lactobacilles :

Plusieurs applications de lactobacilles sont mises en évidence parmi lesquelles : l’affinage

des fromages et la fabrication du yaourt en contribution avec l’acidification, l’aromatisation

et l’amélioration de la Texture (Saxer et al., 2013).

Le yaourt a une texture qui est déterminée par le traitement thermique sur la matrice du

lait de base et par les cultures starter. La texture d’un yaourt est la résultante d’une

interaction complexe entre les protéines du lait, qui sont acidifiées et entre les

polysaccharides exocellulaires produites par les cultures starter (Hassan et al., 1995). Les

propriétés les plus recherchées sont la finesse, la douceur et la viscosité. Les cultures starter

peuvent influencer chacune de ces propriétés par la production d’exopolysaccharides, ces

dernières sont produites soit sous forme de fibres soit sous, forme de capsules (Gentes et

al., 2011).

Revue bibliographique II. Les exopolysaccharides des bactéries lactiques :

16

Il est connu que pour améliorer la qualité du produit laitier fermenté ; quelques

approches technologiques parmi lesquelles l’augmentation des substrats solides

du lait comme les lipides, protéines ou les sucres (sucrose, fructose,) l’addition de

stabilisateurs agréés par la législation nationale (pectine, amidon, alginate,

gélatine) sont considérés comme nécessaires (Duboc et Mollet, 2001).

Depuis que, l’addition de stabilisateurs d’origine animale ou végétale dans le yaourt

naturel est interdite en France et en Netherlands (Les Pays Bas/Hollande) et puisqu’il en

existe une croissance dans la popularité des produits alimentaires exempts d’additions, on

s’est dirigé vers d’autres substituant biosynthétiques, secrétés naturellement dans les

produits fermentés ; dans le but de remplacer les additifs interdits , tout en réservant la

même fonctionnalité de ces derniers .De ce fait, l’utilisation des bactéries lactiques

productrices d’EPS a attiré la plus grande popularité (Grobben et al., 1998) grâce aux

caractères stabilisant et rhéologiques qu’elles offrent. Plusieurs études ont fait l’isolement

et l’analyse des souches de bactéries lactiques notamment : Leuconostoc, Lactobacilles,

Lactococcus ayant la capacité de produire les exopolysaccharides, la quête de leur

recherche (Grobben et al., 1998 ; Duboc. et Mollet, 2001 ; Zajsek et al., 2013)

Les souches productrices S. thermophilus ; L. delbrueckii subsp. bulgaricus et même

Lactococcus lactis sont maintenant largement employées en culture starter pour la

fabrication du yaourt (Grobben et al., 1997 ; Hassan et al., 2002 ; Vaningelgem et al., 2004 ;

Aslim et al., 2005; Hutkins., 2006 ; Urshev et al., 2008 ; Mende et al., 2012) soient seules ou

bien mélangées à d’autres souches. L’intérêt s’est depuis peu tourné vers les souches de

Lactobacillus et de bifidobactéries. Ces souches sont considérées comme probiotiques : ce

qui est une qualité de plus en plus recherchée par les consommateurs. .

2.Définition des polysaccharides :

Les polysaccharides font partie de la classe des fibres alimentaires et peuvent aussi servir

de substituts aux gras dans la préparation de certains aliments à faible teneur en calories.

Plusieurs types de polysaccharides provenant de sources diverses peuvent être employés

selon le produit visé et l’effet recherché. Ils peuvent être d’origine végétale : plantes

(cellulose, pectine, amidon), algale (agar-agar, alginate, carraghénine) ou bactérienne

(gomme gellan, gomme xanthane, alginate).


17

La majorité des polysaccharides employés dans l’industrie alimentaire sont d’origine

végétale (amidons et dérivés, celluloses et pectines, naturellement dérivés) ou produits par

des algues (agars, carraghénanes et alginates). L’amidon et ses dérivés : les gommes, y

compris, l’haricot de sauterelle, les gommes de guar, fécule de maïs, tapioca, ainsi que la

cellulose ; sont les polymères les plus utilisés par l’industrie alimentaire. Ils sont

disponibles en grande quantité et aucun traitement n’est nécessaire avant leur utilisation.

Le principal intérêt des polymères dérivés d’algues est dans leur caractère

thermoréversible qui permet une foule d’applications dans les produits alimentaires.

Parfois, on ajoute même de la gélatine (Duboc et Mollet, 2001; Hutkins, 2006 ; Badel et al.,

2011).

3.Structure et composition générale des polysaccharides :

Un polysaccharide est un polymère de résidus monosaccharidiques reliés entre eux par des

liens glycosidiques. Ces liens se forment par l’élimination d’une molécule d’eau entre le

groupe hémiacétal hydroxyle de l’extrémité de l’un et le groupe hydroxyle primaire ou

secondaire du résidu suivant. Le groupement hydroxyle peut être dérivé par estérification

et peut être présent sous forme d’acétate, de sulfate ou de phosphate. Les groupements

hydroxyles peuvent aussi être substitués par des pyruvates ketals. Des résidus d’acides

uraniques (ex. : acide D-galacturonique) peuvent être présents dans certains

polysaccharides (certaines unités sont méthyl-estérifiées alors que d’autres sont associées à

des cations mono ou divalents).

Les polysaccharides peuvent être linéaires, avec embranchements ou, dans certains cas,

cycliques. Le degré de ramification du polymère a une incidence sur les propriétés

physiques telles que la solubilité dans l’eau, la viscosité et les comportements gélifiants des

solutions de polysaccharides.

Le nombre de résidus contenus dans un polysaccharide peut être de quelques-uns à

plusieurs milliers et la composition d’un polysaccharide peut être homogène (un seul type

de monosaccharide) ou hétérogène (plusieurs types de monosaccharides) (Hames et al.,

2006 ; Gorska et al .,2013).


18

4.Classification des polysaccharides microbiens :

Les polysaccharides microbiens sont généralement divisés en trois catégories :

1. polysaccharides des parois cellulaires.

2. polysaccharides intracellulaires

3. polysaccharides exocellulaires

Les premiers sont généralement difficiles à extraire ainsi à faible intérêt industriel à part la

chitine et le yeast glucan.

Les polysaccharides intracellulaires sont aussi difficiles à extraire, de ce fait, tous les efforts

ont été consacrés à commercialiser les exopolysaccharides.

Les polysaccharides exocellulaires peuvent être rencontrés sous forme de capsules ou sous

forme de boue extracellulaire détachée de la surface bactérienne.

5.Les exopolysaccharides bactériens :

Ils se présentent soit sous forme d’une capsule enrobant la cellule soit secrétés dans le

milieu environnant. Dans certains cas, les deux formes sont produites par le micro-

organisme sauf que dans la pratique, la distinction entre les deux est floue.

Ces polymères ont été nommés polysaccharides capsulaires (« capsular polysaccharides » :

CPS), microcapsulaires, ou encore « slime » dans la littérature anglo-saxonne. Le terme

général de polysaccharide exocellulaire ou exopolysaccharide (EPS) est le plus approprié

pour désigner ces différentes formes de polysaccharides.

II est aussi possible de produire des polysaccharides par fermentation microbienne en plus

de ceux végétaux et des algues ; en offrant les mêmes propriétés physicochimiques, une

meilleure qualité et encore à un niveau plus élevé de pureté. Exemple de la cellulose

bactérienne employée comme stabilisant ou émulsion dans l’industrie des cosmétiques,

comme peau artificielle aux applications médicale. Qui est d’une résistance à la traction

plus haute que le polymère végétal. Les EPS sont produits par de nombreuses espèces de

bactéries provenant de diverses niches écologiques (Roger, 2011, Badel et al., 2011)

Définissent les EPS comme des polymères localisés dans le milieu extracellulaire sans

liaisons covalentes avec la membrane bactérienne, produits par les Archaebactéries et les


19

Eubactéries (par les Gram positif aussi bien que par les Gram négatif) (Kranenburg et al.,

1991 ; Badel et al., 2011) alors que Ruas-Madiedo et al., (2005) ajoutent que les EPS forment

aussi de fines couches lâchement jointes à la surface cellulaire.

Chez les Gram négatif : le xanthane produit par Xanthomonas campestfi et le gellan produit

par Pseudomonas elodea (selon Bresin, 2008) ou par Sphingomonas paucimovilis (selon Ruas-

Madiedo et de los Reyes-Gavilan, 2005) ; ainsi que le curdlan trois types de polysaccharides

bactériens largement utilisés dans I‘industrie alimentaire comme agent stabilisant et

texturant (Badel et al., 2011). On cite aussi l’acétane produit par Acetobacter xylinum.

On a aussi, les bactéries lactiques et les bactéries propioniques (Cerning, 1995) entre autre,

des glucanes formés par Streptococcus mutans ; des homopolymères de glucose tandis que

des Streptococcus salivarus produit des levanes qui sont des homopolymères de fructose.

La stabilité de la production et la régularité de la structure des polymères produits par des

bactéries leur en font des bioingrédients de choix (Bresin et al., 2008),

Bresin et al., (2008), ont réalisé une recherche dénuant des souches de la rhizosphère d’un

certain nombre de plantes (blé dur, blé tendre, tournesol, colza, Arabidopsis thaliana), mises

en culture dans des sols de régions tempérées, semi-désertiques ou désertiques qui ont été

recherchées de façon systématique. Les espèces révélées appartenaient surtout à la famille

des Rhizobiacées (Rhizobium, Sinorhizobium, Agrobacterium) et plus spécifiquement ;il ont

étudié la capacité de l’espèce Rhizobium alamii YAS34, en fonction de la connaissance de la

structure et les propriétés originales de son EPS ; afin de, définir et développer une gamme

d’applications. Apres, il ont procède a l’optimisation de cette production d’EPS en

intégrant la souche dans un procédé industriel de fabrication (fermentation).

6.Les exopolysaccharides des bactéries lactiques :

Mentionnée par plusieurs auteurs et même approuvée ; la capacité des bactéries lactiques à

générer ces polymères lors de leur croissance (Grobben et al., 1997 ; De Vuyst et Degeest,

1999 ; Degeest et al., 2001 ; Ruas-Madiedo et de los Reyes-Gavilan, 2005 ; Badel et al., 2011 ;

Mende et al., 2012). Les genres les plus couramment rencontrés producteurs d’EPS sont :

Streptococcus, Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus et les plus fréquents sont Lactobacillus ;


20

approximativement 30 espèces l’en sont (Ruas-Madiedo et de los Reyes-Gavilan, 2005 ;

Badel et al., 2011) parfois même des Bifidobacterium.

Ruas-Madiedo et al., 2007 ont pu isoler des espèces de Lactobacillus et des Bifidobacterium du

microbiote intestinal de l’Homme (hébergeant 10 fois plus de bactéries que le corps), à

partir des échantillons fécaux et de la muqueuse de sujets adultes sains ; qui produisaient

des EPS.

Le kéfir :

C’est un lait fermenté fait à base de grains de kéfir contenant les bactéries lactiques et les

levures responsables de la fermentation. Un polysaccharide appelé kéfiran est produit par

une souche de Lactobacillus kéfiran au cours de la fermentation. Il contient des quantités

équimolaires en D-glucose et le D-galactose (figure4 et 5) seulement d’un rapport de 1 :1

(Farnworth, 2005).

Figure 4 : schéma de la structure chimique proposée du kefiran, le polysaccharide hydrosoluble des grains de kéfir (d’après Farnworth, 2005)

Figure 5 : structure du Kéfiran (d’après Badel et al., 2011)

Les souches laitières productrices d’exopolysaccharides concernent plusieurs espèces qui

peuvent figurer parmi le consortium microbien de grains de kéfir : Leuconostoc

mesenteroides, Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis subsp. cremoris, Lactobacillus


21

acidophilus, Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus, Lb. helveticus, Lb. paracasei et Lb. rhamnosus (De

Vuyst et al., 2001).

7.Composition chimique des EPS produits par les bactéries lactiques :

De grandes controversions se sont imposées ; dans les premiers travaux de recherche dès

1958, sur la nature du matériel extracellulaire produit par les bactéries lactiques, donnant

au lait fermenté un aspect visqueux.

Puis les consensus se sont convergés vers la théorie qui dit que : ces exopolymères

consistent en divers polysaccharides formés d’unités (ramifiée) répétées, contenant des

liaisons α et β (Cerning, 1994).

Selon De Vuyst et Degeest, 1999 ; Degeest et al., 2001 ; on a défini une grande variété de ce

type de composés chez les bactéries lactiques (tableau 2).

Tableau 2 : composition des exopolysaccharides de différentes bactéries lactiques (Hutkins, 2006).

Souches de bactéries Composition d’exoploysaccharides Rapports en sucres

Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus

LY03

Heptasaccharide de glucose, galactose, rhamnose

Gal :Glu :Rha 5 :1 :1

Rr Heptasaccharide de glucose, galactose, rhamnose Gal :Glu :Rha 5 :1 :1

Lfi5 Heptasaccharide de glucose, galactose, rhamnose Gal:Glu:Rha 5:1:1

291 Pentasaccharide de glucose, galactose Glu:Gal: 3:2

Lactobacillus lactis subsp. Cremoris

B39

Heptasaccharide de glucose, galactose, rhamnose

Gal:Glu:Rha 3:2:2

H415 Pentasaccharide de galactose —

SBT 0495 , Pentasaccharide glucose, galactose, rhamnose, phosphate

Gal:Glu:Rha:Pho

2.1:1.8:1.3:1

Lactobacillus helveticus TY1-

2 Heptasaccharide o glucopyranosyl, galactopyranosyl, 2- acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosyl

GluP:GalP:AgluP: 3.0:2.8:0.9

Lactobacillus rhamnosus RW-9595M

Heptasaccharide de glucose, galactose, rhamnose, pyruvate,

Glu :Gal :Rha :Pyr 2 :1 :4 :1


22

Lactobacillus sakei 0-1 Pentasaccharide de glucose, rhamnose, Glu :Rha :G3P 3 :2 :1

Lactobacillus sanfranciscensis LTH2590

Trisaccharide de glucose et fructose Glu :Fru 1 :2

Streptococcus thermophilus

S3

Hexasaccharide de galactose et rhamnose

Gal:Rha 2:1

Sy89 Tetrasaccharide de glucose et galactose Gal:Glu 1:1

Sy102 Tetrasaccharide de glucose et galactose Gal:Glu 1:1

Sfi6 Tetrasaccharide de glucose, et galactose, N-acetylgalactosamine

Gal:Glu:GalNAc 2:1:1

Sfi12 Hexasaccharide de galactose, rhamnose, glucose Gal:Rha:Glu 3:2:1

Sfi39 Tetrasaccharide de glucose et galactose Gal:Glu 1:1

IMDO1 Tetrasaccharide de glucose et galactose * Gal:Glu 3:1

IMDO2 Tetrasaccharide de glucose and galactose* Gal:Glu 3:1

IMDO3 Tetrasaccharide de glucose and galactose * Gal:Glu 3:1

NCFB 859 Tetrasaccharide de glucose and galactose * Gal:Glu 3:1

CNCMl Tetrasaccharide de glucose and galactose * Gal:Glu 3:1

MR-Lc Octasaccharide de galactose, rhamnose, fucose Gal:Rha:Fuc 5:2:1

EU20 Heptasaccharide de glucose, galactose, rhamnose Glu:Gal:Rha 2:3:2

OR 901 Hepatsaccharide de galactopyranose, rhamnopyranose

GalP:RhaP 5:2

(La suite du tableau 2) : *Un résidu apparait en N-acetygalactosamine

8.Structure des exopolysaccharides des bactéries lactiques :

Diverses sont les structures de ces macromolécules produites par les espèces de bactéries

lactiques que l’on a décrites (Badel et al., 2011). Les polysaccharides sont constituées en

unités de sucres ou de leurs dérivés embranchées, les chaines sont répétitives ;

généralement des résidus de glucose, galactose et rhamnose sous différents rapports

(Welman et Maddox, 2003) parfois même on cite le mannose, le fructose, l’arabinose, et le

xylose (Liu et al., 2011). On prend come exemple : la structure du Dextrane (figure 6).


23

Figure 6 : Structure de l’homopolymère : dextrane.

9.Classification des exopolysaccharides des bactéries lactiques :

En se basant sur la localisation des polysaccharides relative à la cellule productrice, on

définit des EPS d’encapsulation étroitement liés à la cellule et des EPS secrétés hors de la

cellule sous forme de boue lâche (Ruas-Madiedo et de los Reyes-Gavilan, 2005).

En se basant sur les chaînes de sucres répétitives dont ils sont composés ces polymères, on

distinguent deux groupes d’EPS produits (figure 7) :

1 .Homopolysaccharides (HoPS) : constitués d’un seul monosaccharide ; les deux positions

(alpha ou beta) du groupement hydroxyle sur l’hexose sont possibles (De Vuyst et al.,

2001) ; d’un poids moléculaire élevé entre : 4.0×104 et 6.0×106 Da ; souvent produits en

grandes quantités par rapport aux hétéropolysaccharides. Ils sont subdivisés en 4 sous-

groupes (Sanchez et al., 2006).

a. α-D glucanes : exemple :

Dextrane : polymères de glucose liés 1-6, produits par : Leuconostoc mesenteroides ;

Mutane-1-3, le second Hops le plus décrit, produit par S. mutans ; linéaire, formé par des

résidus de D-glucose liés par plus de 50% du total avec des liaisons glucosidiques α-(1-3),

associé avec D-glu embranché en α-(1-6), insoluble dans l’eau, responsable de l’adhésion

de la bactérie productrice Lb. reuteri à la surface des dents , en plus sans aucune application

industrielle.

b. β-D glucanes : glucanes, polymères de 1-3 glucose, produits par : Pediococcus et

Lactobacillus,


24

c. Fructanes : polymères de D-fructose liés 2-6, produits par des souches de S.

salivarius, Lb. sanfranciscensis, et Lb. reuteri ; le type Inuline présente souvent des

liaisons β-(2-6) ou β-(2-1), si produit par L. reuteri 121.

d. Autres comme le polygalactane : galactose produit par des souches L. lactis (De

Vuyst et Degeest, 1999 ; Lapointe, 2009 ; Badel et al., 2011).

Figure 7 : classification des homopolysaccharides produits par Lactobacillus sp (Badel et al., 2011).

2 .Hétéropolysaccharides (HePS) : formés de plusieurs copies d’oligosaccharides construits

d’unités répétitives contenant deux ou plusieurs monosaccharides dont le nombre d’unités

varie entre tri et octasaccharides. Avec un enchainement de sous-unités, souvent

embranchés en C2, C3, C4, or C6 (De Vuyst et al., 2001 ; Welman et Maddox, 2003), élaborés

par différentes bactéries lactiques thermophiles et mésophiles. Ils sont d’un grand intérêt

rhéologique très recherché. Ils différent considérablement entre les souches dans la

composition, la structure et les propriétés physicochimiques. Le plus souvent formés de

combinaison : Glucose, Galactose, et Rhamnose, ainsi que le Fructose, sucres amino-

acetylés, Ribose, acid glucuronique, et des constituants non carbohydrate : glycérol,

phosphate, pyruvyl, and groupements acétyles, en faibles taux (De Vuyst et Degeest, 1999 ;

Duboc et Mollet, 2001; Hutkins, 2006). Ils peuvent être encore classifiés selon la

composition des monosaccharides, les liaisons entre les unités, la présence des chaînes

latérales répétées, et surtout la longueur et la fréquence de l’embranchement qui affectent


25

fortement leur propriété rhéologique ; généralement produits à l’ordre de 10–1000 mg/L

avec une grande masse moléculaire entre 104 et 106 Da (Duboc et Mollet, 2001 ; Lapointe,

2009, Badel et al., 2011). Ils sont produits par des bactéries lactiques mésophiles (ex : L.

lactis, L. cremoris, Lb. casei) et thermophiles (ex : Lb. bulgaricus, S. thermophilus).

10 .Organisation des gènes codant pour les EPS :

Les gènes codant pour la production des EPS généralement, localisés dans les plasmides

des bactéries lactiques mésophiles ou sur le chromosome des thermophiles. Ils existent

sous forme de faisceaux avec de spécifiques fonctions structurelles, régulatrices et de

transport. Ils ont été séquencés des souches de yaourt aussi bien que des bactéries lactiques

mésophiles. Ces faisceaux indiquent une structure commune d’opéron, avec les gènes

placés dans un ordre particulier (figure 8) (Hutkins, 2006).

Au début du faisceau epsA une région suggérée potentiellement impliquée dans la

régulation des EPS. Pendant qu’au centre : les gènes epsE, epsF, epsG, epsH, et epsI, codant

pour les enzymes ; conçues pour la biosynthèse des unités répétitives des EPS. Les

produits des epsC, epsD, epsJ, et epsK sont responsables sur la polymérisation et l’export des

EPS.

Figure 8 : schéma de comparaison fonctionnelle des gènes d’EPS des bactéries lactiques. 1, Streptococcus thermophilus NCFB 2393 ; 2, Lactobacillus lactis NIZO B40 ; 3, Streptococcus thermophilus Sfi6 ; 4, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus Lif5 (d’après Hutkins, 2006).


26

11.Régulation des gènes des EPS et biosynthèse :

Ni la production ni le rendement en EPS, n’est un caractère stable (De Vuyst et Degeest,

1999). Les bactéries lactiques contrairement aux autres Gram positifs, produisent de faibles

taux en EPS (3 g /l) par rapport aux autres qui font de 10 à 15 g /l (Hutkins, 2006).

Le site de la synthèse des EPS et la nature des précurseurs permettent de distinguer deux

types principaux de biosynthèse par les bactéries lactiques : la synthèse en dehors de la

cellule (produisant des HoPS) ; ou celle à la membrane cellulaire (produisant des HePS).

Sachant que la biosynthèse et la sécrétion d’EPS s’effectue à différentes phases de

croissance (De Vuyst et al., 2001 ; Badel et al., 2011)

a. La biosynthèse des HoPS : Il existe au moins deux mécanismes de biosynthèse des

HoPS :

1 .Les polymères sont synthétisés en dehors de la cellule grâce à des enzymes excrétés par

la bactérie : comme les glycansucrases appartenant aux glycosyltransferases (GTF), classe

(E.C. 2.4.x.y), contrairement aux types glycosyltransferases classiques de Leloir. Elles

n’utilisent pas le sucre nucléotidique comme donneur sauf le sucrose. Elles catalysent le

transfère des monosaccharides des molécules activées à une molécule réceptrice pour la

création des liaisons glycosidiques (Badel et al., 2011).

En présence de sucrose et d’un sucre accepteur (le maltose,) les glycanesucrases effectuent

la synthèse des oligosaccharides de faible PM, au lieu de polymères à PM élevé.

Dans la production du dextrane par exemple, seulement une enzyme est utilisée : la

dextranesucrase (figure 9). Cet enzyme est spécifique pour le sucrose ; ainsi, l’énergie de

la polymérisation, vient de son hydrolyse. Le dextrane peut être produit à partir de

cultures cellulaires de Lnc. Mesenteroides, ou de préparations de l’enzyme sans cellules

vivantes, éventuellement immobilisée.

Il existe ainsi, d’autres enzymes extracellulaires ; qui sont produites par différentes souches

des espèces Lnc. mesenteroides et Lb. reuteri : levansucrases, glucansucrases et

fructansucrases (figure10) (Cerning, 1990, Lapointe, 2009).


27

Figure 9 : clivage du sucrose et synthèse de l’homopolysaccharide dextrane par la dextransucrase chez certaines bactéries lactiques (De Vyust et Degeest, 1999).

Figure 10 : représentation de la synthèse extracellulaire des Glucanes et des Fructanes (D’après Badel et al., 2011).

2 . Un deuxième mécanisme de biosynthèse des glucanes survient : la glucane synthase

Dps chez certaines espèces de Pediococcus damnosus et Oenococcus oeni productrices d’EPS.

Grâce à un seul type d’enzyme la β-glucosyltransferase catalysant les liaisons successives

de sucres de type β(1-2) et β(1-3) ; qui effectue l’exportation du polysaccharide.

b. La biosynthèse des HePS :

Une enzyme très spécifique « glycosyltransferase » est impliquée dans la réaction de

polymérisation.

Dans ce deuxième type, la biosynthèse a lieu à la membrane cytoplasmique. Elle comprend

quatre grandes étapes : la synthèse des sucres nucléotidiques, l’assemblage des sous unités

répétitives, l’exportation et la polymérisation des sous unités à l’extérieur de la cellule.


28

La biosynthèse des sucres précurseurs :

La voie de production des HePS dépond de l’approvisionnement en glucose -1-phosphate

qui dérive de la conversion du glucose-6-phosphate grâce à l’enzyme clé : la

Phosphoglutcomutase (PGM) ; à partir duquel les sucres précurseurs qui consistent en

sucres nucléotidiques comme les UDP-glucose, Dtdp glucose, UDP-galactose et le Dtdp-

rhamnose ayant un rôle important dans l’activation des sucres. Elles sont essentielles à la

polymérisation des monosaccharides aussi bien qu’aux interconversions (comme

l’épimérisation, la déshydrogénation, la décarboxylation… etc ). A ce moment elles n’ont

aucun rôle notable dans la composition des EPS produits. Elles sont synthétisés par

glycolyse au sein du cytoplasme (figure 11) ; mais, qui ne sont pas disponibles à la

production d’énergie. Ils peuvent provenir soit d’une synthèse de novo ou d’une voie de

récupération par le catabolisme de nucléotides préexistants. L’UDP glucose et le Dtdp

glucose sont formés grace aux enzymes UDP–glucose pyrophosphorylase (GalU)ou Dtdp–

glucose pyrophosphorylase ou glucose-1P thymydilyltransferase (RfbA ou RmiA).

La conversion du galactose en glucose-1-phosphate via galactose-1-phosphate (la voie de

Leloir) est possible en cas de présence du système dans la cellule (Degeest, et De Vuyst,

2000 ; De Vyust et Degeest, 1999 ; Lapointe, 2009).

L’assemblage des unités répétitives :

Plusieurs enzymes interviennent lors de la biosynthèse et la sécrétion des HePS (figure 11):

l’UDP glucose déshydrogénase, la glycosyltransférase et la galactosyltransférase. Toutefois,

ils sont impliquées dans d’autres activités métaboliques. L’unité répétitive est assemblée à

la membrane cytoplasmique par addition successive d’unités glucosyle au polysaccharide

naissant , qui est probablement ancré individuellement sur un transporteur lipidique qui

pourrait être l’undécaprenyl phosphate, nommé C55 (figure) par l’action séquentielle de

glycosyltransferases. Après complétion de l’unité répétitive, celle-ci est transportée au

travers de la membrane cellulaire probablement à l’aide d’une flippase. Elle est

polymérisée à l’extérieur de la cellule pour former l’hétéropolysaccharide, avec un poids

moléculaire finale élevé d’environ 1 .106 Da (De Vyust et Degeest, 1999 ; Welman et

Maddox, 2003 ; Lapointe, 2009).


29

Figure 11 : schéma représentatif des voies impliquées dans le catabolisme lactose/glucose

et la biosynthèse des EPS par Lactococcus lactis Gal+ (via les systèmes phosphoénolpyruvate

PEP et phospho-transférase PTS) et par Lactobacilles delbrueckii ssp. Bulgaricus et

Streptococcus thermophilus Gal- (via l’antiport lactose/galactose) (De Vuyst et al., 2001 ;

Welman et Maddox, 2003).

12. Fonctions et intérêts des exopolysaccharides bactériens :

Plusieurs rôles biologiques, physiologiques ainsi que technologiques ont été dénués dans

les travaux de recherches vu leur grande importance. Les propriétés de cette couche

hydrophile secrétée autour des bactéries (figure12) semblent importantes pour leur survie

en milieu naturel (qu’il soit liquide ou solide). Ou, la majeure partie des bactéries

s’adsorbe, sélectivement ou non, à des surfaces inertes ou des organismes vivants.

Dès 1928, le rôle des polysaccharides capsulaires dans la virulence de la souche

Streptococcus pneumoniae était mis en évidence par Griffith ; notant que l’étude du rôle et de

la conséquence d’existence de ces polymères étaient au début visés par les travaux de

recherche médicaux (Dupont, 1999).


30

Figure 12 : localisation cellulaire des polysaccharides produits par les gram positif (CPS = Capsular polysaccharides (capsule), EPS = exopolysaccharides (couche fine) (d’après Ruas-Madiedo et al., 2005).

Les EPS ne semblent pas constituer une source d’énergie puisque les bactéries productrices

ne catabolisent généralement pas le polymère qu’elles produisent (Looijesteijn, 2000).

Cependant, ils peuvent stocker l’énergie lors de la formation des matrices extracellulaires

des biofilmes et même parfois, on rencontre une dégradation du polymère produit chez

les Lactocoques et les Lactobacilles. Comme dans le cas de Lb. rhamnosus dans des

fermentations prolongées ; après lyse cellulaire des glycosylhydrolases intracellulaires

dégradent les EPS (Mozzi et al., 2009). Mais il n’est pas certain que l’organisme utilise le

polymère dégrad (Ruas Madiedo et al., 2002 ; Ruas-Madiedo. P et de los Reyes-Gavilan,

2005, Lapointe, 2009 ; Rendueles et al., 2013).

Ils peuvent servir d’agent adhésif des molécules regroupées « connues sous le nom de

glycocalyx » entre cellule-cellule ou bien cellule-surface. Ou, ils jouent le rôle important

dans la formation et la stabilisation des colonies. Majoritairement elles comprennent les

EPS acides, avec des lipoprotéines et des glycoprotéines (Ruas-Madiedo et al., 2005 ;

Flemming, 2010 ; Rendueles et al., 2013). Elles peuvent servir de substance d’agrégation

bactérienne dans les communautés de rhizosphère et d’avoir un rôle dans la dissimulation

de la surface bactérienne. Dans certaines interactions entre les cellules (dans la

communication : glycosaminoglycans) (Badel et al., 2011) plantes et les bactéries : comme

dans la formation de nodules par Rhizobium meliloti et Agrobactenum tumefaciens par

exemple, ; Ils peuvent aussi être utiles au captage des ions métalliques (Dupont, 1999).

Comme dans certaines revues, on attribué la formation de la matrice extracellulaire (MEC)

des biofilmes à plusieurs composés dont 90% est l’eau et 10% des polymères


31

extracellulaires, parmi lesquels on cite le plus majeur chez plusieurs bactéries : les EPS. On

a découvert plus qu’une trentaine de types d’EPS de MEC. Exemple : glucanes produits

par Streptococcus mutans, et l’alginate : Pel et Psl produits par Pseudomonas aeruginosa (Badel

et al., 2011 ; Rendueles.O et al., 2013) d’une part et d’autre part, on a marqué un effet de

certains EPS (qu’on a appelé r-EPS) isolés de biofilmes formés, par deux espèces Gram

positif de bactéries lactiques Lactobacillus acidophilus A4 antibiofilmes de beaucoup de

germes pathogènes tels E. coli, Salmonella sp., Yersinia enterocolitica, P. aeruginosa, L.

monocytogenes et B. cereus (Kim.Y et al., 2009) et cela par l’effet des conditions

environnementales. Parmi les effets de ces EPS antibiofilmes (figure13) on a décrit le

changement des propriétés des surfaces abiotiques.

Figure 13 : les rôles biologiques des polysaccharides anti-adhésion. A. Compétition. Polysaccharides anti-adhésion inhibent la formation du biofilme ou augmente la

dispersion du biofilme. Ils sont trop impliqués dans la résistance de colonisation contre les

bactéries concurrentes ou envahissantes, par conséquent, ils fournissant un avantage écologique

aux bactéries productrices.

B. les polysaccharides anti-adhésion sont secrétés dans le milieu extracellulaire. Même chez les

bactéries productrices peuvent en être susceptible de leur propre polysaccharide antibiofilme et

donc peuvent autoréguler leur comportement d’adhérence.

C. les bactéries concurrentes peuvent détecter les polysaccharides anti-adhésion secrétés et même

réagir contre eux en changeant leur propre expression de gène, par exemple, en réglant l’expression

de leurs facteurs d’adhésion (d’après Rendueles et al., 2013).


32

La présence d’EPS peut être responsable de la résistance aux phages en masquant le site

récepteur des cellules bactériennes sensibles. Le transfert du caractère mucoïde d’une

souche résistante aux phages à une souche non mucoïde sensible aux phages provoque une

résistance aux phages des nouveaux transconjugants ; aux anticorps, et aux surfactants ;

comme on leur a attribué la protection dans l’environnement naturel contre l’attaque par

les phages, la phagocytose, les antibiotiques, aux prédations par les protozoaires ainsi

qu’au stress osmotique (Vdamuthu et Nevile, 1986 ; Badel et al., 2011 ; Liu et al., 2011).

On a découvert chez certains polysaccharides de bactéries hydrothermales la capacité a

chélater des métaux lourds tels le Zn2+, le Cd2+ et le Hg2+ grâce à leurs propriétés

rhéologiques ce qui confère une résistance a ces bactéries extremophiles (Roger, 2002).

Du à la présence de phosphate ; l’EPS chargé négativement à pH environ de 2 ; Lactococcus

lactis NZ4010 produit un EPS composé de glucose, galactose, rhamnose et phosphate.Cette

charge négative est probablement importante dans la fonction protective des EPS contre les

ions métaux toxiques et le lantibiotique nisine chargé positivement. Apparemment, le

mécanisme de détoxification des EPS dans ce cas consiste en l’élimination des molécules

chargées positivement (Looijesteijn, 2000).

On leur a même attribué un effet bénéfique sur la santé des consommateurs comme la

réduction du cholestérol, activité antitummorale (Vinderola et al., 2006 ; Sanchez et al.,

2006), anti-inflammatoire et l’immunomodulation (Liu .C-F et al., 2011) ; aussi prouvée par

Gorska et al., (2013) qui a détecté par le test ELISA leur immunoréactivité en employant des

anticorps de lapins issus d’une immunisation directe avec les bactéries Lb. Johnsonii 142, Lb.

johnsonii 151 , Lb. animalis murinus 148, Lb. reuteri 115, et Lb. casei 0912. EPS 151 structure

commune chez toutes les espèces de Lactobacillus réagit avec le sérum polyclonal anti-

Lactobacillus contre les cellules de toutes les souches citées sauf le sérum control pris avant

immunisation (Vinderola et al., 2006).

Dans certains cas ils peuvent agir comme des prébiotiques en assurant un rôle protecteur

contre le cancer du colon rectal si dégradés par le microbiote bénéfique du colon par

exemple dans le cas de formation de courtes chaines d’acides gras. Alors que s’ils ne sont


33

pas dégradés, ils offrent une protection contre ce cancer en augmentant le volume de selles

ou par l’adsorption spécifique des carcinogènes (Mozzi et al., 2009).

Quand à leur effet physiologique leur présence ne garantie pas la survie mais au moins ils

assurent une adaptation métabolique aux microorganismes producteurs comme chez les

souches S. thermohilus CRL 1190 et Lb. casei CRL 87. Face aux conditions acides rudes

stressantes du système gastrique, que ce soit des EPS ou des polysaccharides capsulaires

(PSC). Ils confèrent ainsi, une protection partielle aux microorganismes probiotiques ; pour

exercer leurs effets bénéfiques dans l’hôte (Mozzi et al., 2009). Sans oublier que les

probiotiques doivent de plus résister aux concentrations élevées en sels biliaires dans le

duodénum et plus ou moins dans les intestins.

Zhang et al., (2013), ont réalisé dans ce contexte un des travaux montrant l’importance des

EPS de l’espèce Lb. plantarum C88 isolés du Tofu fermenté chinois traditionnel, dans la

capacité de résister face au peroxyde d’hydrogène et dans l’activité de capture des radicaux

(tel le radical hydroxyle et le radical 1,1-diphenyl-2-picrylhydraz (DPPH) libre), in vitro et

la capacité d’amélioration du statu antioxydant des souris soumises à une souche oxydante

induite par D-Gal, in vivo.

13.Les facteurs essentiels affectant la biosynthèse des exopolysaccharides :

La biosynthèse normale des EPS reste toujours marquée par plusieurs facteurs

intrinsèques et/ou extrinsèques.

13.1 .Les conditions de production :

Rappelant que, ce phénomène dépond essentiellement de la souche étudiée et

sélectionnée.

a. L’instabilité du phénotype :

certaines parmi les souches Gram positif peuvent produire des EPS, car du point de vue

génétique, ce caractère s’avère instable chez les souches visqueuses employées dans la

fermentation (Kojic et al., 1992 ; Lapointe, 2009) . Ainsi, le type et le taux de production des

souches de la même espèce varient sous différentes conditions de culture (De Vuyst et


34

Degeest, 1999). comme on peut attester la production polyvalente par une seule souche

(Grobben et al., 1997).

La culture répétée peut induire la perte du phénotype. Même ceci peut être découlé d’une

perte coïncidente à l’encontre d’un manque de fermenter le : a-méthyle-glucoside. Ce fait

est un trait normal chez certaines espèces comme Lb. casei CG11 (Kojic et al., 1992).

La mutation spontanée, peut générer des variant clonaux avec production faible, plus

élevée comme peuvent donner carrément de nouveaux composés d’EPS. Ainsi, la perte de

plasmide portant le gène codant pour la production d’EPS chez les bactéries lactiques

mésophiles, provoquera une perte du phénotype (Cerning, 1990, Lapointe, 2009)

b.Les plasmides :

Vedamuthu et Nevile (1986) ont prouvé la probabilité avouant la perte du trait de

production des EPS chez les mésophiles à cause de la perte du plasmide.

Peu de bactéries lactiques sont connues pour leur possession des plasmides, bien que

toutes les souches de L.lactis présentent de 2 à 14 plasmides différents allant de 30 à 130

Kb. Ainsi ; avec fréquence chez Leuconostoc et Lb.salivarus de 100 à 380 Kb, chez

Streptococcus cremoris MS (Vedamuthu et Nevile, 1986). Seul un quart de souches de

S.thermophilus possédant un plasmide de petite taille, avec une rareté relative chez

Lb.bulgaricus et les lactobacilles intestinaux (Leblond et Guedon, 2009).

L’instabilité peut être due chez plusieurs espèces telles L. cremoris et Lb. casei CGll, par le

fait que le plasmide est impliqué dans l’expression du caractère mucoïde (Muc+) (Kojic et

al., 1992).

Mais chez les thermophiles cette explication demeure inacceptable. L’instabilité génétique

est plutôt due aux éléments génétiques mobiles comme les séquences d’insertion (SI), ou

due à l’instabilité génomique généralisée. En incluant les délétions et les réarrangements

de l’ADN. Ainsi, les deux phénomènes ont été observés chez Lb. delbrueckii subsp.

bulgaricus et S. thermophilus (De Vuyst et al., 2001).


35

c. Rendement de la production :

Le rendement final des EPS dépond de la composition du milieu (source de carbone,

source d’azote et autres nutriments) et des paramètres de croissance (température, pH,

oxygène, temps d’incubation..etc) (Badel et al., 2011).

13.2 .Les conditions de culture :

Les conditions de culture optimales : pH, température de croissance, temps d’incubation,

source de carbone, source d’azote ; ainsi que plusieurs d’autres additifs (comme la caséine,

le glycérol…etc) ont un impact clair sur la croissance des bactéries productrices d’EPS.

Plusieurs auteurs l’ont prouvé (Cerning et al., 1986 ; Grobben et al., 1998 ; Sanchez et al.,

2006) en testant la biosynthèse des polysaccharides sous différentes conditions de culture.

Aussi bien que, sur le type et le taux d’EPS (De Vuyst et al., 2001).

La plupart des espèces de Lactobacillus sont auxotrophes, car elles sont incapables de

produire des acides aminés et des vitamines. C’est pour cela les différents milieux de

culture ont été employés à l’étude de la production qualitative et quantitative des EPS et de

déterminer l’influence des nutriments sur la croissance des souches productrices, et sur la

biosynthèse et la génétique des EPS (Cerning et al. 1990, Laws et al. 2001, Welman et

Maddox, 2003).

Les bactéries lactiques mésophiles, la plupart de celles rencontrées dans le kéfir, produisent

des EPS en quantités maximales sous des conditions sub-optimales (Kojic et al., 1992). On

soutient que, le taux de production d’exopolysaccharide est indépendant de la croissance

bactérienne (De Vuyst et al., 2001). Toutefois, dans le cas de Lactobacillus kefiranofaciens

subsp. kefiranofaciens et de Lb. rhamnosus la production d’exopolysaccharide en milieu de

synthèse est corrélée à la croissance bactérienne de la souche étudiée. Tandis que chez les

thermophiles, elle est associée à la croissance bactérienne.

a. La source de carbone :

Malgré que, le lactose soie la source d’énergie majoritairement préférée chez les bactéries

lactiques. Elles sont capables de métaboliser encore d’autres mono et disaccharides grâce à

trois systèmes qui sont bien connus :


36

1 .système de transport primaire ou bien par un couplage direct de la translocation du

sucre avec l’hydrolyse d’ATP via une ATPase de transport spécifique.

2 . des systèmes de transport de sucre secondaire, ou par un couplage du transport du

sucre avec le transport des ions ou d’autres solutés. Chacun des systèmes de transport

symport et antiport

3. Des systèmes de groupes de translocation, ou un couplage de transport de sucre avec la

phosphorylation, via le système phosphotransferase (PST) dépendant du

phosphoenolpyruvate (PEP) (De Vuyst et al., 2001).

Ce paramètre affecte la production et le rapport en sucres des EPS. Le comportement des

souches vis-à-vis de cette source diffère d’une espèce à une autre (Sanchez et al., 2006). Le

glucose étant la source la plus efficace, puis vient le lactose par rapport au fructose pour

des densités égales en cellules. Le taux de production des EPS était très minime pour le

mannose comme source de crbohydrates ; pour les souches de Lactobacilles delbrueckii

subsp. bulgaricus NCFB 2772 (Grobben et al., 1998), dans un travail précédant Grabben et

al., 1997 ont découvert la production par des souches de L. delbrueckii subsp. Bulgaricus

NCFB 2772 de deux fractions d’EPS concurremment dans le Glucose avec des taux presque

identiques. L’une avec un PM élevé et l’autre avec un PM plus faible. Même avec différents

rapports en Glu, Gal et Rha. En changeant le glucose par le fructose il y a eu une

favorisation de production de l’EPS à faible PM.

Pendant que chez Lb .delbruecki ssp bulgaricus CNRZ 1187, le carbohydrate le plus dominant

parmi ceux approvisionnés lors de la fermentation : Ara, Man, Glu et Gal ; elle vient d’etre

notée chez ce dernier (Bouzar et al., 1996).

Cerning et al., (1994) ont étudié les effets de différentes sources de carbone (galactose,

glucose, lactose, sucrose, maltose, melibiose) à différentes concentrations sur la production

d’EPS chez Lactobacillus casei CG11.

Ainsi, la production extracellulaire de certains homopolysaccharides ; comme les

dextranes, mutanes, alternane et levanes, elle dépond d’un substrat spécifique : sucrose

(Kojic et al., 1992 ; Schutten et al., 1998 ;Devyust et Degeest, 1999). Alors, la glycosyl

transférase achève la réaction de polymérisation grâce à l’énergie fournie par son


37

hydrolyse (Duboc et Mollet, 2001). Ce substrat est signalé nécessaire chez les Lactobacilles

(Badel et al., 2011).

Pendant que, la polymérisation des unités répétitives chez les hétéropolysaccharides

s’effectue par des précurseurs formés dans le cytoplasme. La biosynthèse et la sécrétion

dépondent de plusieurs enzymes et /ou protéines.

Le lactose s’est avéré la source de carbone idéale pour la production du Kéfiran par les

espèces des grains de Kéfir, en ajoutant des dissacharides de lactose et même chose pour le

sucrose contrairement pour les monosaccharides de glucose et de fructose induisant une

production minime après leur ajout (Zajsek et al., 2013)

Grobben et al., 1997 ; on conclu entre autre que Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus

NCFB 2772 produit trios fois plus d’EPS avec le glucose qu’avec le fructose comme source

de sucre, et le type d’EPS ainsi produit est influencé par la source de sucre plus d’autre

conditions (Looijesteijn, 2000).

b. Source d’azote

L’omission d’un ou de plusieurs acides aminés ; dans le but d’étudier son effet sur la

production d’EPS. Celle-ci n’a influencé ni la biosynthèse, ni la composition en sucres.

Malgré qu’elle a affecté la croissance des cellules Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus en

diminuant la densité cellulaire. Sachant que cette dernière a été affectée par l’omission de

certains acides nucléiques comme l’Uracile et l’Adénine (Grobben et al., 1998).

Un environnement riche en carbone et pauvre en azote (ratio carbone : azote élevé) favorise

la production d’EPS. Par contre, un faible ratio carbone sur azote favorise la production

d’EPS à faible poids moléculaire (Gentès, 2011)

c. Certaines vitamines :

D’après Grobben et al., (1998) : en omettant plusieurs vitamines citées, (sauf : la riboflavine,

la pantothenate de calcium et l’acide nicotinique) parues essentielles au développement de

Lb. delbrueckii subsp. bulgaricus. La croissance était minime bien qu’il s’est avéré une

élévation en production des EPS


38

Entre autre, une omission de multiples vitamines n’a touché la composition monomérique

des EPS parue dans le contenu en galactose ; contrairement à l’omission élémentaire.

d. Stade de croissance bactérienne :

Certaines bactéries synthétisent des EPS durant toutes les étapes de croissance. Tandis que,

d’autres ne les produisent qu’en fin de phase exponentielle ou au stade stationnaire (Ruas-

Madiedo & de los Reyes-Gavilan, 2005)

e. La température d’incubation :

La température d’incubation a un impact sur la production d’EPS (Ruas-Madiedo & de los

Reyes-Gavilan, 2005). La perte du trait de production peut se produire sur la culture

secondaire répétée, ou après incubation prolongée, particulièrement, à températures

élevées (De Vyust et Degeest, 1999). On a remarqué une différence des températures

optimales de la production de biomasse ; c’est-à-dire : la température de croissance des

graines de Kéfir (37°C), température de la production du Kéfiran (23°C) et celle affectant le

rapport en sucres dans ces polymères (Zajsek et al., 2013). On a ainsi, noté une diminution

de la production du Kéfiran vis-à-vis l’augmentation de la température dans un intervalle

de [25; 37]°C, avec une fraction en galactose et glucose maximale à 28°C .

Des psychrotrophes synthétisent des niveaux élevés de polysaccharides :

Les exemples les plus connus de cet effet, incluent la production du lait visqueux et de la

pâte à pain visqueuse, favorisées par de basses températures. La production des dextranes

extracellulaires par des espèces de : Leuconostoc et de Pediococcus, est connue pour être

favorisée à des températures au-dessous des optimums de leur croissance. Sa plus grande

production à de plus basses températures est due apparemment du fait que la

dextransucrase est très rapidement inactivée aux températures au-dessus de 30°C. Un

système thermosensible de dextransucrase synthétisant a été également montré chez des

espèces de Lactobacillus (James et al., 2005).

f. Le pH:

Chez les bactéries lactiques, les changements du pH jouent un rôle important dans la

biosynthèse, la production et possiblement dans la dégradation des EPS. L’importance du


39

contrôle du pH durant la fermentation réside dans la stabilité du système. Un pH stable

élimine une variable à prendre en compte dans l’interprétation des résultats. Aussi, un pH

stable permet de prolonger la phase logarithmique et la phase stationnaire de la croissance

du microorganisme. Ce qui provoque une baisse de la synthèse des peptidoglycanes et des

acides teichoïques. En favorisant ainsi, la production de polymères exocellulaires et de

même le catabolisme de la source de carbone.

Peu de travaux ont porté sur l’effet du pH sur la production d’EPS, l’information reste

fragmentaire (Ricciardi & Clementi, 2000). Cependant, Pety et al., (2000) ont souligné l’effet

de pH et de la source de carbone sur les rapports relatifs de monosaccharide dans les EPS.

Aussi, chez Lb. rhamnosus R on a observé que le pH contrôlé a favorisé l’activité des

glucohydrolases, ce qui a réduit le poids moléculaire d’EPS durant la fermentation (Pham

et al., 2000). Alors que Dupont et al. (2000) ont observé qu’avec ou sans contrôle de pH, la

quantité d’EPS restait la même chez la souche Lb. rhamnosus RW9595M.

De façon générale, l’optimum de pH pour la production d’EPS est le pH pour lequel les

effets opposés de la production et de la dégradation seront équilibrés.

g. Les enzymes dégradantes :

Le phénomène a été observé par plusieurs auteurs. L’hypothèse de la présence de

glycohydrolases, enzymes dégradantes capables d’hydrolyser les polysaccharides dans du

lait ou dans l’ultra filtrat de lait, rapportée pour la première fois par Cerning (1988) dans

une étude sur les EPS des bactéries lactiques mésophiles, en chauffant un échantillon d’EPS

à 90°C pendant 10 min avant l’extraction ; comparé à un autre échantillon natif, sa

concentration était 40% plus élevée.

h. Les procédés de fermentation :

Les EPS peuvent être produits soit dans des bioréacteurs, suivi par un traitement en aval

approprié pour leur emploie comme des additifs alimentaires ou bien in situ, durant le

processus de fermentation (Sanchez et al., 2006). Cependant, l’accumulation du lactate

provoque l’inhibition des bactéries lactiques. Dans ce cas, une culture « fed batch » à

écoulement discontinu, avec des cellules libres ou immobilisées est nécessaire pour


40

diminuer la concentration de tels métabolites et pour améliorer la production. ce résultat

s’est présenté dans un même type de fermentation répétée avec une biomasse élevée de

cellules immobilisées. Où, le taux d’EPS était plus élevé que dans le cas de cultures de

cellules libres de Lb. rhamnosus RW9595M (Lapointe, 2009).

14.Méthodes culturelles d’optimisation de la production des EPS :

Différents milieux ont été utilisés dans ce contexte. Cependant, le choix du milieu

convenable est un paramètre crucial pour un meilleur rendement. Etant donné que ,

l’analyse peut être affectée par l’un des ingrédients du milieu de production ; bien qu’ils

permettent une bonne croissance des bactéries lactiques et souvent même une bonne

production d’EPS (comme l’extrait de bœuf, la proteose-peptone et l’extrait de levure).

Mais, ils contiennent d’autres polymères carbohydrates (comme : les glucomannanes de

l’extrait de levure et la peptone), ce qui a été démontré dans certains essaies en signalant

que ces composés forment 94% du fond total dans le bouillon MRS (Vaningelgem et al.,

2004 ; Ruas-Madiedo et de los Reyes-Gavilan, 2005).

Au début des recherches sur la production des EPS par les bactéries lactiques, aucune

production n’a été observée dans des milieux semi-définis comme le MRS (à base de

glucose). Ainsi, plusieurs travaux ont été réalisés dans le lait écrémé (milieu à base de

lactose) et les dérivés du lait (milieu à base de lactosérum). Seulement récemment des

milieux semi-synthétiques et synthétiques ont été utilisés.

La définition de nouveaux milieux de culture adaptés pour augmenter et pour accélérer la

production des EPS par les souches bactériennes (Kojic et al., 1992). Qui ne contiennent pas

ces composés interférant avec la production. Ainsi, un milieu chimiquement défini est plus

approprié pour l’étude de la biosynthèse des EPS par les bactéries lactiques et des voies

métaboliques impliquées. La cause majeure consiste à l’absence de composants qui

interférent avec la quantification et avec l’analyse des EPS.

Une autre étude a été consacrée pour déterminer un nouveau milieu synthétique (à part le

milieu MRS) en dédiant l’influence de la composition du milieu sur le type

d’exopolysaccharide produit car l’utilisation de milieux chimiquement déterminés est


41

particulièrement importante à l’étude quantitative et qualitative et la régulation de

synthèse des EPS produits par les bactéries lactiques (Grobben et al., 1998)

Un milieu développé du milieu semi-défini (SDM) par Mende et al., (2012), pour L.

delbrueckii ssp. bulgaricus DSM 20081, isolée du yaourt Bulgare). Après sélection des milieux

les plus prometteurs sur des cultures en flacon, des expériences de bioréacteur ont été

effectuées en lots pour réaliser le plus grand rendement d’EPS. Tandis qu’aux

fermentations continues, elles ont été effectuées pour obtenir l’information sur la cinétique

de la croissance et de la production d’EPS (Petry et al., 2000).

Van der Meulen et al., 2007, ont mené tout simplement à la filtration du milieu MRS ; dans

le but d’éliminer les glucomannes ; avec une ultrafiltration de l’extrait de levure et la

peptone bactériologique

15.Détection des EPS :

II existe plusieurs façons de détecter la présence de polysaccharides. Ils peuvent être

détectés qualitativement par un examen visuel, par coloration ou par microscopie

électronique, et quantitativement, par différentes méthodes impliquées.

15.1. Examen visuel :

Pour détecter la production d’EPS chez une souche consiste à examiner une colonie sur un

milieu gélosé. En se basant sur l’apparence de la colonie productrice ; plusieurs

phénotypes ont été attribués aux souches lactiques productrices d’EPS « visqueuse »,

« mucoïde » et « slime : gluante» ; alors que, les souches mucoïdes ou slime, productrices

de boue ne sont pas toutes visqueuses (Vedamuthu et Neville, 1986 ; Kojic et al., 1992 ; Ruas

et de los Reyes, 2005).

Les colonies mucoïdes ont un aspect scintillant et gluant sur les plats d’agar (figure14, 15)

mais ne produisent pas de filament quand on les prolonge avec une anse à

ensemencement, contrairement la chez celles «visqueuses» ou il y aura formation de longs

filaments visqueux en touchant la colonie à l’aide d’un cure-dent ou d’une anse

d’ensemencement (selon la figure16).


42

Cependant, certaines souches de bactéries lactiques ne produisent pas de polymères sur un

milieu gélosé mais en produisent en milieu liquide sous certaines conditions bien définies

(Dupont, 1998).

Figure 14 : Colonies mucoïdes de Rhizobium alamii produites sur un milieu riche en glucose après 4 jours à 30°C et à l’obscurité (Bresin et al., 2008).

Figure 15 : Culture en boite de Pétri de souches mucoïdes de bactéries hydrothermales productrices d’EPS (Roger, 2002).

Figure16 : apparence macroscopique du filament visqueux formé par la masse cellulaire d’une souche de bactéries lactiques commerciale productrice d’EPS en croissance sur le milieu gélosé de Man Rogosa et Sharpe.

Dans l’évaluation sensorielle des laits fermentés les souches visqueuses confèrent une

consistance lisse avec une basse synérèse par rapport à celles non visqueuses.


43

15.2. Les colorations :

Certaines études se basent sur une astuce découverte par Gancel et al., en 1988 qui consiste

en l’ajout de colorants cationique additionnés au milieu de croissance ; possédant une

affinité aux composés organiques et inorganiques anioniques environnants, aussi bien

qu’aux polysaccharides neutres et anioniques ; non pas ceux excrétés mais ceux qui sont

fixés à la paroi bactérienne. Ils se fixent donc sur le peptidoglycane de la paroi et induisent

à la coloration de la colonie d’une souche non-productrice. En masquant la coloration (par

les EPS) apparaissent les colonies productrices en blanc sur le fond du milieu coloré. On

appelle cette technique : la méthode de détection des clones bactériens muc+ (Dupont,

1998).

Le rouge de ruthénium est l’un de ces colorants cationiques utilisé par Bouzar et al., (1995)

pour détecter des EPS de souches de Lb . delbrueckii ssp. Bulgaricus CNRZ 1187 productrices

de différents niveaux d’EPS, il colore le milieu en rose foncé sur lequel apparaissent les

clonies non productrices (clones Muc-) colorées en rose et celles productrices (Muc+) en

blanc grâce au masquage par les EPS (Ruas-Madiedo et de los Reyes, 2005).

15.3 .Microscope électronique:

Dans le but de l’illustration du fonctionnement des EPS ; Hassan et al., en 2002 a réalisé une

étude de microstructure du lait fermenté se basant sur la Microscopie confocale de laser de

balayage (CSLM) , comme méthodologie de visualisation directe des EPS des espèces

lactiques (Str. thermophilus CHCC 3534, CHCC2136 et 3855, Lb. delbrueckii ssp. Bulgaricus

CHCC 769 et RR, L.lactis CHCC 3367), dans les produits laitiers entièrement hydratés.

Sachant qu’elle est potentiellement impliquée dans ce contexte. Il a employé une nouvelle

astuce impliquant la souillure ou le marquage des EPS par l’agglutinine de germe du blé

marquée avec le fluor 488 d’Alexa ou la souillure avec la concanavaline A 488, puis

l’observation des échantillons par CSLM. Le résultat de l’observation est dans la figure ci-

dessous.

Les lectines (liant les protéines et les carbohydrates) et leur conjugués fluorescents, à

liaison spécifiée permettent la visualisation des EPS en biofilmes : comme la concanavaline

(qui se lie spécifiquement aux résiduels α-mannopyranosyl et α-glucopyranosyl) et à


44

l’agglutinine du germe de blé qui se lie aux résiduels N-acétyle glucosamine et acide N-

acetylneuraminique) (Chaplin, 2008).

D’habitude, avant observation par microscopie de balayage d’électron conventionnelle

(SEM : Scanning electron microscopy) une déshydratation est impliquée car les EPS sont

fortement hydratés et ne peuvent être fixés chimiquement, ainsi ; ils apparaissent sous

forme de filaments (résultat d’effondrement de leur structure pendant la déshydratation) ;

associés aux cellules bactériennes et au réseau de la caséine. Alors, cette nouvelle méthode

confère une bonne visualisation des EPS au sein des produits laitiers dans leur état hydraté

sans chevaucher l’intégrité structurale du gel.

Figure 17 : distribution d’exopolysaccharides (en vert) dans la structure du lait fermenté. a. Lait fermenté par Streptococcus thermophilus CHCC 3534 visqueuse et l’espèce non visqueuse

Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus CHCC 769.

B. Lait fermenté par. S. thermophilus CHCC 3534 visqueuse et l’espèce non visqueuse Lactobacillus

delbrueckii ssp. Bulgaricus CHCC769 après agitation.

C. Lait fermenté par Lactococcus lactis CHCC3367 visqueuse.

D. Lait fermenté par Lactococcus lactisCHCC3367 visqueuse après agitation. La barre = μm 10.


45

Figure 18 : le lait fermenté par l’espèce Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus RR après agitation. Les flèches principales fermées indiquent les agrégats rouges de protéine) et les flèches principales

ouvertes indiquent les EPS (en jaune). La concanavaline A a été employée pour souiller les EPS.

Barre =25μm.

Figure 19 : micrographes de microstructure et de morphologie de surface des KF5 EPS observées par SEM.

15.4 .Détection des EPS par mesure de la viscosité du milieu fermenté :

Une méthode très utilisée mais reste comme toutes autres méthodes limitée. La viscosité en

milieu liquide n’est pas affectée seulement par la quantité de polysaccharides formée.

Comme, elle ne peut pas être stable ; à cause de, plusieurs facteurs les plus majeurs sont le

type de polymère et les métabolites produits ; comme l’acide lactique qui acidifie le milieu,

précipite la caséine (dans le cas du lait) et donc introduit la coagulation). Comme dans

plusieurs d’autres cas il peut se produire des interactions entre cellules ou entre EPS et

certains composants comme la caséine (Bouzar et al., 1996).

On à la mesure directe dans le milieu de culture « viscosité apparente » ou bien à partir

d’un échantillon purifié, resuspendu dans de l’eau distillée « viscosité intrinsèque ».L’unité

fondamentale de mesure de viscosité est le «poise» ou le «centipoise». Alors que l’unité de


46

mesure de viscosité du système internationale qui est souvent utilisée conjointement avec

le système métrique est le «pascal-seconde» (Pa*s) ou «millipascal-seconde* » (mPa*s)

(Dupont, 1998).

15.5. Méthodes de purification des EPS :

L’étude caractéristique des EPS exige un isolement qui n’altère ni les propriétés chimiques

ni celles physiques des échantillons d’EPS.

Au fur et à mesure que la complexité du milieu de culture augmente, une purification

additionnelle est nécessaire (Ruas-Madiedo et de los Reyes-Gavilan, 2005).

L’extraction des EPS dans le lait est plus compliquée ; les constituants du lait peuvent

interférer dans la précipitation des polymères et les EPS bactériens ont tendance à

s’associer aux protéines du lait pour former un complexe glycoprotéique (figure20 ). II faut

alors hydrolyser les caséines avec des enzymes spécifiques et bien purifier les polymères

recueillis par une précipitation à l’éthanol (Bouzar et al., 1997).

Figure 20 : modèle de gomme arabique avant et après traitement avec la pronase.

Pour cela on emploie surtout la chromatographie échangeuse d’ion sur colonne, pour

séparer les EPS des acides téichoïques et les acides nucléiques ; comme on emploie des

méthodes enzymatiques telle : la Dnase, la Rnase et la protéase (Gorska et al., 2013).

16.Quantification des EPS :

La quantification des glucides peut se faire par des méthodes colorimétriques dont

souvent on utilise la méthode du phénol/acide sulfurique ; celles-ci sont largement

employées en raison de leur rapidité, simplicité et faible coût. (Dubois et al., 1956 ; Ruas-

Madiedo & de los Reyes-Gavilan, 2005 ; Amatayakul et al., 2006) ou des méthodes de


47

chromatographie d’exclusion moléculaire permettant la séparation des biopolymères selon

la taille (Looijesteijn et al., 2000).

17.L’analyse des polysaccharides :

Il est important de connaître la composition et la structure tridimensionnelle des EPS, pour

bien comprendre leurs propriétés physicochimiques et par conséquence leurs fonctions;

sauf qu’une seule méthode analytique n’est pas suffisante. Diverses techniques sont

impliquées, mais; aucune compilation complète de ces méthodes analytiques n’a été mise

en main, actuellement.

Pour analyser, il faut d’abord l’extraction, puis la purification des EPS de la masse

bactérienne dont certains emploient la chromatographie échangeuse d’ions. En suite,

viennent les différentes méthodes d’analyse de masse par chromatographies :sur gel de

filtration , GC, HPLC, ou bien de structure qui impliquent plusieurs méthodes (résumées

dans le tableau ), surtout pour les carbohydrates complexes telles les techniques d’analyse

de sucre, analyse par méthylation (pour déterminer la configuration absolue Górska-

Fraçzek et al., 2013), dérivations chimiques, modifications chimiques ; les enzymes, analyse

élémentaire (C, H, N, S et P) polarimétrie, diffusion de la lumière, modélisation

moléculaire, spectroscopie infrarouge transformée par Fourier , et analyse par

spectrométrie et RMN résonance magnétique nucléaire à haute résolution 1D et 2D : 1H 13C

31Pqui incluse les méthodes d’analyse bidimensionnelle par les méthodes 1H,1H COSY,

TOCSY, NOESY, et 1H,13C HSQC, HMBC, méthodes complémentaires dont l’une renforce

l’autre (Vaningelgem et al., 2004 ; Van Clasteren, 2010 ; Vijayabaskar et al., 2011 ; Ahmed et

al., 2013 ; Gorska et al., 2013).

Habituellement, une détermination structurelle complète d’un carbohydrate inconnu porte

sur les stages suivants selon l’ordre dans lequel sont présentés :

-Détermination des constituants monosaccharides, leur configuration absolue (D ou L),

leur taille d’anneau et toute dérivation subie comme la sulfation, la méthyltion ou

l’acetylation ;

-Détermination de la taille moléculaire ou la distribution de taille moléculaire


48

-Détermination de la configuration anomérique des liaisons (α ou β)

-Détermination de la position de liaison entre les unités de monosaccharides

-Détermination de leur séquence, incluant tout modèle répétitif de structure et le degré de

toute hétérogénéité,

-Détermination de toute conformation préférée des pièces ou de toute molécule (s) présente

(Chaplin, 2008 ; Van Clasteren, 2010).

Avant, le travail analytique a porté sur l’utilisation de la chromatographie sur papier pour

séparer les sucres composants des polysaccharides hydrolysés par l’acide. Avec beaucoup

d’effort étant appliqué au choix des solvants de développement et de la méthodologie de

détection. Bien que la chromatographie sur papier soit facile et peu coûteuse. Elle peut

séparer une large variété de types structuraux ; y compris des oligosaccharides et quelques

polysaccharides, sans une dérivation antérieure et s’assure généralement, que tous les

composants soient détectés. Elle est seulement et rarement employée de nos jours. Puis, la

chromatographie sur papier a été développée en chromatographie en couche mince avec sa

plus grande puissance de résolution.

Ces méthodologies améliorées possèdent une puissance de résolution beaucoup plus

grande et une quantification améliorée. Mais ; elles sont peu employées dans l’analyse

moderne d’hydrate de carbone, indépendamment de leur utilité importante pour séparer

des glycolipides, généralement excellé par des techniques à rendement élevé de

chromatographie liquide (Chromatographie liquide sous haute pression).

Tableau 3 : les méthodes analytiques majeures des carbohydrates (d’après Chaplin M. F, 2008) :

Monosaccharides Les essaies colorimétriques, chromatographie en phase gazeuse/ spectrométrie

de masse, chromatographie échangeuse d’ion haute performance.

Oligosaccharides Résonance nucléaire magnétique RMN, spectrométrie de masse, analyse par

méthylation, chromatographie échangeuse d’ion haute performance.

Polysaccharides Clivage enzymatique, analyse par méthylation, chromatographie d’exclusion

plus la méthode de dispersion de lumière laser en multi-angle,


49

Figure 21 : structure d’EPS de Lb.johnsonii 151 (Górska-Fraçzek et al., 2013).

On a aussi des méthodes de caractérisation physiques comme la détermination des

propriétés thermales par Calorimètre de balayage différentiel et plus détaillées par

l’analyse du thermogramme (Ahmed et al., 2013) ; en raison de la grande importance de ce

paramètre dans l’utilisation industrielle.

18.Utilisations des EPS des bactéries lactiques :

Parmi certaines applications commercialisées des polysaccharides qui ont été

réalisées dans le domaine : de la cosmétique, de l’analytique, et celui médicale (Rendueles

et al., 2013).Cependant, beaucoup d’autres tests mériteront d’être réalisés en formulation

alimentaire ou non alimentaire. Surtout, si on souhaite profiter des propriétés très

spécifiques de ce polymère en milieux aqueux. Des tests réalisés en agronomie suggèrent

aussi des applications dans le domaine de l’irrigation, problème d’avenir pour notre

planète.

Mais au fait du faible rendement en EPS produits chez la majorité des bactéries lactiques,

leur exploitation commerciale n’est pas très répandue (Badel et al., 2011). Sauf quelques

exceptions pour des HoPS ; comme les dérives de dextranes et des dextranes activés qui

retrouvent une large utilisation commerciale (produits de gels de filtration, comme unités

d’extension du volume de sang et pour améliorer le débit sanguin ; améliorants de pates ;

stabilisateurs de sirops alimentaires ; rétablissement des huiles). Le levane peut aussi être

impliqué comme bioépaississala nt alimentaire (De Vuyst et al., 2001). Ils sont intégrés

dans l’amélioration de la texture, de la viscosité des produits laitiers fermentés: fromages,

crèmes fermentées et surtout les divers types de yaourts (Gorska et al., 2013) ; aussi bien,

pour prévenir la synérèse (Hutkins, 2006).


50

Dans le cas du yaourt, les propriétés du gel sont affectées par : les ingrédients lors de sa

préparation, la façon dont la préparation de yaourt est traitée, l’activité de culture ; et des

facteurs de post-fermentation. Par exemple, le traitement thermique approprié au lait a un

effet profond sur la force du gel et spécifiquement, sur la capacité de rétention d’eau. Si le

gel est mal formé ou abrupte la synérèse se produira, menant au défaut connu sous le nom

de « wheying off ».

Le lait coagulé est essentiellement un gel de protéine qui donne la viscosité, l’effet dans la

bouche et le corps au produit fini. La formation et l’entretien de la structure de gel sont

donc importants pour la qualité de yaourt. Ainsi, dans le cas des yogourts brassés

additionnés de fruits, la présence de polysaccharides empêche que ceux-ci ne se déposent

au fond. Cependant, pour contrôler la synérèse et de maintenir une structure appropriée

du gel, généralement les fabricants de yaourt aux Etats-Unis ajoutent des stabilisateurs au

mélange ; qui sont typiquement des polysaccharides hydrophiles pour lier l’eau (Hutkins,

2006). Ainsi ; au Canada on emploie souvent l’amidon modifié pour ce défaut de qualité,

mais, les problèmes restent toujours (Gentès, 2011).

Parfois, on implique carrément ces bactéries lactiques elles même comme bio-épaississants

et des stabilisants à la place des polysaccharides d’autres origines; notamment, pour leur

statut GRAS (generally recognized as safe) (Mende et al., 2012). En faite, l’utilisation de

souches productrices d’EPS comme ferments du yaourt est plus intéressante, pour

améliorer la rétention d’eau à fin de diminuer la synérèse, améliorer la viscosité et qui

peut remplacer le gras ; avec un choix de souche à combiner en co-culture dans le ferment

bien et adapté au produit final ainsi, une combinaison de Lb. bulgaricus filantes et Str.

thermophilus non filantes à donner de bons résultats (Lapointe, 2009).

Ce qui est davantage, c’est que certains auteurs affirment que : la structure des EPS

produits par les différents microorganismes, leur composition, leur masse moléculaire, leur

conformation spatiale et leurs interactions avec les protéines ; seraient responsables de ces

effets plutôt que de la concentration produite (Duboc & Mollet, 2001 ; Gentès, 2011).

Dans le contexte médical, on trouve certaines applications des EPS bactériens à propriété

anti-biofilme lorsqu’on est face aux tolérances aux antibiotiques « un souci croissant ». On

a essayé d’exploiter ces EPS anti-adhésion qui modifient les propriétés physiques des


51

surfaces biotiques (cellules Gram positif et Gram négatif), et donc selon plusieurs études

l’effet des antibiotiques peut être renforcé contre ces biofilmes ; en les administrant

ensemble avec ces EPS anti-adhésion qui pourront rompre des interactions cellule-cellule

ou même cellule-surface biotique (figure 22A).

D’une autre part, ces EPS modifient les propriétés physicochimiques même des surfaces

abiotiques (ex : surfaces de glasses, surfaces de polystyrène) alors on les a utilisé comme

couvertures ou couches de protection contre la formation des biofilmes, (figure22 B). Ce

qui pourraient être employé sur les appareils médicaux laissés dans un organe (les

cathéters veineux totalement implantés et la tuyauterie de silicone) ou les arrangements

industriels (tubes industriels).

De ce fait, ces bactéries produisant des polysaccharides d’anti-adhésion ont pu être

employées en tant que probiotiques concurrents des microbes pathogènes. Par exemple

dans l’appareil gastro-intestinal ; comme dans le cas des EPS-r de L. acidophilus qui ont

inhibé l’attachement de E. coli O157 :H7 aux cellules humaines du colon adenocarcinoma

HT-29 cultivées. D’ailleurs, des oligosaccharides biodégradables sont actuellement

employés comme prébiotiques pour conférer aux avantages de santé (figure 22C)

(Rendueles et al., 2013).

Figure 22 : les applications potentielles du polysaccharide anti-adhésion : A.adjuvants,

B. couverture antiadhésive et C. Prébiotiques/Probiotiques. (d’après Rendueles et al., 2013).

A

B

C

.


52

19.Les effets non souhaitables des EPS :

Les polysaccharides excrétés par certaines souches peuvent avoir un impact négatif : par

exemple, la production de glucanes par Streptococcus mutans permet à la souche de coller

aux dents et participe à la formation de la plaque dentaire. La production de

polysaccharides par des souches de Leuconostoc ou de Pediococcus donne un aspect filant et

huileux au vin.

La sélection des souches mucoïdes lors de la fabrication de yaourt est cruciale et doit être

faite avec précaution ; pour ne pas compromettre le processus fermentaire. Etant donné

qu’une forte production d’EPS masque la saveur et les arômes et peut produire un yaourt

filamenteux. Mise à part, l’envahissement des autres souches acidifiantes non productrices

d’EPS, sachant que, souvent les souches productrices ne démontrent qu’une faible

production d’acides en début de croissance; ce qui peut compromettre la fermentation

(Dupont, 1998).

Matériel et méthodes

53

1.Origine des échantillons :

L’échantillon de Klila provenait de la wilaya de Msila.

L’échantillon du Raib provenait de la ville d’Ouanougha wilaya de Msila.

L’échantillon de margine d’olive fermentée était recueilli de la wilaya de Tlemcen.

L’échantillon du levain naturel servant à fabriquer le pain est obtenu par

fermentation spontanée de farine et d’eau.

2.Milieux et solutions biologiques utilisés :

Milieu MRS (mis au point par Man Rogosa et Sharpe 1960) gélosé et liquide pH 5.4

pour isolement et purification des Lactobacilles ; en raison de leurs exigences

nutritionnelles.

Milieu M16 BCP Pour la recherche de l’arginine dihydrolase « ADH » (Thomas,

1973),

MSE (Mayeux Sandine et Elliker, 1962),

Milieu MRS BCP : MRS sans extrait de viande ni Glucose,

Milieu kempler et Mc key (kempler et Mc key, 1980) KMK,

Milieu Clark et Lubs (Avril et al., 1992),

Eau physiologique (8.5g NaCl /l),

Tampon phosphate,

Lait écrémé,

Milieu plate count agar PCA au lait,

Milieu agar au tween 80,

Bouillon nutritif pour la culture des bactéries indicatrices pathogènes,

Muller Hinton (Muller et Hinton 1941).

3.Isolement et purification des souches de Lactobacillus :

L’isolement s’effectue par ensemencement en profondeur sur boites (de gélose MRS

acidifiée (pH 5.4) et de gélose MRS au CaCO3) ; de 1ml des dilutions 10-4 , 10-5 pour chacun

des échantillons de Klila et des margines ; et des dilutions 10-6 , 10-7 pour chacun des

échantillons de levain de panification et de Raïb, le milieu en surfusion (45°C), ensuite les

boites séchées sont incubées à 30° pendant 24 à 48 h en anaérobie.

On choisit de la gélose MRS acidifiée les colonies typiques des Lactobacilles (lenticulaires, à

pourtour régulier) et du MRS au CaCO3 celles entourées d’un halo transparent du à


54

l’acidification du milieu par dépôt du calcium, on repique sur bouillon et on incube à 30°C

pendant 24h en anaérobie, le développement d’un trouble bactérien au fond des tubes

témoigne d’une croissance.

La purification se fait par repiquages, successifs sur MRS gélosé en incubant toujours à

30°C pendant 24 à 48h ; jusqu’à obtention de colonies uniformes, de la même couleur

renseignant sur la pureté des souches.

4. Pré-identification des souches de Lactobacillus :

La pré-identification a reposé sur deux étapes :

La première consiste en l’identification par les méthodes classiques du genre ; dont le

Gram, test catalase, type fermentaire à partir du glucose et du gluconate, étude de la

croissance à 15 et 45°C. Les bactéries présumées Lactobacillus subissent la deuxième étape

d’identification d’espèce ; qui étudie le métabolisme azoté par la recherche de l’arginine

dihydrolase « ADH », le métabolisme des carbohydrates par l’étude du profil fermentaire

sur 19 sucres. Le résultat est comparé à plusieurs recommandations de classification des

bactéries lactiques, selon : Carr et al., (2002) ; Axlesson, (2004) ; Hammes et Hertel (2006).

4.1. Le type fermentaire :

4.1.1. A partir du glucose

La recherche des types fermentaires est conduite à partir de cultures bactériennes de 18h,

dans des tubes de bouillon MRS au fond desquels on a des cloches de Durham ; qu’on

incube pendant 24h à 30°C en anaérobiose.

4.1.2. A partir du gluconate

Le même protocole est procédé pour conduire la recherche du type fermentaire à partir du

gluconate, qui particularise le métabolisme homofermentaire obligatoire (absence de gaz)

du facultatif (présence de gaz) sauf que le glucose était remplacé par le gluconate de

sodium (Axlesson, 2004).


55

4.1. Croissance à différentes températures :

Il a pour objectif de différencier les bactéries lactiques mésophiles des thermophiles.

L’effet de ce paramètre sur la croissance des souches était conduit dans du bouillon MRS,

incubé à 15 et 45°C pour 24 h en anaérobiose.

4.2. Test de l’arginine dihydrolase (ADH) :

La recherche de l’enzyme arginine dihydrolase (ADH) est intéressante pour la

caractérisation des bactéries lactiques. Cette enzyme libère l’ammoniac et la citruline à

partir de l’arginine.

4.3. Profils fermentaires des isolats :

Etudiés sur 19 sucres : Amidon, L et D-arabinose, Cellobiose, D-Fructose, D-glucose, D-

galactose, Lactose, Maltose, Mannitol, Sorbitol, Sucrose, L-Rhamnose, D-Raffinose, Ribose,

Tréhalose, et D-xylose.

Des cultures jeunes sur MRS sont centrifugées à 6000 trs pendant 10min, le culot est rincé

au tampon phosphate à pH 6.8, une à deux fois, puis on y ajoute dessus du MRS BCP, pour

répartir sur des tubes contenant 1ml de milieu MRS BCP, plus 0.1 ml de chacun des sucres

déjà cités (en raison de 10% dans le milieu). On incube à 30°C, pendant 24 à 48h en

anaérobiose.

4.4. La pré-identification sur API 50 CH et API 20 Strep :

La galerie API 50 CH (de Biomerieux) composée de 49 microtubes contenant des substrats

déshydratés appartenant aux carbohydrates et dérivés (hétérosides, polyalcools et acides

uroniques), pour permettre l’étude du métabolisme des microorganismes. Notamment, les

bactéries lactiques. Le premier microtube sans principe actif sert de témoin négatif.

La galerie API 20 Strep composée de 10 microtubes qui contiennent des carbohydrates. Un

permettant d’étudier la production d’acetoine et l’autre décelant la possession de l’enzyme

Arginine dihydrolase.

Le milieu d’inoculation de la culture bactérienne consiste en MRS sans extrait de viande ni

de glucose, additionné de Pourpre de Bromocrésol (BCP) comme indicateur de pH.


56

5. Etude de quelques aptitudes technologiques des Lactobacilles isolés:

5.1. Etude de la thermorésistance :

On ensemence les souches lactiques dans du MRS liquide puis ils subissent un chauffage à

63,5°C au bain Marie pendant 30 min puis on incube à 30°C pendant 24h à 48h (Badis et al.,

2004).

5.2. Test de croissance à différentes concentrations en NaCl et à différends pH :

On utilise pour ce test des milieux MRS à 2%, 4% et 6.5% de NaCl, dans lesquels en

ensemence la souche bactérienne. Il nous permet de déterminer la résistance de la souche

au stresse dite halin (Badis et al., 2004).

Pour les différents pH on ensemence les cultures de 18h sur MRS à pH 4, pH 6,8 et à pH 9.

On incube à30°C pendant 48h à 72h.

5.3. Pouvoir protéolytique :

L’aptitude à la protéolyse des caséines du lait des différentes espèces de Lactobacillus est

recherchée sur milieu MRS liquide, dont la peptone est remplacée par la caséine du lait.

L’appréciation de l’activité protéolytique se fait par l’apparition d’un coagulum du à

l’hydrolyse de la caséine (Badis et al., 2004).

Pour confirmer on a évalué sur milieu PCA à 5%, MRS à 3% et à 5%de lait écrémé (Moulay

et al., 2006) en mesurant les diamètres de l’hydrolyse appréciés par la zone claire autour

des colonies ; ensemencées à partir de cultures de18h et incubées à 30°C pendant 24h en

anaérobiose.

5.4. Pouvoir lipolytique :

Cette aptitude est décelée sur milieu agar au Tween (Guessas et al ; 2012). On ensemence

des cultures jeunes de 18h, on incube à 30°C pendant 24h en anaérobiose, les souches qui

dégradent le tween sont entourées d’un halo transparent du au dépôt des cristaux du sel

de calcium formé par libération des acides gras libérés par les enzymes ou un précipitât

autour de la colonie du à la dégradation complète des acides gras.


57

5.5. Production de composés aromatiques :

La production de l’acétoïne (acétylméthylcarbinol) est testée sur milieu Clark et Lubs ; les

cultures de 18, ensemencées puis incubées à 30°C pendant 24h en anaérobiose, par la

réaction de Vogues-Proskauer dite réaction de V.P (Avril et al., 1992).

Ainsi, le lait écrémé est employé pour le même but, on y ensemence des cultures jeunes et

on incube en anaérobie à 30°C.

VPI (NaOH à16%) et VPII (α-naphtol à 6% alcool) sont les deux réactifs qui permettent

après incubation de détecter la production de composés aromatiques.

5.6. Utilisation de citrate en présence de sucre fermentescible :

Le citrate est transporté à l’intérieur des cellules par une citrate-perméase, où il est scindé

en acétate (en majeure partie excrétés) et en oxaloacétate par le complexe enzymatique

citrate-lyase.

L’oxaloacétate est ensuite converti en pyruvate et en CO2 par une oxaloacétate

décarboxylase. Des transformations successives du pyruvate aboutissent à la formation de

composés aromatisants et le produit fini est le 2,3-butylène-glycol (2,3-butanediol).

Cette propriété est étudiée sur milieu Kempler et Mc Key (KMK) ; qui contient un mélange

de deux solutions aqueuses : ferricyanide de potassium à 10% (p/v) et citrate de fer et

citrate de sodium à 2,5% (p/v). Le citrate a pour rôle d’inhiber la réaction entre l’ion

ferrique et le ferricyanide de potassium. L’apparition de colonies à couleur bleu-vert après

une incubation de 2 à 3 jours à 30°C indique une fermentation de citrate en lançant la

réaction entre les ions et le bleu de bromothymol ; tandis que les colonies qui gardent leur

couleur normale étant incapables de fermenter le citrate.

5.7. Etude du pouvoir acidifiant :

L’évaluation est réalisée par le dosage de l’acidité Dornic du lait ensemencé à 1%par des

pré-cultures bactériennes à partir de cultures de 18h ensemencées dans du milieu MRS

liquide , par titrimétrie (titrage de 10 ml d’échantillon de culture avec la soude NaOH N/9

en présence de 5gouttes de phénolphtaléine) jusqu’au virage de la couleur au rose pâle

persistant au moins 10 secondes vis-à-vis la mesure du pH du milieu par un pH-mètre en


58

fonction du temps ; les intervalles de temps d’incubation (à 30°C) et de la mesure étaient de

deux heures, (0 h, 2h, 4h, 6h, 8h…..18H et 24h).

L’acidité est déterminée par la formule : Acidité (°D) = V NaOH x 10.

Où : V NaOH : Volume de NaOH utilisé pour titrer l’acide lactique contenu dans les 10 ml de

lait écrémé.

L’acidité est exprimée en degré Dornic ou 1°D =0.1 g/l d’acide lactique produit.

5.8. Etude des interactions bactériennes :

5.8.1. Entre bactéries lactiques et souches pathogènes :

5.8.1.1. La méthode directe :

Selon la méthode modifiée de Barefoot et Klaenhammer (Spot Agar Test), (1986) ; des

boites de MRS solide sont ensemencées par les souches lactiques à tester en touche (Spot),

incubées à 30°C pendant 24h en anaérobiose. Des cultures de 18h des souches indicatrices

pathogènes référenciées provenant du laboratoire de Microbiologie fondamentale et

appliquée : Staphylococcus aureus ATCC 25923, Escherichia coli ATCC 25922, Listeria

monocytogenes ATCC 33090 et Enterococcus faecalis ATCC 2035 sont préparées en parallèle ;

ensemencées dans le bouillon nutritif et incubées à 37°C pendant 24h.

Des tubes de 7ml de Mueller Hinton semi solide (0.7% agar) en surfusion sont ensemencés

avec 0.5 µl des cultures jeunes des souches indicatrices pathogènes puis chaque boite Pétri

de la gélose MRS ensemencée en touches reçoit une des souches indicatrices en coulant le

tube à la surface. On laisse sécher puis on incube les boites à 37°C en aérobiose de 24 à 48h.

Les zones d’inhibition sont apparaissent en halos clair autour des souches ensemencées

(spots) ; la lecture des résultats se fait par mesure de leurs diamètres. Ce test a été répété

deux fois pour chaque souche indicatrice étudiée.

5.8.1.2. La méthode indirecte :

L’activité inhibitrice du surnageant natif et celui ajusté à pH entre 6.5 et 7 (afin d’éliminer

l’effet de l’acide lactique), est également évaluée par l’application de la technique de

diffusion sur gélose décrite par Barefoot et Klaenhammer (1986) :


59

On utilise le surnageant obtenu par centrifugation à 10000 trs pendant 10min, de

l’inoculum de la bactérie lactique qu’on veut tester. Le surnageant obtenu est divisé en

deux volumes dont le premier est dit surnageant natif, et le deuxième est ajusté à pH 6.5 à

7 avec du NaOH (2N) ; filtrés sur millipore (de 0.45 µm) les surnageant sont ensuite

déposés dans des puits de 5mm de diamètres, d’une gélose MH ensemencée auparavant

par écouvillonnage par une des souches indicatrices pathogènes référenciées utilisées

précédemment, la base des puits est bouchée par 10µl de gélose MH.

Chaque boite ensemencée par une souche pathogène reçoit 5 surnageants de cultures de

bactérie lactique. Chaque puits reçoit 100µl de surnageant. Après incubation 24h à 37°C en

aérobiose, les diamètres des zones d’inhibition sont mesurés.

5.8.2. Entre bactéries lactiques :

Selon la méthode de Fleming et al., (1975), des boites de MRS solide sont ensemencées par

les souches lactiques à tester en touche (Spot), incubées à 30°C pendant 24h en anaérobiose.

Des cultures jeunes des souches indicatrices lactiques sont préparées en parallèle ;

ensemencées dans le bouillon MRS et incubées à 30°C pendant 24h en anaérobiose.

Des tubes de 7ml de MRS semi solide (0.7% agar) en surfusion sont ensemencés avec 0.5 µl

des cultures jeunes des souches indicatrices lactiques puis chaque boite Pétri de la gélose

MRS ensemencée en touches reçoit une des souches indicatrices en coulant le tube à la

surface. On laisse sécher puis on incube les boites à 30°C en anaérobiose de 24 à 48h.

5.9. Pouvoir texturant :

5.9.1. Production des EPS :

La production des EPS était évaluée selon différentes méthodes référenciées, dont certaines

sont qualitatives et d’autres sont quantitatives.

Les méthodes qualitatives étaient conduites sur milieux surtout solides : Mayeux, Sandine

et Elliker (MSE), MRS normal et MRS modifiés: à 5% lactose, à 5%sucrose et à 5%glucose ;

sur milieu au colorant de détection : milieu au rouge de ruthénium et sur le milieu

Chalmers agar modifié.


60

Le milieu MSE pour la détection du dextrane, ayant contenu le sucrose et le Glucose

comme sources de carbone le premier est en forte concentration (10%) alors que le

deuxième est à 5%.

Le milieu MRS pour détecter les souches productrices des homopolysaccharides tant que

des héteropolysaccharides à partir du glucose comme seule source de carbone (à 2%).

Le milieu MRS modifié à 5% des sucres (Lac, Glu et Suc) permet de détecter les souches

fortement productrices d’EPS à partir de différentes source de carbone.

Sur milieu semi-synthétique au rouge de ruthénium approprié à la détection des bactéries

productrices d’EPS, tel que rapporté par Bouzar et al., (1996) ; les cultures de 18h des

souches sont ensemencées à la surface des boites et incubées à 30°C pendant 24h-48h, les

colonies qui apparaissent en rose sont considérées comme souche non visqueuse et les

colonies qui apparaissent en blanc sont considérées comme souche visqueuse productrice

d’exopolysaccharides.

Le milieu Chalmers Agar modifié à 5% des sucres suivants : sucrose, glucose, fructose et

lactose (Palomba et al., 2012). Après ensemencement par des cultures jeunes sur chacun

des milieux cités, on incube à 30°C en anaérobiose pendant trois jours, on teste le

phénotype des souches visqueuses productrices de longs filaments visibles par une anse ou

par cure-dent stérile.

Sur milieu MRS saccharosé à 5% (sans peptone, ni glucose), une culture de 18h est cultivée

à 30°C pendant 24h, après centrifugation à 4600 tours durant 30min ( à 4°C) ; on mélange

1volume de l’éthanol brute à 96° avec 1volume du surnageant dans des tubes en verre

bien propres, l’apparition d’une opacité à l’interface révèle la présence des EPS, les isolats

sont classés selon l’intensité de l’opacité : ++ pour une bonne production ; + pour une

faible production et ± pour une pauvre production (Lingani et al., 2010).

On a même étudié la production d’EPS sur lait écrémé par l’appréciation du gel formé et le

caractère visqueux présenté. La viscosité du lait fermenté est évaluée en mesurant le temps

de son passage à travers un entonnoir en plastic d’une capacité de 33 cc à température

ambiante; ainsi, on détecte la formation du filament en touchant avec une anse stérile.


61

Test quantitatif et estimatif du taux de la production des EPS :

Le screening initial a été poursuivi en réalisant : la production et la purification des

polymères en vue de leur quantification.

La méthode de Shutten et al., (1999) consiste en la mise en évidence de souches

productrices d’EPS sur milieu MRS à une teneur très élevée (10%) des sucres suivants :

glucose, fructose, sucrose et lactose.

Apres ensemencement de 10 ml de chaque milieu à 1% par des cultures jeunes, on incube à

30°C en anaérobiose pendant trois jours.

On extrait les EPS par méthode de précipitation à l’éthanol : on centrifuge 1ml de

suspension (11000g par 4min), on ajoute deux volumes d’éthanol frais à un volume de

surnageant, on laisse précipiter toute la nuit à 4°C.

Le précipitât est collecté par centrifugation (2000/15min) resuspendu dans 1ml d’eau

déminéralisée. Apres précipitation avec deux volumes d’éthanol et centrifugation, le culot

est séché à 55°C puis le précipitât est pesé. On exprime la masse sèche des carbohydrates

totaux en milligrammes par millilitre (mg/ml).

5.9.2. Extraction, purification et quantification des EPS :

La méthode utilisée pour l’évaluation de la production des EPS est conduite sur bouillon

MRSs à 10%. On ensemence le milieu à 3% pour chaque culture jeune et l’incubation se fait

à 30°C en anaérobiose pendant 48h.

Des leur récupération de l’incubateur, les tubes sont placés au bain marie à 100°C pendant

10min. L’extraction est faite selon Ismail et al., (2013): 10ml de suspension est centrifugée à

15000 trs pendant 15min, à 4°C le surnageant est récupéré sur lequel on ajoute 2volumes

d’éthanol frais à 95° puis on laisse précipiter à 4°C toute la nuit.

On centrifuge à 2500trs pendant 20min, puis le culot est dissout dans de l’eau pure, on

ajoute 2volumes d’éthanol à 4°C et on laisse précipiter puis on centrifuge à 2500 trs

pendant 10 min.


62

Cette méthode se base sur la purification totale de la solution EPS par la dialyse et

quantification selon la méthode de Dubois et al., (1956), qui est la plus sensible et la plus

précise.

Les échantillons sont dialysés contre de l’eau déminéralisée pendant 24 heures à 4°C. Avec

de fréquents changements d’eau (au moins deux fois par jour). Cette étape permet

d’éliminer les sucres résiduels, les sels et les acides aminés du milieu de culture.

Pour la quantification des EPS on suit la méthode de Phénol-Acide sulfurique de Dubois.

et al., (1956), qui repose sur le traçage d’une courbe standard à partir de dilutions réalisées

d’une solution stock (ou le glucose est le standard (1g /l)) (voir annexe),

Dans des tubes bien propres on met :

800µl d’échantillon (généralement on met 50µl d’échantillon+ 750µl d’eau distillée),

40µl de phénol à 80%,

2ml d’acide sulfurique et on agite immédiatement par le vortex,

On laisse refroidir à température ambiante ou bien au bain marie (à 23°C),

On mesure l’absorbance à λ= 490 nm.

Le principe de dosage colorimétrique par mesure de l’absorbance en spectrophotomètre

(UV/ Visible) à une longueur d’onde λ= 490 nm, repose sur la proportionnalité de la

concentration en EPS avec la densité optique mesurée DO 490. De petites quantités de

carbohydrates peuvent être détectées et la présence de protéines ou de peptides n’influence

pas le dosage. Les quantités de polysaccharides sont exprimées en mg/l (ou en g/l)

d’équivalent glucose selon la courbe standard. Chaque échantillon est préparé deux à trois

fois.

6. La cinétique de croissance des souches Lb. plantarum (Lbl26), Lb.plantarum (Lbl57) et Lb.

acidophilus (Lbl61) :

On a étudié la cinétique de croissance bactérienne en fonction du temps chez les trois

souches : Lb. plantarum (Lbl26), Lb. plantarum (Lbl57) et Lb. acidophilus (Lbl61), permettant

une comparaison de leurs développements cellulaires.

Pour se faire, on ensemence à 1% des tubes de MRS, qui sont ensuite incubés à 30°C en

anaérobiose. A chaque point d’observation choisi (0, 2, 4, 18, 24 h), la croissance


63

bactérienne est suivie par dénombrement sur boite et l’acidification du milieu par pH

mètre.

On calcule d’après la phase exponentielle de la courbe de croissance les paramètres

d’évaluation du développement cellulaire :

µ : le taux de croissance spécifique (en heure-1 (h-1) et G : le temps de génération (temps

nécessaire au dédoublement cellulaire, en minutes (min).

µ= lnN2- lnN1/ t2-t1 , G= ln2/µ.

7. Optimisation des conditions de la production des EPS chez Lb.plantarum (Lbl26):

Dans cette partie on a formé des combinaisons entre les différents paramètres de croissance

bactérienne : température d’incubation (T°), pH du milieu de croissance) et la source de

carbone avec la même durée d’incubation. On a évalué la production d’EPS chez la souche

Lb. plantarum (Lbl26) sur MRS modifié à 10% sucrose (MRSs), glucose (MRSG) et

lactose (MRSL); à deux differents pH : 5.4 et 6.2, à deux temperatures d’incubation : 30°C et

23°C pendant 48h d’incubation en anaerobiose, ainsi ; on a obtenu 12 combinaisons,

comme ce qui suit (en triple):

Pour se faire on ensemence les tubes de 111 ml MRS modifié à 1% d’une culture jeune de la

souche Lb. plantarum (Lbl26) et l’incubation se fait en anaérobiose.

Suc

pH 5.4

23°C

30°C

pH 6.223°C

30°C


64

La purification des EPS est procédée selon Ismail et al., (2013), et leur quantification est faite

selon Dubois et al., (1956).

8. Etude de la cinétique de production des EPS en fonction de la croissance bactérienne

chez Lb.plantarum (Lbl26) :

La cinétique de production des EPS est étudiée sur milieu MRSs, pour la souche

considérée comme fortement productrice d’EPS : Lb. plantarum (Lbl26), en fonction de sa

croissance pendant 48h.

On ensemence à 1% des tubes de MRS, ils sont ensuite incubés à 30°C en anaérobiose. A

chaque point d’observation choisi (0, 3, 6, 12, 18, 24, 48 h), la croissance bactérienne est

suivie par dénombrement sur boite. Entre autre; pour la production des EPS ; 10 ml sont

prélevés pour procéder selon le protocole de l’extraction et de la purification de Ismail et

al., (2013) et de la quantification selon Dubois et al., (1956).

9. Etude de quelques aptitudes probiotiques :

9.1. Résistance aux antibiotiques :

La méthode d’application des disques sur milieu solide, selon de Leory et al.,

(2007) ; modifiée; on ensemence par écouvillon la boite de l’inoculum bactérien de chacune

des souches : Lb. plantarum (Lbl( 22,24,26 et57), Lb. casei (Lbl60) et Lb. acidophilus (Lbl61), on

laisse sécher les boites puis on y dépose les 12 disques d’antibiotiques sur dessus :

Amoxicilline 25 µg (AMX), Pénicilline (P6) 6 µg et (P 10) 10µg, Vancomycine 30µg (VA),

Oxacilline 5 µg (OX 5), Gentamicine 10 µg (GM) , Ampicilline 10 µg (Amp 10), Cifotaxime

30 µg (CTX 30), Azithromycine 15 µg(AZM), Fosfomycine 50 µg (FOS), acide fusidique 10

µg (FA), acide nalidixique 30 µg (AN 30).

Le résultat est évalué par diamètres d’inhibition de la croissance des bactéries testées

exprimé en millimètres (mm).

9.2. Tolérance à l’acidité :

La capacité à résister à l’acidité gastrique est déterminée selon la méthode de Hydrominus

et al., (2000) modifiée. Avant de réaliser ce test, on prépare une culture jeune sur bouillon

MRS. Le culot bactérien de la culture est récupéré par centrifugation à 10000 g pendant


65

4min, puis les cellules sont suspendues dans 10 ml du bouillon MRS ajusté à pH2 et le

témoin est ensemencé à pH5.4.

La résistance des souches à ce facteur hostile est estimée par dénombrement des cellules

sur boites ; avant et après deux heures d’incubation (T 2h) à 30°C en anaérobiose ; le taux

de survie est calculé par l’équation suivante :

Taux de survie (%) = logUFC à T 2h / logUFC à T 0h x 100.

9.3. Résistance aux sels biliaires :

Selon la méthode modifiée de Hydrominus et al., (2000) : on prépare en la culture

bactérienne sur bouillon MRS. Le culot bactérien des cultures jeunes est récupéré après

centrifugation à 10000 g pendant 4min, puis les cellules sont suspendues dans 10ml du

bouillon MRS à 5 % de sels biliaires et ajusté à différentes valeurs de pH (pH2 et pH 8,5).

Le nombre de cellules viables est déterminé à Temps zéro heure. Les tubes sont par la

suite incubés pendant 2h à 30°C.

Taux de survie (%) = logUFC à T 2h / logUFC à T 0h x 100.

Résultats et discussion

66

1. Isolement et purification des Lactobacilles :

L’isolement et la purification d’un total de quarante souches étaient conduits sur milieu

MRS, les colonies en profondeur de la gélose se sont apparues lenticulaires, d’un pourtour

régulier, de couleur beige (figure23).

Figure 23 : aspect macroscopique des colonies de bactéries lactiques : 1.dilution 10-4 ; 2.dilution 10-5 et 3.dilution 10-6 du MRS au CaCO3.

Dépourvues de la catalase (tableau 4); ces bactéries sont ainsi présumées des bactéries

lactiques.

L’observation des colonies de l’ensemble des souches étudiées révèle un aspect presque

semblable : elles sont lisses, légèrement bombées, régulières, translucides ou opaques, de

taille plus ou moins importante (2 à 3mm) et de couleur généralement blanche ou crème

(figure 24).

Figure 24 : pureté des souches sur milieu solide.

La sélection de souches productrices d’EPS a été réalisée sur milieu MRSs (ou le glucose est

substitué par sucrose à 5%) (Figure 42c), dont la majorité des souches productrices,

appartenaient au genre de Lactobacillus ; Sous microscope, les cellules bactériennes

apparues en forme de bâtonnets à Gram positif, isolées, disposées par paires ; ou en petites

chaînettes (figure 25).


67

Figure 25 : aspects microscopiques après coloration de Gram des souches Lbl60 et Lbl23 (Gr X 1250).

2. Pré-identification des isolats de Lactobacilles :

2.1. Selon le groupe :

D’après l’analyse des résultats (tableau 4), les souches de Lactobacillus ont montré presque

les mêmes caractères biochimiques et physiologiques.

Parmi les souches de Lactobacillus, Lbl (21, 22, 23, 24, 25, 26, 55, 56, 57, 58, 59 et 60) sont

classées dans le groupe Streptobactrium du fait qu’elles soient (héterofermentaires

facultatifs), et qu’elles ne possèdent pas l’enzyme Arginine Dihydrolase (figure 27).

Les souches Lbl61, Lbl62 appartenant au groupe de Thermobacterium (homofermentaires

obligatoires). Les souches Lbl27 et Lbl28 sont classées parmi le groupe Betabacterium. Elles

se développent à 45°C et ne possèdent pas l’Arginine Dihydrolase.

L’ensemble des souches dégrade l’esculine (figure27).

a. production du gaz à partir du glucose. b. production du gaz à partir du gluconate,

par la souche Lbl56.

Figure 26 : a et b, le type fermentaire des souches lactiques.


68

Figure 27 : test de l’ADH sur milieu M16 BCP des souches Lbl21 et dégradation de l’esculine.

Tableau 4 : Profil physiologique et biochimique des souches isolées.

So

uch

es

Caractères physiologiques et biochimiques

Gra

m

Ca

tala

se

AD

H

Cro

issa

nce

à 1

5°C

Cro

issa

nce

à 2

3°C

Cro

issa

nce

à 3

7°C

Cro

issa

nce

à 4

5°C

Th

erm

ore

sist

an

ce 6

3 ,5

°/30

min

Cit

rate

Pro

du

ctio

n d

’acé

toïn

e

Cro

issa

nce

à p

H4

Cro

issa

nce

à p

H8

Cro

issa

nce

à p

H9

2%

Na

Cl

4%

Na

Cl

6,5

% N

aC

l

Esc

uli

ne

Lbl21 + - - + + + - - + + + + + + + + + Lbl22 + - - + + + - - + + + + + + + + + Lbl23 + - - + + + - - + + + + + + + + + Lbl24 + - - + + + - - + + + + + + + + + Lbl25 + - - + + - - + + + + + + + + + Lbl26 + - - + + + - ± + + + + + + + + + Lbl27 + - - - + + + + + + + + + + + + + Lbl28 + - - - + + + + + + + + + + + + + Lb155 + - - + + + - - + + + + + + + + + Lbl56 + - - + + + - - + + + + + + + + + Lbl57 + - - + + + - - + + + + + + + + + Lbl58 + - - + + + - - + + + + + + + + + Lbl59 + - - - + + - - + + + + + + + + + Lbl60 + - - - + + - - + + + + + + + + + Lbl61 + - - - + + - - + + + + + + + + + Lbl62 + - - - + + - - + + + + + + + + + Lbl63 + - - - + + - - + + + + + + + + + Lbl64 + - - - + + - - + + + + + + + + +

Significations : (+) : test positif ; (–) : test négatif ; (±) : résultat intermédiaire ; homo :

homofermentaire ; héter : hetérofermentaire ;


69

2.2. Selon l’espèce :

2.2.1. Profils fermentaires des isolats

La comparaison des profils fermentaires (tableau 5, figure 28) révèle, une diversité d’espèce

de Lactobacillus isolées selon la classification de Carr et al., (2002) et Hammes et Hertel,

(2006).

Les souches appartenant au groupe Thermobacterium Lbl61 et Lbl 62 sont présumées : Lb.

acidophilus pendant que la souche Lbl59 est présumée Lb. helveticus.

Du groupe Streptobactrium on rencontre surtout l‘espèce Lb. plantarum : Lbl21, Lbl22, Lb23,

Lb24, Lb25, Lb26, Lbl57 et Lbl65, on trouve trois souches présumées Lb. casei : Lbl55, Lbl56,

Lbl58, Lbl60 et deux souches qui sont présumées Lb. curvatus : Lbl63 et Lbl64.

Les souches Lbl27 et Lbl28 du groupe Betabacterium se rapprochent de l’espèce: Lb.

cellobiosus.


70

Tableau 5 : le profil fermentaire des differentes souches de Lactobacillus.

Significations : (+) : test positif ; (–) : test négatif ; (±) : résultat intermédiaire, ND :non défini.

Figure 28 : sucres témoins (à gauche) du profil fermentaire de la souche Lbl26 (à droite).

Souches

L-A

ab

ino

se

D-A

rab

ino

se

Am

ido

n

Cell

ob

iose

D-F

ruct

ose

Glu

cose

D-

Gala

cto

se

Lact

ose

Malt

ose

Man

nit

ol

Man

no

se

Rib

ose

L-R

ham

no

se

D-R

aff

ino

se

So

rbit

ol

Su

cro

se

Tré

halo

se

D-X

ylo

se

Pré

sum

ées

:

Lbl61 - - - + - + ± + ± + + - - + + + + - Lb.acidophilus

Lbl62 - - - + - + + + + - + - - + + + + - Lb.acidophilus

Lbl59 - - - - - + + + ± - - - - - - - - - Lb.helveticus

Lbl55 - - - ND + + + + + + + - - - ND - + - Lb.casei

Lbl56 - - - + + + - + + + + + - + - + - - Lb.casei

Lbl58 - - - - - + - + + + + - - - - + + - Lb.casei

Lbl60 - - - - ND + + + ± + + - - - - + ND - Lb.casei

Lbl63 - - - + + + - + ± ± - ± - - - - + - Lb.curvatus

Lbl64 - - - + + ± ± + ± ± + ± - - - ± - - Lb.curvatus

Lbl57 - ± - + - + ± + + - + + + + + + - - Lb. plantarum

Lbl24 - - - + + + + + + + + + ± - - + + - Lb.plantarum

Lbl25 - - - + + + + + + + + ± - - + + + + Lb.plantarum

Lbl 26 - - - + + + + + + + + + - - ± + + - Lb.plantarum

Lbl27 - - - + - + + - + + + + + - + + + - Lb.cellobiosus

Lbl28 - - - + - + + - + + + + + - + + + - Lb. cellobiosus


71

2.2.2. Pré-identification sur API50CH et API20 STREP :

Deux souches ont été sélectionnées pour la confirmation de leurs profils fermentaires des

carbohydrates sur API 50CH : Lbl26 et Lbl60 qui sont considérées comme fortement

productrices d’EPS.

La pré-identification de la souche Lb. plantarum (Lbl26) était confirmée par galerie API

50CH (figure 29), le tableau 6 indique le résultat qui en comparaison avec le document

technique de microbiologie technique (2emme édition) révèle l’identité présumée Lb.

plantarum.

Sur API20 STREP, les deux souches Lbl57 et Lbl61 sont confirmées pour leur pré-

identification, les sucres déjà testés (Ribose, Arabinose, Mannose, Sorbitol, Lactose,

Tréhalose, Raffinose, et Amidon) donnent le même résultat (figure 30, tableau7). En plus

du Glycogène et l’Inuline qui sont négatifs chez les deux souches ; ils ne sont pas

fermentés.

Les deux tests : esculine et VP sont toujours les mêmes en comparaison avec le résultat

obtenu par les méthodes classiques : positifs.


72

Tableau 6 : résultat des profils fermentaires sur API 50 CH

Carbohydrates

Souches

Carbohydrates

Souches

Lbl26 Lbl60 Lbl26 Lbl60

Glycérol - - Salicine + +

Erythritol - - D- Celiobiose + +

D- Arabinose - - D- Maltose + +

L- Arabinose - - D- Lactose 1 + +

D- Ribose + + D- Melibiose + +

D- Xylose - - D-Saccharose + +

L- Xylose - - D- Trehalose + +

D- Adonitol - - Inuline - -

Méthyl-Βd-Xylopyranoside,

- - D- Mélézitose + -

D- Galactose + + - D- Raffinose - -

D- Glucose + + Amidon - -

D- Fructose + + Glycogène - -

D- Mannose + + Xylitol - -

L- Sorbose - - Gentiobiose + +

L- Rhamnose - - D-Turanose ± -

Dulcitol - - D- Lyxose - -

Inositol - - D- Tagatose - -

D- Mannitol + + D- Fucose - -

D- Sorbitol ± - L-Fucose - -

MDM - - D- Arabitol + -

MDG ± - L-Arabitol - -

NAG + + Potassium Gluconate - -

Amydaline + + Potassium 2-cétogluconate - ±

Arbutine + + Potassium 5-cétogluconate, ± -

Esculine citrate de fer,

+ +

Pré- identifiée

comme étant :

Lb.

plantarum

Lb.

Casei spp.

rhamnosus


73

Figure 29 : test de fermentation des hydrates de carbone sur Api 50CH des souches Lbl26 et Lbl 60.

Figure 30 : profil fermentaire de la souche Lbl63 sur API20 STREP.

Tableau 7: résultats sur API 20 STREP.

VP Esc ADH Rib Ara Man Sor Lac Tre Inu Raf Glyg Amid Pré-identifiée :

Lbl57 + + - + + + + + + - + - - Lb. plantarum

Lbl61 + + - + - + + + + - + - - Lb. acidophilus

3. Etude de quelques aptitudes technologiques des Lactobacilles isolés :

Les résultats dans le tableau 4 résument cette étude :


74

Ainsi, on note que seules les souches Lb. plantarum (Lbl26) et Lb. cellobiosus (Lbl27, Lbl28)

résistent sous l’effet de température à 63.5°C, pendant 30min ; avec une faible croissance

après 72h d’incubation, les autres souches sont incapables d’y persister. A cet effet, elles ne

sont pas thermorésistantes, elles ne sont même pas thermophiles.

Entre autre, toutes les souches de Lactobacillus isolées marquent une résistance au stresse

halin allant jusqu’à 6.5% en NaCl. Alors que, les souches de Lb. plantarum, Lb. casei isolées

par Badis et al., (2004) n’ont pas résisté à la salinité élevée sauf Lb. helveticus. Pour l’effet de

la diversification en pH du milieu (pH 4 acide et pH 9 alcalin (figure a)) sur la croissance,

les souches s’y répondent très bien, ce qui compense la défaillance précédente.

Toutes les souches sont dites aromatiques ; d’après les résultats du test de la réaction de

Vogues Proskauer (dans le tableau 4) ; puisqu’elles produisent à partir du pyruvate des

composés responsables des aromes des produits laitiers ; comme l’acétoïne détecté par

l’apparition d’anneau rose-rouge à l’interface (figure 30 c).En plus, toutes les souches

utilisent le citrate en présence du glucose (figure 30b). Un critère très désirable en industrie

laitière puisqu’elles en produisent à partir le diacétyle.

Les souches Lb. plantarum (Lbl22, Lbl23 et 2Lbl4) dégradent la caséine du milieu MRS à la

caséine ; d’après l’apparition d’un coagulum dense (figure 30 d). Entre autre, les souches

Lb. plantarum (Lbl26, LBL65), Lb. casei (Lbl56, Lbl59 et Lbl60), Lb. cellobiosus (Lbl27, Lbl28) et

Lb. acidophilus (Lbl61, Lbl62) ont presque totalement dégradé la caséine avec une

importante production de coagulum qui a été précipité.

La souche est dite protéolytique si elle présente une zone de lyse de diamètre compris

entre 5 et 15 mm. Ainsi, sur milieu PCA à 5% lait écrémé toutes les souches s’entoure d’une

zone de protéolyse mais seules Lb. plantarum (Lbl26, Lbl57) et Lb. casei (Lbl56) qui exhibent

un grand halo allant jusqu’à 2mm de diamètre pour Lb. plantarum (Lbl26), Lb. casei (Lbl58)

et 2.5 mm pour Lb. casei (Lbl60). Les autres diamètres vont de 0.7 à 0.9mm (voir tableau 8).

Cependant, sur milieu MRS à 5% jusqu’à 10% de lait écrémé, le caractère protéolytique des

isolats est bien distinct. Les halos sont importants (entre13 et 20 mm de diamètre). Sauf la

souche Lb. casei (Lbl58) qui exhibe un faible diamètre de protéolyse. Les souches: Lb.

plantarum (Lbl25) et Lb. casei (Lbl60) représentent les diamètres les plus grands (20mm).


75

Ces résultats montrent que l’activité protéolytique dépend de la souche et qu’il existe une

relation entre la composition du milieu de croissance et l’expression de l’activité

protéolytique.

Le pouvoir lipolytique testé selon Guessas et al., (2012), sur milieu agar au tween 80

(tableau 8), est prononcé chez toutes les souches isolées : Lb. plantarum (Lbl (22,23, 24 ,25

,26 , 57), Lb. casei (Lbl56), Lb. cellobiosus (Lb27, Lbl28), Lb. acidophilus (Lbl61, Lbl62) et Lb .

curvatus (Lbl63,Lbl64), dont on note des zones de précipitation importantes (figure 31 f).

Les souches qui dégradent le tween 80 sont entourées d’un précipitât visible, du au dépôt

des cristaux de sel de calcium formé par la libération des acides gras libérés par les

enzymes ou un précipitât autour de la colonie du à la dégradation complète des sels des

acides gras, les diamètres des zones de précipitas chez: Lb. plantarum (Lbl21), Lb. acidophilus

(Lbl61 et Lbl62), sont petits. En comparaison avec les résultats de lipolyse des travaux de

Guessas et al., (2012), sur agar au tween 80, qui ne sont guère importants à signaler chez

toutes les souches de Lactobacillus. Car nulle n’a montré une aptitude dégradante.

Toutefois, la recherche du caractère par Karam et al., (2012), sur MRS au tween 80 à 3%

représente des résultats semblables. On considère que le résultat ainsi obtenu est fructueux

mais à faible concentration en tween 80 (0.25%).

VP-

==+=++

VP+

==+=

++

Coagulum précipité : hydrolyse de la caséine.

Lbl62

Lbl 24

Lbl26 Lbl27

Lbl55

Figure b : utilisation du citrate en présence du glucose sur

KMK

Figure a : croissance sur MRS à pH 9.

Figure c : production d’acetoine sur

milieu Clarck et Lubs et sur lait écrémé.

Figure d : dégradation de la caséine du lait

bovin par la souche Lbl27, témoin à gauche.

Lbl26 Lbl25

Lbl56 Lbl63

Lbl56 Lbl61

Lbl26

Témoin


76

Figure e : pouvoir protéolytique sur milieu MRS et PCA Figure f : lipolyse sur milieu agar au

5% de lait écrémé. Tween 80.

Figures 31 : a. b. c. d. e. f : études des aptitudes technologiques des souches.

Tableau 8 : activités protéolytique et lipolytique des Lactobacilles.

Diamètres (mm)

Souches

Protéolyse sur

PCA à 5%

(diamètre en mm)

Protéolyse sur

MRS

(diamètre en mm)

Hydrolyse

de la caséine du lait

Lipolyse

à 3% à 5% à10%

Lbl22 + + + + + +

Lbl23 + + + + + ++

Lbl21 + + + + + +

Lbl24 + + + + + ++

Lbl25 + + + + + ++

Lbl26 ++ + + + + ++

Lbl27 + + + + ++ ++

Lbl28 + + + + ++ +

Lbl55 + + + + + ++

Lbl56 ++ + + + + ++

Lbl57 ++ + / / + ++

Lbl58 + + + + + ++

Lbl59 + + + + + +

Lbl60 + + ++ + + +

Lbl61 + + + ++ + +

Lbl62 + + + ++ + ++

Lbl63 + + + + + ++

Lbl64 + + + + + +

Lbl63 Lbl60

Lbl64 Lbl61

Lbl58

Lbl55 Lbl21

Lbl61 Lbl 28

Lbl56

557

Lbl22

Lbl25


77

Significations : + : présence de caractère ; ++ : caractère fort.

3.7. Pouvoir acidifiant

Les figures A et B: 32, 33, 34, 35, 36, 37 révélant la cinétique d’acidification des différentes

souches de Lactobacillus, indique une diversité en pouvoir acidifiant qui dépond du

pouvoir protéolytique et de la capacité de métaboliser les différentes substances du milieu.

Les souches Lb. plantarum (Lbl26 Lbl22, Lbl24 et Lbl25) sont bien acidifiantes avec des

valeurs d’acide lactique très élevées (10, 10.5, 11.9 et 16.6 g/l), produites au bout de 24h.

La vitesse maximale de l’abaissement du pH du milieu est exercée par la souche Lb.

plantarum (Lbl24) (figure 32 A et B).

Les cinétiques des deux souches de Lb. cellobiosus (Lbl27 et Lbl28) sont presque semblables ;

sauf que, Lbl27 est un peu plus acidifiante que Lbl28 avec une valeur de 12.1 g/l d’acide

lactique produit (figure33.A et B).

Les souches Lb. casei (Lbl56 et Lbl60) abaisse le pH du milieu à 4.53 et à 3.63,

successivement. Le taux d’acide lactique produit est plus élevé chez Lbl56 (98g/l), que chez

Lbl60 (70g/l) (figure 34. A et B).

Pour les deux souches de Lb. curvatus, Lbl64 est la plus acidifiante avec une production de

10.5 g/l d’acide lactique et un abaissement de pH du lait jusqu’à 3. 63, par rapport à Lbl63

qui produit 80g/l avec un abaissement de pH jusqu’à 4.19 (figure 36 A et B).

La souche Lb. helveticus (Lbl59) est considérée très acidifiante elle produit 12.3g/l d’acide

lactique avec un abaissement de pH qui atteint 3.70 au bout de 24h (figure 37 A et B).

Le pouvoir acidifiant le plus bas est celui effectué par la souche Lb. casei (Lbl60) (70 °D).

L’abaissement du pH le plus remarquable est celui de la souche Lb. plantarum Lbl22 (figure

32.B).

Les souches Lb. plantarum (Lbl23), Lb. casei (Lbl60) et Lb. curvatus (Lbl63) ne sont pas trop

acidifiantes par rapport aux autres souches avec des valeurs en acide lactique de 79, 70 et

80 g/l, successivement.


78

Figure 32 : A. cinétique d’acidification (en degré Dornic °D) et B. évolution du pH en fonction du temps, des souches de Lb. plantarum (Lbl26, Lbl22, Lbl23, Lbl25, et Lbl26).

Figure 33 : A. cinétique d’acidification (en degré Dornic °D) et B. évolution du pH en fonction du temps, des souches de Lb. cellobiosus (Lbl27 et Lbl28).

Figure 34: A. cinétique d’acidification (en degré Dornic °D) et B. évolution du pH en fonction du temps, des souches de Lb. casei (Lbl56 et Lbl60).

0

2

4

6

8

0 4 8 12 24

pH

Temps (h)

B

0

2

4

6

8

0 2 4 6 10 18 24

pH

Temps (h)

B

0

2

4

6

8

0 2 4 6 8 18 24

pH

Temps (h)

B

A


79

Figure 35: A. cinétique d’acidification (en degré Dornic °D) et B. évolution du pH en fonction du temps, des souches de Lb. acidophilus (Lbl61 et Lbl62).

Figure 36: A. cinétique d’acidification (en degré Dornic °D) et B. évolution du pH en fonction du temps, des souches de Lb. curvatus (Lbl63 et Lbl64).

Figure 37 : A. cinétique d’acidification (en degré Dornic °D) et B. évolution du pH en fonction du temps, des souches de Lb. helveticus (Lbl59).

3.8. Etude des interactions bactériennes (antibiose) :

3.8.1. Entre les souches de Lactobacilles et les souches indicatrices pathogènes :

3.8.1.1. La méthode directe :

Les souches présentant une zone claire d’extension latérale supérieure à 0,5 mm sont

considérées comme productrices de substances antibactériennes (Fleming et al., 1975), alors

on considère que toute les souches de Lactobacillus isolées ont exhibé une activité

antagoniste vis-à-vis des quatre souches indicatrices pathogènes ; car les halos d’inhibition

0

2

4

6

8

0 2 4 6 8 18 24

pH

Temps (h)

B

0

2

4

6

8

0 2 4 6 8 18 24

pH

Temps (h)

B

Lbl63

Lbl64

0

2

4

6

8

0 2 46 8 10 18 24

pH

Temps (h)

B


80

allaient de 14 mm au minimum à 30 mm au maximum, de diamètres (résultats dans

l’annexe).

L’effet inhibiteur majeur est celui marqué par les souches Lb. plantarum (Lbl22, Lbl26, Lbl

27), Lb. casei (Lbl55), Lb. helveticus (Lbl59) et Lb. acidophilus (Lbl61) contre les quatre souches

pathogènes à des valeurs moyennement élevées entre 20 et 28mm. La souche Lb. casei

(Lbl55) est privilégiée. L’inhibition vis à vis de S. aureus la plus élevée est marquée par une

zone de 26 mm de diamètre par la souche Lb. helveticus (Lbl59); par rapport aux autres

souches, ainsi pour Lis. monocytogenes 26mm est le diamètre d’inhibition le plus élevé, pour

En. faecalis 23mm est le diamètre de zone d’inhibition maximal sur tout les diamètres et

finalement, un diamètre de 28mm est marqué sur E. coli par la souche Lb. casei (Lbl55).

Le diamètre 08 mm est considéré comme étant le seuil minimum marqué par la souche Lb.

curvatus (Lbl64) sur Lis. monocytogenes. Les souches Lb. plantarum (Lbl25) et Lb. cellobiosus

(Lbl27) ont aussi marqué un bon effet inhibiteur sur les quatre germes pathogènes : 20mm

de diamètre de zone d’inhibition de la croissance de : S. aureus, Lis. monocytogenes et En.

faecalis sauf pour E.coli dont Lb. cellobiosus(Lbl27) l’a mieux inhibé (20 mm de diamètre) par

rapport à Lb. plantarum (Lbl25)

La souche Lb. casei (Lbl56) contrairement aux autres a mieux inhibé E. coli (22mm) et En.

faecalis (23mm) que Lis. monocytogenes et S. aureus avec des valeurs plus élevées.

En moyenne toutes les souches de Lactobacillus testées ont marqué un effet inhibiteur

notable sur Lis. monocytogenes et S. aureus (figure38) même sur En. faecalis et E. coli mais en

moyenne à diamètres plus ou moins inferieurs.

Figure 38 : activité inhibitrice des souches isolées sur les souches indicatrices pathogènes : 1 –Listeria monocytogenes 33090, 2 –Staphylococcus aureus 25923, 3- Enterococcus faecalis 2035, 4- Escherichia coli 25922, successivement.

3.8.1.2. La méthode indirecte :

Lbl 55

Lbl24

Lbl63

Lbl26

Lbl59

Lbl62

Lbl27

Lbl25


81

a. Utilisation du surnageant natif :

L’inhibition des germes pathogènes demeure ainsi significative, pour les souches Lb.

plantarum (Lbl21, Lbl23, Lbl26 et Lbl57). Notamment, pour la souche: Lb. plantarum (Lbl21).

Cependant, l’effet du surnageant de la souche Lb. plantarum (Lbl26) devient plus faible avec

des diamètres compris entre: 10 et 13mm (tableau 9, figure 39).

La méthode des puits donne un résultat plus ou moins différent de celui de la méthode

directe. Les diamètres sont plus petits (entre 10 et 17mm), mais il y a toujours inhibition.

L’ensemble des surnageants natifs des souches testées inhibent les quatre souches

pathogènes déjà citées. Cependant, le surnageant natif de la souche Lb. acidophilus(Lbl62)

semble avoir un effet moyennement plus inhibant sur les quatre souches pathogènes.

L’effet majeur sur: Lis. monocytogenes est des surnageants natifs des souches: Lb. plantarum

(Lbl21, Lbl65), Lb. casei (Lbl55) et Lb. acidophilus(Lbl60). Celui sur: S. aureus, est exercé par

les surnageants natifs des souches: Lb. acidophilus(Lbl62) et Lb. plantarum (Lbl21). Tandis

que, sur: En. faecalis est celui exercé par le surnageant natif de la souche : Lb. plantarum

(Lbl22) et en fin sur: E. coli est des surnageants natifs des souches: Lb. acidophilus(Lbl62). En

comparaison avec les résultats de Kalalou et al., (2010), nos souches semblent être de bonne

inhibition vis-à-vis des souches pathogènes.

Tableau 9 : activité antagoniste des surnageants natifs des souches de Lactobacillus.

Diamètres des zones d’inhibition (mm)

Lis.

monocytogenes

S. aureus En. faecalis E. coli

Lb. plantarum (Lbl21) 15 16 12 16






Lb. casei (Lbl55) 15 15 13 13

Lb. acidophilus(Lbl61) 15 15 13 13

Lb. acidophilus(Lbl62) 13 17 14 17

Lb. cellobiosus (Lbl27) 14 15 12 14 µ


82

Figure 39 : activité inhibitrice des surnageants natifs des souches isolées sur les souches indicatrices pathogènes : 1-Listeria monocytogenes 33090, 2 –Staphylococcus aureus 25923, 3- Enterococcus faecalis 2035, 4- Escherichia coli 25922, successivement.

b. L’utilisation de surnageant neutralisé :

D’après le tableau10: seul le surnageant neutralisé. La souche Lb. plantarum (Lbl23) exerce

une activité inhibitrice vis-à-vis de Lis. monocytogenes, S. aureus et En. Faecalis, mais pas sur

E.coli. Contrairement à ce qu’on note sur l’inhibition passée. Aucun des autres surnageants

neutralisés n’a inhibé les souches indicatrices (figure 40).

De cela, on attribue l’inhibition des souches pathogènes à l’effet de l’acide lactique qui

diminue le pH du milieu. Entre autre, des tests supplémentaires sur la nature de l’agent

inhibiteur secrété par la souche Lb. plantarum (Lbl23) doivent être mis en évidence.

Tableau 10 : activité antagoniste des surnageants neutralisés :

Diamètres d’inhibition (mm)

Lis.

monocytogenes

S. aureus En. faecalis E. coli






Lb. casei (Lbl55) 00 00 00 00

Lb. casei (Lbl56) 00 00 00 00


Lb. helveticus (Lbl59) 00 00 00 00

Lb. acidophilus (Lbl61) 00 00 00 00

Lb. curvatus (Lbl63) 00 00 00 00


83

Figure 40: activité inhibitrice des surnageants neutralisés des souches isolées sur les souches indicatrices pathogènes : 1-Listeria monocytogenes 33090, 2 –Staphylococcus aureus 25923, 3- Enterococcus faecalis 2035, 4- Escherichia coli 25922, successivement.

3.8.2. Entre les souches de Lactobacillus :

Certaines souches ont une activité inhibitrice vis-à-vis des souches du même genre. Ce qui

est révélé par le résultat obtenu (tableau 11; figure 41). Toute zone supérieure à 02 mm est

prise en considération dans l’évaluation de l’inhibition.

Toutes les souches testées: Lb. plantarum (Lbl (21, 22, 23, 25, 26, 57), Lb. cellobiosus (Lbl27,

28), Lb. casei (Lbl55), Lb. curvatus (Lbl63) sont inhibées. Ainsi, celles fortement inhibées sont:

Lb. plantarum (Lbl21, 22, 25) et Lb. cellobiosus (Lbl28), les moins inhibées sont: Lb. plantarum

(Lbl23, Lbl26, Lbl65), Lb. casei (Lbl55, 57).

On note quelques cas de symbiose entre : Lb. plantarum (Lbl26) avec Lb. helveticus (Lbl59)

aussi bien qu’avec Lb. acidophilus (Lbl63) ; entre : Lb. curvatus (Lbl63) avec Lb. acidophilus

(Lbl61) et entre : Lb. plantarum (Lbl21) avec Lb. plantarum (Lbl26). Mise à part ces cas,

aucune autre souche ne présente de symbiose, ni avec les espèces des autres écosystèmes,

ni avec celles du même écosystème.

Le résultat obtenu est aussi figuré par Ali, (2010), qui s’est retrouvé face à de telles

interactions symbiotiques et inhibitrices ; entre différentes souches pré-identifiées toutes

comme étant: Lb. plantarum.

Figure 41 : interaction entre bactéries lactiques.


84

Tableau 11 : interactions entre bactéries lactiques.

Lbl23 Lbl25 Lbl26 Lbl65 Lbl27 Lbl28 Lbl55 Lbl57 Lbl63

Lb. plantarum(Lbl21) + _ _ _ _ _ _ _ _

Lb. plantarum (Lbl22) _ _ _ _ _ _ _ _ _

Lb. plantarum (Lbl23) _ _ _ + _ _ + _ _

Lb. plantarum (Lbl28) _ _ _ + _ _ + _ _

Lb. plantarum (Lbl57) _ _ _ _ _ _ _ _

Lb. casei (Lbl55) _ _ _ _ _ _ _ _

Lb. plantarum Lbl59) _ _ _ + _ _ _ _ _

Lb. casei (Lbl60) _ _ _ _ _ _ _ _ _

Lb.acidophilus(Lbl61) + _ _ + _ _ _ _ +

Lb.acidophilus(Lbl62) _ _ _ _ _ _ _ _ _

Lb. curvatus (Lbl63) _ _ _ _ _ _ _ _

Lb. curvatus(Lbl64) _ _ _ _ _ _ _ _ _

Significations : (-) : interaction négative, (+) : interaction positive.

3.9. Etude du pouvoir texturant :

3.9.1. Recherche de la production des EPS :

En se basant sur le phénotype des souches de Lactobacilles, dont on note la formation d’un

long filament visible, dès qu’on touche les colonies visqueuses, soit par une anse ou par

cure-dent stérile. Elle en témoigne une forte production d’EPS sur gélose (résultats tableau

12):

Sur milieu MRS les souches Lb. plantarum (LBL65, Lbl21, Lbl22, Lbl23, Lbl24, Lbl26, Lbl27,

Lbl28,) et Lb. curvatus (Lbl63), ont présenté le résultat désiré. Elles étaient très gluantes

(figure 42a) le filament a dépassé 15mm. Le reste des souches était à phénotype plutôt

crémeux. Les filaments étaient plus courts d’un environ 2mm, à part celle à aspect très sec

et rude Lactobacillus.spp (Lbl20). Elle était gardée comme témoin pour la non production.

Elle n’a pas poussé sur milieu lait gélosé au rouge de ruthénium (figure 42e), ni sur MRS à

5% sucrose (MRSs), ni sur milieu MSE du à la teneur en sucrose élevée.

Sur le milieu MRS modifié au sucrose et au lactose : l’aspect visqueux fut apparu chez les

souches Lbl (21, 22, 23, 25, 26, 27, 28, 56 59, 60) (figure 42b). Tandis que, les souches : Lbl

(55, 57, 58, 61, 62, 63, 64) et Lbl65 montrent un aspect plutôt crémeux que visqueux.


85

Sur milieu MSE, toutes les souches présentent un aspect visqueux avec formation de

filaments bien persistants (figure 35.d). Toutefois, les souches Lbl (58, 60, 61 et 63) forment

des filaments mais qui ne sont pas persistants. La souche Lbl24 est visqueuse sans

formation de filament. Cependant, aucune souche n’exhibe la production du dextrane

apparenté à celui de l’espèce: Lnc. mesenteroides.

Sachant que les bactéries lactiques sont connues pour produire des EPS, soit visqueux ou

non visqueux (Roger, 2010). La recherche de production élevée conduite sur milieu gélosé

se basant sur l’aspect, était fructueuse surtout sur milieu MSE et MRSs. Les souches ayant

présenté cet aspect semblent donc produire des EPS.

Sur milieu au rouge de ruthénium, toutes les souches marquent un aspect très visqueux.

Les colonies sont larges et gluantes (figure 42.f). La croissance sur ces milieux étudiés n’est

pas semblable chez toutes les souches de Lactobacillus isolées. Bien qu’elles présentent un

aspect visqueux, les souches Lbl59 et Lbl63 y forment de petites colonies. Le reste semble

résister au stress osmotique.


86

Tableau 12 : résultats de la recherche qualitative de production des EPS.

Significations : ± : le filament formé par touche à l’anse ne persiste pas trop longtemps (environ 2 secondes) ; + : le filament est persistant (5 secondes) ; ++ : le filament est bien persistant.


87

Figure a : aspect visqueux de la souche productrice d’EPS Lbl26 et test de Ruas et de los, (2005) ; du

filament visqueux sur le milieu gélosé de Man Rogosa et Sharpe.

Figure b : aspect muqueux de la souche Lbl56 sur Figure c : aspect des souches sur milieu MRS

MRS à 5% au lactose sucrose

Figure d: aspect sur milieu MSE et y formation de filament.

Figure e: aspect des souches sur milieu au rouge de ruthénium

Figures 42 : a, b, c, d, e : recherche qualitative de souches productrices d’EPS.

Lbl25

Lbl62

Lbl60

Lbl26

Lbl64 Lbl58

Lbl28

Lbl57


88

Figure f : à gauche : aspect des souches sur milieu Chalmers modifié au glucose et au fructose et à

droite formation de filament à partir du milieu Chalmers au lactose.

Figure g : aspect de la souche Lbl26 sur Chalmers modifié au sucrose.

Figure 43 f et g : recherche qualitative de souches productrices d’EPS sur milieu Chalmers.

Le développement de la croissance des souches sur milieu Chalmers était lent par rapport

aux autres étudiés pour cet effet. Certaines colonies ont pris la coloration du rouge neutre.

Elles montrent un aspect visqueux après trois jours d’incubation et marquent la formation

du long filament. A partir du fructose et lactose (figure 43.g), toutes les souches marquent

formation du filament dès qu’on touche à l’aide d’une anse ou d’un cure-dent stérile

(figure 43.f). Cependant à partir du sucrose et glucose; seules les souches Lbl25 et Lbl59

n’exhibent pas d’aspect visqueux (tableau13)

Lbl22

Lbl60

Lbl62

Lbl24


89

Tableau 13 : formation d’EPS sur milieu Chalmers agar modifié.

Significations : - : pas de filament formé ; + : le filament est formé ; ++ : le filament est bien persistant.

Test de Lingani (2010) :

En se référant au tube T qui témoigne d’un milieu MRS sans peptone à 5% sucrose stérile

sur lequel le même procédé d’extraction était appliqué ; sachant que le milieu contient de

l’extrait de levure ; les souches Lb. plantarum (Lbl22, Lbl26, et Lbl65), Lb. cellobiosus (Lbl27,

Lbl28) marquent un lien opaque important à l’interface (tableau 14 ; figure 44) ; elles sont

classées en premier puis se classent les différentes autres souches de Lactobacillus (Lbl24,

Lbl55, Lbl56, Lbl57, Lbl61, Lbl62 , Lbl63 et Lbl64). La souche Lb. plantarum (Lbl24) présente

le lien opaque le plus faible.

Contrairement à ce qu’on note sur milieu gélosé à-propos de la viscosité des souches. Ce

test met en évidence l’inégalité dans la production des EPS par rapport aux souches isolées

des margines qui semblent être toutes fortement productrices. Cependant, les souches de

Lb. plantarum (Lbl65, Lbl27 et Lbl28) qui avaient un aspect plutôt crémeux que visqueux ;

sont parmi les mieux classées.

Figure 44 : résultat du test estimatif de production des EPS.

T


90

Tableau 14 : les résultats du test de Lingani et al., (2010).

Souches Intensité du

lien opaque

des EPS


lien opaque

des EPS


Lien opaque

des EPS

Lbl21 ++ Lbl55 ++ Lbl63 ++

Lbl 22 ++ Lbl56 ++ Lbl64 +

Lbl23 + Lbl57 ++ Lbl65 ++

Lbl24 ± Lbl58 +

Lbl25 + Lbl59 ++

Lbl26 ++ Lbl60 ++

Lbl27 ++ Lbl61 +

Lbl28 ++ Lbl62 ++

Sur lait écrémé :

L’étude de la production d’EPS, celle du caractère visqueux, ainsi que, du gel formé sont

résumées dans le tableau 15. On note chez les souches Lb. plantarum (Lbl23, LbL26, Lbl57),

Lb. acidophilus (Lbl61) et Lb. curvatus (Lbl63) un aspect épais et ferme du coagulum, du à la

viscosité très élevée par l’accumulation des EPS. Accompagnée d’une très grande rétention

du lactosérum (figure 45). Ainsi ; on considère les souches très performantes. Cependant,

la fermeté du coagulum est moins grande chez les souches Lb. plantarum Lbl (27, 65 et 57)

bien qu’il y eu parfois une présence de viscosité (Voir tableau ci-dessous).

Les différents résultats obtenus aident à comprendre l’effet des EPS sur la viscosité du lait,

certaines souches (Lb. cellobiosus (Lbl27 et Lbl28), Lb. casei (Lbl(55,56) et Lb. plantarum

(Lbl65), sont classées parmi celles fortement productrices d’EPS, sauf que l’effet de leur

EPS produits sur la modulation de la viscosité n’est pas considérable. Mais, ceci n’empêche

pas qu’il y eu une forte rétention d’eau; ce qui explique l’opinion de ceux qui disent que la

quantité d’EPS ne suffit pas ; c’est plutôt sa structure.


91

Figure 45 : aspect du gel formé sur lait écrémé par les souches Lbl23, Lbl26 et Lbl 27.


92

Tableau 15 : caractères visqueux des EPS dans le lait fermenté par les Lactobacilles.

Souches :

Caractère

visqueux des

EPS dans le lait

formation de

filament

Rétention de

lactosérum

Aspect du

coagulum formé

Lbl21 + - forte Coagulum dense

Lbl22 + - Forte Coagulum dense

Lbl23 + + Forte Coagulum dense

Lbl25 + - faible Petit coagulum

Lbl26 + + Forte Coagulum dense

Lbl27 - - Forte Coagulum dense




Lbl57 + + Forte Petit coagulum

Lbl59 - - Moyenne Petit coagulum

Lbl60 - - Faible Petit coagulum


Lbl62 - - Faible Coagulum dense



Lbl65 - - Forte Petit coagulum

Test d’estimation de la production des EPS :

La méthode de recherche de production d’EPS est aussi fructueuse. La précipitation a

permis d’évaluer à vu d’œil (figure 46) et à partir de plusieurs sources de carbone dans le

milieu, le rendement en EPS (figure 47). La souche la moins productrice à 30°C est Lb.

plantarum (Lbl24) ; ce qui a été déjà noté dans le test de Lingani et al., (2010). La souche Lb.

plantarum (Lbl26) reste la plus fortement productrice (voir tableau 16).


93

Tableau 16 : rendement en production des EPS en mg de masse sèche/ml.

Souches

Sources de carbone

Glucose Lactose Sucrose Fructose

Lbl24 < 1 < 1 < 1 < 1

Lbl26 1.0 1.1 1.2 1.0

Lbl59 < 1 < 1 < 1 < 1

Lbl60 < 1 < 1 < 1 < 1

Lbl61 < 1 1.0 1.0 < 1

Lbl63 < 1 1.0 < 1 < 1

Figure 46 : précipitation des EPS à l’éthanol.

Figure 47 : résultats du séchage des differents EPS après précipitation à l’éthanol.

3.9.2. Quantification des EPS purifiés:

Le résultat dans le tableau 17, illustre ce qui est obtenu par méthodes qualitatives. Il éclairci

la distinction entre les différents aspects phénotypiques des souches de Lactobacillus. La

souche : Lb. plantarum (Lbl26) demeure ainsi la plus fortement productrice ; puis se classe la

souche : Lb. plantarum (Lbl57), la souche Lb. acidophilus (Lbl61), Lb. curvatus (Lbl63), Lb.

plantarum (Lbl25) et en dernier vint : Lb. plantarum (Lbl22).

Lbl63 Lac

T Glu

Suc FRU

Lac Lbl62Glu

Suc FRU


94

Tableau17 : taux de production des EPS quantifiés selon Dubois (1956) (en g/l).

4. Etude de la cinétique de croissance des souches Lb. plantarum (Lbl26), Lb.plantarum

(Lbl57)et Lb.acidophilus(Lbl61) :

En analysant les résultats obtenus (figure 48B) sur MRS à pH 5.4±0.2 à 30°C. On remarque

que la souche Lb. acidophilus (Lbl61) est la plus rapide, vu qu’elle se développe chaque

heure, avec un taux de croissance (µ3) de 0.65 h-1. En seconde place, se situe la souche Lb.

plantarum (Lbl26), qui se dédouble toutes les deux heures avec un taux (µ1) de 0. 297 h-1.

Pendant que, la souche Lb. plantarum (Lbl57) se dédouble toutes les trois heures avec un

taux de croissance (µ2) de 0.235 h-1.

La souche Lb. plantarum (Lbl57) présente une cinétique de croissance proche à celle de Lb.

plantarum (Lbl26), de même pour la cinétique d’acidification sur MRS. La souche Lb.

acidophilus (Lbl61) diffère en développement cellulaire, ainsi, en acidification sur milieu

MRS elle est moins acidifiante.

Figure 48 A et B: cinétique de croissance et d’acidification sur MRS des souches : Lb. plantarum (Lbl26), Lb. plantarum (Lbl57) et Lb. acidophilus (Lbl61).

5. Etude de la cinétique de production des EPS en fonction de la croissance bactérienne

chez Lb.plantarum (Lbl26):

D’après la courbe de croissance de la souche Lb. plantarum (Lbl26) (figure 49) sur milieu

MRSs à 30°C. On note un développement cellulaire différent à celui étudié sur MRS à 30°C.

Puisque le taux de génération spécifique µ1’ (0.247 h-1) est plus faible par rapport à µ1 (sur

0

1

2

3

4

5

6

0 2 4 6 18 24

pH

Temps (h)

B

Lbl61

Lbl57

Lbl26

A


95

milieu MRS) avec une différence de 0.05 h-1. Ce qui fait que le temps de génération

pratique G1’ devienne 2h 80 min ; ce qui signifie qu’on a un retard de 45min de génération.

La cinétique de production des EPS diffère de la cinétique de croissance (tableau 18); le

taux d’EPS à T0 était 1.88g /l. Il atteint son maximum à 24h. Il réduit après 48h pour arriver

à 9.10 g/l.

Tableau 18 : cinétique de la production des EPS en fonction de la croissance.

Lb. plantarum (Lbl26)

0h 3h 6h 18h 48h

Quantité d’EPS (g/L) 1.88 3.12 4. 34 11.2 9.10

Log10 Cfu/ml 7.87 8.31 8 .51 9.86 10.12

Figure 49 : cinétique de la production des EPS en fonction de la croissance de la souche Lb. plantarum (Lbl26) sur MRSs.

6. Optimisation des conditions de la production des EPS chez Lb.plantarum (Lbl26) :

Le développement de la souche Lb. plantarum (Lbl26), sous des conditions définies : 23°C,

en anaérobiose sur MRSs aux deux pH testés (pH 5.4 et pH 6.2) et après 48h d’incubation,

demeure très faible, vue que le trouble ne soit pas intense ; en comparaison avec ceux

obtenus dans les autres milieux (MRSG, MRSF et MRSL), sous les autres conditions de

croissance : pH 5.4, pH 6.2 à 23°C et à 30°C.

L’analyse de la figure 50 fournit des informations sur le comportement producteur d’EPS

en fonction de différentes conditions. A une température de 23°C sur MRSs à pH 5.4 la

production des EPS chez la souche Lb. plantarum (Lbl26), est plus élevée que sur MRSs à

pH 6.2. Ainsi, elle représente la valeur maximale atteinte (12.14 g/l). Alors, qu’à 30°C. Elle

produit huit fois beaucoup plus à partir du pH 5.4 que du pH 6.2.


96

A 23°C sur MRSL et MRSG à pH 5.4 la production d’EPS reste toujours élevée, presque dix

fois plus avec le même pH à 30°C.

A 23°C à pH 6.2 sur MRSL et MRSG, le taux d’EPS produits diminue. Il devient bas pour

atteindre une valeur d’environ : 0.8g/l. Alors qu’à 30°C à partir du MRSL et MRSG la

production atteint son minimum (0.62 g/l).

Sur 12 combinaisons (figure 50); la combinaison (T°=23°C, MRSs, pH 5.4) est la meilleure

pour une production d’un taux maximal d’EPS, chez la souche Lb. plantarum (Lbl26). On les

considère comme conditions optimales pour un meilleur rendement. . On a déjà noté un

tel effet de la source de carbone sur la croissance aussi bien que sur la production des EPS

chez la souche Lb. reteuri ATCC 55730, (Årsköld et al., 2007), ou la meilleure combinaison

est (T°=37°C, pH4.5 et à 100g/l de sucrose) pour un rendement de 0.5g/g en EPS. Comme

chez la souche Lb. paracasei HCT, un privilège au glucose comme source de carbone est

noté (le maximum de sa production d’EPS a atteint 23.78g/l). Alors que le sucrose ne lui a

pas conféré un bon rendement (Xu et al., 2010).

Figure 50 : étude de l’optimisation des conditions de la production des EPS chez Lb. plantarum (Lbl26).

7. Etude de quelques aptitides probiotiques :

7.1. La résistance aux antibiotiques :

Les souches présentant un diamètre de zone d’inhibition (figure 51 ; tableau 19) supérieur à

15mm sont considérées comme sensibles.

En analysant le tableau ci-dessous, on distingue que toutes les souches testées (Lbl22,

Lbl24, Lbl26, Lbl57, Lbl60 et Lbl61) résistent à la pénicilline à 6µg, l’ampicilline 10, la

Vancomycine et la Fosfomycine 50, l’acide nalidixique, elles sont sensibles à l’Amoxicilline,


97

l’Azithromycine, l’acide fusidique, la Cifotaxime, et la Pénicilline 10. Le comportement des

souches vis-à-vis du reste des antibiotiques était différent. Elles résistent à la gentamicine

contrairement aux souches Lb. acidophilus (Lbl61) et Lb. plantarum (Lbl24). Cependant, elles

sont inhibées par l’oxacilline à part les souches Lb. plantarum (Lbl22) et Lb. casei (Lbl60) qui

en résistent.

Les résistances notées sur la souche Lb. casei (Lbl60) à la Vancomycine, la Gentamycine et

l’Oxacilline sont naturelles. Comme l’a mentionné Belleti et al., (2009). Ainsi, sa résistance à

l’Ampicilline a aussi été notée par Herreros et al., (2005).

Figure 51: antibiogramme de la souche Lb. casei (Lbl60).

Tableau 19: résultats de la résistance et la sensibilité aux antibiotiques.

Antibiotiques

Souches

P10

P

Amx

Ox

Am

Azm

Va

Gm

Ctx

FA

Fos

AN

Lbl22 S R S S R S R R S S R R

Lbl24 S R S S R S R S S S R R

Lbl26 S R S I R S R R S S R R

Lbl57 S R S I R S R R S S R R

Lbl60 S R S R S I R R S S R R

Lbl61 S R S S R I R S S S R R

(R): résistante ; (I) intermédiaire ; (S): sensible.

7.2. Tolérance à l’acidité :

D’après ce qu’on note dans le tableau 20 sur la survie des souches testées : Lb. plantarum

(Lbl23, Lbl26), Lb. acidophilus (Lbl61) (figure 52) et Lb. curvatus (Lbl63) elles sont

caractérisées par une bonne tolérance à l’acidité qui est en moyenne supérieure à 85%. La

souche Lb. plantarum (Lbl23) est la plus résistante avec un taux de 99.98%. Le reste des


98

souches Lb. plantarum (Lbl26) Lb. acidophilus (Lbl61) et Lb. curvatus (Lbl63) survie avec des

taux de 96.24, 86.69, 85.87%, successivement.

Sur le milieu MRS témoin à pH (5.4) (voir tableau 20), le taux de survie est supérieur à

100%, ce qui affirme un bon développement cellulaire.

Généralement, le taux de croissance diminue avec la diminution du pH. On note

cependant, une survie des souches pendant deux heures qui n’est pas négligeable (Kacem

et Karam, 2006).

Tableau 20: survie des souches à pH 2.

Souches :

Lbl23 Lbl26 Lbl61 Lbl63

pH 2 pH5.4 pH 2 pH5.4 pH 2 pH5.4 pH 2 pH5.4

Taux de survie (%) 99.98 106 96.24 101.8 86.69 101.2 85.87 102

Figure 52 : résistance à l’acidité après 2h par la souche Lb. acidophilus (Lbl61).

7.3. Résistance aux sels biliaires :

Sur l’ensemble des souches testées aucune ne survie sur MRS à 5% de sels biliaires à pH 2

(voir tableau 21). De ce fait; le taux de viabilité est nul chez les quatre souches : Lb.

plantarum (Lbl23, Lbl26) Lb. acidophilus (Lbl61) et Lb. curvatus (Lbl63).

Néanmoins ; a pH 8,5 et sur le même milieu le résultat est tout à fait différent. Les souches

y résistent avec des taux de survie élevés après deux heures d’incubation. Or la souche Lb.

plantarum (Lbl23) est considérée la plus apte à survivre avec un taux de 98.76 %(figure 53)

Le reste des souches Lb. plantarum (Lbl26), Lb. plantarum (Lbl 57) Lb. acidophilus (Lbl61) et

Lb. curvatus (Lbl63) survive avec des taux de 98.44, 96.00, 97.03 et 90.00, successivement.


99

Tableau 21: viabilité des souches sur milieu à 5% de sels biliaires.

Lbl23 Lbl26 Lbl57 Lbl61 Lbl63

pH2 pH 8.5 pH2 pH8.5 pH2 pH8.5 pH2 pH8.5 pH2 pH8.5

Taux de

viabilité (%)

00 98.76 00 98.44 00 96.00 00 97.03 00 90.00

Figure 53: viabilité de la souche : Lb. plantarum (Lbl23) sur MRS aux sels biliaires après 2h.

Figure 54 : viabilité des souches aux conditions extrêmes.

D discussion générale

100

On note une diversité en espèces de Lactobacilles isolées. L’échantillon de Klila. C’est une

niche écologique riche en bactéries lactiques. Elle héberge diverses espèces parmi

lesquelles celles retenues dans notre étude: Lb. casei, Lb. plantarum et Lb. helveticus. Les

margines d’olive fermentées aussi contiennent des bactéries lactiques. Les espèces

prédominantes sont : Lb. plantarum, Lb. brevis, Lb. Casei subsp casei, Lnc. mesenteroides, Lnc.

dextranicum et Pediococcus cerevisiae. Parfois, la présence de l’espèce du genre : Enterococcus

a été constatée (Asehraou et al., 1993 ; Campaniello et al., 2005). Le Raib est très riche en

bactéries lactiques (Taylor et al., 2006). Cependant, les seules retenues appartiennent à

l’espèce : Lb. acidophilus. Le levain de panification est riche en espèces de bactéries lactiques

parmi lesquelles Lb.sanfransiscensis, Lb. plantarum, Lb. salivarius, Lb. coryneformis. Lb casei, Lb.

farciminis, Lb. cellobiosus, Lb. brevis, Lb. fermentum, plus les pediocoques et Leuconostoc (Onno

et al., 2009).

Les souches indigènes de Lactobacillus isolées, ont présenté plusieurs caractères

technologiques désirables à savoir: la production de composés aromatiques, la

fermentation du citrate, la résistance au stress halin. Elles sont protéolytiques,

lipolytiques, acidifiantes et inhibent la croissance des germes pathogènes référenciés qui

ont été testés: E. coli ATCC 29232, E. faecalis ATCC 2035, Lis. monocytogenes ATCC 33090 et

S. aureus ATCC 25923. Toutefois; en éliminant l’effet de l’acidité par neutralisation du

surnageant. L’inhibition des souches pathogènes n’est pas apparue. Ainsi, une inhibition

par la production d’acides organiques est la plus estimée. Mise à part par le surnageant

neutralisé de la souche Lb. plantarum (Lbl23), qui exerce un effet inhibiteur sur les souches

pathogènes mais pas sur l’espèce: E. coli.

Les souches pathogènes S. aureus ; E. coli sont responsables des toxi-infections alimentaires

individuelles et collectives (TIAC), par la production d’enterotoxines qui résistent au suc

digestif ; parfois même thermostables (Avril .J et al., 1992). Lis.monocytogenes et Ent.

Faecalis sont aussi des microbes pathogènes de grande préoccupation.

Les souches de Lactobacillus résistantes au sel peuvent présenter un intérêt technologique.

Elles pourraient en effet bien être testées pour transformer le lait, ou encore dans des

fermentations de produits salés (fromages salés, olives, concombres, viandes, …).

Pour la croissance à différents pH: acide (pH4), neutre (pH6.8) et alcalin (pH9), les souches

montrent une aptitude de s’adapter aux changements du pH du milieu de développement.

Discussion générale

101

A pH 4, toutes les souches s’y développent. Elles sont donc aptes à prédominer les

substrats naturels ayant atteint un pH bas, pour, déclencher une fermentation spontanée

naturelle. A pH 9, les souches sont toujours capables à se développer. Ceci leur offre une

capacité d’être ubiquiste.

La confrontation entre les mêmes espèces de bactéries lactiques et les différentes espèces

appartenant au même genre (Lactobacillus), a révélé une diversité d’interactions soit

symbiotique ou inhibitrice. Cette dernière oriente vers la possibilité de production de

substances proches des bactériocines et ce qui diminue la possibilité de les exploiter

comme ferments mixtes.

Au-delà de leurs caractères originaux, les souches exhibent une production d’EPS

considérable. La capacité de production d’exopolysaccharides (EPS) par des souches de

bactéries lactiques isolées de levain de panification a été mise en évidence récemment. Ces

EPS correspondent à des homopolysaccharides composés de glucose (glucanes) ou de

fructose (fructanes). Ils sont synthétisés à partir de saccharose par des glycane-saccharases.

Il semble que ces polymères permettent d’améliorer la rhéologie des pâtes, la texture des

produits et de limiter les phénomènes de rassissement des produits céréaliers ; notamment,

par leur propriété d’hydrocolloïdes (Tieking et al., 2003; Marie et al., 2010; Palomba, 2012).

Parmi les effets bénéfiques des levains de panification sur la qualité du pain citons: le

retard du rassissement, l'augmentation de l'acidité, la protection contre les moisissures,

l'abaissement de l'index glycémique et l'amélioration du flaveur et de la texture (De

Vuyst et al., 2002).

Sur un ensemble de souches analysées, les souches Lb. plantarum (Lbl (21, 22, 23, 25, 26, 27

et 28), Lb. casei (Lbl56, 58 et 60) ont présenté un phénotype très visqueux sur différents

milieux de culture contenant du saccharose à concentration élevée. On a déjà marqué la

production des EPS par les espèces Lb. plantarum, Lb. casei et Lb. acidophilus (Wang, 2010 ;

Ismail et Nampoothiri, 2013, Fguiri et al., 2015).

En générale on inspecte la production des EPS principalement par les méthodes

qualitatives guidées, sur des milieux gélosés (MRS, MSE, milieu au rouge de

ruthénium…).On note trois types d’aspects de colonies sur milieux aux taux élevés en

sucre : soit muqueux, visqueux ou crémeux.


102

Ces milieux modifiés gélosés aux taux élevés en source de carbone permettent une

sélection préliminaire des souches pouvant produire des EPS. Cependant, l’aspect

visqueux des souches ne suffit pas à affirmer la production d’EPS libres dans le milieu de

culture et les EPS synthétisés par les bactéries lactiques peuvent être soit visqueux ou non

visqueux. Parfois même, ce sont les EPS capsulaires qui en donnent la texture visqueuse ;

donc pour une extraction globale des méthodes de sonification et de lyse cellulaire doivent

être employées (Sanchez et al., 2006).

On a postulé que l’habilité de moduler la viscosité est corrélée plutôt avec la structure des

EPS (composition du monosaccharide, charge, poids moléculaire, degré d’embranchement

et rigidité du squelette) et leur interaction avec les composants du lait (notamment les

protéines), qu’avec leur quantité produite en (Duboc et Mollet, 2001; Gentes, 2011).

Looijesteijn et al. (2001) ont rapporté qu’au sein d’une même espèce de bactéries lactiques,

les résultats peuvent être différents. On a pu identifier des souches productrices d’EPS

(voire très fortement) et des souches non productrices sans que ce caractère n’engendre des

disparités de croissance.

D’après l’étude de la production des EPS en fonction de la croissance bactérienne et

l’optimisation des conditions de la production des EPS. On déduit que, la production est

affectée par plusieurs paramètres à savoir la température d’incubation, la durée

d’incubation, le pH du milieu, la concentration de la source de carbone induite et la phase

de croissance. Cependant, à une température de croissance sous l’optimale, à pH acide, à

des taux trop élevés en source de carbone, la souche Lb. plantarum (Lbl26) exhibe une

production immense inattendue.

La production semble commencer à une phase de croissance avancée (6h) pour atteindre

son maximum (entre 18 à 28h). Comme chez la grande majorité des travaux réalisés sauf

quelques exceptions notées pour des espèces qui en produisent durant toutes les phases de

croissance (Dupont, 1998 ; Schutten et al., 1999 ; Aslim, 2005 ; Xu et al., 2010)

Le sucrose et le lactose sont de bonnes sources de carbone, favorisant un bon rendement en

EPS à une température de 23°C à pH 5.4. Le glucose aussi donne un bon rendement à30°C

à pH 5.4 (0.87g/l) par rapport à ce qui a été rapporté dans les travaux publiés (Schutten et

al., 1999).


103

Toutes les souches de Lactobacillus testées exhibent une résistance à au moins deux

antibiotiques ce qui est conforme aux résultats de kyriacou et al., (2008) qui a trouvé que Lb.

acidophilus résiste à un jusqu’à trois antibiotiques testés. Généralement, les Lactobacilles

ont une sensibilité envers les inhibiteurs de la synthèse de la paroi cellulaire comme les

pénicillines rencontrée chez des espèces utilisées comme probiotiques ou des cultures

starter des espèces du tractus intestinal humain; mais encore plus résistants aux

céphalosporines. Comme ils ont une résistance naturelle élevée à l’acide fusidique,

gentamycine et la Vancomycine; sauf qu’une telle résistance intrinsèque codée sur le

plasmide est habituellement non transmissible (Zhou et al.2005; Snezara et Zora, 2011).

Les quatre souches sélectionnées qui sont testées pour la résistance à pH très acide (pH 2),

marquent un taux de viabilité qui est notable aussi bien que sur MRS à 0.5M de sels

biliaires (figure 54). On attribue leur résistance lors du passage à travers le tractus gastro-

intestinal à leur capacité de produire des EPS (Lindström et al. 2012) et puisque les

résistances aux antibiotiques testées qui sont déjà mentionnées dans la littérature comme

étant normales, avec une étude de caractères probiotiques supplémentaire (adhésion

cellulaire), ont pourra affirmer leur performance et la possibilité de les investir autant que

des probiotiques au sein des aliments fonctionnels avec des propriétés d’amélioration de la

santé par la production de prébiotiques . Car les EPS possèdent le potentiel à contribuer à

la santé humaine comme prébiotiques ou par leurs activités antitummorales,

antiulcériennes, immunomodulatrices ou réductrices de cholestérol. Mise à part la leur

effet sur la texture et la rhéologie (Ismail et Nampoothiri, 2013, Fguiri et al.,2015).

Conclusion

104

La grande diversité de l’habitat explique pourquoi les lactobacilles sont utilisés pour la

production de nombreux produits fermentés traditionnels.

On note sur les méthodes qualitatives qui sont probablement plus faciles, une incapacité

de détecter les souches visqueuses à faible taux de production.

Cependant, le test de Lingani permet de marquer une estimation approximative sur la

production d’EPS, en se basant sur la précipitation à l’éthanol. Comme il permet aussi une

sélection préliminaire des souches fortement productrices. Mais, ceci n’empêche pas que la

méthode colorimétrique de Dubois reste rapide, simple et surtout la plus fiable.

Cependant, lorsqu’on combine entre l’aspect phénotypique et la quantification précise, on

déduit que les souches qui ne présentent pas de filaments ne produisent pas de grandes

quantités d’EPS. Malgré qu’elles présentent un aspect visqueux. Cas de la souche : Lb.

plantarum (Lbl24). Elle a été gardée pour une comparaison de production avec les autres

isolats de Lactobacillus.

L’appréciation de la structure du lait fermenté (type de coagulum : ferme, non ferme,

dense, rétention du lactosérum, sa taille…), confère la distinction et la bonne

compréhension de la liaison structure-fonction des molécules d’EPS produits par les

souches lactiques étudiées, ainsi leur interaction avec les protéines.

Les paramètres étudiés dans l’optimisation de la production des EPS : température

d’incubation, durée d’incubation, pH du milieu de culture (conditions

environnementales) , nature et concentration de la source da carbone (conditions

nutritionnelles) et phase de croissance (conditions physiologiques), se sont apparus des

paramètres abruptes ; affectant la cinétique de la production des EPS ; aussi bien, que la

rentabilité.

Dans cette étude, le paramètre source de carbone a un effet notable sur la croissance, aussi

bien, que le rendement en EPS. Ainsi, le sucrose est la source de carbone la plus rentable

mais qui ne joue pas un bon facteur de croissance, puisqu’il, ralentit le développement

cellulaire de la souche Lb. plantarum (Lbl26). Le Lactose est la deuxième source de carbone

qui confère un bon rendement à des conditions bien définies.

Conclusion

105

Les travaux publiés examinant l’effet de la température sur la production des EPS par les

bactéries lactiques sont contradictoires ; dont certains rapportent une production immense

à température de croissance sub-optimale. Alors que, d’autres travaux suggèrent que la

majorité des EPS soit produite à des températures de croissance inferieures à l’optimale. Ce

qui a été clairement noté d’après le résultat d’optimisation de la production des EPS chez la

souche Lb. plantarum (Lbl26). A cet effet, on note une anomalie dans la littérature pour la

variété des raisons, concernant les différentes méthodes à mesurer les EPS, différents

milieux de culture, les conditions et les temps de mesure, plusieurs façons à exprimer la

production des EPS (mg d’EPS, mg EPS/l, mg EPS/cfu)…

Les EPS obtenus des souches peuvent être des candidats excellents pour la production des

aliments fonctionnels avec allégation santé.

Références bibliographiques

106

Adebayo .C.O and Aderiye. B.I. 2010. Antifungal activity of bacteriocins of lactic acid

bacteria from some Nigerian fermented foods.Research journal of microbiology .5(11).1070-

1082.

Ahmed.Z, Wang.Y, Anjum.N, Ahmad.H, Ahmad.A et Raza.M. 2013. Characterization of

new exopolysaccharides produced by coculturing of L. kefiranofaciens with yoghurt strains.

International Journal of Biological Macromolecules.59: 377– 383.

Alain LS.2004.Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria against microbial

pathogens.FEMS MicrobiologyReviews .28.405–440;

Ammor MS.2004.Ecosysteme microbien d’un atelier fermier de salaison : Identification et

propriétés des bactéries lactiques, école doctorale vie-agro-santé, 177Balice V.

Annika.M.M et Marc.B.2004. Industrial Use and Production of Lactic Acid Bacteria. Ed

Marcel Dekker,

Asehraou.A, Faid.M and Akhratouf.R.1993. pure culture fermentation of green olives by

Lactobacillus strains. Microbiologie -Aliments –Nutrition.11:221-228.

Aslim.B, Yu ksekdag.Z.N, Beyatli.Y and Mercan.N. 2005. Exopolysaccharide production by

Lactobacillus delbruckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus strains under different

growth conditions. World Journal of Microbiology & Biotechnology. 21:673–677.

Avril. J. L, Dabernat. H, Denis. F et Monteil. H. 1992. Bactériologie Clinique. Ellipses.

Axelsson. L. 2004. Lactic Acid Bacteria: Classification and Physiology. In Lactic acid

bacteria, Microbiological and Functional Aspect. Third Edition. Marcel Dekker.

Badel.S, Bernardi.T and Michaud .P. 2011. New perspectives for Lactobacilli

exopolysaccharides. Biotechnology Advances: 29. P 54–66.

Barefoot .S.F et Klaenhammer T.R. 1983. Detection and activity of lacticin B, a bacteriocin

produced by lactobacillus acidophilus. App. Env. Microbiol. 45 : 1808-1815.

Belal.J.M, Zaiton.H,and Sajaa .K.S.2011.Antifungal activity of Lactobacillus fermentum

TE007,Pediococcus pentosaceus Te010, Lactobacillus pentosus G004 and L.paracasei D5 on

selected foods .Journal of food science .V76.N7.M493-M499.


107

Boumehira.A.Z.2010. Identification et caractérisation technologique et fonctionnelle des

souches Lactobacillus plantarum isolées du lait cru de chèvre et de chamelle. Thèse de

doctorat. Faculté des Sciences ES-Senia.

Bouzar, Fm, Cerning, J., Desmazeaud, M. 1997. Exopolysaccharide production and texture-

promoting abilities of mixed-strain starter cultures in yogurt production. Journal of Dairy

Science.80: 2310-2317.

Bresin.A, Rinaudo.M, Heyraud.A, Santaella.C, Baynast.R D et Heulin.T.2008 .Production

industrielle d’un polysaccharide bactérien luttant contre le stress hydrique. Innovation 104

TECHNO 1-7.

Carr. F. J, Chill. D, et Maida. N. 2002.The Lactic Acid Bacteria: A Literature Survey. Critical

Reviews in Microbiology, 28(4):281–370.

Campaniello.D, Bevilacqua.A, D’amato.D, Corbo.M.R, Altieri.C and Sinigaglia.M. 2005.

Microbial characterization of table olives: processed According to Spanish and Natural

Styles. Food Technology and Biotechnology.43: (3):289-294.

Cerning, J. 1990. Exocellular polysaccharides produced by lactic acid bacteria. Microbiol.

Rev. 87:113-130.

Chaplin M. F.2008. Carbohydrate Analysis in: Encyclopedia of analytical chemistry by

Meyers.R.A. John Wiley & Sons Ltd.

Cocolin .L and Ercolini. D. 2008 .Molecular Techniques in the Microbial Ecology of

Fermented Foods. Food microbiology and food safety series.Springer Science+Business

Media, LLC. sequencing of 16S rRNA. FEMS Microbiology Letters 77, 5-12.

De Man. J.C, Rogosa. M, et Sharpe. M.E. 1960. A medium for the cultivation of lactobacilli.

J. Appl. acteriol. 23, 130-135

De Vuyst.L and Degeest.B. 1999. Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria. FEMS

Microbiol. Rev. 23:157–177.

De Vuyst.L, De Vin.F, Vaningelgem.F and Degeest.B. 2001. Recent developments in the

biosynthesis and applications of heteropolysaccharides from lactic acid bacteria. Int. Dairy

J. 11:687–707.


108

Degeest, B. and L. De Vuyst. 1999. Indication that the nitrogen source influences both

amount and size of exopolysaccharides produced by Streptococcus thermophilus LY03 and

modelling of the bacterial growth and exopolysaccharide production in a complex

medium.Appl. Environ. Microbiol. 65:2863– 2870.

Degeest, B., Mozzi, F. and De Vuyst, L.2002. Effect of medium composition and

temperature and pH changes on exopolysaccharide yields and stability during

Streptococcus thermophilus LY03fermentations. Int J Food Microbiol 79, 161–174.

DoguietKDenis D.2010. Biocontrôle des moisissures du genre Fusarium productrices de

fumonisines par sélection de bactéries lactiques autochtones de maïs. Thèse de doctorat

université Bordereaux école doctorale science de la vie et de la sante.

Dupont.I.1998. Identification moléculaire de souches de lactobacilles productrices

d'exopolysaccharides et comparaison de la production d'exopolysaccharides par trois de

ces souches. 'Université Laval, Faculté des études supérieures.

Duboc.P and Mollet. B.2001. Applications of exopolysaccharides in the dairy industry. Int.

Dairy J. 11:759-768.

Dubois.M, Gilles. K. A, Hamilton.J.K and Rebers.P.A. 1956. Colorimetric method for

determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28:350–356.

Farnworth.E.R.2005. Kefir – a complex probiotic. Food Science and Technology Bulletin:

Functional Foods 2 (1) 1–17.

Franz.C.M, Du Toit.M, Olasupo.N.A, Schillinger.U, Holzapfel.W.H.1998. Plantaricin D, a

bacteriocin produced by Lactobacillus plantarum BFE 905 ready-to-eat salad. Lett Appl

Microbiol.26(3):231-5.

Fguiri.I, Ziadi.M, Atigui.M, Ayeb.N, Arroum.S, Assadi.M et Lorchani.T. 2015. Isolation and

production of EPS from camel milk. International journal of dairy technology.68:1-11.

Fleming .H.P, Etchells .J.L et Costilow.R.N. 1975. Microbial inhibition of isolates of

Pediococcus from cucumber brine. Appl. Env. Microbiol. 30 : 1040-1042.


109

Gentès.M.C, Daniel .S.G et Sylvie. L. T.2011. Gel formation and rheological properties of

fermented milk with in situ exopolysaccharide production by lactic acid bacteria. Dairy Sci.

& Technol. 90: 645–661.

Gevers.D, Huys.G and Swings.J.2001.Applicability of rep-PCR fingerprinting for

identification of Lactobacillus species.FEMSMicrobiol. Lett.205: 31–36.

Hames.B.D, Hooper.N.M et Houghton.J.D. 2006. Biochimie. Port royal livres, Paris.

Hammes.W.P et Hertel.C. 2006. The Genera Lactobacillus and Carnobacterium in

Prokaryotes. 4th edition.

Hassan. A.N, Frank .J.F and Qvist. K.B. 2002. Direct Observation of Bacterial

Exopolysaccharides in Dairy Products Using Confocal Scanning Laser Microscopy. J. Dairy

Sci. 85:1705–1708.

Herreros. M. A., Sandoval.H, Gonzalez.L, Castro.J.M, Fresno.M.E. 2005.

TornadijoAntimicrobial activity and antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated

from Armada cheese (a Spanish goats’ milk cheese). Food Microbiology; 22: 455–459.

Ho Thi Nguyet T .2008 .Etude de la flore lactique du Nem Chua, produit carne fermente

cru traditionnel du sud vietnamien et maitrise du processus de fermentation par ajout des

souches lactiques sélectionnées spécifiques du produit. L’université Bordeaux école

doctorale de science de la vie et de la santé. N° d’ordre : 3738 ; 201.

Hydrominus.B , Le Marrec.P, Hadj Sassi.A et Deschamps.A.2000. Acid and bile tolérance of

spore forming lactic acid bacteria. Int.J.Food Microbiol.61:193-197.

Hutkins. R.W. 2006.Microbiology and Technology of Fermented Foods. Blackwell

Publishing. Premiere edition.

Ismail.B, Nampoothiri.K.M. 2010. Production, purification and structural characterization

of an exopolysaccharide produced by a probiotic Lb. plantarum MTCC 9510. Arch Microbiol

192:1049–1057

James.A. J, Martin.J A et David.A G.2005. Modern food microbiology. Springer science +

business media, Inc .Septicemia edition.

Jay JM.1982.Anyimicrobial properties of diacetyl .Appl.Environ.Microbiol.44.525-532.


110

Jolly.L, Stingele .F. 2001. Molecular organization and functionality of exopolysaccharide

gene clusters in lactic acid bacteria. Int Dairy J. 11:733–45.

Kacem.M and Karam N.E.2006.in vitro preselection criteria for probiotic Lb. plantarum

strains of fermented olives origin.International Journal of Probiotics and Prebiotics Vol. 1,

No. 1: 27-32

Kalalou.I, Zerdani. I and Faid .M. 2010. Antagonistic Action of Biopreservative Lactobacillus

plantarum Strain on Pathogenic E. coli O157:H7 in Fresh Camel Meat Stored at 10°C. World

Journal of Dairy & Food Sciences. 5 (1): 07-13.

Kouakou P, Philippe T.2011.Action des cultures protectrices : cas des germes lactiques sur

la flore alimentaire indésirable .Biotechnol. Agron. Soc. Environ. 15(2), 339-348.

Kimmel.S.A. and Roberts .R.F. 1998. Development of a growth medium suitable for

exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus RR. Int. J. Food

Microbiol. 40:87–92.

Kojic.M, Vujcic.M, Banina.A, Cocconcelli.P, Cerning.I and Topisiorvic.L.1992.Analysis of

Exopolysaccharide Production by Lactobacillus casei CG11, Isolated from

Cheese.Appl.envir.Micro. Vol. 58, No. 12.p 4086-4088.

Kleanhammer .T.R .1986. Bacterionines of lactic acid bacteria. Biochimie .70:337-349

Lapionte.G.2009. Métabolisme des bactéries lactiques: production d’exopolysaccharides in:

Bactéries lactiques: physiologie, métabolisme, génomique et applications industrielles by

Drider.D et Herve.P. Ed Economia.

Laref.N, Guessas.B.2013. Antifungal activity of newly isolates of lactic acid bacteria.

Innovative Romanian Food Biotechnology Vol. 13, Issue of September.

Leblond.B.N et Guedon.G .2009.Génétique génome et transcriptome: organisation et

évolution des génomes des bactéries lactiques agroalimentaires in bactéries lactiques by

DriderD et Prévost.H. Ed Economia.

Leroy.S, Lebert.I, Chacornac .J.P, Chevalier .I et Talon.R, 2007. Identification et

caractérisation de la flore d’intérêt technologique : bactéries lactiques et staphylocoques à

coagulase négative. Sci. Tec. V. Prod. Carnés. 25 : 172.


111

Liu .C.F, Tseng. K.C, Hsu .W.H andPan .T-M.2011.Immunomodulatory and antioxidant

potential of Lactobacillus exopolysaccharides. J Sci Food Agric: 2284–2291

Looijesteijn.P.J, Trapet.L, de Vries.E, Abee. T,and Hugenholtz.J.2001. Physiological function

of exopolysacharides produced by Lactococcus lactis. Int J Food Microbiol : 71–80.

Lindstrom.C, Holst.O, Nilsson. L, Öste. R, Andersson .K.E. 2012. Effects of Pediococcus

parvulus 2.6 and its exopolysaccharide on plasma cholesterol levels and inflammatory

markers in mice. AMB Express 2:66.

Magboul.A.A, McSweeney.P. 1999. Purification and characterization of an aminopeptidase

from Lactobacillus curvatus DPC2024. International Dairy Journal : 107–116.

Marie.S.B, Herve. R, Valerie. G, Sandrine.M, Magali R-S, Bruno.G & Catherine.F-F .2010.

Characterization of dextran-producing Weissella strains isolated from sourdoughs and

evidence of constitutive dextransucrase expression. FEMS Microbiol Lett :18–26.

Marshall.V.M, Laws.A.P, Gu Y, Levander.F, Radstrom.P, De Vuyst L.2001.

Exopolysaccharide- producing strains of thermophilic lactic acid bacteria cluster into

groups according to their EPS structure. Lett Appl Microbiol; 32: 433.

Mende.S, Krzyzanowski.L, Weber. J, Jaros .D and Rohm.H. 2012.Growth and

exopolysaccharide yield of Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus DSM 20081 in batch and

continuous bioreactor experiments at constant pH. Journal of Bioscience and

Bioengineering VOL. 113, 185.

Messens.W et De.VL. 2002. Inhibitory substances produced by Lactobacilli isolated from

sourdoughs--a review. Int J Food Microbiol.72(1-2):31-43.

Molly .K, Demeyer .D, Johansson .G, Raemaekers .M, Ghistelinck M and GeenenI.1997.The

importance of meat enzymes in repening and flour generation in dry fermented sausages

.First results of a European project .Food chem.59.539-545.

Moulay. M, Aggad. H, Benmechernene. Z, Guessas .B, Henni.D.E and Kihal .M.2006.

Cultivable Lactic Acid Bacteria Isolated from Algerian Raw Goat’s Milk and Their

Proteolytic Activity. World Journal of Dairy & Food Sciences 1 (1): 12-18.


112

Mozzi.F, Rollan.G, Savoy de Giori.G and Font de Valdez.G. 2001.Effect of galactose and

glucose on the exopolysaccharide production and the activities of biosynthetic enzymes in

Lactobacillus casei CRL 87. J Appl Microbiol .91: 160–167.

Mozzi.F, Vaningelgem.F, Hebert.E.M, Van der Meulen.R, Foulquie Moreno.M.R, Font de

Valdez.G and De Vuyst.L. 2006. Diversity of heteropolysaccharide-producing lactic acid

bacterium strains and their biopolymers. Appl Environ Microbiol. 72: 4431–4435.

Muriana.P.M and Klaenhammer.T.R.1991.Purification and Partial Characterization of

Lactacin F, a Bacteriocin Produced by Lactobacillus acidophilus 11088.Appli and Enviro

Microbio 57: 114-121.

Nigatu .A, Ahrne´.S and Molin.G. 2000. Temperature-Dependent Variation in API 50 CH

Fermentation Profiles of Lactobacillus Species. Current Microbiology. Vol. 41 : 21–26.

Onno.B, Valcheva.R et Dousset.X.2009. Les levains de panification : un écosystème

microbien céréalier complexe et des fonctionnalités spécifiques, in: Bactéries lactiques:

physiologie, métabolisme, génomique et applications industrielles by Drider.D et Herve.P.

Ed Economia.

Papamanoli E, Kotzekidou P, Tzanetakis N and Litopoulou-Tzanetaki

E.2002.Characterisation of Micrococcaceae isolated from dry fermented sausage .Food

Microbiol.19:441-449.

Patrignani.F, Lanciotti.R, Mathara.J.M, Guerzoni.M.E, Holzapfel.W.H. 2006. Potential of

functional strains, isolated from traditional Maasai milk, as starters for the production of

fermented milks, Int. J. Food Microbiol. 107: 1 – 11.

Paulraj.K, Ramraj.S, Neelakandan.Y, KupusamyAlagesan .P, Vellaiyan .P, and

Venkatesan.A.2011.The role of environmental factors and medium composition on

bacteriocin production by an aquaculture probiotic Enterococcus faecium MC13 isolated

from fish intestine.Korean J. Chem. Eng., 28(3), 860-866.

Pham.PL, Dupont.I, Roy .D and Lapointe .G.2000. Production of exopolysaccharide by

Lactobacillus rhamnosus R and its enzymatic degradation during prolonged fermentation.

App.Envir.Micro.66: 2302-2310.


113

Petry.S, Furlau.S, Crepeau.M, Cerning.J and Desmazeaud.M: 2000.Factors affecting

exocellular polysaccharide production by Lb.delbrueckii subsp. bulgaricus grown in a

chemically defined medium, Appl. Environ. Microbiol., 66, 3427–3431.

Piard. J.Cand Desmazeaud. M.1991. Inhibiting factors produced by lactic acid bacteria. 2.

Bacteriocins and other antibacterial substances . Le Lait . 71, 525.

Prescott, Harley, Klein, Willey.J.M, Sherwood.L.M and Woolverton

.C.J.2010.Microbiologie. 3emme Ed De Boeck universite.p 1984.

Rendueles.O, Kaplan .J. B and Ghigo.J-M. 2013. Antibiofilm polysaccharides.

Environmental Microbiology .15 , 2 : 334–346

Roger.P. 2006. Organic Acid and Solvent Production Part I: Acetic, Lactic, Gluconic,

Succinic and Polyhydroxyalkanoic Acids in Prokaryotes .1:511–755.Ed 3.

Romain.H. 2011. Caractérisation des régulateurs transcriptionnels Rgg et étude du rôle de

la protéine Rgg0182 de Streptococcus thermophilus. Thèse de doctorat .Université Henri

poincare.

Roudj.S.2010. Protéolyse chez Lactobacillus: purification et caractérisation de protéases et

aminopeptidases. Faculté des Sciences ; Es-Sciences Naturelles.

Ruas.M.P, Hugenholtz.J and Zoon.P. 2002. An overview of the functionality of

exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria. Int. Dairy J. 12:163-171.

Ruas.M. P and de los Reyes.G.C. G.2005. Invited Review: Methods for the Screening,

Isolation, and Characterization of Exopolysaccharides Produced by Lactic Acid Bacteria. J.

Dairy Sci. 88:843–856.

Sanchez.J.I, Martinez.B, Guillen.R, Jimenez.D.R and Rodriguez.A.2006. Culture Conditions

Determine the Balance between Two Different Exopolysaccharides Produced by

Lactobacillus pentosus LPS26.App.Envirenm.Micro. Vol. 72, No. 12. P 7495–7502.

Schutten.V.G.G.H, Fabier.E.G, Smit.E, Bonting.K, Smith.M.R, Brink.B.T, Kamerling.J.P,

vlieginthart.J.F.G and Dijkhuizen.L.1999. Biochemical and Structural Characterization of

the Glucan and Fructan Exopolysaccharides Synthesized by the Lactobacillus reuteri Wild-

Type Strain and by Mutant Strains. Appl.Envir.Microbiol. Vol. 65, No. 7 : 3008–3014.


114

Sexar.S, Schwenninger.S.M and Lacroix.C.2013.characterisation of the microflora of

industrial Mexican cheeses produced without added chemical preservatives.LWT-Food

Scienceand Technology.53:314-320.

Smaoui. .2010. Purification et Caractérisation de Biomolécules à partir de microorganismes

nouvellement isolés et identifiés. Doctorat de l’université de Toulouse.

Snezara.B et Zora.M.2011. Antimicrobial susceptibility of lactic acid bacteria isolated from

Sombor Cheese.Acta Veterinaria (Beograd), Vol. 61, No. 2-3, 247-258.

Stoyanova.L.G, Ustyugova.e.A, Netrusov.A.I.2012. antibacterialmetabolites of LAB /their

diversity and properties. Applied Biochemistry and Microbiology. 48:229-243.

Sutherland.I.W.2001.Microbial polysaccharides from Gram negative bacteria.Int Dairy J;

11:663–74.

Tabak.S et Bensoltane.A.2012.L’activité antagoniste des bactéries lactiques (Streptococcus

thermophilus, Bifidobacterium bifidum et Lactobacillus bulgaricus) vis-à vis de la souche

Helicobacter pylori responsable des maladies gastroduodénales. Nature & Technologie.6:79.

Talon.R, Leroy. S, Lebert. I.2007. Microbial ecosystems of traditional fermented meat

products: The importance of indigenous starters. Meat Science.77.p 55–62.

Tieking.M, Korakli. M, Ehrmann . M. A, Ganzle .M.G et Vogel. R. F.2003. In Situ

Production of Exopolysaccharides during Sourdough Fermentation by Cereal and

Intestinal Isolates of Lactic Acid Bacteria. Applied and Ennvironmental Microbiology, Vol.

69, No. 2 : p. 945–952.

Tomomi .H,Melaku .A, Miho .K, Chise .S, Sunee. N, Sadahiro .O.2009. Characterisation of

bacteriocin produced by Enterococcus faecalisN1-33 nd its application as a food

preservative.Journal of food protection .Vol 72. No 3:524-530

Udomsil. N, Rodtong. S, Tanasupawat.S , Yongsawatdigul.J.2010. Proteinase-producing

halophilic lactic acid bacteria isolated from fish sauce fermentation and their ability to

produce volatile compounds. International Journal of Food Microbiology.186–194.

Urshev.Z.L, Dimitrov.Z.P, Fatchikova.N. S,Petrova.I.G, Ishlimova.D.I. 2008. Partial

characterization and dynamics of synthesis of high molecular mass exopolysaccharides


115

from: Lb.delbrueckii ssp. bulgaricus and Str.thermophilus .World J Microbiol Biotechnol .

24:171–179.

Van der Meulen.R , Grosu-Tudor.S, Mozzi.F, Vaningelgem.F, Zamfir.M, Font de Valdez.G,

De Vuyst.L. 2007. Screening of lactic acid bacteria isolates from dairy and cereal products

for exopolysaccharide production and genes involved. International Journal of Food

Microbiology 118 :250–258.

Vandamme.P, Pot.B, Gillis.M, DeVos.P, Kersters.K and Swings.J.1996. Polyphasic

taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics.Microbiol. Rev. 60: 407.

Vandervoorde.L, Chritians.H et Verstraete.W .1991 .In vitro appraisal of the probiotic

value of intestinal lactobacilli. World journal of microbiology and Biotechnology, 7, 587_592.

Vaningelgem.F, Zamfir.M, Mozzi.F, Adriany.T, Vancanneyt.M, Swings.J and De

Vuyst.L.2004. Biodiversity of exopolysaccharides produced by Streptococcus thermophilus

strains is reflected in their production and their molecular and functional

characteristics.Appl.Environ.Microbiol.70:900–912.

Vedamuthu.E.R and Neville.J.M. 1986. Involvement of ropiness (mucoidness) in milk

cultures by Streptococcus cremoris MS. Appl. Environ. Microbiol. 51: 677 - 682.

Vinderola .G, Perdigon.G, Duarte.J, Thangavel.D, Farnworth .E, Matar.C .Immunobiology

.2006. 211, 149–156.

Wang.Y, Li.C , Liu.P, Ahmed.Z, Xiao.P, Bai.X. 2010. Physical characterization of

exopolysaccharides produced by Lactobacillus plantarum kF5 isolated from Tibet Kefir.

Carbohydrates polymers. 82, 895-903.

Welman. A.D, Maddox .I.S. 2003.Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: perspectives

and challenges. Trends Biotechnol.21:269–74.

Xu.R, Ma.S, Wang.Y, Liu.L and Li.P .2010.African Journal of Microbiology Research. Vol

4(9):783-795 .

Zajsek.K, Gorsek.A et Kolar.M.2013.cultivating conditions effects on Kefiran production by

the mixed culture of lactic acid bacteria. Food chemistry. 139:970-977.


116

Zhang.L, Liu.C, Li.D, Zhao.Y, Zhanga.X, Zeng .X, Yang,Li. S. 2013.Antioxidant activity of

an exopolysaccharide isolated from Lactobacillus Plantarum C88. International Journal of

Biological Macromolecules. 54 :270– 275

Zhoua J.S., Pillidge C.J, Gopal P.K, Gill H.S.2005.Antibiotic susceptibility profiles of new

probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains. International Journal of Food

Microbiology.98 : 211 – 217.

Zourari.A, Accolas.J.P and Desmazeaud.M. 1992. Metabolism and biochemical

characteristics of yogurt bacteria. A review. Lait 72:1.

Annexe

117

Milieu MRS :

Peptone 10g Extrait de viande 10g Extrait de levure 5g Glucose 20g Phosphate bipotassique 2g Acétate de sodium 5g Citrate d’ammonium 2g Sulfate de magnésium 0.2g Sulfate de manganèse, 0.5g Tween 80 1ml Agar 15g Eau distillée qsp 1000ml

Stérilisation par autoclavage à 120°C pendant 15 min, pH 5,4± 0.2.

Annexe

118

Tableau: activité antagoniste des souches de Lactobacillus.

Diamètres des zones d’inhibition (mm)

Lis. monocytogenes

33090

S. aureus

25923

E. faecalis

2035

E. coli

25922

Lb. casei (Lbl55) 24 25 21 28

Lb. casei (Lbl56) 19 18 23 22

Lb. casei (Lbl58) 20 16 16 16

Lb. casei (Lbl60) 15 13 15 30













Lb. helveticus(Lbl59) 26 20 20 22

Lb. cellobiosus(Lbl27) 20 20 21 20

Lb. cellobiosus(Lbl28) 21 12 10 15

Résumé

Les investisseurs de l’industrie laitière, désirent bénéficier des effets irremplaçables desbactéries lactiques à caractères technologiques privilégiés. Les exopolysaccharides (EPS)produits naturellement par certaines bactéries lactiques suscitent un intérêt technologique du àleur capacité de rétention d’eau et celles de moduler la viscosité des produits fermentés. Notreétude a pour but l’isolement de souches lactiques de différents écosystèmes : lait (Raib etKlila), margines d’olive fermentées et du levain de panification ; ainsi, la sélection etl’identification de celles productrices d’EPS. Quarante souches de bactéries lactiquesobtenues; appartenaient essentiellement à trois genres : Enterococcus (dix souches),Leuconostoc (deux souches) et en grande partie à Lactobacillus (vingt huit souches). Environ67% des souches isolées ont exhibé une production d’EPS ; spécialement, les souches deLactobacilles. Cependant, dix neuves souches ont été retenues à identifier et à évaluer leursaptitudes technologiques, notamment, le pouvoir texturant. En plus, de quelques aptitudesprobiotiques. Différentes espèces ont été pré-identifiées selon leurs caractères phénotypiques: 8 souches de Lb. plantarum, 4 souches de: Lb. casei, 2 souches de: Lb .acidophilus et 2souches de Lb. cellobiosus. Elles ont montré plusieurs performances d’après l’étude descaractères technologiques et probiotiques ; mise à part leur production d’EPS. La recherchede la production d’EPS a reposé sur deux types de tests : 1. Tests qualitatifs (sur gélose MRSmodifiée, milieu MSE, milieu au rouge de Rhuténium, milieu Chalmers modifié), lait écrémé, et2. Tests quantitatifs (bouillon MRS modifié). La quasi totalité des souches ont montré unaspect très visqueux sur les milieux utilisés pour la recherche de la production des EPS. Unesélection préliminaire était effectuée grâce au test de Lingani. Néanmoins, la quantification arévélé une certaine inégalité en production entre ces souches. Les souches les plusperformantes sont Lb. plantarum (Lbl25, Lbl26 et Lbl57), Lb. acidophilus (Lbl61) et Lb.curvatus (Lbl63) avec des taux de production trop élevés, qui dépassent les 1 g/l.L’optimisation des conditions de la production des EPS chez la souche Lb. plantarum (Lbl26),a donné le meilleur rendement avec la combinaison (T°=23°C _ pH 5.4 _ MRS modifié à 10%de sucrose) : 12.14 g/l.

Mots clés :

Bactéries Lactiques; Exopolysaccharides; EPS; Lactobacillus Plantarum; Optimisation De LaProduction; Cinétique De Production; Probiotiques; Cellobiosus; Acidophilus; Casei.

Documents

Les exopolysaccharides des bactéries lactiques ...theses.univ-oran1.dz/document/TH4529.pdf · 9.3. Résistance aux sels biliaires : 65 Résultats et méthodes: 1. Isolement et purification