●：プロテインレポーターとして標的 ORFと融合させて発現

HaloTag® & ligand

高感度でしか 見えないものがある。プロテインレポーター選択ガイド

タグ（タンパク質レポーター） HaloTag® NanoLuc® SmBiT LgBiT HiBiT

特長

概要

19kDaSmBiT11アミノ酸

LgBiT17.6kDa

HiBiT11アミノ酸

• 低分子リガンドと 特異的に共有結合

• ホタルルシフェラーゼの約 100倍の発光 強度

• SmBiT ⇔ LgBiT 親和性小 （Kd=190 µM）

• 再構成により発光（ホタルルシ フェラーゼの約 30倍の発光強度）

• HiBiT ⇔ LgBiT 親和性大 （Kd=700 pM）

• 再構成により発光（ホタルルシ フェラーゼの約 30倍の発光強度）

検出用基質 蛍光リガンド フリマジン（発光基質）

アプリケーション

タンパク質の定量・検出発光 ● 〇（試薬として供給） ●

蛍光 ●（イメージング）

タンパク質： タンパク質相互作用

発光 ● ●

BRET ● ●

タンパク質： 化合物相互作用 BRET

●（NanoLuc® 融合タンパク質と蛍光標識化合物との結合をBRETで検出）

ウィルス感染・細胞融合 発光 〇（細胞内で発現させて供給）

●

ウェスタン様ゲル分析 発光 /蛍光 ● ● 〇（試薬として供給）

●

プルダウン /精製 ー ●（+担体）

タグの使い分けについては以下の表をご覧ください。

レポーター実験については以下のガイドも参照ください。

★ 発光レポーターガイド：最新の NanoLuc® ルシフェラーゼを用いたデュアルアッセイやなど、 新たな発光アプリケーションや実験の手順などをご説明！ promega.co.jp/go?lumrepguide

★ タンパク質レポーターテクノロジーガイド：ペプチドルシフェラーゼ HiBiTなど最先端の NanoLuc® テクノロジーおよび多機能性 HaloTag® タグを 利用した広範なタンパク質機能解析アプリケーション・ツールをご紹介！　promega.co.jp/go?prorepguide

★ ルミノメーター なになになーに：発光測定装置 ルミノメーターの原理から チェックすべき重要なポイントを解説！　promega.co.jp/go?naninani6

プロメガ株式会社

プロメガ株式会社

最新のレポーターテクノ

ロジーとアプリケー

ション

第 1章　レポーターアッ

セイとテクノ

ロジー

● これまでとこれからのレポーター …

……………………………………………………… 2

● 最新鋭レポーター

NanoLuc® ルシ

フェラーゼ

…………………………………… 4

● デュアルレポーター & マル

チアッセイ ……

…………………………………………… 6

● リアルタイムア

ッセイ ……

…………………………………………………………………………… 8

第 2章　レポーターア

ッセイでできること

● シグナルパスウェイ

解析 ……

…………………………………………………………………… 10

● タンパク質間相互作用（PPI 解析

） ………………………………………………………… 12

● プロモーター解析

…………………………………………………………………………………… 14

● 核内受容体解析 …

…………………………………………………………………………………… 14

● タンパク質安定性解析

…………………………………………………………………………… 15

● RNA干渉解析 ……

……………………………………………………………………………………… 16

● in vivo イメージング & ウイ

ルスのマーキング

…………………………………… 17

第 3章　レポーターア

ッセイ試薬 & レポ

ーターベクター

● レポーター実験の流れ

…………………………………………………………………………… 18

● アッセイ

/検出試薬

………………………………………………………………………………… 20

● レポーターベクター・ク

ローン・細胞 ……

…………………………………………… 26

● 関連製品（トランスフェクション

・マルチアッセイ・ル

ミノメーター）

…… 30

発光レポーターガイド

最新鋭 NanoLuc

® ルシフェラ

ーゼが広げるレポーターの可能性！

イントロダクション

2

NanoLuc® アプリケーション 5

・タンパク質の安定性 5

・タンパク質間相互作用 6

・タンパク質発現検出（HiBiT） 10

・タンパク質-リガンド相互作用 12

HaloTag® アプリケーション 13

・分子間相互作用

13

・イメージング

16

・タンパク質精製

21

タグ融合タンパク質の発現（How To） 23

Contents

タンパク質レポーターテクノロジーガイド生きた細胞で見るタンパク質ダイナミクス

レポーター実験 無料相談無料相談 && ベクター受託構築 ベクター受託構築

ベクター50 OFF増量無料の

大チャンス! 材料ベクター半額！　しかも構築ベクターは高純度 （20 µg）＊

そのままトランスフェクション実験に使用可能！納期 ：2~3か月＊25,000円分に相当（通常はシークエンスグレード 約 3 µg）

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完全サポートプログラム期間：2020.8.20（木）～ 10.30（金）受注分まで

進化した3 3 3 3

レポーター実験NanoLuc® Luciferase

CRISPR/Cas9ゲノム編集を利用して標的遺伝子の内在ローカスに HiBiT レポーターなどをノックインすれば、ネイティブプロモーターによって発現されるタンパク質を、発光により定量することができます。過剰発現モデルと比較して、内在的に標識されたタンパク質は、自然なエピジェネティック制御とネイティブの相互作用パートナーとの化学量論を維持し、より真のバイオロジーを反映した正確なモデルとして利用することができます（参考文献： Schwinn MK, Steffen LS, Zimmerman K, Wood KV, Machleidt T. Sci Rep 2020-06-02. ）。

HiBiT などをゲノム編集により導入した細胞リストについては右記をご覧ください。promega.co.jp/go?crisprcells

CRISPR ゲノム編集 でより内在的なアッセイが可能more

レポーターアッセイ用の 検出装置がありません ..

機器貸出 RentaMAX申込みサイト www.promega.co.jp/rentamax/

さらに お試しコストは 出来るだけ抑えたい

ベクター設計の仕方が わからない？ ベクター構築の 時間も無い！

レポーター実験のご相談 &受託構築見積りサイト www.promega.co.jp/Reporter2020/

中面 2-3ページ 参照

33kDa

となになになー

に？

ほたるん

エビビン

ルミノメーター

って

Vol.6

こん

にちは、

ほたるんさんエビビンさん

。

うちの先

生が

つい

に

96/384ウェルプレート対応

のプレート

リーダーを買うことに！

ひゃっほー

い！

最強最高のルミノメーター

を選

ぶよう

言われ

たので、選び

方のコツを教えてください。

Q

プロ

メガ

子より

機器

選び

ってワクワクするよ

ね！ ル

ミノメーター

にもいろん

な機

種があって

迷っちゃうけど、

この2 点を押

さえれ

ば失

敗しない

よ！ あ

と、シンプルで

誰で

も使

いこな

せることも大事

だね！

A

ダイナミックレンジとクロストークに注目しよう！

ダイナミックレンジとは

クロストークとは

検出

できる

最も

弱い

発光

と最

も強

い発

光の

差の

幅のこ

とだよ！

ダイナミックレン

ジが

広い

とシグナルの

強さが

バラバラの

サンプルでも同じプレ

ートで測

定で

きるよ！

ダイナミックレンジ

広い

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設定

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のまま測

定で

きる

狭い

とき …

強く

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ンプ

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るし、

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出で

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整してやり直しだ

よ…

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セイし

たとき

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強く

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よ！ ま

わり

の

ウェル

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の光

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ウトするしくみ

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測

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絶対

必要

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実験

を機

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検出

限界

に合

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間や

サン

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試薬

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約に

なるんだ！

この2 つ

のハードル

を

軽や

かにクリアした

最優秀機種とは！？

すごく光

るサンプル

隣の

ウェル

から漏

れこむ

光

マルチウェルプレート断面図

水

サンプル検出器

わずか

に光

るサンプル

ただ

の水

から

発光

値！？

プロメガ株式会社

& %%

プロメガ試薬

プロメガ検出器高感度好感度 第 3 弾

Protein Reporters

L et’s Star t New Repor ter A nalysis !

テクニカルサービス ● Tel. 03-3669-7980 ／ Fax. 03-3669-7982　● E-Mail : prometec@jp.promega.com

販売店

プロメガ株式会社

日本語 Web site : www.promega.jp

PK2008-01B

プロメガ株式会社本　　　社　〒103-0011東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビルTel. 03-3669-7981／Fax. 03-3669-7982

大阪事務所　〒532-0011大阪市淀川区西中島6-8-8 花原第8ビル704号室Tel. 06-6390-7051／Fax. 06-6390-7052※製品の仕様、価格については2020年8月現在のものであり予告なしに変更することがあります。

※ 本ベクター構築受託サービスは遺伝子配列上の移し替えのみを行うサービスであり、レポーターの発現・局在・機能（タンパク質間相互作用など）を保証するものではありません。

UTR

Compound

Promoter REPORTER

Receptor

Signal

siRNA

Secretion

Translocation Interaction Abundance

Degradation

Infection Cell Fusion

Promoter REPORTER GOI

ジェネティック レポーターGenetic Reporters

プロテイン レポーターProtein Reporters

プロテインレポーターとはプロテインレポーターとは標的タンパク質に融合させ、その挙動を容易に検出するための機能性タンパク質です。プロメガでは各種発光レポーターやイメージング・ 精製などに利用できるユニークな 受け皿タンパク質 HaloTag® をラインナップにそろえています。また発光酵素 NanoLuc® をサブ ユニット化した SmBiT、HiBiT、LgBiTを用いれば、タンパク質間相互作用やタンパク質の発現・分解などを高感度に定量することができます。

製品名 カタログ番号 サイズ 価格 特別価格ライブセルアッセイ用細胞透過性 NanoLuc® 発光基質

Nano-Glo® Live Cell Assay System N2011 100回分 ¥28,000 ¥19,600Nano-Glo® Endurazine™ Live Cell Substrate N2570 0.1ml ¥30,000 ¥21,000Nano-Glo® Vivazine™ Live Cell Substrate N2580 0.1 ml ¥30,000 ¥21,000Nano-Glo® Extended Live Cell Substrate Trial Pack N2590 0.2 ml ¥38,000 ¥26,600HiBiTライブセルアッセイ用 LgBiT供給用発現ベクター

LgBiT Expression Vector N2681 20 µg ¥78,000 ¥54,600

Nano-Glo® Live Cell Assay System、Endurazine™、Vivazine™ の発光カイネティクス比較

ViaFect™と他社トランスフェクション試薬の導入効率と細胞生存性の比較

Vivazine™ substrateEndurazine™ substrate

Nano-Glo® Live Cell Assay System

104

105

106

107

108

Lum

ines

cenc

e (R

LU)

Time (hours)1050 15 20 25

ジェネティックレポーターとはレポーターアッセイといえば、プロモーター解析やシグナル伝達研究などに利用されているホタルルシフェラーゼがジェネティックレポーターとして広く利用されてきました。このジェネティックレポーターは、レポーターベクターに導入した転写制御配列（プロモーターや応答配列）に対応する一連のシグナル経路（刺激［薬剤 /ホルモン］→ 受容体 → シグナル因子 → 転写因子→ 制御配列 etc）に及ぼされる変化（正 /負の調節など）をレポータータンパク質の活性として定量する手法です。これまでにプロモーター解析など転写に関わる基礎研究をはじめ、特定のシグナルに影響する薬剤のスクリーニングなどに使用されています。近年では特定の受容体と応答配列を組み合わせた遺伝子改変細胞がバイオセンサー（ADCCアッセイ etc）として利用されるなど様々な分野で応用されています。

NanoLuc®で変わるレポーターの世界ホタルルシフェラーゼはシングルレポーターアッセイとしてあるいは、ウミシイタケルシフェラーゼを内部標準として組み合わせたデュアルアッセイとしても一般的に用いられるようになりました。プロメガではより真のバイオロジーを解析できる高感度な発光レポーターとして NanoLuc®を開発しました。NanoLuc® レポーターは深海エビ（トゲオキヒオドシエビ［Oplophorus gracilirostris］）に由来する 19 kDaの小型発光酵素で、ホタルの 100倍以上の発光強度をほこります。これらの特長はレポーターの性能を飛躍的に向上させ、アプリケーションを拡充しました。

ジェネティックレポーターとして従来のレポーター酵素からの改良点：• トランスフェクションの困難な細胞、少数の細胞でも十分なシグナルが得られる• 使用するベクターや細胞、被検化合物の量を低減可能• より微細な細胞内変化をとらえることができる• ホタルルシフェラーゼのクエンチング効率が飛躍的に改善され、より正確なデュアル測定が可能に（Nano-Glo® Dual）

NanoLuc® &ホタルデュアルルシフェラーゼアッセイ試薬 & コントロールレポーターセット製品名 カタログ番号 サイズ 価格 特別価格

Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay/pGL4.54［luc2/TK］ Bundle N1541 1セット ¥80,000 ¥40,000Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay/pGL4.53［luc2/PGK］ Bundle N1551 1セット ¥80,000 ¥40,000

実験レポーター

応答配列導入ベクター（各 ¥80,000 程度）AP1 CRE MycMax SRE ARE GAS NFAT SRF ATF4 HRE p53 STAT5 ATF6 ISRE SBE TCF/LEF CEBP MRE SIE XRE

プロテインレポーター実験に関するお問合せやベクター構築のお見積り依頼は www.promega.co.jp/Reporter2020/ よりお申込みください。

各種レポーター検出試薬

製品名 検出レポーター カタログ番号 サイズ 価格 特別価格

Nano-Glo® Luciferase Assay NanoLuc® N1110 10 ml ¥24,000 ¥16,800Nano-Glo® HiBiT Lytic Detection System

HiBiT

N3030 10 ml ¥27,000 ¥18,900Nano-Glo® HiBiT Extracellular Detection System N2420 10 ml ¥29,000 ¥20,300Nano-Glo® HiBiT Blotting System N2410 100 ml ¥37,000 ¥25,900NanoBRET™ Nano-Glo® Detection System NanoLuc® + HaloTag® N1661 200 回分 ¥60,000 ¥42,000HaloTag® TMR Ligand HaloTag® G8252 15 µl ¥53,000 ¥37,100

HiBiT• タンパク質の検出・定量• ウイルス感染• 細胞融合

SmBiT• タンパク質間相互作用検出• 分子重合（RealTime-Glo™ Apoptosis Assay）

NanoLuc ®（発光酵素：ホタルの 100倍の発光強度）深海エビに由来する分子量約 19kDaの小型の発光酵素で従来のルシフェラーゼの発光強度を大きく上回ります。

• タンパク質の定量・検出（発現、安定化、分解）

• BRETのドナー光源として（化合物：タンパク質相互作用）

• 発光イメージング

NanoLuc®実験レポーター（一例）

ジェネテックレポーター実験に関するお問合せやベクター構築のお見積り依頼は www.promega.co.jp/Reporter2020/ より お申込みください。

LgBiTと SmBiT/HiBiT（ NanoLuc® のサブユニット）NanoLuc® を大小のサブユニットに分け、近接あるいは結合することで発光酵素として再構成（ホタルの約 30倍の発光強度）されます。小サブユニットには大サブユニット LgBiT（共通）との親和性が異なる 2つのタイプ HiBiT（高親和性）および SmBiT（低親和性）があり、2つのペアは異なる細胞内イベントの検出に利用することができます。小サブユニットはどちらも 11アミノ酸と非常に小さいため、本来のタンパク質機能への影響は最低限で、CRISPRによる内在ローカスへの導入も容易です。

HaloTag®

HaloTag® 低分子機能性リガンドと特異的に結合する約30kDaの受け皿タンパク質です。タンパク質解析ツールとして様々な機能性リガンドをご用意しています。

• 蛍光イメージング、パルスチェイス様実験• BRETにおけるアクセプター• リガンド担体を利用した精製、プルダウン実験など

HiBiT

HaloTag®

LigandSmBiTLgBiT

（11 a.a.）（11 a.a.） （17.6kDa）

low af�nityhigh af�nity

製品名 カタログ番号 サイズ 価格 特別価格

FuGENE® HD Transfection Reagent E2311 1 ml ¥65,000 ¥52,000ViaFect™ Transfection Reagent E4981 0.75 ml ¥60,000 ¥48,000

トランスフェクション試薬は導入効率が優れていても、その分死細胞も増えるなど頭を悩ませるポイントです。また、細胞毒性だけでなく、その他の遺伝子発現パターンにも影響を及ぼしている可能性もあります。プロメガのトランスフェクション試薬は多くの細胞種で他社製品よりも毒性が少なく（参考資料：promega.co.jp/go?tfcomp）、試薬による細胞生理への影響も最低限です（参考文献：Jacobson et al .［2009］Biotechniques 47, 617–24[FuGENE HD®]）。高感度な NanoLuc® は少量のベクターを導入するだけで十分なシグナルが得られるので、プロメガのトランスフェクション試薬と併用することでより細胞にやさしく本来のバイオロジーに近いレポーター実験が可能になります。

細胞にやさしいトランスフェクション × 高感度レポーター リアル バイオロジーTF各種 Nano-Glo® Live Cell Substrateは NanoLuc® 酵素あるいは NanoBiT®バイナリー酵素（SmBiT＋ LgBiTまたは HiBiT＋ LgBiT）に対する細胞透過性の発光基質です。また、LgBiT Expression Vectorを細胞内に導入し、LgBiTを安定に供給することで HiBiT融合タンパク質のライブセルアッセイを実現できます（LgBiT安定発現細胞株については別途お問合せください）。

イムノアッセイでは不可能なダイナミックな細胞内イベントを経時的にモニタリングライブ

上記製品の専用注文用紙については以下よりご入手ください。 promega.formstack.com/forms/nlvector2020

ViaFect™ Transfection Reagent

CompetitorL2K

Genetic and Protein Reporter Systems for Cellular Analysis