Insegnamento di Genomica

Corsi di Laurea Specialistica in: Biotecnologie Agro-industrialiBiologia Molecolare e cellulare

docenti:Silvia Fuselli ( fss@unife.it )

Vincenza ColonnaInga Prokopenko

Morena de Bastiani

Definizioni

• Genomica: Scienza che si interessa della determinazione e dello studio, a livello molecolare, dell’intera sequenza di DNA di un organismo.

• Genoma: L’intero contenuto genico di un organismo vivente

InformaticaGenetica Molecolare

Primi computerCollegamento tra DNA ed ereditarietà

1940-1950

Primo computer commerciale

Struttura del DNA1950-1960

ChipCodice genetico1960-1970

Internet collega 4 università americane

Sequenziamento DNA1970-1980

PCPCR1980-1990

Internet collega tutto il mondo

Progetto genoma umano1990-oggi

Bioinformatica• Informatica applicata alla biologia (molecolare)

con diversi scopi:

– Generazione di dati:• Interpretazione di dati di sequenziamento • “Assemblaggio” di sequenze e genomi

– Organizzazione di dati:• I dati sono memorizzati in banche dati di pubblico

dominio• Devono essere accessibili per parole chiave o comunque

in modo “semplice”• Devono essere “collegati” tra loro in modo logico: da un

cromosoma devo potere risalire ai geni mappati sul cromosoma, dai geni alle proteine che codificano, e così via

Bioinformatica

• Ma anche analisi (alcuni esempi):– Analisi delle sequenze nucleotidiche per la localizzazione di

geni ed elementi di regolazione.– Analisi delle sequenze proteiche allo scopo di riconoscerne

la funzione biologica.– Studio delle interazioni intermolecolari tra proteine e acidi

nucleici allo scopo di riconoscerne la funzione e sviluppare nuovi farmaci.

– Studio dell’evoluzione di geni e genomi per la loro classificazione funzionale e filogenetica

– Studio dell’espressione dei geni in diverse condizioni– Sviluppo di tecniche diagnostiche innovative– Progettazione e applicazione di modelli che simulino i

processi biologici cellulari

Trascrittomica

Proteomica

Reti metaboliche

Genomica

Identificazione, studio e analisi funzionale dell’intero contenuto di mRNA di una cellula.

Determinazione e studio dell’intera sequenza del DNA di un organismo.

Identificazione e studio dell’espressione dei geni(associati a malattie e non) in essa contenuti.

Studio sistematico della struttura (primaria, secon-daria, terziaria), della funzione e delle interazioni tra proteine.

Studio di serie di processi biochimici legati tra loro darelazioni funzionali.

Es:. Processi chimici e biochimici che portano alla morte cellulare nelle patologie tumorali

5 agosto 2005 – da ensembl

5 maggio 2006 – da ensembl

Ensembl release 53 - Mar 2009

Obiettivi fondamentali della Genomica

• Stabilire un database ed un’interfaccia di ricerca, reciprocamente integrati e disponibili su Internet

• Ottenere e combinare mappe fisiche e genetiche del genoma• Generare ed ordinare sequenze genomiche e sequenze di geni espressi

(allineamento contig, segnali di sequenze espresse: EST)• Identificare ed annotare tutti i geni codificati da un determinato genoma• Costruire atlanti di espressione genica (analisi dei microarray)• Accumulare dati funzionali, identificando le caratteristiche biochimiche,

cellulare e fisiologiche dei geni (Genomica funzionale, Farmacogenomica).• Caratterizzare la diversità di sequenza del DNA attraverso lo studio della

distribuzione dei polimorfismi, analisi del LD (Genetica forense, Genetica delle popolazioni)

• Fornire le risorse per eseguire comparazioni tra i genomi (Genomicacomparativa)

Tutti i “progetti genoma” condividono un gruppo comune di scopi:

Programma• Anatomia dei genomi

– I genomi dei procarioti– I genomi degli eucarioti (I genomi nucleari, I genomi degli organelli)

• Studio dei genomi– Enzimi (nucleasi,ligasi,ecc.), Clonazione, Vettori (BAC, YAC, ecc.),

PCR

• La mappatura dei genomi– Mappatura genetica (RFLP, SSLP, SNPs ecc.)– Mappatura fisica (restrizione, FISH, STS, ecc.)

• Metodi per il sequenziamento del DNA– Metodi di sequenziamento– Assemblaggio dei contigua

• Funzionamento dei genomi– I domini della cromatina– Modificazioni della cromatina e l’espressione del genoma

• Progetto Genoma umano• Evoluzione dei Genomi

Diversi tessuti umani sono formati da cellule che si comportano in modo diverso

(nel corpo umano ci sono circa 6x1013 cellule)

Ogni cellula contiene una esatta copia del genoma (che non è altro che l’intera sequenza del DNA dell’organismo)

All’interno del nucleo della cellula ci sono i cromosomi: 22 paia di autosomi

e un paio di cromosomi sessuali XY

Nei cromosomi si possono individuare porzioni di DNA codificante chiamati geni

Dogma Centrale

L’ espressione dell’informazione genetica raccolta nelle molecole di DNA, avviene in due stadi:

–(i) trascrizione , durante la quale il DNA è trascritto in mRNA

–(ii) traduzione , durante la quale l’ mRNA è tradotto per produrre la proteina associata

DNA mRNA proteine

Espressione DifferenzialeSe ogni cellula contiene una copia dell’intero genoma, e le cellule sono di diversi tipi (cellule muscolari, cellule cardiache, cellule della pelle, cellule del sangue …),

Che cosa le rende differenti ?

Espressione genica differenziale , cioè: quando , dove , e in che quantità ogni gene è espresso.

Il controllo dell’espressione genica può essere esercitato ad ogni tappa del processo che termina con la sintesi proteica ma avviene prevalentemente a livello della prima tappa, ovvero a livello dellatrascrizione del DNA in RNA messaggero.

Anatomia dei genomi

EUCARIOTI: nucleo, mitocondri (cloroplasti)

• eubatteri (gram +, gram -, cianobatteri)

• archeobatteri

• piante • animali• funghi• protozoi

PROCARIOTI

Anatomia dei genomi eucariotici

Componenti nucleari e mitocondrali del genoma umano

Genoma mitocondriale: molecola di DNA circolare di 16.569 bp;

Ci sono ~ 800 mt per cellula e ~10 copie di mtDNA per mitocondrio = 8000 molecole di mtDNA

Genoma nucleare: 3,2 Gbcomposto da 46 molecole di DNA lineare:

La molecola più corta è di ~ 47Mb e la più lunga è di ~ 245 Mb

Il genoma mitocondriale umanoSequenziato nel 1981 (Anderson et al.)

Control region

16.569 bp

Il Genoma umano in numeri

• 23 paia di cromosomi;

• 2 metri di DNA;

• 3,200,000,000 bp (3,2 Gb; 3,200 Mb; 3,200,000 kb);

• 20,000-25,000 geni.

???????????

Dicembre, 2003

Maggio, 2004Maggio, 2005

10% di sequenze ripetute non assegnabili perché appartengono a telomeri, centromeri ecc.

Science. 1996 Jun 21;272(5269):1755-62.

The complete 685-kilobase DNA sequence of the human beta T cell receptorlocus.

Rowen L, Koop BF, Hood L.Department of Molecular Biotechnology, University of Washington, Seattle 98195-7730, USA.

The human beta T cell receptor (TCR) locus, comprisinga complex family of genes, has been sequenced. The locus contains two types of coding elements-TCRelements (65 variable gene segments and two clustersof diversity, joining, and constant segments) and eighttrypsinogen genes --that constitute 4.6 percent of the DNA. Genome-wide interspersed repeats and locus-specific repeats span 30 and 47 percent, respectively, of the 685-kilobase sequence. A comparison of the germline variable elements with their approximately 300 complementary DNA counterparts reveals markeddifferential patterns of variable gene expression, the importance of exonuclease activity in generating TCR diversity, and the predominant tendency for onlyfunctional variable elements to be present in complementary DNA libraries.

65 Vß; 2 cluster DJC con 1 D ß, 6-7 Jß, 1 Cß

Un segmento del genoma umano

Locus:Recettore ß delle cellule T

685 Kb

50 Kb

Cromosoma 7

Cosa contiene questa regione di 50 kb, parte del locus che codifica il β T-cell receptor?

• un gene: TRY4 (5 esoni, 4 introni)• due segmenti genici: V28 e V29-1, discontinui

• uno pseudogene: TRY5

• 52 “genome-wide repeat sequences”: 4 tipi tutti presenti (LINEs, SINEs, elementi LTR, trasposoni)

• due microsatelliti• il rimanente 50% della sequenza è composto di

DNA a singola copia, non genico e non ripetitivo, a funzione ignota

• tutti sono suddivisi in 2 o + molecole lineari

• tutti gli eucarioti hanno anche genomi mitocondriali , alcuni anche cloroplastici

• le caratteristiche generali sono comuni, l’unico aspetto molto variabile è la grandezza

• il n° di cromosomi non è legato alla complessità della specie, né alla grandezza del genoma

(es. salamandra ha un genoma 30 volte più grande dell’uomo ed è distribuito su un n° di cromosomi che è la metà di quello umano)

GENOMI EUCARIOTI

Le dimensioni dei genomi dei vari organismi sono molto variabili. L’ordine di grandezza però coincide in un certo modo con la complessità dell’organismo:

•eucarioti semplici (funghi) hanno genomi piccoli,

•eucarioti superiori (vertebrati o piante a fiore) hanno genomi grandi

AMEBA?!?!?

paradosso del valore Cparadosso del valore Cparadosso del valore Cparadosso del valore C

Contenuto in paia di basi del genoma aploide

Paradosso del valore CParadosso del valore CParadosso del valore CParadosso del valore C

manca correlazione tra la complessitàcomplessitàcomplessitàcomplessità di

un organismo e la grandezzagrandezzagrandezzagrandezza del suo

genomagenomagenomagenoma

La grandezza del genoma è correlata al numero di geni in esso contenuti???

Paradosso del numero dei geniParadosso del numero dei geniParadosso del numero dei geniParadosso del numero dei geni

es: genoma di lievito = 12 Mb uomo ha ~ 25.000 geni

genoma umano = 3200 Mb

0.004 x genoma umano lievito dovrebbe avere

25.000 x 0.004= 100 geni

in realtà ne ha 5.800

la correlazione tra le dimensionidimensionidimensionidimensioni del genoma

di un organismo ed il numero di geninumero di geninumero di geninumero di geni in esso

contenuto non ènon ènon ènon è affatto esattaesattaesattaesatta!

Ipotesi:Ipotesi:Ipotesi:Ipotesi: i genomi più grossi presentano un numero di geni maggiore

Specie Dimensioni del genoma (Mb)

N° geni approssimativo

Eucarioti S. Cerevisiae 12,1 5800 C. elegans 97 19000 Arabitopsis thaliana (erba galletta) 125 25500* D. Melanogaster 180 13600 Homo Sapiens 3200 27000 Batteri Mycoplasma genitalium 0,58 500 Streptococcus pneumoniae 2,16 2300 Vibrio cholerae EI Tor N16961 4,03 4000 Mycobacterium tubercolosis H37Rv 4,41 4000 Escherichia coli K12 4,64 4400 Yersinia pestis CO92 4,65 4100 Pseudomonas aeruginosa PA01 6,26 5700 Archea Methanococcus jannaschii 1,16 1750 Archaeoglobulus fulgidusla) 2,18 2500

(*) (*) (*) (*) circa 8000 geni sono specifici per la fotosintesi

Cr. 3

Cr. 7

• contiene più geni (26 per proteine e 2 per tRNA)

• i geni discontinui sono molto pochi: solo 239 introni in tot (nell’uomo > di 300.000)

• ci sono poche genome wide repeats: una LTR (Ty2) e 4 LTR troncate (sequenze delta). In questo caso LTR sono 16% del tot, ma in realtà, su tutto il genoma, sono solo il 3.4% (nell’uomo il 44%, in drosofila il 12%)

rispetto a quello umano il segmento del genoma di lievito

soluzione:soluzione:soluzione:soluzione: i genomi degli organismi

meno complessi hanno i geni

strettamente impacchettati, e per

questo risultano più piccoli.

Sembra che le genome-wide repeats abbianoruolo importante nel determinare il grado di compattezza di un genoma in mais sembranocostituire ~ 50% del genoma

sta emergendo che nei genomi di alcune specie

queste repeats hanno proliferato massicciamente

questo spiegherebbe perché genomi di speciemolto simili possono essere anche molto diversiper grandezza

Riflette l’eterogeneità degli eventi evolutivi che hanno portato al modellamento dei diversi genomi