Lezione 7

Allineamento di sequenze biologiche

Allineamento di sequenze

Determinare la similarità e dedurre l’omologia

Allineare

1 LA CASA È NUOVA

2 LA CASSA È VUOTA

Definire il numero di passi necessari per trasformare una sequenza nell’altra utilizzando passaggi mutazionali come -sostituzione -inserzione/delezione

1 LA CASA È NUOVA

2 LA CASSA È VUOTA

1 LA CAS-A È NUOVA

2 LA CASSA È VUOTA

1 indels + 2 sostituzioni

Tra le due soluzioni mostrate (ce ne sono altre!), quale scegliamo? Esistono criteri e algoritmi che ci possono aiutare

match

mismatch

1 LA CAS-A È –NUO-VA

2 LA CASSA È V-UOT-A

5 indels

gap

Perchè allineare?

• Per fornire una misura di quanto sequenze nucleotidiche o aminoacidiche siano “imparentate”, abbiano in comune

• Questa parentela ci permette di fare inferenze biologiche in termini di

– relazioni strutturali

– relazioni funzionali

– relazioni evolutive

• Alignment-based database searching

Terminologia

• La misura QUANTITATIVA: Similarità

– Si esprime in genere come % di identità, quantifica i cambiamenti che sono avvenuti dal momento della divergenza tra due specie (sostituzioni, In-dels)

– Identifica i residui cruciali per mantenere la struttura o la funzione di una proteina

Alti livelli di similarità possono indicare una divergenza recente tra le sequenze, una storia evolutiva comune, simile funzione biologica

Terminologia

• Una valutazione di STATO: Omologia

– Implica l’esistenza di relazioni evolutive

– Geni omologhi: geni che si sono originati per divergenza da un antenato comune

– I geni SONO o NON SONO omologhi, non esiste una misura quantitativa dell’omologia

Eyeless ha un ruolo importante nel dirigere lo sviluppo dell’occhio in drosofila; Pax6 lo stesso nel topo Eyeless e Pax6 sono decisamente simili in sequenza e funzione

probably > 500 MYA http://evolution.berkeley.edu/

Terminologia Ortologhi: Geni che si sono separati in seguito ad un evento di speciazione

• Le sequenze discendono da un antenato comune

• Molto probabilmente codificano per proteine con domini simili e simili strutture tridimensionali

• Spesso mantengono funzioni simili

• Possono essere usati per predire funzioni geniche in genomi nuovi

Paraloghi: Geni che si sono evoluti per duplicazione in una specifica linea evolutiva

• E’ meno probabile che mantengano funzioni simili, più comunemente evolvono nuove funzioni

Allineamenti globali e locali

• Globale

– trova l’allineamento ottimale sul totale della lunghezza delle sequenze

– È la soluzione migliore per sequenze di lunghezza simile ed omologhe

– Al dimiuire del grado di similarità (es. aumento distanza evolutiva, alto tasso di ricombinazione) i metodi di allineamento globale tendono a peggiorare molto in efficienza

Allineamenti globali e locali • Locale

– Ha lo scopo di trovare regioni simili (es. domini) in due sequenze (“paired subsequences”)

– Le regioni fuori dalle aree di allineamento locale vengono escluse

– Può essere generato più di un allineamento locale per ogni coppia di sequenze confrontate

– Scelta indicata nel caso di due sequenze a similarità ridotta o di differenti lunghezze

Local vs. Global Alignment

• Global Alignment

• Local Alignment—migliore per trovare regioni conservate

--T—-CC-C-AGT—-TATGT-CAGGGGACACG—A-GCATGCAGA-GAC | || | || | | | ||| || | | | | |||| | AATTGCCGCC-GTCGT-T-TTCAG----CA-GTTATG—T-CAGAT--C

tccCAGTTATGTCAGgggacacgagcatgcagagac

||||||||||||

aattgccgccgtcgttttcagCAGTTATGTCAGatc

Allineamenti locali: perchè?

• Due geni in specie diverse possono essere simili in corte regioni conservate e diversi nel resto della sequenza.

• Esempio:

– I geni Homeobox (chiaramente omologhi) hanno corte regioni chiamate omeodomini altamente conservate tra specie.

– Un allineamento globale non troverebbe gli omeodomini perchè cercherebbe di allineare l’INTERA sequenza

Allineamento: ipotesi circa l’omologia

posizionale (discendenza da antenato comune)

di due residui in due (o più) sequenze

GCGGCCCATCAGGTAGTTGGTGG GCGTTCCATCCTGGTTGGTGTG

Sequenza della specie 1 sequenza della specie 2

Sequenza ancestrale

(prima della speciazione: antenato comune delle due sequenze.

Non direttamente osservabile (a meno di avere il DNA antico),

ma ricostruibile

11111111112222

base nr 12345678901234567890123

GCGGTCCATCAGCTGGTTGGTGG

presente

passato

G > T pos 4

Del AG pos 11 e 12

Ins T pos 23

T > C pos 5

C > G pos 13

G > A pos 15

Un allineamento a coppie consiste di una serie di residui o basi accoppiati, una per sequenza. Ci sono tre tipi di coppie:

(a) match = stesso nucleotide (o AA) in entrambe le sequenze (b) mismatch = diverso nucleotide (o AA) in una delle sequenze (c) gap = una base (o AA) in una sequenza e niente nell’altra

1111111111222 2

1234567890123456789012 3

Specie1 GCGGCCCATCAGGTAGTTGGTG-G

Specie2 GCGTTCCATC--CTGGTTGGTGTG

aaabbaaaaaccbabaaaaaaaca

Come si può fare in modo non manuale??

Nelle prossime diapositive cercheremo di rispondere alla domanda: su che cosa si basa un allineatore (algoritmo di allineamento) per operare un allineamento?

Come si può fare in modo non manuale??

1. Matrici di punteggio e 2. Penalità per i gap

• Il vero allineamento tra due sequenze è quello che riflette in modo accurato le loro relazioni evolutive (vedi i numerini nell’esempio precedente: omologia posizionale).

• Poichè il vero allineamento non è conosciuto in pratica si cerca l’allineamento ottimale: minimizza i mismatches e i gaps secondo certi criteri….purtroppo ↓ mms ↑ gaps

↓ gaps ↑ mms

Sostituzioni o mismatch

In/del o gap

( (

(

Matches

Mismatches

Gaps

(1 terminal)

Matches

Mismatches

Gaps

Matches

Mismatches

Gaps (both

terminal)

Lo schema di punteggio include una penalizzazione per le in-del (gap penalty) e una matrice di punteggio (scoring matrix) M(a,b), che specifica ogni tipo di match (a = b) o di mismatch (a b). Le unità nella matrice di punteggio possono essere nucleotidi nelle sequenze di DNA o RNA, i codoni nelle regioni codificanti, o gli aminoacidi nelle sequenze proteiche.

Matrici di punteggio e penalità per i gap

Cos’è una matrice di punteggio?

• Matrice che associa un punteggio ad ogni coppia di entità che troviamo in un allineamento

• Ogni linea e ogni colonna rappresentano un residuo (4 nucleotidi o 20 aminoacidi)

• La diagonale è l’identità

• Il triangolo inferiore corrisponde alle sostituzioni e il superiore è simmetrico (non necessario)

• I valori negativi indicano penalità per certe sostituzioni, l’algoritmo di allineamento cercherà di evitarle

• I valori positivi indicano sostituzioni ‘accettate’ in termini evoolutivi, strutturali o funzionali

Sostituzioni : mismatches

Perché è importante capire le matrici di punteggio?

• Compaiono in ogni analisi che implichi un confronto tra sequenze

• Implicano un determinato percorso evolutivo

• Possono influenzare fortemente il risultato delle analisi

Sostituzioni : mismatches

Di solito sono semplici. La più semplice: M(a,b) assegna valori positivi se a = b (match), altrimenti negativi (mismatch)

M(a,b) 0 if a b

0 if a b

DNA scoring matrices Sostituzioni : mismatches

Matrici più complesse possono distinguere ad esempio tra transizioni e trasversioni (le prime avvengono più facilmente trattandosi di molecole più simili, però ci sono 4 possibili trasversioni e solo 2 transizioni)

DNA scoring matrices Sostituzioni : mismatches

Margareth Dayhoff 1965: “Atlas of potein sequences” contenente le sequenze aminoacidiche di 65 proteine Inizio delle collezioni di dati da cui avranno origine le banche dati elettroniche Dayhoff et al. nel decennio 1970-1980 hanno proposto una procedura per il calcolo di matrici di punteggio per quantificare la propensione di AA a mutare l’uno nell’altro durante l’evoluzione (matrici 20 x 20). Alla base c’è l’osservazione delle proteine note: MATRICI DI SOSTITUZIONI EMPIRICHE

Amino acid/protein scoring matrices

Sostituzioni : mismatches

Empirical substitution matrices

PAM matrix (Percent/Point Accepted Mutation Matrix) BLOSUM (BLOcks SUbstitution Matrix)

Amino acid/protein scoring matrices

Sostituzioni : mismatches

P > 0 lo scambio AAx ↔ AAy si osserva più frequentemente di quanto atteso per caso P = 0 la frequenza della sostituzione è indistinguibile da quella casuale P < 0 lo scambio AAx ↔ AAy è più raro di quanto atteso per caso

ogni valore indica la probabilità che l’AAx sia sostituito con l’AAy attraverso una o più mutazioni accettate in uno specifico intervallo evolutivo, rispetto alla probabilità che i due aminoacidi siano stati allineati per caso

Sostituzioni : mismatches

BLOSUM (BLOcks SUbstitution Matrix)

• Henikoff and Henikoff (1992): matrice basata su molte più osservazioni della PAM: scambi aminoacidici calcolati su circa 2000 «blocchi»

• Blocco: regione conservata di una famiglia di proteine senza indels

• Direttamente calcolate sulla base di allineamenti locali – Probabilità di sostituzione (conservazione)

– Frequenza degli aminoacidi

Sostituzioni : mismatches

E: Asp D: Glu

Default in BLAST Sostituzioni : mismatches

Maggiore il punteggio (score) maggiormente imparentate sono le sequenze

Maggiore è il valore, più simili sono le proteine utilizzate nel calcolo della matrice

Sostituzioni : mismatches

Gap penalties Costo delle indels (GAP) Quanto è probabile una

certa sostituzione (matrici)

• Costo dell’introduzione di un gap (Gap opening penalty: G) • Costo dell’estensione di un gap (Gap extension penalty: L*n)

• Costo complessivo: G+Ln

Questi sono valori usati spesso, ma si possono cambiare!

In/Dels : gaps

Algoritmi di allineamento

• Obiettivo: trovare il miglior allineamento, cioè il massimo numero di simboli identici e il minor numero di gap (=minor numero di mutazioni = più breve percorso evolutivo)

• Per due sequenze di DNA di 200 basi ci sono 10153 possibili allineamenti….meglio non farli a mano!

Dynamic programming = tecnica computazionale. Si usa per effettuare ricerche complesse dividendole in una successione di piccoli passaggi, inizialmente semplici e poi più complessi. L’ultimo passaggio contiene la soluzione complessiva

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Algoritmi di allineamento

• Esausitivi o esatti: esplorano tutte le possibili soluzioni e scelgono la migliore (lenti, computazionalmente intensi, precisi)

• Euristici: prendono ‘scorciatoie’ e cercano di arrivare ad una soluzione ottimale basandosi su ipotesi plausibili

Algoritmi di allineamento comuni

Algoritmo Esaustivo? Loc/Glo Mul align Db searches

Needleman-Wunsch

Si Global Si No

Smith-Waterman

Si Local Si Si

FASTA No Local Si Si

BLAST No Local No Si

• Exact global alignment method

– Non adatto in molti casi (es. db searches, ricerca di piccole regioni di similarità, allinemanti tra sequenze con grosse differenze di lunghezza)

– Il più rigoroso e completo se lo scopo è di allineare sequenze che non si sono evolute per exon shuffling, inserzione/delezione di domini, etc.

– Il metodo migliore se le sequenze sono di lunghezze simili e si sono evolute da un antenato comune attraverso mutazioni di punto, piccole ind/dels

Needleman-Wunsch

• Exact local alignment method

– Modifica del N-W che permette di allineare in locale (non serve allineare tutta la seq)

– Allineamento molto buono per db searching, allineamento multiplo e a coppie

– Esaustivo, quindi può essere molto lento. A differenza del N-W considera qualunque allineamento che parta da qualunque posizione della sequenza, non solo quelli che cominciano all’inizio e terminano alla fine

Smith-Waterman

• Euristico locale

– Prima identifica regioni di identità tra la sequenza sonda (‘query’) e le sequenze in db. (KTUP)

– I geni o proteine con la densità maggiore di segnale vengono riesaminati

– L’allineamento viene esteso ad entrambi i lati delle regioni di match aggiungendo gaps e mismatches sulla base di matrici di punteggio

– L’allineamento ottiene un punteggio

FASTA: http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/ Pearson WR (1996) Effective protein sequence comparison. Academic Press Inc 227-258 Pearson WR and Lipman DJ (1998) Improved tools for biological sequence comparison. PNAS 85:2444

NB: leggere l’HELP del programma