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genetica molecolare lezione 16/11/2007universita di pavia
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Le Tecnologie diBiologia Molecolare
nella ricerca Biomedica
La possibilità di accedere a tecnologie del DNA ricombinante rappresenta un grande vantaggio per la ricerca biomedica.
Queste tecnologie possono essere particolarmente utili per:
a) Aiuto nella formulazione di una diagnosi;b) Caratterizzazione funzionale di un fattore genetico;
Tecnologie considerate
PCR DNART-PCR cDNASequenziamento DNA
Southern Blot DNANorthern Blot RNA
Diagnosi di difetto genetico
Paziente con cariotipo XY ma con fenotipo femminile
15-20% di questi pazienti hanno un’alterazione del gene SRY
Analisi del gene SRY
Delezione Mutazione puntiforme
Totale Parziale
Delezione Mutazione puntiforme
Totale Parziale
PCR Sequenziamento
Migrazione elettroforetica del DNA
Il DNA (e l’RNA) possiede carica negativa e pertanto in particolari matrici (gel di agarosio e poliacrilammide) se sottoposto ad un campo elettrico tende a migrare verso il polo positivo.
La velocità con cui un frammento migra verso il polo positivo è proporzionale alla sua dimensione
M1,353 bp
1,078 bp
271 bp
310 bp
603 bp
194 bp
98 bp
852 bp
Necessari metodi di rilevamento per “vedere” il DNA (o RNA) EtBr
P C R
Polymerase Chain Reaction
Reazione a catena di polimerizzazione del DNA
ObiettivoProdurre una notevole quantità di copie di un frammento di DNA di interesse che viene sottoposto ad amplificazione
PCR
1988
P C R
Regione di interesse(non necessaria la conoscenza della sequenza)
5’
5’3’
3’Primer F
Primer R
Reazione enzimatica con: DNA polimerasi
dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) A C T G
2 primers (innesco)
Template (stampo)
P C R
Animazione
Applicazioni della P C R
Fornisce una risposta qualitativa (c’è o non c’è?) su una data
sequenza genomica
PCR – analisi mutazionale di geni
Prodotti di PCR
Sequenziamento direttoSSCPDDGE
PCR – Tipizzazione polimorfismi (varianti neutre del DNA)
Prodotto di PCR
Digestione enzimi di restrizioneRFLP
VNTR (VariationNumber TandemRepeat)
SNP (Single NucleotidePolimorphism)
PCR – Genotipizzazione VNTR (Microsatelliti)
GATCAGCTGAGGACTATAGCCAGTCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTACTGACCCAGTTTAACAGAATAGCAAC
p M
RT - P C R
Polymerase Chain Reaction
Reazione a catena di polimerizzazione del DNA
Il materiale di partenza è RNA che viene retrotrascritto in cDNA
Studio dell’espressione dei geni (++)
RT
tessuto
AAAAA
AAAAA
AAAAA
AAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAATTTTTTTTTTTTTTTTT
cDNA
Reverse transcriptase
RT - PCR
cDNA
PCR positiva = gene espresso nel tessuto da cui è stato estratto l’RNA
RT - PCR
Qualitativa: “espresso, non espresso”Quantitativa: “quanto è espresso” (con speciali accorgimenti e/o speciali apparecchiature)
Serve anche a verificare eventuali fenomeni di splicing alternativo in funzione dei primers utilizzati
Rapidità, scarsità di materiale
Isoforma 1
Isoforma 2
RT-PCR
Un vantaggio della tecnologia di RT-PCR è la possibilità di amplificare e sequenziare direttamente un gene che possiede una struttura esoni/introni molto frammentata.
- Disponibilità di un tessuto che esprima il gene
RT-PCR
Analisi di mutazioni che non interessano il cds ma che comprendono siti di splicing
- Disponibilità di un tessuto che esprima il gene
Splicing normaleSplicing aberrante
ag ag aggt at gt
Sequenziamento
Per sequenziamento si intende la lettura ordinata delle basi che compongono una catena
di DNA
La tecnologia odierna permette di attuare facilmente questo processo solo in presenza di una notevole quantità di copie del frammento da sequenziare
Prodotti di PCR
Cloni plasmidici, BAC, PAC
DNA genomico
Sequenziamento
Senso della lettura
Lettura possibile di 600-800 basi dopo l’oligonucleotide-innesco
Sequenziamento
AGTCAAAGTACAGTGATCATAGCGATATCGATGTGTGACAGTAGGTTTCAT
Reazione enzimatica con: DNA polimerasi
dNTP (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) - 90%A C T G
ddNTP (ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP) – 10%A C T G
1 Primer innesco
Sintesi nuovo DNA
MOLTE COPIE!!!!!
Sequenziamento
AGTCAAAGTACAGTGATCATAGCGATATCGATGTGTGACAGTAGGTTTCAT
GTCACT
GTCACTAGTATCGCTATAGCTACACACTGTCATC
GTCACTAGTAT
GTC
GTCACTAGTATCGCTATA
GTCACTAGTATCG
GTCACTAGTATCGCTATAGCT
GTCACTAGTATCGCTATAGCTACACAC
Sequenziamento
AGTCAAAGTACAGTGATCATAGCGATATCGATGTGTGACAGTAGGTTTCAT
GGTGTCGTCAGTCACGTCACTGTCACTAGTCACTAGGTCACTAGTGTCACTAGTAGTCACTAGTATGTCACTAGTATCGTCACTAGTATCGGTCACTAGTATCGCGTCACTAGTATCGCTGTCACTAGTATCGCTAGTCACTAGTATCGCTATGTCACTAGTATCGCTATAGTCACTAGTATCGCTATAGGTCACTAGTATCGCTATAGCGTCACTAGTATCGCTATAGCTGTCACTAGTATCGCTATAGCTAGTCACTAGTATCGCTATAGCTACGTCACTAGTATCGCTATAGCTACAGTCACTAGTATCGCTATAGCTACAC
Migrazione elettroforetica+
Lettura fluorocromi
Sequenziamento
-
+ Lettore laser
Animazione
Ibridazione Acidi Nucleici
ATCGTTTGCGTAGTGCAGT
TAGCAAACGCATCACGTCA
TAGCAAACGCATCACGTCA
SONDA (DNA o cDNA)
Ibridazione Acidi Nucleici
In funzione di alcuni parametri operativi della tecnica possiamo ottenere ibridazioni altamente specifiche oppure permettere ibridazioni meno
specifiche.
Southern Blot
Attuata sul DNA
DNA digerito con enzimi di restrizione e sottoposto a elettroforesi
Tecnica che fornisce una risposta qualitativa e quantitativa
Tecnica utilizzata per individuare la presenza (o assenza) di un frammento di
acido nucleico in un genoma
Southern Blot
DNA Digestione conEcoRI
M T
-
+
10 Kb
5 Kb
3 Kb
2 Kb
2.5 Kb
MigrazioneGel agarosio
DenaturazioneCon NaOH
Trasferimentosu membrana di nylon
Fissazione
Southern Blot
ATGGCAGTAACG
Marcatura
ATGGCAGTAACG
Ibridazione
Lavaggi
Rivelazione
Southern Blot
3 Kb
EcoRI EcoRI
3 Kb
ATGGCAGTAACG
Applicazioni possibili
Identificazione aberrazioni cromosomiche strutturali
DelezioniDuplicazioniInversioni……
Tutte quelle aberrazioni cha causano un cambiamento della lunghezza del
frammento compreso tra i due siti di taglio dell’enzima utilizzato e contenente la
sequenza specifica della sonda utilizzata.
SB - Delezione
EcoRI EcoRI
WTEcoRI EcoRI
-EcoRI
wt/wt wt/- -/-
SB - Delezione
EcoRI EcoRI
WTEcoRI
wt/wt wt/- -/-
EcoRI
-EcoRIEcoRI
SB - Duplicazioni
wt/wt wt/- -/-
EcoRI EcoRI
WTEcoRIEcoRI EcoRI
WTEcoRI EcoRI
-EcoRIEcoRI
-EcoRIEcoRI EcoRI
SB - Inversioni
wt/wt wt/- -/-
EcoRI EcoRI
WTEcoRIEcoRI EcoRI
WTEcoRI EcoRI
-EcoRI
-EcoRIEcoRI
Southern Blot - Test
Test.
Pazi
en
te 1
Pazi
en
te 2
Pazi
en
te 3
Pazi
en
te 4
Pazi
en
te 5
Pazi
en
te 6
Pazi
en
te 7
Pazi
en
te 8
Pazi
en
te 9
Pazi
en
te 1
0
EcoRI EcoRI EcoRI
delezione
Southern Blot – tra specie diverse
Attuando lavaggi meno stringenti posso evidenziare sequenze simili tra specie diverse, ossia permettere un minor numero di legami tra sonda e sequenza omologa, e quindi evidenziare la presenza o meno di una sequenza simile.
ZOO-BLOT
ZOO - Blot
H.
Sap
ien
s
Dog
Cat
Mou
se
Rat
Pig
Catt
le
Goat
Sh
eep
Tu
rtle
Ch
iken
Northern Blot
Attuata sull’RNA
RNA non digerito
Tecnica che fornisce una risposta qualitativa e quantitativa
Tecnica utilizzata per individuare la lunghezza di un mRNA e per studiare l’espressione di un gene
nei diversi tessuti
Northern Blot
AAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAA
mRNA
M T
-
+
10 Kb
5 Kb
3 Kb
2 Kb
2.5 Kb
MigrazioneGel agarosio
TrsferimentoSu membrana
Fissazione
Northern Blot
ATGGCAGTAACG
Marcatura
ATGGCAGTAACG
Ibridazione
Lavaggi
Rivelazione
Northern Blot
3 Kb
3 Kb
AAAAAAAAAAATGGCAGTAACG
Northern Blot
Testi
colo
Ovaio
Feg
ato
Milza
Pelle
Inte
sti
no
Cerv
ello
Su
rren
e
HeLa
Pla
cen
ta
Ren
e
AAAAAA
Espres. Ubiquitaria
AAAAAA
Splicing Alternativo
Northern Blot
Testi
colo
Ovaio
Feg
ato
Milza
Pelle
Inte
sti
no
Cerv
ello
Su
rren
e
HeLa
Pla
cen
ta
Ren
e
AAAAAA
Espres. Specifica
Northern Blot
Testi
colo
Ovaio
Feg
ato
Milza
Pelle
Inte
sti
no
Cerv
ello
Su
rren
e
HeLa
Pla
cen
ta
Ren
e
Quantitativa
AAAAAA
Northern Blot
AAAAAA 10 d
pc
11 d
pc
12 d
pc
13 d
pc
14 d
pc
10 d
pc
11 d
pc
12 d
pc
13 d
pc
14 d
pc
HeLa
Testis Ovary
Quantitativa
Southern e Northern Blot
Tecniche di ibridazione di acidi nucleici
Tecniche cha forniscono una risposta quantitativa
Tecniche cha forniscono una risposta qualitativa
Southern e Northern Blot
Evidenziare e quantificare la presenza di una regione genomica
Evidenziare e quantificare la presenza di un trascritto di un gene in un dato tessuto
in un dato momento