LÆGEMIDDELFORSKNING - ku · Af Jette Christensen, Dan Stærk, Hanne L. Ziegler, Majid Sairafianpour og Jerzy W. Jaroszewski 4. Skræddersyede lægemidler til individuelle genomer

2 0 0 1

D A N M A R K S

F A R M A C E U T I S K E

H Ø J S K O L E

LÆGEMIDDELFORSKNINGLÆGEMIDDELFORSKNING

2

Fra svampegift til potentielt lægemiddel med ny virkning

De mest kendte af fluesvampens gifte er muscarin og musci-mol. Muscarin aktiverer de muscarine receptorer, som bl.a.forekommer i hjertemuskulaturen, hvilket er årsag til dendødbringende effekt ved indtagelse af større mængder afden tørrede fluesvamp.I modsætning til muscarin trænger muscimol gennem blod-hjerne-barrieren og aktiverer GABA-receptorerne på hjer-nens nerveceller meget kraftigt. GABA er hjernens vigtigstehæmmende signalstof. De alvorlige psykiske forstyrrelser,som ses hos mennesker, der indtager den tørrede fluesvamp,skyldes primært muscimols effekt på GABA-systemet.Denne artikel beskriver et mangeårigt projekt, hvor vi hartæmmet giften muscimol til det lovende lægemiddelstofTHIP, som i kliniske forsøg viser en helt ny farmakologisk pro-fil.

Muscimol som modelstofMuscimol har som nævnt en kraftig stimulerende effekt påhjernens GABA-receptorer. Muscimols aktivering af recepto-rerne er væsentlig stærkere end GABA’s egen, og toksicitetenskyldes sandsynligvis, at muscimol bindes for kraftigt tilGABA-receptorerne og dermed på en måde sætter dem ud afspillet. Toksiciteten kan også til dels skyldes, at muscimol bli-ver omdannet til andre giftige forbindelser af enzymer i hjer-nen og i øvrigt påvirker andre funktioner i GABA-signalsy-stemet. Ikke desto mindre er muscimol et interessant medicinalke-misk modelstof for udvikling af lægemidler til behandling afsygdomme, som skyldes ubalance i GABA-systemet, og sommuligvis kan afhjælpes gennem påvirkning af GABA-recep-torerne. Spørgsmålet var fra starten, om vi kunne tæmmeeffekten af muscimol og omdanne dette særegne stof til etlægemiddel med en ønsket og kontrolleret virkning.I den første fase af projektet opstillede vi en hypotese ved-rørende muscimols kraftige stimulerende virkning på GABA-receptorerne. Hypotesen blev fremsat på et tidspunkt, hvorvi intet vidste om GABA-receptorernes struktur og funktion.Muscimol har på grund af det indbyggede ringsystem enlangt mere fastlåst struktur end GABA; kun molekylets side-kæde kan drejes. Muscimol kan indtage to konformationer,som i følge hypotesen muliggør en trinvis binding, hvorvedstoffet tilpasser sig receptoren. Først bindes muscimol tilreceptoren, hvorefter der sker en konformationsændring fraden relativt stabile konformation I til den mindre favorablekonformation II. Efter bindingen til receptoren forestillede vios, at muscimolmolekylet med hjælp fra receptoren igen villeændre konformation henimod den mere stabile konformati-on I, og at den herved frigjorte energi var tilstrækkelig til ataktivere receptoren.For at underbygge denne hypotese blev stoffet THIP synteti-seret som modelstof. I THIP er muscimol fastlåst i den ufavo-

Muscimol fra rød fluesvamp forårsager de alvorlige psy-kiske forstyrrelser, som kan optræde hos mennesker, derhar indtaget den tørrede svamp. I et mangeårigt projekthar vi tæmmet giftstoffet til forbindelsen THIP, som i kli-niske forsøg viser en helt ny farmakologisk profil, somkan føre til udvikling af nye sovemidler og smertestillen-de lægemidler.

Af Povl Krogsgaard-Larsen og Lotte Brehm

Den røde fluesvamp, Amanita muscaria, danner flere struk-turelt særegne stoffer, hvoraf nogle påvirker det periferenervesystem, mens andre udøver deres effekt på centralner-vesystemet, dvs. hjernen og rygmarven. Stofferne kan forgif-te både mennesker og dyr, og denne toksicitet afspejler, atstofferne påvirker vitale fysiologiske mekanismer.

L æ g e m i d d e l f o r s k n i n g - 2 0 0 1

Smuk, men farlig - den røde fluesvamp, Amanita muscaria. Nården tørrede svamp indtages i større mængder kan indholdsstof-ferne forårsage dødbringende uregelmæssigheder i hjertefunk-tionen og alvorlige psykotiske forstyrrelser. t

D a n m a r k s F a r m a c e u t i s k e H ø j s k o l e

Indhold

3

1. Fra svampegift til potentielt lægemiddel med ny virkning 2-5Af Povl Krogsgaard-Larsen og Lotte Brehm

2. Nyt lægemiddel forbedrer søvnen 6-7Af Martin Mortensen, Jan Kehler, Povl Krogsgaard-Larsen og Bjarke Ebert

3. Forbedret test af nye lægemidler mod malaria 8-9Af Jette Christensen, Dan Stærk, Hanne L. Ziegler,

Majid Sairafianpour og Jerzy W. Jaroszewski

4. Skræddersyede lægemidler til individuelle genomer 10-11Af Claus Møldrup

5. Stofskiftesygdomme - fra gen til terapi 12-13Af Trine Meldgaard Lund, Ernst Christensen,

Arne Schousboe og Allan Meldgaard Lund

6. Håb om bedre behandling af brystkræft 14-15Af Martin Wenckens, Per Vedsø, Mikael Begtrup og Palle Jakobsen

7. Proteiner som lægemidler 16-17Af Susanne Sønderkær, Lars Lindgaard Hansen, James Flink, Sven Frøkjær

8. Fra krampefremkaldende til krampestillende effekt 18-19Af Ulf Madsen, Tine B. Stensbøl, Hans Bräuner-Osborne og Connie Sánchez

9. Et bud på fremtidens lægemidler mod epilepsi 20-21Af Rasmus P. Clausen, Orla M. Larsson, Jeremy Greenwood og

Povl Krogsgaard-Larsen

10. Fokus på hjernens støtteceller 22-23Af Helle S. Waagepetersen, Orla M. Larsson og Arne Schousboe

11. Genvej til hjernen via næsen 24-25Af Morten Aavad Bagger og Erik Bechgaard

12. Ind gennem tarmens lymfesystem 26-27Af René Holm, Anette Müllertz og Henning Gjelstrup Kristensen

13. Computeren er medicinalindustriens krystalkugle 28-29Af Jan Høst, Flemming Steen Jørgensen, Inge Thøger Christensen,

Lars Hovgaard og Sven Frøkjær

14. E-screening af lægemidler 30-31Af Flemming Steen Jørgensen, Jørgen Bonefeld Kristensen og

Inge Thøger Christensen

15. Optagelse af nye vacciner i kroppens immunceller 32-33Af Camilla Foged, Birger Brodin og Sven Frøkjær

16. DNA-vaccine mod salmonella 34-35Af Jesper Drøgemüller, Peter Thygensen, Erik Riise og Jan Engberg

17. Højfølsomme mikroteknikker til analyse af blod og urin 36-37Af Lars Bendahl, Bente Gammelgaard, Ole Jøns, Ole Farver og

Steen Honoré Hansen

18. Farmaceutisk omsorg på apotekerne 38-39Af Charlotte Rossing, Ebba Holme Hansen og Janine Marie Morgall

FRA GIFT TIL LÆGEMIDDELSTOF

Figuren viser to konformationer af giftstoffet muscimol, Iog II, samt strukturen af det potentielle lægemiddelstofTHIP. Alle tre stoffer binder sig til GABA-receptorer på hjer-nens nerveceller.Muscimol aktiverer GABA-receptorer 100 procent og skiftermuligvis mellem de to konformationer under bindingen tilreceptoren. THIP aktiverer GABA-receptorer langt mereskånsomt. Stoffet er en såkaldt partiel GABA-agonist. THIPer således en tæmmet udgave af muscimol – et potentieltog lovende lægemiddelstof.

SYNTESE AF THIP

Fremstillingen af THIP sker gennem en syntese med mangetrin, som er skitseret i figuren. Strategien har været atopbygge 6-ringen i THIP og derefter at opbygge funktionel-le grupper på ringen, hvilket muliggjorde tilbygningen af 5-ringen. Som vist indeholder udgangsstoffet A kun et af dekulstofatomer, der kommer til at indgå i GABA-delen afTHIP. Gennem seks syntesetrin omdannes A til B, som nuindeholder alle de fire kulstofatomer, som kommer til atudgøre GABA-delen i målmolekylet. Gennem to yderligeretrin omdannes grupper på ringen af B til grupper på C, sommuliggør cyklisering til den bicykliske ringstruktur. Detkræver 3 syntesetrin at omdanne C til THIP.

Muscimol

“Lav-energi”konformation I

“Høj-energi”konformation II

“Frossen”konformation II

THIP

O

O

O

O

O

ONNN

H3N

H3N H2N

O

O

O

O

O

O

O O

OO

N N

NNH2N

CH3O

CH3O

OC2H5

NHOH

A B

CTHIP

FLUESVAMPENS GIFTSTOFFER


Fra svampegift til potentielt lægemiddel med ny virkning

4

mært denne effekt, der ligger til grund for alvorlige for-giftninger, eventuelt med dødeligt forløb efter indtagelse af større mængder af tørret fluesvamp.Fluesvampen biosyntetiserer også aminosyren ibotensy-re, som indeholder en 3-hydroxyisoxazolgruppe. Hy-droxygruppen på isoxazolringen har sur karakter afomtrent samme styrke som en carboxylgruppe.Ibotensyre er således en strukturanalog af glutaminsyremed 3-hydroxyisoxazolgruppen i stedet for glutaminsy-rens carboxylgruppe. Denne strukturelle lighed kanligge til grund for, at ibotensyre er i stand til at aktive-re receptorerne for signalstoffet glutaminsyre. Dentørrede fluesvamp indeholder også stoffet muscimol,som strukturelt ligner signalstoffet GABA. Svampen bio-syntetiserer ikke muscimol; men under tørringsproces-sen taber ibotensyre sin carboxylgruppe under fraspalt-ning af kuldioxid, og bliver derved til muscimol. I deområder i verden, hvor fluesvampen anvendes somrusmiddel, er det den tørrede svamp, der indtages.Effekten på centralnervesystemet skyldes primært ind-holdet af muscimol. De forvirringstilstande – og efterindtagelse af større mængder tørret svamp – psykotiskeforstyrrelser, der karakteriserer rusen, er primært resul-tatet af, at muscimol meget kraftigt aktiverer hjernensreceptorer for signalstoffet GABA.Ibotensyre er toksisk over for flere lavere dyrearterbl.a. fluer. Det er næppe ibotensyren selv, der dræberfluerne, idet flere analoger af glutaminsyre, sompåvirker receptorerne for glutaminsyre endnu krafti-gere end ibotensyre, ikke er toksiske over for fluer.Alle dyrearter har receptorer for GABA, og den toksi-ske effekt skyldes efter al sandsynlighed, at ibotensy-re i dyrene omdannes til muscimol, som påvirkerGABA-receptorerne.Fraspaltningen af carboxylgruppen i ibotensyre kata-lyseres af enzymet GAD, som i alle organismer kata-lyserer dannelsen af GABA ud fra glutaminsyre.Meget tyder altså på, at fluesvampen har fundet dethensigtsmæssigt at danne ibotensyre som transport-form af muscimol som forsvar mod forskellige arteraf dyr. En anden funktion af ibotensyre er i øvrigt atudgøre en strukturel komponent af svampens rødefarvestof.Strukturen af ibotensyre og muscimol er entydigt fast-lagt ved røntgenkrystallografiske analyser. Strukturenaf begge stoffer er enestående, og der findes ikkeandre naturstoffer, som indeholder den sure 3-hydroxyisoxazol-ringstruktur. Den nederste del af figu-ren viser strukturen af ibotensyre og muscimol.

De vigtigste farmakologisk aktive indholdsstoffer i denrøde fluesvamp er muscarin, ibotensyre og muscimol. Iden øverste figur illustreres den strukturelle lighedmellem ibotensyre og muscimol og hjernens signalstof-fer glutaminsyre og GABA.Stoffet muscarin er i stand til at aktivere den under-gruppe af receptorer for signalstoffet acetylcholin, derbetegnes muscarine receptorer. Muscarin indeholder enpermanent positiv ladning. Stoffet kan derfor ikketrænge gennem den fedtholdige blod-hjerne-barriere,som adskiller blodbanen fra hjernevævet. Muscarinaktiverer derfor kun de muscarine receptorer i det peri-fere nervesystem, bl.a. i hjertemuskulaturen. Det er pri-

OH

ON

Muscarin

Ibotensyre Muscimol

O

O

O

OO

O

NNH3NH3N

H3N H3N

O OO

O

O

O

- CO2GAD

Glutaminsyre GABA

Ibotensyre

Muscimol


5

Dr. pharm. Povl

Krogsgaard Larsen er

professor ved Institut

for Medicinalkemi og

rektor på DFH.

Ph.d. Lotte Brehm er

lektor ved Institut for

Medicinalkemi.

rable konformation II, som vi mente muscimol kunne antagei forbindelse med bindingen til GABA-receptoren. På grund afden fastlåste konformation mente vi, at THIP nok ville bindesig til receptoren, men måske ikke være i stand til at aktivereden.Det blev vist, at THIP binder effektivt til GABA-receptoren omend ikke helt så kraftigt som muscimol. Men til vores overra-skelse viste det sig, at THIP også i høj grad var i stand til ataktivere receptoren. Det betød, at den del af hypotesen, dervedrørte selve aktiveringsmekanismen, var forkert. Det kunnealtså ikke alene være frigjort energi ved muscimolmolekyletsændring af konformation fra II til I, som aktiverer receptoren.Hvilken mekanisme, der aktiverer GABA-receptoren, er i dag,mange år senere, fortsat uafklaret.Men det skulle vise sig, at vi havde fundet det helt rigtigestof, omend af den forkerte grund. Gennem flere års studierer det nu blevet klarlagt, at THIP i modsætning til muscimolspecifikt stimulerer GABA-receptorer og kun dem. Og mensmuscimol aktiverer receptorerne 100 procent, gør THIP det påen langt mere skånsom og afdæmpet måde.Det var lykkedes at tæmme muscimol, og efter omfattendestudier af THIP tonede konturerne af et nyt lægemiddelstoffrem.

THIP i kliniske undersøgelserØnsker man at trænge ind på nye farmakologiske og tera-peutiske områder, er det selvsagt nødvendigt med nye stof-fer, der hverken kan købes eller på anden måde erhverves.De må syntetiseres, og i mange tilfælde er synteserne van-skelige og særdeles tidsrøvende. Det gælder også for THIP.Det tog mere end et år at syntetisere de første 50 mg afstoffet og yderligere adskillige måneder, før metoden varvidereudviklet til at fremstille THIP i gramskala. H.Lundbeck A/S har nu stoffet i udvikling og har efter årsintens forskning formået at udbygge syntesemetoden tilproduktion af THIP i stor skala.Tilsammen har alle disse forhold banet vejen for kliniskeforsøg med THIP. Undersøgelser i patienter har vist, at THIPbesidder meget kraftig smertestillende effekt. Det skelsæt-tende i denne sammenhæng er, at THIP’s smertestillendeeffekt er helt uafhængig af hjernens opiatsystem – detsystem, der medierer morfins effekt på smerter. Vi står altsåmed et nyt smertestillende stof, hvis effekt ikke ledsages afmorfinpræparaternes bivirkningsmønster. Dertil kommer,at det i de seneste år er blevet vist, at THIP har meget inter-essante effekter på søvnmekanismerne i mennesker. Det eren spændende kombination af kliniske effekter.

Det foreliggende projekt er et mangeårigt samarbejdspro-jekt mellem forskere på Institut for Medicinalkemi, DFH ogfirmaet H. Lundbeck A/S.

GENNEM BLOD-HJERNE-BARRIEREN

THIP, og i øvrigt også muscimol, er i modsætning til signal-stoffet GABA i stand til at trænge gennem blod-hjerne-bar-rieren. GABA-molekylet er næsten 100 procent elektriskladet, og på grund af denne ladede struktur er GABA ikke istand til at trænge gennem blod-hjerne-barrieren. LigesomGABA er både muscimol og THIP elektrisk ladede, men forbegge disse stoffer gælder det, at omkring 0,1 procent afmolekylerne i vandig opløsning foreligger i uladet form.Den uladede form kan trænge gennem blod-hjerne-barrie-ren. Inde i hjernevævet, på den anden side af barrieren, ind-stiller ligevægten sig igen med 99,9 procent af stoffet THIPi elektrisk ladet form, og det er denne form, der binder tilog aktiverer GABA-receptorerne. Mere præcist er det enundergruppe af GABA-receptorer, GABAΑ, der aktiveres afmuscimol og THIP.I modsætning til muscimol viser THIP meget ringe toksiciteti dyr og mennesker. Dette forhold skyldes muligvis i nogengrad, at aminogruppen (NH-gruppen) i THIP er indbygget ien ring og dermed beskyttet mod den enzymatiske proces,der nedbryder sidekæden i muscimol.

RØNTGENSTRUKTUR AF THIP

THIP er et nyt potentielt lægemiddel, som viser en spænd-ende farmakologisk profil og en bemærkelsesværdig spe-cificitet. Stoffet har kun effekt på GABAΑ-receptorerne.Der er syntetiseret en mangfoldighed af strukturelt bes-lægtede forbindelser, men ingen af dem evner at aktivereGABAΑ-receptorerne. THIP er således en enestående for-bindelse.THIP er et meget fastlåst molekyle. Det betyder, at denstruktur af THIP, der er blevet bestemt ved en røntgen-kry-stallografisk analyse, må formodes at illustrere THIP i denform, der bindes til og aktiverer GABAΑ-receptorerne.Første trin i analysen er at dyrke krystaller af THIP. Krystallenanbringes i en intens røntgenstråle, som spredes af ato-merne i krystallen. Den spredte stråling danner et mønster,og ud fra spredningsmønstret kan man entydigt beregneden tredimensionelle atomare struktur af THIP.

THIP

GABA THIP

O

O

O

O ON N

N N

THIP

O

O O

OH

OH

HN

HN

H2N

H2N

H3N

Blodbane

Hjerne

Aktivering af

GABAA-receptorer

t


Nyt lægemiddel forbedrer søvnen

samme er tilfældet ved brug af traditionelle sovemidler.Sovemidler som Rohypnol og andre benzodiazepiner fjernernemlig overgangene mellem de forskellige søvntilstande. Såselv om man har sovet dybt hele natten, kan man stadigvækvære søvnig og uoplagt den følgende dag; nogle føler detsom om de har en mild omgang tømmermænd. Udover dårlig søvn er der mange andre bivirkninger ved ben-zodiazepinerne. Den væsentligste er nok, at man alleredeefter den første uge er blevet vænnet så meget til sovemid-let, at man for det første har brug for større mængder for atfå sovet og for det andet kommer til at ligge søvnløs, hvisman stopper med tabletterne. Grunden er, at når vi kemisktvinger hjernen til at sove med benzodiazepiner, slukker vifor bevidstheden ved at stimulere hjernens vigtigste hæm-mende signalsystem - GABA-systemet - som dæmper nerve-cellernes aktivitet i hjernen.Når man overaktiverer et af hjernens signalsystemer, for-søger systemet straks at mindske aktiveringen på sammemåde, som når hørelsen bliver midlertidigt nedsat ved megethøj musik. GABA-systemet bliver således mindre følsomt, nårman overaktiverer det. Samtidigt vil hjernens stimulerendesignalsystemer begynde at blive mere aktive for at modvirkehæmningen af hjernen. Tilsammen betyder det, at ens hjer-ne efter nogle ugers behandling er blevet afhængig af sove-midlet. Derfor har man behov for at få mere medicin for atfalde i søvn, og samtidig får man abstinenser, hvis man stop-per med at bruge sovemidlet.

Det rigtige håndtagLøsningen på disse problemer er at udvikle nye sovemidler,der i stedet for blot få hjernen til at falde i søvn også forbed-

Forskere på Danmarks Farmaceutiske Højskole og H.Lundbeck A/S undersøger mekanismen bag en ny typesovemiddel, som forbedrer søvnens kvalitet. Dyreforsøghar vist, at stoffet hverken skaber afhængighed ellermedfører abstinenser, og nye forsøg med ældre menne-sker tegner lovende.

Af Martin Mortensen, Jan Kehler, Povl Krogsgaard-Larsen og Bjarke Ebert

Alle har prøvet at ligge søvnløse om natten og opdaget, atden næste dag ofte præges af irritation og trang til en lillelur. Men for en stor del af befolkningen er søvnløshed mereend blot en enkelt nats venden og drejen i sengen - for demer det en langvarig tilstand, der er lige så invaliderende somsmerter og depression. Faktisk resulterer søvnløshed ofte idepression, og manglende søvn gør under alle omstændig-heder hverdagen meget svær for den søvnløse. Behandlingen af søvnløshed er umiddelbart simpel: Et sove-middel – så ligger man i det mindste ikke vågen. Men des-værre er søvn ikke blot en periode, hvor man ligger stille.Søvnen er i høj grad hjernens frikvarter, hvor man er fri for attænke. Når man sover godt, kører hjernen skiftevis på højtryk,mens man drømmer, og langsomt i rolige perioder med dybsøvn. Om morgenen vågner man efter en nats drømme meden hjerne, der er blevet renset og er klar til en ny dag. Netopvekselvirkningen mellem drømme og dyb søvn er vigtigt forgod søvn, så hvis samspillet hæmmes, får det konsekvenser.Hvis man vågner mange gange i løbet af natten, får hjernenikke vekslet mellem drømmesøvn og drømmeløs søvn. Og det

Simulationen viser forskellige typer GABA-receptorer på over-fladen af en nervecelle.

Øverst ses et elektroencefalogram (EEG), som med blåt viserhjernens elektriske aktivitet under en del af den normale søvn.Her veksler perioder med hektisk aktivitet med rolige periodermed lav aktivitet. Nederst ses med rødt et EEG af en forsøgsper-son, der har fået et traditionelt sovemiddel, et benzodiazepin.Her viser hjerneaktiviteten, at forsøgspersonen hele tiden soverdybt og mangler de hektiske perioder med drømme.

6

Normal

Med benzodiazepin


rer kvaliteten af søvnen og ikke gør hjernen afhængig. Menkan man det?Ja, meget tyder på det! Men for at forstå mekanismen er detnødvendigt at kigge nærmere på GABA-systemet. GABA-systemet består af en mængde forskellige receptorer påhjernens nerveceller, og alle receptorerne kan aktiveres afsignalstoffet GABA. Når en GABA-receptor stimuleres afGABA, medfører det, at nervecellen bliver mindre aktiv.GABA-systemet kan derfor opfattes som hjernens overord-nede bremse, som forhindrer, at signalprocesserne løberløbsk. De forskellige typer af GABA-receptorer er placeretsærlige steder i hjernen, således at en type findes i områder,der har betydning for søvn, mens andre er lokaliseret i dedele af hjernen, der har betydning for hukommelse, angsteller smerte. Visse typer GABA-receptorer findes næstenoveralt i hjernen.Problemet med benzodiazepinerne er, at sovemidlernepåvirker de GABA-receptorer, der findes næsten overalt ihjernen, og derfor kan det ikke undre, at der er en mæng-de bivirkninger forbundet med brugen af disse stoffer.Målet er derfor at udvikle stoffer, som mere specifikt kanramme og påvirke de receptorer, der findes i de områder afhjernen, som er vigtige for søvnens kvalitet.Det er ikke nogen nem opgave! Faktisk var det indtil fornylig stort set umuligt, fordi man ikke vidste, hvilke typer afGABA-receptorer, der er ansvarlig for søvnen. Derfor kunneman selvfølgelig ikke fremstille lægemiddelstoffer, der vir-ker på netop den rigtige receptortype. Men nu har situati-onen ændret sig.

God søvn uden afhængighedFor nogle år siden opdagede professor Marike Lancel vedMax Planck Instituttet i Tyskland nemlig, at lægemiddels-toffet THIP, der er syntetiseret på Danmarks FarmaceutiskeHøjskole af professor Povl Krogsgaard-Larsen, i dyreforsøgvar i stand til at forbedre dyrenes søvnkvalitet. Efter-følgende har Lancel vist, at længere tids behandling tilsy-neladende heller ikke medfører de kendte problemer medfaldende effekt og abstinenser hos forsøgsdyrene.På den baggrund besluttede H. Lundbeck A/S, at THIP, somfirmaet allerede i midten af 1980’erne havde undersøgt, nuskulle udvikles som en helt ny type sovemiddel under navnetgaboxadol.En ting er at have et nyt og spændende lægemiddel i udvik-ling, noget andet er at forstå virkningsmekanismen. For atopnå en dybere forståelse af, hvad det er, som bestemmeraktiviteten af stoffer som THIP har vi i et samarbejde mellemDanmarks Farmaceutiske Højskole og H. Lundbeck A/S frem-stillet og undersøgt THIP-lignede stoffer, der virker på for-skellige typer af GABA-receptorer.For at kunne undersøge en enkelt type GABA-receptorer ad

Cand.scient. Martin

Mortensen er ph.d.-

studerende ved

Institut for

Farmakologi.

Ph.d. Jan Kehler er

medicinalkemiker

ved Medicinalkemisk

Afdeling på

H. Lundbeck A/S.

Dr.pharm. Povl

Krogsgaard-Larsen er


for Medicinalkemi

og rektor på DFH.

Ph.d. Bjarke Ebert er

principal scientist ved

Molekylærfarmakolo-

gisk Afdeling på

H. Lundbeck A/S.

7

gangen er det nødvendigt at klone dem og derpå få nogle cel-ler til at danne receptorerne. Til det formål har vi gennem deseneste år benyttet ubefrugtede æg fra en sydafrikansk frø tilat danne receptorerne. Æggene fungerer som en slags syntes-efabrikker. Når man indsprøjter et gen, der koder for en recep-tor, i et frøæg, vil ægget i løbet af kort tid danne receptoren isin overflade. På den måde har vi fremstillet frøæg med for-skellige typer GABA-receptorer.Derefter kan vi undersøge, hvordan forskellige lægemiddels-toffer påvirker de forskellige typer af receptorer. Vi har pådenne måde karakteriseret en mængde stoffer på mange for-skellige GABA-receptorer og til vores store overraskelse ser detud til, at THIP er et helt unikt stof. THIP er nemlig det enestestof, som aktiverer GABA-receptorer af type 4 meget stærkt.Netop denne GABA-receptor er placeret i de områder af hjer-nen, som man mener har betydning for søvnens kvalitet. DaTHIP er det eneste stof, som virker så godt på denne receptor,mener vi, at vi er ved at forstå baggrunden for THIP’s effekt påsøvnen. Ingen af de stoffer, som vi eller andre har undersøgt,har nemlig den samme aktivitet på søvnen som THIP. Samspilletmellem forskellige faggrupper fra Danmarks FarmaceutiskeHøjskole og H. Lundbeck A/S har i denne sammenhæng værethelt nødvendig for at kunne opnå en dybere viden.Professor Lancel har for nyligt vist, at ældre mennesker medsøvnbesvær sover fastere og er væsentligt mere veludhviledenår de har fået gaboxadol. Det er derfor utroligt spændende,om vi her virkelig står med en helt ny type sovemedicin, derforbedrer kvaliteten af søvnen uden de bivirkninger, som mannormalt ser. Gaboxadol undersøges netop nu i klinisk fase II-studier, hvor patienter med søvnproblemer får lægemidlet. Ogefter disse studier venter der flere meget omfattende under-søgelser. Der kommer derfor sikkert til at gå cirka 4 til 5 årinden THIP som lægemidlet gaboxadol kommer på markedet.

IAATHIPP4S

1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6

Eff

ek

t

Diagrammerne viser, hvordan forskellige typer GABA-receptorerpåvirkes af lægemiddelstofferne P4S og THIP samt stoffet IAA,som hjernen selv danner. THIP er det eneste af stofferne, deraktiverer receptorer af type 4 stærkt. Netop disse receptorer fin-des i de områder af hjernen, der har betydning for søvnen.

Receptortype


Forbedret test af nye lægemidler

mod malariade største hindringer for den sociale og økonomiskeudvikling i Afrika, hvor mere end 90 procent af alle mala-riatilfældene forekommer. Alene i år 2000 skønnes deøkonomiske tab som følge af malaria at have været 29milliarder kr.Sygdommens geografiske udbredelse har været stigendei de senere år. Spredningen af malaria skyldes bl.a. æn-dret brug af landområder i de ramte lande, globale kli-maændringer, krige og massive flygtningestrømme tilellers ikke ramte områder. Globalisering og den stærktforøgede rejseaktivitet medfører, at flere og flere dan-skere kommer i kontakt med malaria. I 1999 importerede207 danskere malaria og på trods af, at Danmark råderover et moderne sundhedsvæsen, så dør én ud af 100malariaramte danskere.

Problemer med behandling En medvirkende faktor til udbredelsen af malaria er spred-ningen af malariaparasitter, som er modstandsdygtigeover for behandling med de traditionelle lægemidler modsygdommen. En af WHO’s fire globale kontrolstrategierfor malaria er således, at en tidlig diagnosticering ogbehandling er nødvendig for at kunne bekæmpe sygdom-men.Det betyder, at adgangen til billige og effektive lægemid-ler skal øges i de malariaramte områder i verden. Samtidiger det nødvendigt, at der udvikles nye og virksomme læge-midler til bekæmpelse af de resistente parasitter. Den mest udbredte og farligste art af malariaparasitten,Plasmodium falciparum, har i stigende grad og i størregeografiske områder udviklet resistens over for klorokin,som er det hyppigst anvendte middel mod sygdommen.Det samme er tilfældet for lægemidler som indeholdersulfadoxin, pyrimethamin, meflokin og kinin.Behovet for nye lægemidler mod malaria er derfor stort- specielt set i lyset af, at effektive og sikre vacciner modsygdommen stadig har lange udsigter, ikke mindst forbefolkningen i de områder, hvor epidemier er hyppige.WHO vurderer, at der er behov for et nyt lægemiddelmod malaria ca. hvert femte år. Det kræver en intensive-ring i screeningen af stoffer for virkning mod malaria,hvis denne del af WHO’s strategi skal lykkes.

Lægemidler fra naturenNaturen er en rig kilde til lægemidler mod mange syg-domme, og dette er også tilfældet med malaria. Kinin frakinabark og artemisinin fra en kinesisk malurt er eksem-pler på lægemidler fra naturen, som har dannet grund-lag for udvikling af nye syntetiske stoffer, som på for-skellig vis er bedre egnede til at bekæmpe sygdommenend naturstofferne selv.

Malaria skyldes en parasit, som er mester i at udvikle res-istens mod lægemidler. Derfor er det nødvendigt atintroducere ny medicin med få års mellemrum. DFH ermed i den globale indsats for at finde nye lægemidlermod sygdommen. Hvert år dør omkring to millionermennesker af malaria, og de fleste ofre er små børn.

Af Jette Christensen, Dan Stærk, Hanne L. Ziegler, Majid Sairafianpour og Jerzy W. Jaroszewski

Malaria er et af de mest alvorlige og komplekse sund-hedsproblemer, som verden står overfor. Sygdommenskyldes infektion med en parasit, der invaderer menne-skets røde blodlegemer. Parasitten formerer sig i enbestemt myggeart, der virker som mellemvært. Når myg-gen suger blod fra en smittebærer, videregives parasitteni dens spyt til en rask person ved næste stik.Infektionen giver indledningsvis symptomer, der minderom maveinfektioner og influenza, og anfaldene kommermed bestemte intervaller. Senere i forløbet kan ube-handlet malaria medføre alvorlig blodmangel meddøden til følge. Mange dødsfald skyldes også blokering

af blodkar til vitale organer som hjerne, lever og nyrer.I mange udviklingslande er malaria skyld i et

enormt antal dødsfald, store udgiftertil sundhedsvæsenet og mange

tabte arbejdsdage. Det skøn-nes, at 300 millioner men-

nesker, hovedsageligt iAfrika, Indien, Sydøst-asien og Sydamerika,har malaria. Mellem1,5 og 2,7 millionermennesker dør hvertår af sygdommen, oghovedparten er børnunder fem år. For at

sætte tingene i per-spektiv, svarer det til, at

syv jumbojets fyldt medbørn styrter ned hver dag

året rundt.Malaria kræver således lige

så mange dødsofre som f.eks.AIDS, og sygdommen er en af

Malaria er et særligt stortsundhedsproblem i Afrika,

og børn hører til denmest udsatte gruppe.

8


Man er nu på jagt efter nye ledestrukturer, der ligesomkinin og artemisin kan føre til udvikling af effektive syn-tetiske stoffer. En ledestruktur er et molekyle, som har enny kemisk opbygning og ofte også en ny virkningsmeka-nisme. I søgen efter nye ledestrukturer kan man udnyttenaturens kemiske mangfoldighed og underkaste natu-rens rige stofbibliotek en farmakologisk testning. Naturstofkemisk gruppe har intensiveret forskningen imalaria, og har i den forbindelse implementeret enmetode, som kan bruges til at teste naturstoffer for deresvirkning mod malariaparasitter. Metoden anvendes til atundersøge ekstrakter af forskellige planter for på denmåde at finde frem til planter med aktive indholdsstof-fer.Testen kan undersøge et meget stort antal planter forderes virkning mod malaria, og undersøgelserne kan bru-ges til at bestemme, hvilke planter der skal arbejdes vide-re med. Ligeledes kan metoden anvendes til en effektivog rationel isolering af de aktive indholdsstoffer i plan-terne, fordi aktiviteten mod malaria bestemmes i hvertenkelt trin af isoleringsfasen. Derved får man en målret-tet procedure for isolering og oprensning, hvilket sparertid i forhold til tidligere metoder.

Forskning på DFHTil trods for, at dyrkning af malariaparasitter er blevet enforholdsvis simpel opgave, råder kun få laboratorier i ver-den over en kontinuerlig og velfungerende biologisk testtil undersøgelser af stoffers virkning mod malaria.De testmetoder, som generelt anvendes til vurdering afstoffers virkning mod malaria, kan ofte af ukendte årsa-ger give upålidelige og variable resultater. Metoden, sombenyttes på DFH, blev oprindelig implementeret medhjælp fra forskere fra Rigshospitalet, men forskningen påDFH har resulteret i en videreudvikling af testen.Samtidig har vi identificeret flere faldgruber, som resul-terer i upræcise eller falske resultater.Da malariaparasitten lever inde i de røde blodlegemer, erdet vigtigt at vide, om stofferne er toksiske over for selveparasitten eller overfor værtscellen. Ganske vist vil øde-læggelse af de røde blodlegemer indirekte medføreparasittens død, men det er bestemt ikke ønskeligt at

ødelægge de røde blodlegemer hos patienterne. Derforer det vigtigt at kunne vise, om nye potentielle læge-middelstoffer alene skader parasitten. I samarbejde med et finsk forskerhold har vi identificereten type stoffer, der medfører falske resultater i testen,fordi de påvirker de røde blodlegemer og ikke parasit-ten. Det drejer sig om de såkaldte stomatocytogeneamphiphile stoffer, som på en særlig måde modificererde røde blodlegemers membraner og derved sandsynlig-vis påvirker kanaler i membranerne, som parasittenbenytter i forbindelse med vækst og formering.Til trods for, at dette resultat ikke i sig selv giver nyelægemiddelstoffer mod malaria, bidrager opdagelsenstærkt til at forhindre, at søgen efter nye ledestrukturerkører af sporet. Litteraturen er således fuld af beretnin-ger om påståede antimalariastoffer, som nu alligevel ikkesynes at påvirke selve parasittens biokemi.Vore resultater medvirker således stærkt til, at søgenefter nye lægemiddelstoffer mod malariaparasitten kanforetages hurtigere og mere rationelt.

Nye lægemiddelstofferDen nye test har i kombination med moderne teknologitil isolering og strukturopklaring af naturstoffer resulte-ret i, at vi har identificeret en række nye stoffer med enhøj toksicitet mod malariaparasitten. Stofferne under-søges nu nærmere for at afdække deres mulige egnet-hed til videre medicinalkemisk udvikling.Forskningen på DFH omfatter også undersøgelser af tra-ditionel naturmedicin. Her er afsløringen af uvirksomnaturmedicin, der anvendes i mange udviklingslande,lige så vigtig som fund af nye potentielle lægemiddels-toffer mod malaria.DFH er således ved at udvikle sig til et sted, hvor forske-re fra nær og fjern sender deres stoffer hen for at få demundersøgt for virkning mod malariaparasitten. Det drejersig både om private firmaer og om universitetslaborato-rier i såvel udviklingslande som industrilande. Samtidigforegår der et omfattende samarbejde for at finde nyeantiparasitære stoffer. DFH bidrager således til den glo-bale indsats for at fremme malariaforskning på detkemoterapeutiske plan.

Ph.d. Jette

Christensen er forsk-

ningsadjunkt ved

Institut for

Medicinalkemi.

Ph.d. Dan Stærk er

adjunkt ved Institut

for Medicinalkemi.

Cand.pharm. Hanne

L. Ziegler er ph.d.-

studerende ved

Institut for

Medicinalkemi.

Cand.pharm. Majid

Sairafianpour er

ph.d.-studerende

ved Institut for

Medicinalkemi.

Ph.d. Jerzy W.

Jaroszewski er profes-

sor ved Institut for

Medicinalkemi.

9

Malariaassay

Opskalering Isoleringsprocedure

Isoleringsprocedure

Nye ledestrukturer

Råekstrakter

Fraktioner medaktive indholdsstoffer

Pilotforsøg ilille skala

Der er et stort behov for nye lægemidler mod malaria, fordi parasitten hurtigt bliver resistent overfor eksisterendemedicin. Derfor testes et stort antal naturstoffer på DFH. Figuren viser princippet i undersøgelserne.


Skræddersyede lægemidler til individuelle genomer

filer, vil patienterne i fremtiden blive klassificeret i forhold tilderes individuelle arveanlæg, så de praktiserende læger kanudvælge et specifikt lægemiddel til en specifik patient. Ipraksis vil udvælgelsen foregå ved brug af en genchip, somanalyseres i konsultationen via et tilhørende softwarepro-gram.

Nye etiske problemerTrods de åbenbare fordele er farmakogenetikken ettveægget sværd, hvor man risikerer at erstatte én ulempemed én anden. Udviklingen vil nemlig udskifte de terapeuti-ske ulemper ved nutidens lægemidler med ulemper af mereetisk, social og økonomisk karakter.Til forskel fra i dag vil læger og myndigheder kunne aflæsespecifik information om en patients sygdom og genetiskeprofil. Lægemidlet bliver med andre ord en genetisk infor-mationsmarkør. Håndteringen af den detaljerede genetiskeinformation vil rejse etiske problemstillinger som hensynet tilindividets autonomi, herunder informeret samtykke, diskri-mination og rettigheder til genetiske data.Hidtil har disse problemstillinger været begrænset til stærkt

kontrollerede screeningsundersøgelser eller til kliniske for-søg på landets universitetshospitaler overfor mindre befolk-ningsgrupper. I de kommende år vil farmakogenetikkensudbredelse betyde, at problemstillingerne også får betyd-ning for den primære sundhedssektor og patienterne ialmindelighed.

Ud i offentlighedenEt centralt aspekt ved farmakogenetikken er, at vigtig infor-mation om vores personlige genetiske hemmeligheder auto-matisk bliver en del af det offentlige rum.Når vi i dag henter receptpligtig medicin på apoteket, indbe-rettes medicinforbruget til Lægemiddelstyrelsen og sygefor-sikringer. Samtidig er vi offentlige med vores medicin, nårdenne indtages på arbejdspladsen, i skolen eller når plejeper-sonale hjælper med at indgive medicinen i hjemmet. På denmåde bliver offentligheden bekendt med en persons læge-middelbrug. Men i fremtiden vil langt flere informationerblive offentligt tilgængelige.Hvor den praktiserende læge i dag har 35-40 præparater til atprøve sig frem med ved behandling af depression, vil patien-tens genetiske profil reducere dette antal til 1-2 præparater,som vil have maksimal effekt. På denne baggrund vil såveldirekte som indirekte informationsmodtagere ikke blotkunne opdage, at brugeren har en depression, men ogsåkunne udlede detaljeret viden om vedkommendes genetiskeprofil, fordi den pågældendes arveanlæg har bestemt valgetaf det anvendte lægemiddel. Hvis patienten indtager fleretyper lægemidler for forskellige diagnoser, vil kombinationenaf denne viden kunne give informationsmodtagerne yderli-

Fremtidens lægemidler vil blive skræddersyede til pati-enternes individuelle arveanlæg. Fordelen er bedrebehandlinger og færre bivirkninger. Prisen er, at folksDNA-profiler kommer ud i det offentlige rum. Det rejseretiske spørgsmål og skaber risiko for genetisk diskrimi-nation.

Af Claus Møldrup

Det samme lægemiddel kan virke fortrinligt på én person ogvære uden effekt på en anden - og måske endda medførealvorlige bivirkninger. Årsagen er, at vi er genetisk forskelli-ge og derfor omsætter lægemidler på forskellig vis i krop-pen. Den genetiske variation i befolkningen medfører, at etlægemiddel typisk kun virker optimalt på 50-70 procent af enpatientgruppe.I de senere år er det så småt blevet muligt at skræddersy nyelægemidler til bestemte patientgrupper, og vi har endnu kunset begyndelsen. I fremtiden vil der i stigende grad blive mar-kedsført lægemidler, som er baseret på genetiske profiler afforskellige grupper i befolkningen eller sågar designet tilenkelte individer.De nye lægemidler er baseret på farmakogenetik – lærenom, hvordan vore individuelle arveanlæg påvirker kroppensevne til at omsætte lægemidler. Farmakogenetikken vil førstslå igennem i lægemiddelforskningen og ved udvikling afnye lægemidler. Her vil medicinalindustrien anvende DNA-profiler i kliniske forsøg, hvor ny medicin afprøves på men-nesker. Ved at begynde med en genetisk screening af delta-gerne vil man nemlig på forhånd kunne frasortere personer,som må forventes at reagere dårligt på lægemidlet eller fåalvorlige bivirkninger af behandlingen.Følgelig vil lægemidler, som er målrettet mod undergrupperaf befolkningen, i stigende grad blive introduceret på mar-kedet. Der er ingen tvivl om, at farmakogenetikkens frem-march vil resultere i nye lægemidler med en bedre virkningog færre bivirkninger, og samtidig vil lægemidlerne hurtige-re komme på markedet og blive billigere end i dag.Dét må betragtes som et gode, da udvikling af lægemidlertraditionelt er en dyr og langvarig proces, hvor succesraten ertil at overse. Samtidig udgør bivirkninger og dårligt samspilmellem forskellig medicin en betydelig byrde for patienter-ne, de pårørende og for samfundsøkonomien. I USA menesbivirkninger og uheldige vekselvirkninger mellem lægemid-ler at være en af de hyppigste årsager til dødsfald, og der ernæppe grund til at tro, at situationen er anderledes iDanmark og Europa. Der er derfor mange gode grunde til, atmedicinsk praksis vil bevæge sig væk fra ”one size fits all” tilmere skræddersyede behandlinger – og det vil sandsynligvisske indenfor ganske få år.Da lægemidlerne er udviklet på baggrund af genetiske pro-

10


gere specifik viden om vedkommendes genetiske disposition.Informationerne vil naturligvis kunne sammenholdes medandre oplysninger af social og økonomisk karakter, som tilsammen vil kunne give en viden, som patienten måske ikkeengang selv er bekendt med. I udlandet har disse emnerallerede vakt stærke diskussioner i forhold til diskriminationi forsikringsspørgsmål og på arbejdsmarkedet. Dette er blotnogle få eksempler på, hvordan genetikkens indtog i læge-middelverdenen er startskuddet til genetikkens indtog i detoffentlige rum.Hvis ikke vi som individer, sundhedssystem og samfund for-

mår at uddanne og oplyse os, så vi opnår en hensigtsmæssigomgang med genetisk information, så vil generne naturligtudspille en af deres grundlæggende fristelser, nemlig lystentil at sladre. Der er således et stærkt behov for at fokusere påde etiske og samfundsmæssige aspekter af nye lægemidler,som vil blive udviklet med udgangspunkt i farmakogenetik.Især er der behov for at inddrage befolkningen og patien-terne i debatten gennem deling af viden og gennem oplys-ning. Ellers er der risiko for, at ubegrundet frygt eller mang-lende viden vil forhindre udviklingen af en helt ny dimensi-on indenfor rationel medicinsk behandling.

Ph.d. Claus Møldrup

er post.doc. ved

Institut for Samfunds-

farmaci.

1. år af post.doc.-

projektet er finansie-

ret af DFH og 2. år af

Center for Evaluering

og Medicinsk

Teknologivurdering

under Sundheds-

styrelsen.

11

Når en diagnose stilles i dag, f.eks. depression, har lægen 35-40 forskellige præparater at prøve sig frem med, indtil han eller hun –måske – finder det bedste lægemiddel til patienten. I fremtiden vil patientens genetiske profil blive aflæst af en DNA-chip ud fra enblodprøve eller en urinprøve. Ved hjælp af DNA-profilen kan lægen indsnævre antallet af lægemidler til et eller to, som vil have denmaksimale effekt på den pågældende patient. Dét er en fordel for behandlingen, men lægers, myndigheders, arbejdspladsers og for-sikringsselskabers adgang til den genetiske information rejser en række etiske spørgsmål og skaber risiko for genetisk diskrimination.

Fremtid

Nutid

Illustration: Henning Dalhoff

Fejl i stofskiftet er årsag til over 500 kendte sygdomme.Kortlægningen af det humane genom har forbedretmulighederne for at opklare årsagerne til sygdommeneog forstå deres biokemi. Udfordringen er nu at udviklebehandlingsmetoder.

Af Trine Meldgaard Lund, Ernst Christensen, Arne Schousboe og Allan Meldgaard Lund

Mere end 500 sygdomme skyldes fejl i kroppens omsætning afforskellige stoffer, og sygdommene er ofte voldsomt invalide-rende. Den første stofskiftesygdom blev beskrevet i 1902 afArchibald Garrod, som beskrev gigtsygdommen alkaptonuri,som ødelægger ledene i kroppen. Garrod postulerede, at enarvelig fejl i stofskiftet var årsag til sygdommen, og det blevsenere bekræftet, at gigten forårsages af en defekt i nedbryd-ningen af aminosyren tyrosin. Han vidste nok, at sygdommenvar arvelig, men der skulle gå næsten et århundrede, før genetfor alkaptonuri blev identificeret, og de arvelige mutationer igenet blev beskrevet hos patienter med sygdommen. En effek-tiv behandling findes endnu ikke, men er muligvis på vej.


12

Stofskiftesygdomme - fra gen til terapi

Fælles for stofskiftesygdomme er, at en omsætningsvej i stof-skiftet er ændret, fordi et af de involverede enzymer erdefekt. Typisk skal enzymet omsætte et substrat til et pro-dukt. Når enzymet ikke fungerer korrekt, vil substratet bliveophobet i kroppen, mens der opstår mangel på produktet.Desuden kan der via alternative reaktionsveje også dannesfor meget af andre stoffer. Det er således ophobning af ogmangel på bestemte stoffer, som er årsag til symptomerneved denne gruppe af lidelser.Forståelse af sygdomsmekanismerne har ført til, at man i dagkan behandle nogle af sygdommene med diæt, hvor de stof-fer, som ophobes i kroppen, fjernes fra kosten, mens man til-sætter de stoffer, som kroppen mangler. Et eksempel erFöllings sygdom (phenylketonuri), som ubehandlet fører tildyb åndssvaghed, men hvor intelligensen er normal, hvisbørn med sygdommen kommer på diæt umiddelbart efterfødslen. Enzymdefekterne bag stofskiftesygdommene er forårsagetaf mutationer i det gen, der koder for det pågældendeenzym. De sidste årtiers kortlægning af det humane genomhar givet os en betydelig forståelse af sygdommenes moleky-lære baggrund. Samtidig har kendskabet til menneskets sam-lede arvemasse forbedret mulighederne for at identificerede børn, som har en stofskiftesygdom. Udfordringen i denæste årtier er at bruge denne viden til at udvikle effektivebehandlingsformer, som rækker videre end den nuværendebehandling af symptomerne.

En alvorlig sygdomMed dette for øje har vi undersøgt en stofskiftesygdom, somkaldes glutarsyreuri type 1 (GA1). Historien er den samme:De biokemiske ændringer, enzymdefekten og gendefektener kendt, men den egentlige årsag til sygdommen er ukendt,og behandlingen er derfor kun symptomatisk.Ved fødslen ser børn med sygdommen umiddelbart raske ud,selv om de kan være lidt slappe, lidt irritable og lidt svære atgive mad. Flere af børnene har imidlertid store hoveder, ogen CT/MR-scanning af hjernen kan allerede på det tidspunktvise atrofi, især i pande- og tindingelapperne.Et år gamle har tre ud af fire børn oplevet en akut krise medsvær hjernepåvirkning og været i en grad af koma. Krisenefterlader børnene med udtalte forstyrrelser i deres evne tilat bevæge sig. Efterhånden optræder der også spasticitet, ogen del af børnene bliver mentalt retarderede. På tidspunktetfor den akutte krise viser CT/MR-scanning ødelæggelser dybtinde i hjernen. Disse påvirkninger af hjernen ligner dem, viser ved andre neurodegenerative sygdomme, hvor nervecel-lerne i hjernen henfalder og dør.GA1 skyldes, at enzymet glutaryl-CoA dehydrogenase ikkefungerer normalt. Hos flere børn med sygdommen har vi tid-ligere fundet mutationer i det gen, der koder for enzymet.

CT-scanning af hjernen hos et år gammelt barn med GA1. Barnet blev diagno-sticeret 7 måneder gammel på grund af bevægeforstyrrelser (dystoni). Der sesden karakteristiske atrofi svarende til pandelapper og tindingelapper.Basalganglierne (putamen og nucleus caudatus) ses ikke på optagelsen, menformodes også at være beskadiget pga. tilstedeværelsen af dystoni.


Ph.d. Trine Meldgaard

Lund er lektor ved

Institut for

Farmakologi.

Civilingeniør Ernst

Christensen er labora-

torieleder ved Klinisk

Genetisk Afdeling,

Rigshospitalet.

Dr.scient. Arne

Schousboe er profes-


Farmakologi.

Pædiater Allan

Meldgaard Lund er

1. reservelæge ved

Klinisk Genetisk

Afdeling,

Rigshospitalet.

13

Glutaryl-CoA dehydrogenase er et af nøgleenzymerne i ned-brydningen af aminosyrerne lysin, hydroxylysin og tryptofan.Ved nedsat eller manglende funktion af enzymet ophobesstofskifteprodukterne glutarsyre, trans-glutakonsyre og 3-OH-glutarsyre i kroppen, hvilket formodes at forårsage syg-dommens symptomer. Præcist hvordan vides ikke.Sygdomsbilledet kan pege på både en direkte toksisk effektog en energimangel i lighed med det billede, vi ser for visseneurodegenerative sygdomme, hvor signalstoffet glutamin-syre overstimulerer nervecellerne i hjernen. Energimanglenkan skyldes, at der opstår skader på cellernes kraftværker,mitokondrierne. Ser man på symptomerne, er der også flereligheder med de neurodegenerative sygdomme.På denne baggrund ønskede vi at undersøge, om ophobnin-gen af de tre stofskifteprodukter aktiverer nervecellernesreceptorer for glutaminsyre og dermed forårsager en celle-død, der kan forklare ødelæggelserne i hjernen. Hvis dette ertilfældet, vil en medicinsk behandling, som blokerer recepto-rerne for glutaminsyre, muligvis kunne forhindre nervecelle-døden.

Forgiftning af nervecellerI vore forsøg bruger vi kulturer af nerveceller fra mus. I mod-sætning til andre celletyper deler modne nerveceller sig nor-malt ikke. Men hvis man udtager nerveceller fra musefostrepå det rette tidspunkt i deres udvikling, kan man få nerve-celler i kultur til at danne et netværk af udløbere, præcis somi den intakte hjerne.I kulturen såvel som i hjernen foregår kommunikationenmellem nervecellerne via signalstoffer som glutaminsyre.Nervecellerne har flere typer receptorer for glutaminsyre,hvoraf en kaldes NMDA-receptoren. En overstimulering afNMDA-receptorerne forårsager celledød.Vi kan måle på cellernes overlevelse i kultur ved en test, hvoret gult farvestof tilsættes til kulturerne. Levende celler medintakte mitokondrier er i stand til at omsætte det gule farve-stof til et blåt farvestof. Ved at måle på denne omdannelsefår vi et mål for cellernes energiomsætning og dermed forderes levedygtighed. Hvis man overstimulerer NMDA-recep-torerne og dernæst måler på nervecellernes omdannelse afgult farvestof til blåt, kan man se, at omsætningen falder.Det viser, at mitokondrierne er ødelagt, og at cellerne er min-dre levedygtige.Vi har testet de tre stofskifteprodukter glutarsyre, trans-glu-takonsyre og 3-OH-glutarsyre og fundet, at alle tre stofferslår en del af cellerne ihjel ved blot et døgns behandling ikulturerne. Til sammenligning er patienterne konstant udsatfor forhøjede koncentrationer af disse stoffer.Næste spørgsmål er så, om effekten af stofferne skyldes over-stimulering af NMDA-receptorerne eller andre mekanismer.Ved at forbehandle cellerne med et stof, som selektivt blo-

kerer NMDA-receptorerne kan man forhindre celledød, somskyldes overstimulering af NMDA-receptorerne.I en serie af forsøg, hvor vi først har forbehandlet cellernemed det blokerende stof og dernæst udsat dem for hvert afde tre stoffer, som ophobes i sygdommen, forhindres celle-døden. Det er derfor sandsynligt, at de tre stofskifteproduk-ter overstimulerer nerveceller via NMDA-receptorerne. Denskade, der ses i hjernen hos patienterne, kan således forkla-res ved denne overstimulering.

Fremtidig behandlingResultaterne danner basis for at udvikle nye strategier forbehandling af GA1 udover den nuværende behandling, sombestår af en diæt. Behandlingen kunne inkludere blokade afNMDA-receptorerne.Fremtidige studier må afklare effekten af en sådan behand-ling. Her kan man bl.a. anvende de såkaldte knockout dyr,hvor der er slukket for et bestemt gen. Hvis genet for enzy-met glutaryl-CoA dehydrogenase mangler i et forsøgsdyr, vilvi have en god sygdomsmodel for GA1. Det er en klar udfordring i den post-genome æra at forbed-re behandlingen af GA1 børn og børn med andre stofskifte-sygdomme, specielt fordi let tilgængelig screening af nyfød-te snart vil muliggøre en tidlig behandling.

Stofskiftesygdomme skyldes fejl i en omsætningsvej i stof-skiftet, og fejlene opstår, fordi et enzym ikke fungerer kor-rekt. Tegningen viser en skematisk fremstilling af en omsæt-ningsvej. Det defekte enzym, symboliseret ved den sorteblok, skal normalt omsætte substratet A til produktet B, somvidere omsættes til produktet C. Når enzymet ikke fungererkorrekt, opstår der mangel på stofferne B og C, mens dersker en ophobning af substratet A og en stigning i nedbryd-ningsprodukterne D og E via alternative reaktionsveje.

STOFSKIFTESYGDOMME

Effekt af enzymmangel påstofomsætningen


Håb om bedre behandling af brystkræft

antiøstrogen effekt på kræftceller. Stoffet virker ved at for-trænge det kvindelige kønshormon østrogen fra en bestemtreceptor, som findes i et meget større antal på kræftcellerend på raske celler. Når østrogen er bundet til receptoren,danner cellen nye proteiner. Når Tamoxifen binder sig tilreceptoren, ændrer den struktur og produktionen af protei-ner går i stå. Det resulterer i, at kræftcellen ikke kan dannede proteiner, den har brug for, og til sidst dør den.Desværre nedbrydes Tamoxifen ret hurtigt i kroppen af etenzym, hvorved virkningen ophører. Samtidig medførernogle af nedbrydningsprodukterne bivirkninger, som sand-synligvis skyldes, at stofferne virker som østrogen. Andre afTamoxifens bivirkninger kan skyldes, at lægemidlet ogsåpåvirker sunde celler og således ikke virker selektivt nok.I et projektsamarbejde mellem Novo-Nordisk Health Care

De lægemidler, som i dag anvendes til behandling af bry-stkræft, nedbrydes for hurtigt i kroppen. En serie nyelægemiddelstoffer er mere stabile og vil derfor sandsyn-ligvis virke i længere tid. Flere af stofferne hæmmervæksten af kræftceller mere end de almindeligt benytte-de lægemidler.

Af Martin Wenckens, Per Vedsø, Mikael Begtrup og Palle Jakobsen

Omkring hver tiende kvinde bliver ramt af en eller andenform for brystkræft. For dem kan en medicinsk behandlinghave fordele, hvis den er effektiv og uden bivirkninger.I dag bruger lægerne bl.a. præparatet Tamoxifen til behand-ling af brystkræft. Tamoxifen er et syntetisk hormon, der har

14

Tamoxifen er et af de mest almindeligt anvendte lægemidler til behandling af brystkræft. De nye analoger til stoffet er mere stabileend Tamoxifen, hvorfor de sandsynligvis virker i længere tid i kroppen.

(CH3)2N

Tamoxifen

Dimethylaminoalkylgruppenfraspaltes

HO

Z-form med svag modsat virkning E-form med svag modsat virkning

HO

Under Tamoxifen’s nedbrydning i organismen kandimethylaminoalkylgruppen fraspaltes, og der opståren OH-gruppe. Forskydning af et elektronpar (vistsom to prikker) fra O-atomet indleder en række elek-tronforskydninger som dels medfører, at der dannesen E-form med stærk modsat virkning dels indlederen oxidation til uønskede nedbrydningsprodukter.

Elektronforskydning Elektronforskydning

Elektronforskydning

Drejning

HO 1 HO 1

HO + HO + OH

Oxidation

OR

NN

Tamoxifenanalog

I de nye Tamoxifeanaloger er der blokeret for forskyd-ning af O-atomets elektronpar. Derfor bevares denaktive struktur og stoffet nedbrydes ikke så let.


Cand.scient. Martin

Wenckens er ph.d.-

studerende ved

Institut for

Medicinalkemi.

Ph.d. Per Vedsø er

research scientist ved

Novo Nordisk A/S,

Health Care

Discovery, Måløv.

Ph.d. Mikael Begtrup

er professor ved

Institut for

Medicinalkemi.

Cand.scient Palle

Jakobsen er forsk-

ningskemiker ved

Novo Nordisk A/S,

Health Care

Discovery, Måløv.

15

Discovery A/S og Syntesegruppen på DFH har vi forsøgt atforbedre Tamoxifen ved at ændre på stoffets struktur.

Nye Tamoxifen analogerEn af nedbrydningsvejene for Tamoxifen i kroppen startermed, at en bestemt kemisk gruppe spaltes af lægemidlet.Herved får nedbrydningsproduktet en fri fenolgruppe, somgiver stoffet en svag østrogen virkning i stedet for denønskede antiøstrogene effekt, som Tamoxifen normalt besid-der. Fenolgruppen fremmer yderligere kemiske ændringer afnedbrydningsproduktet, så det får en kraftig østrogen effektog altså virker stik modsat Tamoxifen selv.Samtidig accelererer den frie fenolgruppe også den enzymati-ske nedbrydning af Tamoxifen i organismen. Nedbrydningensker ved oxidation, hvilket både kan inaktivere Tamoxifen ogøge stoffets vandopløselighed, så det hurtigere udskilles frakroppen.Syntesegruppen på DFH har udviklet en række analoger tilTamoxifen, hvor fenolgruppen er erstattet med en såkaldt N-hydroxyazol. Denne kemiske gruppe opfører sig på mangemåder som fenolgruppen, men den er mere stabil. Derforbevarer stofferne deres aktive kemiske struktur, og samtidignedbrydes de ikke så hurtigt ved oxidation. Erstatning affenolgruppen i Tamoxifen med en N-hydroxyazol kan såledesgive en Tamoxifen-analog, hvor den ønskede antiøstrogenevirkning bevares i længere tid, og hvor der ikke dannes ned-brydningsprodukter, som virker stik modsat af lægemiddels-toffet.Vi har designet en fleksibel syntesevej, hvor et fællesudgangsstof kan bruges til fremstilling af et stort antal for-skellige analoger af Tamoxifen.

Biologiske målingerTamoxifen virker ved at binde sig til en receptor, som normaltpåvirkes af østrogen, og som kaldes ERα. Når østrogen akti-verer receptoren, binder den sig til cellens DNA. Herved tæn-der receptoren for nogle gener, som så danner nye proteineri cellen. I kræftceller, hvor celledelingen foregår hurtigt, erder mange aktive ERα-receptorer. Når Tamoxifen binder sigtil en ERα-receptor, ændrer den struktur og kan ikke længe-re binde sig til DNA. Resultatet er, at kræftcellen ikke kanproducere de proteiner, den har brug for, og til sidst dør den.Et lægemiddelstofs binding til ERα-receptoren testes vedførst at lade radioaktivt mærket østrogen binde sig til recep-toren. Derefter tilsættes lægemiddelstoffet, som nu vil prøveat erstatte østrogen på receptoren. Efter et stykke tid målerman, hvor meget radioaktivt mærket østrogen, der har for-ladt ERα-receptorerne. Målingerne viser, hvor godt teststof-fet binder sig til receptoren sammenlignet med østrogen.Man kan også undersøge et lægemiddelstofs virkning direk-te på kræftceller, som dyrkes i kultur. Her tilsættes stoffetover en periode, hvorpå man måler, hvor meget det harhæmmet cellevæksten.Forsøgene med receptorer viste, at nogle af de syntetisere-de stoffer bandt sig til ERα-receptorerne. Disse stoffer blevså afprøvet på kræftceller, og det viste sig, at de kunnehæmme kræftcellernes vækst lige så godt, eller bedre endTamoxifen. Samtidig er vore stoffer mere stabile og må for-ventes at have en længere opholdstid i organismen endTamoxifen.Den udviklede syntesemetode er fleksibel og vil gøre det letat fremstille et stort antal lignende stoffer med henblik påat finde den helt optimale kemiske struktur.

Figuren viser princippet i den fleksible, trinvise syntese af analoger til Tamoxifen.

Platin-katalyse

Palladium-katalyse

Palladium-katalyse

Ved syntesen anvendesBor-forbindelser samt Platin og Palladiumkatalyse.lod-forbindelserne, der anvendes ide to trin, kan varieres. Derfor kander fremstilles et stort antalTamoxifenanaloger.

Tamoxifenanalog Isomert biprodukt

NN

OR

N

N

OR

NN O

OB

OR

O

O O

OBBOR

NN

B BO O

OO

Proteiner har et stort potentiale som lægemidler; de ermeget biologiske aktive og medfører få bivirkninger.Men proteiner er ustabile og kan blive nedbrudt underfremstillingen eller i det færdige lægemiddel. Derfor erder behov for at stabilisere proteiner, som skal brugessom lægemidler.

Af Susanne Sønderkær, Lars Lindgaard Hansen, James Flink og Sven Frøkjær

Mange proteiner er lovende som lægemidler, og i dag kanman fremstille proteiner i stor skala ved hjælp af gentekno-logi. Derfor vil mange nye protein-lægemidler blive mar-kedsført i de kommende år.Proteiner har flere fordele sammenlignet med almindeligelægemidler, som typisk består af små molekyler. Proteinerfindes ofte naturligt i kroppen, hvor de fungerer som celler-nes arbejdsheste. Som lægemidler virker proteiner megetspecifikt og effektivt, hvilket sandsynligvis vil medføre færrebivirkninger for patienten end ved brug af traditionellelægemidler.


Proteiner som lægemidler

Insulin er et velkendt eksempel på et protein, der bruges sommedicin til behandling af sukkersyge. Proteiner anvendesogså i behandlingen af kræft (interleukin-2), AIDS (interfer-on) og ved væksthormonmangel (væksthormon).Med kortlægningen af det humane genom vil vi komme til atse endnu flere proteinbaserede lægemidler, fordi det vil blivemuligt at vise, at bestemte sygdomme skyldes forhøjet ellernedsat produktion af bestemte proteiner. Kroppens produk-tion af proteiner bestemmes nemlig af vores gener. Hvis ensygdom skyldes underproduktion af et bestemt protein, kanden således behandles med et proteinbaseret lægemiddel.

Proteiners strukturProteiner er meget store sammenlignet med almindelige smålægemiddelstoffer, og de har en kompleks tredimensionelfacon. Proteiner er opbygget af aminosyrer, der er sat sam-men som perler på en snor. Aminosyrekæden foldes først tilbestemte karakteristiske strukturer (α-helix og β-sheet), somderefter lejres yderligere. Herved dannes proteinets tredi-mensionelle struktur, som bestemmer dets biologiske funkti-on.For at få et brugbart lægemiddel ud af et protein er vi nødttil at opretholde proteinets rumlige struktur, men desværreer proteinets form ikke særlig stabil og nedbrydes let.Konsekvensen af en sådan nedbrydning kan være tab af virk-ning eller i værste fald immunologiske reaktioner, som med-fører bivirkninger for patienten.Proteiner nedbrydes ofte ved en mekanisme, der kaldesaggregering, hvor flere proteiner går sammen og danner et

16

Proteiner har en meget kompleks struktur sammenlignet med almindeligelægemiddelstoffer, der består af små molekyler. Som eksempel er vist den tre-dimensionelle struktur af humant væksthormon. Væksthormons struktur erkarakteriseret ved fire α−helix-strukturer, der tilsammen danner et bundt.

Tilsætning af forskellige aminosyrer kan påvirke den fysiske sta-bilitet af væksthormon. Hvis en aminosyre stabiliserer væksthor-mon, går der længere tid, før væksthormon danner aggregater.Af de undersøgte aminosyrer, er arginin (arg) mest effektiv tilat stabilisere væksthormon.

7,5

5,0

2,5

0

phos arg asp gly ile thr trp

Antal timer før synlige aggregater


Cand. pharm.

Susanne Sønderkær

er ph.d.-studerende

ved Institut for

Farmaci.

Ph.d. Lars Lindgaard

Hansen er kemiker

ved Pharmexa.

Ph.d. James Flink er

specialkemiker ved

Novo Nordisk A/S.

Ph.d. Sven Frøkjær er


for Farmaci.

17

stort kompleks. Det kan medføre, at proteinet inaktivereseller forårsager bivirkninger hos patienten. Ved formuleringaf proteiner til lægemidler ønsker vi derfor ikke, at vort pro-tein aggregerer. Tværtimod gælder det om at sørge for, atproteinet forbliver på sin naturlige form.Naturen har selv opfundet en måde til stabilisering af prote-iner, nemlig ophobning af visse små molekyler i de celler,hvor proteiner oplagres. Disse stoffer stabiliserer sandsynlig-vis proteinerne ved at gøre deres struktur så kompakt somoverhovedet muligt, hvilket skaber de bedst mulige betin-gelser for proteiners stabilitet. Ved fremstilling af lægemidler, som indeholder proteiner erder risiko for, at proteinerne kan blive nedbrudt under såvelformulering som produktion og oprensning. For at opnå etgodt slutprodukt er det nødvendigt at forstå den fysiske ogkemiske ustabilitet af proteiner, samt hvordan nedbrydnin-gen påvirkes af formulering og opbevaringsbetingelser.I dette projekt fokuserer vi især på den fysiske stabilitet afterapeutisk aktive proteiner med henblik på at forstå, hvor-dan proteiner nedbrydes og stabiliseres ved hjælp af forskel-lige farmaceutiske hjælpestoffer. Et andet mål er at under-søge, hvorvidt det er muligt at forudsige holdbarheden af etgivet protein i en vandig opløsning ved hjælp af en eller flereanalytiske teknikker.Da dannelse af uønskede proteinkomplekser menes at fore-gå ud fra delvist udfoldede proteiner, må det forventes, atden størst mulige fysiske stabilitet kan opnås i formuleringer,hvor proteinernes struktur er meget kompakt.

Formulering af proteinerVed formulering af proteiner bruger man mange forskelligehjælpestoffer for at opnå en stabil formulering. Hjælpestofferer stoffer uden selvstændig terapeutisk effekt, der tilsættes tillægemidlet; et eksempel er mannitol.Selvom man i mange år har arbejdet med formulering af pro-teiner, tilsættes mange hjælpestoffer stadig på basis af erfa-ringer og ikke ud fra en generel og tilbundsgående viden.Årsagen er, at hver enkelt protein er unikt og kræver helt spe-cielle forhold for at bevare sin aktivitet.En karakterisering af, hvordan forskellige typer af hjælpestof-fer stabiliserer proteiner, vil givetvis kunne gøre det farmaceu-tiske formuleringsarbejde hurtigere, bedre og billigere. Vi harderfor valgt at se på, hvordan forskellige hjælpestoffer påvir-ker stabiliteten af udvalgte terapeutisk aktive proteiner.Et af vore mål er at undersøge effekten af aminosyrer i far-maceutisk relevante koncentrationer på proteiners fysiskestabilitet. Som testsæt har vi valgt seks ud af de 20 naturligtforekommende aminosyrer, og som modelproteiner udvalg-te vi væksthormon og insulin.

Effekten af aminosyrerne på et proteins stabilitet undersøgesved at omryste proteinet i en opløsning i kombination medde forskellige aminosyrer. Ved omrystningen dannes der engrænseflade mellem luften og proteinopløsningen, hvilketkan bevirke en delvis udfoldning af proteinerne og dermedmulighed for dannelse af aggregater. Testen gør det muligtat identificere de aminosyrer, som kan stabilisere proteiner-ne, men forsøgene fortæller ikke, hvilken mekanisme der eransvarlig for stabiliseringen.Den rumlige struktur af proteinerne i opløsning og i aggre-gater kan undersøges ved hjælp af infrarød spektroskopi.Metoden udnytter, at forskellige strukturer i proteinerneabsorberer infrarødt lys ved forskellige bølgelængder. Vedspektroskopien er det således muligt at få en ide om, hvilkestrukturer, der er involveret i dannelsen af aggregater.Hvis det lykkes at opnå en basal forståelse af, hvordan pro-teiner stabiliseres og nedbrydes, vil medicinalindustrienkunne formulere nye proteinbaserede lægemidler på etmere rationelt grundlag end i dag. Det vil medvirke til, at nyeprotein-lægemidler hurtigere vil komme gennem udviklings-processen fra idé til markedsføring.

FTIR-spektrofotometeret. I detteprojekt anvendes udstyret til under-søgelse af proteiners rumlige struk-tur. Der findes også mange andreanvendelsesmuligheder, eksempel-vis kontrol af råvarekvalitet.

Infrarød spektroskopi (FTIR) giver oplysninger om de strukture-lementer, som proteinet er opbygget af, f.eks. α-helix og β-sheet. Figuren viser FTIR-spektre af væksthormon i opløsning og i aggregater. Bemærk at aggregaterne indeholder mange β-sheets, som karakteriseret ved båndene ved 1625 og 1695 cm-1.Karakteristiske bånd er markeret med pile.

opløsningaggregat

bølgeantal (cm-1)

1720 1700 1680 1660 1640 1620 1600 1580


Fra krampefremkaldende til krampestillende effekt

Der er tidligere blevet udviklet stoffer, som er meget effekti-ve til at hæmme de ionotrope receptorer. I dyreforsøg harstofferne vist sig at være særdeles virksomme mod kramper,men desværre har de også haft alvorlige bivirkninger.Bivirkningerne skyldes at stofferne blokerer receptorerne foreffektivt. På grund af bivirkningerne ved blokade af de ionotropereceptorer er fokus nu flyttet til de metabotrope receptorer.Disse receptorer modulerer nervecellernes aktivitetsniveauog på grund af deres langsommere signalveje kan de repræs-entere en mildere måde at påvirke glutaminsyresystemet på.Målet er at finde nye effektive stoffer, som kan påvirke demetabotrope receptorer, og bruge disse stoffer til at opklarehvilke undertyper af receptorerne, som er vigtige i forbin-delse med epilepsikramper. På den baggrund kan det blivemuligt at skræddersy lægemidler, som kun påvirker netop derigtige receptorer, og som derfor ikke vil medføre alvorligebivirkninger.

Naturstof som ledetrådI jagten på midler med hæmmende effekt på glutaminsyre-receptorerne har stoffet ibotensyre spillet en afgørende rollefor forskningen i den neuromedicinalkemiske gruppe på Institutfor Medicinalkemi. Ibotensyre er et naturstof fra rød fluesvamp,og fluesvampens giftighed skyldes blandt andet indholdet afibotensyre.Ibotensyre har potent stimulerende effekt på flere typer gluta-minsyre-receptorer, både blandt de ionotrope og de metabo-trope receptorer. Ibotensyre er et molekyle, som indeholder enfemleddet ringstruktur, og vi har brugt ringen som ledetråd vedsyntesen af en række nye forbindelser, hvor den er blevet udsty-ret med sidekæder af forskellig længde. Disse stoffer har vist sig at have meget forskellige effekter på deforskellige typer af receptorer for glutaminsyre, og stoffer medselektiv virkning på såvel de tre ionotrope som på de tre meta-botrope receptorgrupper er blevet udviklet med ibotensyre sommodelstof. Stoffet homoibotensyre (HIBO) har stimulerende effekt på en afde ionotrope receptorer, men har også vist sig at kunne hæmmede metabotrope receptorer i Gruppe I. Da vi kun ønsker den eneaf virkningerne, nemlig hæmningen af de metabotrope recep-torer, har vi fremstillet en række nye stoffer ud fra HIBO. På den måde fandt vi frem til stofferne Hexyl-HIBO og Heptyl-

Glutaminsyre er hjernens vigtigste stimulerende signal-stof, men glutaminsyre er også involveret ved kramper,f.eks. ved epilepsianfald. Det åbner mulighed for atanvende stoffer, der hæmmer glutaminsyres virkning,som nye krampestillende midler.

Af Ulf Madsen, Tine B. Stensbøl, Hans Bräuner-Osborne og Connie Sánchez

Glutaminsyre er et af hjernens vigtigste signalstoffer, sompåvirker stort set alle nerveceller i hjernen. Signalstoffet akti-verer nervecellerne ved at binde sig til receptorer på overfla-den af cellerne. En tilstrækkelig stimulering af receptorernefor glutaminsyre er af afgørende betydning for, at hjernenfungerer normalt.Imidlertid kan forhøjede koncentrationer af glutaminsyremedføre kramper og udbredt nervecelledød, hvilket blandtandet ses under og efter epileptiske anfald. Stoffer, som kanhæmme en sådan overaktivitet af glutaminsyre, er derfor afinteresse som nye krampestillende midler til behandling afepilepsi.Glutaminsyre påvirker et stort antal forskellige receptorer.Overordnet findes der to hovedtyper: de ionotrope recepto-rer og de metabotrope receptorer. De ionotrope receptorerfor glutaminsyre formidler hurtige signaler til nervecellerneved at lade elektrisk ladede atomer strømme ind i cellerne.Når de metabotrope receptorer aktiveres, påvirkes nervecel-lens indhold af sekundære signalstoffer, hvilket frembringerlangsommere signaleffekter i nervecellerne. Såvel de iono-trope som de metabotrope receptorer er opdelt i tre under-grupper, som hver især er opdelt i et antal undertyper.

18

Skematisk oversigt over hjernens glutaminsyre-receptorer.Klassifikationen omfatter de to hovedtyper, ionotrope og meta-botrope receptorer, der hver især er opdelt i tre undergrupper,som yderligere er opdelt i et antal undertyper. Af de i alt 23undertyper er for overskuelighedens skyld kun angivet navne påde to Gruppe I undertyper, som er relevante for dette projekt.


Ph.d. Ulf Madsen er

lektor ved Institut

for Medicinalkemi.

Ph.d. Tine B. Stensbøl

er forskningsadjunkt

ved Institut for

Medicinalkemi.

Ph.d. Hans Bräuner-

Osborne er forsk-

ningslektor

ved Institut for

Medicinalkemi.

Dr.pharm. Connie

Sánchez er afdelings-

leder ved

Farmakologisk

Forskning,

H. Lundbeck A/S.

19

HIBO, som slet ikke aktiverede de ionotrope receptorer, mensom fortsat er i stand til at hæmme de metabotrope receptorer.

Modvirker kramper i musDe fremstillede HIBO-analoger hæmmer metabotrope recep-torer i Gruppe I, som består af to undertyper. Receptorernekaldes mGluR1 og mGluR5. Det viste sig, at Hexyl-HIBO havdeen hæmmende effekt på mGluR1 og mGluR5, hvorimod

Heptyl-HIBO primært virkede på mGluR1.Forbindelserne blev dernæst testet på mus i en krampemo-del. Hexyl-HIBO udviste her en krampestillende effekt over-for AIMDA-inducerede kramper. Heptyl-HIBO havde ingenkrampestillende effekt. Forsøgene viser, at den krampestillende effekt af Hexyl-HIBOformentlig skyldes virkningen på mGluR5, hvorimod denselektive effekt af Heptyl-HIBO på mGluR1 er uden virkning

overfor de inducerede kramper.De gennemførte dyreforsøg blevudført på mus dels ved indgift iblodbanen, dels ved direkte inds-prøjtning i hjernen. Kun ved dendirekte indgift i hjernen blev debeskrevne effekter opnået.Forsøgene tyder derfor på, at deundersøgte forbindelser ikke kantrænge over blod-hjerne-barrie-ren og dermed komme fra blo-det og ind i hjernen. En andenmulig forklaring kan være, atstofferne nedbrydes i blodeteller i leveren, inden de kan pas-sere blod-hjerne-barrieren.Den fortsatte forskning er derforkoncentreret om nye forbindel-ser med den ønskede hæmmen-de effekt på de metabotropereceptorer i Gruppe I, herunderudvikling af stoffer med selektiveffekt på mGluR5. Vi satser isærpå at udvikle HIBO-analoger medsidekæder, som kan forbedrestoffernes evne til at trængeover blod-hjerne-barrieren ogsamtidig forhindre nedbrydningaf stofferne i blodbanen og leve-ren.

Kemisk struktur for signalstoffet glutaminsyre fra hjernen, naturstoffet ibotensyre fra denrøde fluesvamp og for den syntetiske analog homoibotensyre (HIBO).

Kemisk struktur af fem HIBO-analoger indeholdende uforgrenede sidekæder (R) med 4-8kulstofatomer. Stoffernes biologiske aktivitet er angivet til højre.

HIBO-analoger

Stof R Aktivitet

AMPA receptor stimulationButyl-HIBO H3C Gruppe I hæmmende effekt

Krampefremkaldende effekt

Pentyl-HIBO H3C Svag AMPA receptor stimulationGruppe I hæmmende effekt

Hexyl-HIBO H3C Gruppe I hæmmende effektKrampestillende effekt

Heptyl-HIBO H3C Gruppe I hæmmende effekt(kun på mGluR1)

Octyl-HIBO H3C Inaktiv

HO

O

ON

RH2N

OH

Glutaminsyre Ibotensyre HIBO

HO HOHO

OH OH OH

OO O O

OO

N N

H2NH2N

H2N


Et bud på fremtidenslægemidler mod epilepsi

GABA-receptorerne mere følsomme overfor signalstoffet.Desuden findes der endnu en mulighed, som bruges i et af denyere lægemidler mod epilepsi, Tiagabine.Dette præparat, som markedsføres af Novo Nordisk, blokererde transportører på nervecellerne og gliacellerne, som pum-per GABA ind i cellerne. Resultatet er, at GABA bliver længe-re i synapseområdet, og de hæmmende signaler forlænges.Det skaber en bedre balance i signalsystemerne, og patien-ten undgår de epileptiske anfald.Tiagabine er udviklet på grundlag af nipecotinsyre, som forflere år siden blev opdaget på DFH af den medicinalkemiskeforskningsgruppe. Gruppen viste, at denne aminosyre megeteffektivt blokerer transporten af GABA ind i nerveceller oggliaceller. Opdagelsen var et gennembrud i udforskningen afhjernens GABA-system.Det er imidlertid muligt at forbedre denne type lægemidler,hvis det lykkes at udvikle lægemiddelstoffer, der selektivthindrer transport af GABA ind i gliacellerne, hvor signalstof-fet nedbrydes. Transporten ind i nervecellerne er mindreproblematisk, fordi nervecellerne genbruger GABA ogudsender stoffet igen. Lægemidler, som specifikt blokerergliacellernes evne til at indtage GABA, vil derfor bevareendnu mere GABA i synapsen og på den måde opretholdebalancen mellem hæmmende og stimulerende signalstoffer.Lægemiddelstoffer, der kun rammer gliacellernes transpor-tører, findes endnu ikke, men nye forskningsresultater påDFH har skabt håb om, at det kan lykkes at designe sådannestoffer.

Modifikation af strukturerNeuromedicinalgruppen på DFH har gennem flere årbeskæftiget sig med stoffer, der virker på transportørerne inerveceller og gliaceller. Disse stoffer er udviklet ud fraGABA selv, samt ud fra muscimol, som er et af de psykoakti-ve stoffer i rød fluesvamp.Ved at manipulere med molekylestrukturen er det muligt atforfine og målrette virkningen af de naturlige stoffer.GABA-molekylerne har dels en positivt ladet gruppe og delsen negativt ladet gruppe. De tiltrækkes af kemiske gruppermed modsat ladning på transportører og receptorer. Det erpå den måde, at signalstoffet kan binde sig til transportøreneller receptoren og derved blive genkendt. Muscimol harladede grupper, der ligner GABA’s, hvilket sætter stoffet istand til at efterligne GABA og påvirke dele af hjernens sig-nalsystem.Denne mulighed har vi udnyttet ved modificering af musci-mol til stofferne THIP og THPO. THIP virker selektivt på recep-torerne, mens THPO selektivt rammer transportørerne. Manhar på den måde opsplittet muscimols virkning og fået etredskab til at skelne disse to dele af GABA-systemet.Virkningen af THPO førte til, at nipecotinsyre blev undersøgt,

I nogle former for epilepsi har patienterne mangel pådet hæmmende signalstof, GABA, i hjernen. Derfor erdet et problem, at hjernens hjælpeceller tilintetgør sig-nalstoffet, så det ikke kan genbruges. Nu er der håb omat designe lægemiddelstoffer, som selektivt blokerer forgliacellernes optagelse af GABA.

Af Rasmus P. Clausen, Orla M. Larsson, Jeremy Greenwoodog Povl Krogsgaard-Larsen

Hjernen består af et kompliceret netværk af celler der kom-munikerer med hinanden ved udsendelse og modtagelse afsignalstoffer. De primære signalstoffer er glutaminsyre oggamma-amino-smørsyre (GABA). Glutaminsyre overfører stimulerende signaler, som øgermodtagercellernes aktivitet, mens GABA overfører hæm-mende signaler, som dæmper modtagercellernes aktivitet.Hjernens normale funktion er bestemt af en hårfin balancemellem de stimulerende og hæmmende signaler. Det er vigtigt for et velfungerende signalsystem, at signaler-ne hurtigt kan bringes til ophør igen. En konstant stimule-ring af hjernecellerne fører nemlig til celledød, som det ses iParkinsons syge og Alzheimers syge. Derfor råder hjernenover mekanismer til at kontrollere signalerne mellem nerve-cellerne, så de ikke overstimuleres.En nervecelle, der udsender et bestemt signalstof, er såledesi stand til at opsuge overskydende signalstof fra synapseom-rådet, hvor kommunikationen mellem to nerveceller findersted. Samtidig findes der hjælpeceller i hjernen, kaldet glia-celler, som ligeledes kan fjerne signalstoffet fra synapsen.Det sker ved hjælp af transportører i cellemembranerne, sompumper signalstoffet ind i cellerne.Forskellen er, at nervecellen genbruger signalstoffet, mensgliacellerne nedbryder det. Denne forskel kan vise sig atvære væsentlig for udviklingen af nye lægemidler.

Mangel på GABAI nogle typer af epilepsi er der mangel på det hæmmendesignalstof GABA i patienternes hjerner. Når GABA’s modpartglutaminsyre fortsætter med at stimulere nervecellerne, ops-tår der epileptiske krampeanfald, fordi der ikke er tilstræk-keligt med GABA til at dæmpe nervecellernes aktivitet ogholde den nede på et passende niveau.Der kan være flere forklaringer på den nedsatte virkning afGABA hos disse patienter. For det første kan nervecellerneslagre af GABA være udtømte, og for det andet kan de recep-torer, der påvirkes af GABA, have nedsat følsomhed. En tred-je årsag kan være nedsat aktivitet af det enzym, som produ-cerer GABA i hjernen.Problemet kan tænkes løst på flere måder. Man kan forsøgeat stimulere selve produktionen af GABA, eller man kan gøre

20

Ph.d. Rasmus P.

Clausen er forsknings-

adjunkt ved Institut

for Medicinalkemi.

Ph.d. Jeremy

Greenwood er forsk-

ningsadjunkt ved

Institut for

Medicinalkemi.

Ph.d. Orla M. Larsson

er lektor ved Institut

for Farmakologi.

Dr.pharm. Povl

Krogsgaard-Larsen er


for Medicinalkemi og

rektor på DFH.

21

og det viste sig som nævnt, at stoffet havde en langt krafti-gere hæmmende virkning end muscimol, fordi stoffet bloke-rer for optagelsen af GABA i nerveceller og gliaceller.Effekten er efterfølgende blevet yderligere optimeret påNovo Nordisk til lægemidlet Tiagabine, hvis centrale del ernipecotinsyre. Ved at ændre naturens egne stoffer kan man altså udviklestoffer, der selektivt rammer transportørerne. Nu forsøger vived tilsvarende strukturelle ændringer at designe stoffer, derkun blokerer gliacellernes transportører uden at påvirketransportørerne i nervecellerne.

Gliaselektive stoffer.THPO viste sig at foretrække gliacellernes transportører fremfor nervecellernes, om end denne selektivitet var svag. Årsa-gen til selektiviteten har vi siden forsøgt at indkredse ved atlave lignende stoffer. På den måde er det lykkedes at designe stoffet N-Me-exo-THPO, der viste sig at være ikke blot et mere aktivt, men ogsålangt mere selektivt overfor gliacellernes transportører.Denne vigtige opdagelse har vist, at det er muligt at diffe-rentiere effektivt mellem transportørerne i gliaceller og ner-veceller, hvilket kan få stor betydning for udvikling af læge-midler, der virker på GABA-systemet.N-Me-exo-THPO blokerer gliacellernes transportører mereeffektivt end noget andet kendt stof, men stoffet er ikkeegnet som lægemiddel, da det ikke er tilstrækkeligt virk-somt. Derfor arbejder vi nu med at ændre N-Me-exo-THPOmed henblik på at udvikle terapeutisk anvendelige stoffer.Indsatsen har ikke båret frugt endnu, men forsøgene hargivet nogle interessante resultater.Vi har blandt andet forsøgt at optimere N-Me-exo-THPO vedat udbygge molekylet med en sidekæde fra Tiagabine, hvil-ket øger aktiviteten betragteligt, men desværre på bekost-ning af selektiviteten. Desuden har vi ændret N-Me-exo-THPO på samme måde som THPO blev ændret til nipecotin-syre. Herved fås en gruppe stoffer, som vi havde forventetville virke på transportørerne, men som højst overraskendevar inaktive.Forklaringen på stoffernes manglende aktivitet på GABA-transportørerne skal muligvis søges i stoffernes tredimensio-nelle struktur; det er som at stikke en forkert nøgle i en lås.Næste trin i forskningsprocessen vil blive sammenlignendeanalyser ved hjælp af computersimuleringer, som forhåbent-lig kan afsløre, hvilke faktorer der er vigtige for at designestoffer, som selektivt blokerer for gliacellernes transportører;svarende til den rigtige nøgle i låsen.Vi opbygger nu en virtuel skabelon på baggrund af dissecomputersimuleringer, og modellen vil være et vigtigt red-skab for design af nye stoffer. I dette puslespil er de uventetinaktive stoffer vigtige brikker, fordi de er med til at vise, i

hvilken retning vi kan gå for at finde de rigtige stoffer.I de seneste måneder har vi fundet en vej til omdannelse afde inaktive stoffer til farmakologisk aktive forbindelser meden meget spændende og enestående effekt på GABA-trans-portørerne. Vi forfølger nu aktivt denne ny linje med det målat bidrage til udvikling af nye lægemidler til behandling afepilepsi.

Computermodeller er vigtige i jagten på den rigtige strukturfor udviklingen af en ny type lægemiddelstoffer mod epilepsi,der selektivt kan hindre gliaceller i at optage og nedbryde sig-nalstoffet GABA.Øverst ses N-Me-exo-THPO, der er det stof til dato, som mestselektivt blokerer for gliacellernes optag af GABA.I midten ses strukturen af nipecotinsyre, der blev brugt somudgangspunkt for lægemidlet Tiagabine, der blokerer transpor-

ten af GABA ind i både nerveceller og gliaceller.Nederst ses strukturen af et nyt stof, som overraskende

viste sig at være uden virkning på de transportører, somsender GABA ind i gliacellerne.

EN SPECIFIK VIRKNING

A B

Signal

Signal

PRÆSYNAPSE

C

= Signalstof (eks. GABA)

NERVECELLE

C

GLIACELLE

TRANSPORTØR

RECEPTOR

NERVECELLE

POSTSYNAPSE

SYNAPSE

D

Signaler overføres fra en nervecelle til en anden vedhjælp af signalstoffer. Det sker ved, at signalstoffet frigi-ves fra nerveenden på én nervecelle (A), hvorpå signal-stoffet genkendes af den anden nervecelle ved, at detbinder sig til receptorer på modtagercellens overflade (B).Overskydende signalstoffer opsuges dels af afsendercel-len, hvor stofferne genbruges, dels af gliaceller, somdestruerer signalstofferne.I epilepsi opstår der mangel på hjernens vigtigste hæm-mende signalstof, GABA, hvorved nervecellerne overakti-veres af det stimulerende signalstof glutaminsyre – resul-tatet er et epileptisk anfald. Manglen på GABA kanafhjælpes ved at hindre transport af signalstoffet ind igliacellerne. På den måde undgår man, at GABA nedbry-des i gliacellerne.



Fokus på hjernensstøtteceller

udskiller, kan signalet enten stimulere eller hæmme modta-gercellens aktivitet.

Syntese af glutaminsyreDet vigtigste stimulerende signalstof i hjernen er glutamin-syre. Efter signaloverførslen skal glutaminsyre fjernes fra syn-apsespalten, hvilket primært sker via optagelse i astrocytter-ne. I astrocytten inaktiveres glutaminsyre ved omdannelse tilglutamin eller ved nedbrydning i citronsyrecyklus.Citronsyrecyklus er en ring af processer, som er centrale forcellernes energiomsætning, og som foregår i cellernes kraft-værker, mitokondrierne.Glutamin kan frisættes fra astrocytten og optages af nerve-cellen, der bruger glutamin til at gendanne sit signalstof glu-taminsyre. Denne recirkulering er nødvendig for nervecellen,da den ikke har andre muligheder for at danne ny glutamin-syre, uden at det sker på bekostning af stoffer, der indgår icitronsyrecyklus. Dette ville være et problem for nervecellen,da den ikke kan binde CO2, hvilket er nødvendigt for at pro-ducere nye stoffer til citronsyrecyklus.Man kan sige, at nervecellerne er handicappede i deres stof-skifte og afhængige af astrocytterne, der er i stand til atbinde CO2 og fremstille nye udgangsstoffer til citronsyrecyk-lus.Det er i denne sammenhæng blevet observeret, at astrocyt-

ter udskiller store mængder citrat, et stof i citronsyrecyklus.Der er også fundet relativt høje koncentrationer af citrat ivæsken, der omgiver cellerne i hjernen. For at kunne udskil-le citrat er cellen afhængig af, at den kan binde CO2 via enreaktion med pyruvat. Betydningen af udskillelsen af citrat erlangt fra opklaret. Men man ved, at citrat kan regulereniveauet af flere typer positivt ladede ioner, som alle er vig-tige i nervecellernes kommunikation, da de på forskellig vismodulerer nervecellernes receptorer, herunder de recepto-rer, der påvirkes af glutaminsyre.Syntesen af glutamin finder kun sted i astrocytter, og proces-sen påvirker - udover at være en del af glutaminsyre-gluta-min-cyklus - reguleringen af mængden af ammoniak i hjer-nen. Omdannelsen af glutaminsyre til glutamin er den kvan-titativt mest betydende proces i hjernen med hensyn til atbinde ammoniak. Processen er vigtig, fordi for høje koncen-trationer af fri ammoniak kan forgifte både nerveceller ogastrocytter, men først og fremmest astrocytter. Beskadigelseaf astrocytterne vil naturligvis få alvorlige konsekvenser fornervecellerne.

Forsøg med astrocytterVi er interesseret i at opnå mere detaljeret viden om denævnte omsætningsveje i astrocytternes stofskifte. Det erderfor nødvendigt at isolere astrocytter fra hjernevæv,eksempelvis fra mus, for at kunne være sikre på at andre

Nervecellerne i hjernen er dybt afhængige af deres støt-teceller, som er nødvendige for produktion og omsæt-ning af signalstoffer. Studier af støttecellernes rolle ihjernens stofskifte kan bane vejen for nye angrebspunk-ter for fremtidige lægemidler mod neurologiske lidelser.

Af Helle S. Waagepetersen, Orla M. Larsson og Arne Schousboe

Nervecellerne i hjernen er omgivet af støtteceller, som kaldesastrocytter, og specielt i menneskehjernen er antallet afastrocytter flere gange højere end antallet af nerveceller.Selv om nervecellerne umiddelbart er hjernens mest betyd-ningsfulde celler, så har de senere års forskning vist, at de erhelt afhængige af astrocytterne. Uden astrocytter ville kom-munikationen mellem nervecellerne gå i stå, fordi astrocyt-terne hjælper nervecellerne med at producere og omsættede signalstoffer, som sørger for signalprocesserne i hjernen.Kommunikationen mellem to nerveceller sker i en spalte mel-lem to nerveender, synapsespalten. Når en nervecelle afsen-der en besked, frigiver den et signalstof, som krydser synap-sespalten og aktiverer en receptor i cellemembranen på denmodtagende nervecelle. Herefter påvirkes processerne inde imodtagercellen. Alt efter hvilket signalstof afsenderen

22

Illustrationen viser syntese og frisætning af signalstoffet glutaminsyre fra en ner-vecelle og optagelse og omsætning af glutaminsyre i en astrocyt. PYR: pyruvat;CIT: citrat; TCA: tricarboxylsyre; α-KG: α-ketoglutarat; GLN: glutamin; GLU: gluta-minsyre; OAA: oxaloacetat.

Glutamatergnervecelle

GLU GLN GLN GLU

GLU GLU

NH4+ Astrocyt

Modtagendenervecelle

GLUTAMINSYRE

CITOAA

CO2 PYR

Mitokondrie

TCAcyklus

α-KG


Ph.d. Helle S.

Waagepetersen er

forskningsadjunkt

ved Institut for

Farmakologi.

Ph.d. Orla M. Larsson


for Farmakologi.

Dr. scient. Arne

Schousboe er profes-


Farmakologi.

23

celletyper, såsom nerveceller, ikke påvirker resultaterne.De isolerede og dyrkede astrocytter bliver inkuberet medkulstof 13-mærket glukose, hvor alle kulstofatomerne ermærkede. Herefter bliver ekstrakter fra cellerne analyseretmed magnetisk resonans spektroskopi og massespektrometri.Med disse analysemetoder er det muligt at følge de mærke-de kulstofatomer. Glukose bliver omsat til mærket pyruvat.Den videre omsætning af pyruvat til citrat kan imidlertidfølge to forskellige omsætningsveje, og mærkningen gør detmuligt at skelne mellem de to ruter. Uden reaktioner mellempyruvat og CO2 bliver citrat mærket i to positioner, men nårCO2 bindes til pyruvat, bliver citrat mærket i tre positioner.

Flere slags mitokondrierSådanne forsøg har vist, at astrocytter sandsynligvis har speci-fikke afdelinger inde i cellerne. Til hver afdeling er der knyttetforskellige mitokondrier med hver sine særlige arbejdsopgaver.Afdeling A er karakteriseret ved mitokondrier, som har en højproduktion af citrat for videre frisætning. En produktion, derer fuldt afhængig af den omsætningsvej, hvor pyruvat reage-rer med CO2.Afdeling B omdanner glutaminsyre til glutamin. Først optagessignalstoffet, når det har udøvet sin effekt på den modtagen-de nervecelle. Derpå frisætter astrocytterne glutamin tilanvendelse i nervecellerne. Man kan sige, at den del af gluta-minsyre-glutamin-cyklus, der foregår i astrocytterne, er lokali-seret i afdeling B.I afdeling C produceres der glutamin, som ikke bliver frisat.Denne syntese af glutamin formodes at have relation til bin-

ding af fri ammoniak og dermed regulering af ammoniakni-veauet i hjernen.Astrocytterne er altså i stand til fysisk at adskille omsætnings-vejene i deres stofskifte, selv om processerne involverer desamme udgangsstoffer. Denne evne gør det muligt for cellenat regulere omsætningsvejene hver for sig.Eksempelvis bevirker opdelingen, at en umiddelbar forøget

koncentration af ammoniak ikke fører til forhøjede koncen-trationer af glutamin i hjernen, hvilket ville influere på mæng-den af glutaminsyre og dermed på kommunikationen mellemnervecellerne. Ligeledes er den høje produktion af citrat iafdeling A adskilt fra den øvrige energiomsætning i cellen,hvor citrat indgår som et stof i citronsyrecyklus.

Mål for lægemidlerEn kortlægning af astrocytternes specifikke omsætningsveje ogderes forskellige mitokondrier kan bane vejen for nye angrebs-punkter for fremtidige lægemidler mod neurologiske lidelser.Flere sygdomme i hjernen og i det perifere nervesystem somhepatisk encefalopati, skizofreni og amyotrofisk lateral sklero-se er nemlig i et vist omfang knyttet til fejlfunktioner i astro-cytterne.

Astrocytten opdeler sine arbejdsopgaver i speci-fikke afdelinger med forskellige mitokondrier:Afd. A, Syntese af citrat for eksport: Citrat kanmodulere det ekstracellulære niveau af ionersom Zn2+, Ca2+ og Mg2+, hvilket er vigtigt forreceptorers funktion og dermed for nervecel-lernes kommunikation. Citrats betydning forhjernen er langt fra opklaret, men stoffet fore-kommer i relativt høje koncentrationer irygmarvsvæsken.Afd. B, Glutaminsyre-glutamin-cyklus:Inaktivering af glutaminsyre ved omdannelse tilglutamin og derefter frisætning af glutamin tiloptagelse for nervecellerne. Processen er over-ordentlig vigtig for glutaminsyreniveauet ihjernen og dermed for et meget stort antalneurologiske lidelser.Afd. C, Ammoniakniveau: Koncentrationen afammoniak i hjernen reguleres via syntesen afglutamin, der kun sker i astrocytter. For højekoncentrationer af ammoniak er toksiske forbåde nerveceller og astrocytter. OAA: oxaloace-tat; CI:, citrat; TCA: tricarboxylsyre; GLN: gluta-min; GLU: glutaminsyre.

ASTROCYTTER

Astrocytter er celler, der omgiver nervecellernes synapser.Astrocytter er nødvendige for nervefunktionen ved at fjernesignalmolekyler (f.eks. glutaminsyre) og forsyne nervecellermed metabolitter for gendannelse af signalstoffer.

Extracellulært

Intracellulært

Pyruvat Pyruvat Pyruvat

Centre for Drug Design and Transport


Genvej til hjernen via næsen

disse ofte er for store til at slippe gennem nåleøjet. Samtidigindeholder blodkarrene i blod-hjerne-barrieren transpor-tører, der fungerer som udsmidere. Transportørerne genken-der forskellige molekylære strukturer og sørger for at pumpesådanne stoffer tilbage til blodstrømmen. Denne mekanismetager sig især af fedtopløselige stoffer, hvilket kan blokererefor potentielt aktive lægemiddelstoffers adgang til hjernen.I de senere år har en række dyreforsøg imidlertid vist, at derer en mulig genvej for lægemiddelstoffer, som har svært vedat komme ind i hjernen og rygmarvsvæsken. Genvejen gårvia de nerveceller i næsehulen, som sender duftindtryk ind ihjernen.Absorption af lægemiddelstoffer via nervecellerne i næsehu-len kan have et potentiale indenfor behandling af sygdom-me i centralnervesystemet, og samtidig vil bivirkninger, somer relateret til koncentrationen af lægemiddelstofferne iblodet kunne mindskes. For nye konventionelle næsespraysvil eksistens af denne transportvej omvendt kunne medføreøgede dokumentationskrav på grund af risiko for bivirknin-ger i centralnervesystemet, som ikke vil optræde ved anven-delse af tabletter eller injektioner.

Bagdør til hjernenLugtecellerne findes i den øverste, bageste del af næsehulen,hvor kun slimhinden – det olfaktoriske epitel – og en hulletbenplade – sibenet – danner barriere mellem centralnervesy-stemet og de ydre omgivelser. De nøgne ender af lugtecel-lerne stikker ud gennem slimhinden og rækker således heltind i næsehulen. Her kan fedtopløselige lægemiddelstofferoptages i nervecellerne og diffundere gennem dem ind tillugtehjernen, som findes i både højre og venstre side af hjer-nen. Denne transportvej anses for at være relativt langsommed en transporttid til hjernen i størrelsesordenen af timertil dage.Derimod kan vandopløselige lægemiddelstoffer komme ind ihjernen i løbet af minutter, fordi transportvejen her ikke gårgennem nervecellerne, men langs med dem via denrygmarvsvæske, som omslutter nervecellerne helt frem tilslimhindens bagside. Optagelse af vandopløselige lægemid-delstoffer gennem slimhinden i næsehulen vil derfor ske tilrygmarvsvæsken, hvorfra stofferne kan diffundere videre tilvæsken mellem hjernecellerne.På grund af den begrænsede barriere mellem næsehulensduftområde og centralnervesystemet, er det væsentligt, atman i dyreforsøg sammensætter de eksperimentelle læge-midler på en måde, så der ikke opstår skader på dyrenesslimhinder i næsehulen på grund af hjælpestoffer. Flereundersøgelser er gennemført på bedøvede dyr, hvor svælgeter afsnøret. Derfor drænes lægemiddelstof og hjælpestofferikke bort, som det sker under normale forhold, hvorfor ska-der på slimhinden lettere kan opstå.

Det er ofte vanskeligt at sende lægemiddelstoffer ind icentralnervesystemet med blodet, fordi passagen hin-dres af blod-hjerne-barrieren. Direkte indgift via lugte-cellerne i det olfaktoriske område i næsehulen er eninteressant mulighed, som nu undersøges i dyreforsøg.

Af Morten Aavad Bagger og Erik Bechgaard

Mange lægemiddelstoffer udøver deres effekt i hjernen ellerandre dele af centralnervesystemet. Det gælder f.eks. stoffer,som bruges til at behandle stærke smerter, migræne, epilep-si og Parkinsons syge.Når sådanne lægemiddelstoffer indgives som tabletter ellerved indsprøjtninger, skal de være i stand til at passere blod-hjerne-barrieren for at virke. blod-hjerne-barrieren er hjer-nens forsvar mod fremmede stoffer, som cirkulerer rundt iblodet. Barrieren udgøres af cellerne i hjernens kapillær-vægge, hvor åbningerne mellem cellerne er meget små.Derfor er det kun små molekyler, som kan passere gennemåbningerne og komme ind i hjernen.Dette er en meget effektiv barriere mod mange vandopløse-lige lægemiddelstoffers passage fra blodet ind i hjernen, da

24

MIKRODIALYSE PÅ DYR

Optagelsen og omsætningen af et lægemiddelstof i hjer-nen kan måles på forsøgsdyr ved hjælp af mikrodialyse.Princippet er, at lægemiddelstoffet diffunderer gennem enmembran ind i en hul nål – en såkaldt probe – der ved lavhastighed gennemstrømmes med en saltopløsning.Billedet viser en mikrodialyseprobe til kontinuert opsam-ling af lægemiddelstof fra hjernevæsken i en bedøvetrotte. Den 4 mm lange dialysemembran, som sidder på pro-bens spids, tillader diffusion af molekyler op til 20 kDa. Denviste probes dimensioner er 0,5 x 30 mm, hvoraf membra-nen udgør 0,5 x 4 mm. Mikrodialyseprober fås, som vist, ien stiv version til implantering i hjernevæv samt en fleksi-bel version til implantering i f.eks. blodkar.


Cand.pharm. Morten

Aavad Bagger er

ph.d.-studerende på

Institut for Farmaci.

Lic.pharm. Erik

Bechgaard er lektor

på Institut for

Farmaci.

25

Krav til lægemidlerDa direkte absorption af lægemiddelstoffer via næsehulenhidtil kun er blevet undersøgt i begrænset omfang, er detendnu uklart hvilke fysisk-kemiske egenskaber et lægemid-delstof skal have for at opnå den bedste udnyttelse af denolfaktoriske transportvej.Det er dog påvist, at lav molekylevægt og moderat fedtop-løselighed fremmer transporten af lægemiddelstoffer franæsehulen til rygmarvsvæsken. Det svarer til, hvad der gene-relt er optimalt for molekylers passage over biologiske barri-erer. Derfor vil lægemiddelstoffer med disse egenskaberligeledes nemt optages fra næseslimhinden til det almindeli-ge blodkredsløb. Når man arbejder med modelstoffer, er detderfor en fordel at udvælge stofferne på en måde, så dendirekte optagelse til hjernen ikke overskygges af absorptionvia blodkredsløbet. Direkte optagelse af lægemiddelstoffer via lugtecellerne inæsehulen er tidligere blevet undersøgt ved nasal indgift afradioaktive isotoper af tungmetaller til forsøgsdyr. Dyrene erefterfølgende blevet aflivet, og man har kunnet måle udbre-delsen af radioaktivitet fra slimhinden over lugtehjernen ogvidere ind i den resterende del af hjernen.Metoden, som også anvendes til at undersøge optagelsen aflægemiddelstoffer, har den ulempe, at der kræves et stortantal forsøgsdyr for at beskrive absorptionen som funktionaf tid, ligesom det ikke altid er muligt at opnå kvantitativemål. Derfor er der også blevet udført studier med totalbe-stemmelse af lægemiddelstoffer i hjernevævet og medløbende opsamling af prøver fra blodet og rygmarvsvæskenpå forsøgsdyr.Et eksempel er L-Dopa, som anvendes til behandling afParkinsons syge. Det er i dyreforsøg fundet, at koncentratio-nerne i rygmarvsvæsken i forhold til koncentrationerne i blo-det er 10 til 20 gange højere efter indgift i næsehulen endefter injektioner til såvel mus som rotter.

Måling på hjernevæskenMikrodialyse er en metode, som kan bruges til opsamling aflægemiddelstoffer fra hjernevæsken. Undersøgelserne kanbåde gennemføres på bedøvede og ubedøvede dyr, da deikke medfører væsentlige gener. Dyrene kan endda indgå ioverkrydsningsforsøg, hvor forskellige stoffer eller indgifts-former afprøves i de forskellige grupper af dyr med nogledages mellemrum, hvilket nedsætter behovet for et stort

antal forsøgsdyr. Samtidig er mikrodialyse en af de enestemetoder, som kan vise, hvordan lægemiddelstoffer over tidfordeles og omsættes i hjernen.Mikrodialysen foregår ved hjælp af et meget tyndt stålrør,som indføres i hjernen på forsøgsdyret. De yderste 1-10 mil-limeter af røret består af en rørformet dialysemembran. Småmolekyler i hjernevæsken kan trænge gennem membranenog over i den saltopløsning, som røret ved lav hastighed gen-nemstrømmes af. Derimod er membranen lukket for storemolekyler som blodceller og proteiner, hvilket letter detefterfølgende analysearbejde.Når et lægemiddelstof indgives gennem næsehulen og kom-mer ud i hjernevæsken, vil stoffet således diffundere gennemmembranen og komme ind i saltopløsningen. Denne opsam-les løbende i fraktioner, som senere kan analyseres med hen-blik på bestemmelse af sammenhængen mellem tid og kon-centration.Ved anvendelse af mikrodialyse fortages implanteringen vedhjælp af udstyr, som muliggør en meget præcis placering afrøret, således at den ønskede struktur i hjernen rammes. Pågrund af de små dimensioner kan implanteringen ske udenvæsentlig skade på det omkringliggende væv.Dette er vigtigt, da resultaterne af forsøgene kun er pålide-lige, når der ikke sker skader på blod-hjerne-barrieren.Sådanne skader er naturligvis især uacceptable, når manundersøger transporten til hjernen af lægemiddelstoffer,som normalt kun passerer blod-hjerne-barrieren i begrænsetomfang. Kontrol af den fysiske integritet af blod-hjerne-bar-rieren kan foretages med intravenøs indgift en fluoresceren-de markør, som ikke er i stand til at passere en intakt blod-hjerne barriere.Selv om flere studier af lægemiddelstoffers optagelse via lug-tecellerne i næsehulen har virket overbevisende med hensyntil direkte transport til centralnervesystemet, især tilrygmarvsvæsken, er det endnu uklart, hvorvidt transportve-jen er anvendelig ved behandling af mennesker.For det første er det oftest små stofmængder, som totalt setabsorberes via genvejen til hjernen. For det andet har deanvendte forsøgsdyr - mus, rotter og kaniner - en langt størredel af næsehulen dækket med lugteceller, end det er tilfæl-det hos mennesket. Flere forskningsgrupper arbejder dog påat skabe ny viden på området, og fremtiden vil vise om dendirekte transportvej gennem næsehulen vil kunne udnyttestil at behandle sygdomme i centralnervesystemet.

Skitse af det olfaktoriske områdes placering i næsehu-len og af opbygningen af det olfaktoriske epitel.

A: Lugtehjernen, B: Si-benet, C: Olfaktorisk nervecelle,D: Olfaktorisk næseslimhinde.

A B

C D

Illustration: Henning Dalhoff

Centre for Drug De


26

Ind gennem tarmens lymfesystem

fedt, hvorved biotilgængeligheden af mange tungtopløseli-ge stoffer øges. Den forbedrede optagelse af lægemiddels-toffet skyldes påvirkning fra fedtstofferne under fordøjelseni tarmen.

Fordøjelse i tarmenNår man har spist, bearbejdes maden ved tygning og derefteri maven, således at størrelsen af fedtdråberne fra maden for-mindskes. Herefter tømmes maveindholdet over i tolvfingert-armen, hvor der via galden tilføres fosfolipider og galdesaltesamt fordøjelsesenzymer fra bugspytkirtlen.I tarmvæsken flyder fedtet rundt i dråber som olie i vand.Fosfolipiderne og galdesaltene sætter sig nu på overfladen affedtdråberne og skaber adgang for fordøjelsesenzymet, derligeledes sætter sig på fedtdråberne og nedbryder fedtstoffer-ne i mindre bestanddele. I takt med at fedtstofferne nedbry-des, bliver fedtdråberne mindre og mindre, og mængden afnedbrydningsprodukter bliver større og større. Til sidst dannernedbrydningsprodukterne sammen med de tilstedeværendefosfolipider og galdesalte, blandede miceller.Miceller er små kugler med en fedtholdig kerne og en vandel-skende overflade, som øger kroppens optagelse af fedt, fordiden vandelskende overflade muliggør opløsning i tarm-væsken. Tungtopløselige lægemiddelstoffer i en fedtholdigformulering vil under fordøjelsen følge fedtet og ende i micel-lernes kerner sammen med nedbrydningsprodukterne fraføden.

Mange potente lægemiddelstoffer opløses dårligt itarmvæsken og har derfor svært ved at passere tarm-væggen og komme ud i blodet. Transport til blodet vialymfesystemet er en lovende mulighed.

Af René Holm, Anette Müllertz og Henning Gjelstrup Kristensen

I dag udvælger medicinalkemikere ofte nye lægemiddelstof-fer efter, hvor godt stofferne binder sig til receptorer, somlægemidlet skal påvirke for at lindre eller helbrede en syg-dom. Resultatet af strategien er meget potente lægemid-delstoffer. Men desværre er stofferne ofte vanskelige at anvende i tab-letter, fordi de ikke lader sig opløse i mave-tarm-kanalen.Opløsningen i tarmvæsken er nemlig en forudsætning for, atet lægemiddelstof kan passere tarmvæggen og komme ud iblodet, som skal transportere det hen til virkningsstedet.Svært opløselige lægemiddelstoffer vil altså kun komme ud iblodet i meget beskedent omfang, når de indtages i enalmindelig tablet. Dét udgør et reelt problem for den farma-ceutiske industri i Danmark, fordi den ringe opløselighedofte fører til forkastelse af lovende lægemiddelstoffer i løbetaf udviklingsprocessen.Sådanne stoffers opløselighed i mave-tarm-væskerne kanimidlertid øges ved at indtage lægemidlet sammen med etfedtrigt måltid, eller ved at pakke lægemiddelstoffet ind i

Triglycerid svarer til, hvad vi i daglig tale kalder for fedt. Triglycerid kan bruges til indpakning af lægemiddelstoffer, som ikke ladersig opløse i tarmvæsken. Figuren viser, hvordan nedbrudt triglycerid danner miceller – små kugler med en fedtholdig kerne omgivetaf en vandelskende overflade. De tungtopløselige lægemiddelstoffer indbygges i micellerne, som opløser lægemiddelstofferne.Micellerne diffunderer ind til tarmvæggen, hvor micellen går i stykker og komponenterne optages af tarmcellerne. Inde i tarmceller-ne gendannes langkædede nedbrydningsprodukter til triglycerider, indkorporeres i lipoproteiner og udskilles i lymfen.Nedbrydningsprodukter med korte og mellemlange kæder optages direkte til blodbanen.

Tarmen Tarmcellen

Systemiskeblodkredsløb

LymfeLipoproteiner+ associeret

lægemiddelstof

Langkædedenedbrydningsprodukter

+ associeretlægemiddelstof

Triglycerid+ associeret

lægemiddelstof

Kort- og mediumkædedenedbrydningsprodukter

+ associeretlægemiddelstof

Fordøjelses-enzym

Fedtdråbe

esign and Transport

Cand.pharm. René

Holm er ph.d.-

studerende ved


Ph.d. Anette Müllertz


for Farmaci.

Dr.pharm. Henning

Gjelstrup Kristensen

er professor ved


27

Micellerne diffunderer hen til tarmvæggen, hvor de ned-brudte fedtstoffer optages af tarmcellerne sammen med dettungtopløselige lægemiddelstof. Hvad der sker inde i tar-mcellerne afhænger af nedbrydningsprodukternes størrelse.Hvis de består af relativt korte kæder af fedtsyrer, bliver deoptaget direkte i blodet. Men når kæderne er lange, bliverde oprindelige fedtstoffer gendannet via biokemiske proces-ser i tarmcellerne. Herefter dannes der lipoproteiner ved, atfedtdråberne hægtes på proteiner, som udskilles fra tarmcel-lerne til lymfekarrene. Fra tarmen transporteres den danne-de lymfe op gennem brystet og tømmes ud i blodbanen ligeinden hjertet, indeholdende det opløste lægemiddelstof.

Struktureret fedtFedt består af triglycerider, der rent kemisk er tre fedtsyrerbundet sammen. Triglycerider, der stort set svarer til det, mani daglig tale kalder fedt, er neutrale forbindelser med mulig-hed for stor variation i strukturen – disse forskelle er f.eks.årsagen til, at olivenolie adskiller sig fra tidselolie.En interessant udvikling i biokemien og ernæringsvidenska-berne har været udviklingen af strukturerede triglycerider,som enten er kemisk eller enzymatisk modificerede, så deopnår de fysiske egenskaber og fysiologiske funktioner, somman ønsker. Disse specielt fremstillede triglycerider har fun-det anvendelse i behandlingen af patienter med cystisk fibro-se og for tidligt fødte børn.

Brug af lymfesystemetLymfesystemet er et vidtforgrenet netværk af specialiseredekar med fire vigtige funktioner. Den første er at bringe filtreretvævsvæske tilbage til blodet og dermed opretholde kroppensvæskebalance. Den anden er at transportere hvide blodlege-mer ud i blodet. Den tredie er at indgå i immunforsvaret ved atrense den dannede lymfe i lymfeknuderne for fremmedlege-mer, og den fjerde er at transportere fedt bort fra tarmen.Nyere forskning har vist, at transporten af de fedtholdigenæringstoffer via lymfen kan påvirke transporten af tungtop-løselige lægemiddelstoffer ud i blodet via lymfesystemet; til-med i en mængde, der bidrager væsentligt til den totale bio-tilgængelighed.Den lymfatiske absorptionsvej for lægemidler er endnu man-gelfuldt undersøgt, men den er interessant i forbindelse medformulering af lægemidler. Det skyldes først og fremmest, atder er mulighed for at øge biotilgængeligheden af tungtop-løselige lægemiddelstoffer, men også at lægemidlerne trans-porteres uden om leveren, inden de når blodbanen. Hervedundgås nedbrydning af lægemiddelstoffet i leveren. En øget forståelse af de faktorer, som påvirker optagelsen aflægemiddelstoffer via lymfesystemet kan muliggøre en målret-tet optagelse af nogle af de nye potente lægemiddelstoffer,som i dag må kasseres, fordi de ikke lader sig opløse i tarm-

væsken. Optagelsen vil også kunne anvendes til bl.a. behand-ling af kræft i fremskredne stadier, hvor kræftcellerne harspredt sig, samt til behandling af sygdomme som AIDS, hvorimmunforsvarets funktion er nedsat.

Transport af lægemidlerVi bruger rotter til at teste forskellige farmaceutiske hjælpe-stoffers indflydelse på optagelsen af tungtopløselige lægemid-delstoffer; både direkte i blodet og via lymfesystemet.Ved hjælp af rottemodellen har vi undersøgt de struktureredetriglyceriders potentiale som hjælpestoffer til at fremme biotil-gængeligheden af tungtopløselige lægemiddelstoffer. Deanvendte strukturerede triglycerider indeholder både fedtsyrermed korte og mellemlange kæder, der optages gennem blo-det, og langkædede fedtsyrer, der optages gennem lymfen.Forsøgene viste, at det var muligt at øge optagelsen både vialymfen og via blodet ved anvendelse af disse kunstige trig-lycerider. Den umiddelbare konklusion er, at man i fremtidenskal anvende strukturerede fedtstoffer ved formulering aftungtopløselige lægemidler. Men desværre er organismensbehandling af de indtagne stoffer ikke let og gennemskuelig.Dyreforsøgene har nemlig vist, at ikke alt det lægemiddels-tof, der optages gennem lymfesystemet, kan genfindes i blo-det. Årsagen er sandsynligvis, at der sker en ændret forde-ling i vævet af lægemiddelstoffet, som påvirkes ved tilstede-værelsen af lipoproteiner i blodet.Viden om hvordan lægemidler optages i blodet via lymfesy-stemet og om hvilke fysiologiske forhold, der spiller ind, vildanne grundlag for en rationel – og måske endda innovativ –formulering af lægemidler med større biotilgængelighed ogdermed større terapeutisk effekt.

Figuren viser den rumlige struktur af de undersøgte strukture-rede triglycerider. Molekylet til venstre er en afbildning af etnaturligt forekommende triglycerid. De to andre billeder viserstrukturerede triglycerider, som er fremstillet, så de indeholderbåde mellemlange og lange kæder i forskellige positioner.



Computeren er medicinal-industriens krystalkugle

den på en computer - uden anden input end deres kemiskestruktur - kan medicinalindustrien spare mange penge.Forudsigelse af et lægemiddelstofs egenskaber ud fra denkemiske struktur er en kompliceret proces. De fysiske egen-skaber kan være fordelingen af et lægemiddelstof i kroppen,udskillelse af stoffet eller evnen til at trænge gennem en bio-logisk membran som tarmvæggen.

Data til modellerVi har beregnet 20 kemiske forbindelsers evne til at trængegennem tarmslimhinden. Stofferne er valgt ud fra deres for-skellighed for at dække et bredt spektrum af kemiske for-bindelser. Vi anvender computerprogrammet Volsurf, til atberegne forskellige teoretiske egenskaber for hvert enkeltforbindelse. Volsurf er et international anerkendt programsom bl.a. beregner volumen og overfladeareal.Udgangspunktet for beregningerne er molekylernes kemiskestruktur. Dels tager programmet hensyn til hvilke og hvormange forskellige atomer molekylet indeholder. Men ogsåden tredimensionelle placering af atomerne kommer ibetragtning.Overfladens karakter har ligeledes stor betydning. Nogleatomer bidrager med en såkaldt vandig overflade. Det erprimært ilt og kvælstof samt brint, der sidder direkte bundettil ilt og kvælstof. Denne vandige overflade er meget ladetog ligner dermed vand. Vand har udelukkende denne typeoverflade, da vand jo består af lutter ilt og brint. En del afmolekylernes overflade kan også være ikke-vandig, og denbestår oftest af kulstof med tilknyttede brintatomer. Dennetype overflade ses ofte i fedtlignende kemiske forbindelserog ligeledes i membraner, hvis indre er opbygget af fedt.Lægemiddelstoffer, som primært har en fedtlignende over-flade, er normalt bedre til at trænge gennem membranersom tarmslimhinden end lægemiddelstoffer, hvor det mesteaf overfladen er vandig. Kort sagt: Volsurf beregner hvor stor en del af overfladen,der er vandig, hvor stor en del der er fedtlignende, samtlægemiddelstoffets volumen og overfladeareal.

Test af beregningerDet er nødvendigt at sammenholde beregningerne fraVolsurf med eksperimentelle data for at være sikker på, at deberegnede resultater svarer til virkeligheden. Her bruger vien kunstig membran til at bestemme lægemiddelstoffersevne til at trænge gennem biologiske membraner som tarm-slimhinden. Nogle af de kemiske forbindelser trænger ind iden kunstige membran og tilbageholdes, mens andre ikketrænger ind, fordi de ikke har de rigtige kemiske egenskabertil at trænge ind i membranen. Metoden kaldes forImmobilized Artificial Membrane-kromatografi.Samtidig udfører vi transportforsøg med levende celler. Her

Det er dyrt for medicinalindustrien at finde ud af, omkroppen er i stand til at optage nye lægemidler.Computere kan forudsige kroppens optagelse af læge-middelstoffer og gøre udviklingen af ny medicin hurti-gere og billigere.

Af Jan Høst, Flemming Steen Jørgensen, Inge Thøger Christensen, Lars Hovgaard og Sven Frøkjær

Når man udvikler nye lægemidler, er der altid et uomgæn-geligt spørgsmål: Kan kroppen optage lægemiddelstoffet?Normalt er det mest behageligt for patienten, at lægemid-delstoffet indtages som tabletter og derefter optages i blo-det fra tarmen. Hvis lægemiddelstoffet passerer tarmenuden at blive optaget i blodet, har det ingen virkning, ogderfor er det vigtigt, at et lægemiddelstof kan trænge gen-nem tarmslimhinden og komme ud i blodet.Lægemiddelindustrien er naturligvis ikke interesseret i atsatse penge og mandskab på lægemidler, der ikke kan pas-sere tarmslimhinden. Jo tidligere under udviklingen af etlægemiddel man bliver klar over, om lægemiddelstoffet kantrænge gennem tarmslimhinden, jo bedre.Ønskesituationen er at kunne forudsige lægemiddelstoffersevne til at passere tarmslimhinden, inden stofferne er frem-stillet. Hidtil har det været nødvendigt at syntetisere læge-middelstofferne i laboratoriet, før man kan teste deres egen-skaber på celler, dyr og mennesker. Hvis man kan beregnelægemiddelstoffers evne til at trænge gennem tarmslimhin-

28

Km= fluid membrane partition coefficient

KIAM = immobilized membrane partition coefficient

Silica

modeled by

IAM HPLC ColumnMEMBRANE BILAYER

Lægemiddelmolekylers evne til at trænge gennem tarmslimhinden testes eksperi-mentelt ved hjælp af den kunstige membran (til højre), der minder om en biolo-gisk membran som tarmslimhinden (til venstre). Stoffer, som kan trænge ind imembranen bindes, mens stoffer uden evne til indtrængning forbliver i den omgi-vende væske.


Cand.pharm. Jan Høst

er ph.d.-studerende

ved Institut for

Farmaci.

Ph.d. Flemming Steen

Jørgensen er docent

ved Institut for

Medicinalkemi.

Ph.d. Inge Thøger

Christensen er

kemiker ved Novo

Nordisk A/S

Ph.d. Lars Hovgaard

er direktør ved

Galenica Aps.



for Farmaci.

29

dyrkes en bestemt type celler, kaldet Caco-2, på et filter, hvorcellerne vokser sammen og danner en tæt membran, som lig-ner tarmslimhinden. Derefter måles lægemiddelstoffernesevne til at trænge gennem membranen.Til sidst kædes forsøgsresultaterne fra membrankromatogra-fien og fra arbejdet med Caco-2 cellerne sammen med deegenskaber, som vi har beregnet med Volsurf. Mange af deberegnede egenskaber viser sig ofte at være uden indflydel-se på stoffernes evne til at trænge gennem tarmslimhinden,men enkelte har en markant betydning. Molekylernes volumen og overfladeareal kan umiddelbartbruges til forudsigelse af transporten over tarmslimhinden.Det er ikke nogen overraskelse, at størrelsen har betydning,fordi store molekyler normalt har svært ved at trænge gen-nem membraner.Desuden er der en sammenhæng mellem lægemiddelstoffer-nes evne til at passere membraner og det vandige overflade-areal. Det vandige overfladeareal relaterer sig direkte tilsandsynligheden for, at molekylerne danner brintbindingermed omgivelserne. Brintbindinger dannes fra lægemiddels-toffet til den omgivende væske, og de kan kun dannes fravandig overflade til vandige omgivelser som f.eks. tarm-væsken. Det betyder, at molekyler med meget vandig over-flade danner mange brintbindinger, hvis de befinder sig itarmvæsken, mens de ikke kan danne nogen, hvis de befin-der sig i en fedtholdig membran som tarmslimhinden.Molekyler, der kun har en ganske lille vandig overflade, kanselv ikke i vandige omgivelse lave brintbindinger og forskel-len til de fedtholdige omgivelser i membranen er derfor ikkeså stor for dem.Derfor kan molekyler med en meget vandig overflade ikketrænge ind i tarmslimhinden, da brintbindingerne binderdem til vandet, mens molekyler med en fedtholdig overfladesnildt kan vandre gennem membranen, fordi de ikke harbrintbindinger.

God sammenhængStudierne viser, at der er en god sammenhæng mellem decomputerberegnede egenskaber og forsøgsresultaterne frahenholdsvis de kunstige membraner og med Caco-2 cellerne.På trods af den påviste sammenhæng kan der dog gå lang

tid, før computerberegninger helt erstatter eksperimentelbestemmelse af evnen til at gennemtrænge tarmslimhinden.Forudsigelsen er nemlig stadig præget af stor usikkerhed,fordi der er mange andre ting, som påvirker et lægemiddels-tofs evne til at passere tarmvæggen end størrelse, overfladeog brintbindinger. Indtagelse af føde, som teknisk set ikkehar noget at gøre med tarmslimhinden, påvirker lægemid-delstoffers evne til at trænge gennem tarmvæggen. Desudenfindes der transportsystemer i tarmslimhinden, der sendermolekyler gennem den, hvis molekylerne ellers har de egen-skaber, der kræves af pågældende transportør. Disse trans-portører kan enten øge eller hindre lægemiddelstoffernespassage gennem tarmslimhinden.Men der er ingen tvivl om, at computerne er kommet for atblive i forskningens verden. I takt med computernes udvik-ling vil beregningsmetoderne blive mere avancerede, hvilketvil øge præcisionen i forudsigelserne. I fremtiden vil det væremuligt at tage hensyn til flere mekanismer i tarmslimhinden,og efter tilbundsgående udforskning af alle mekanismernevil præcise forudsigelser af membranpassagen blive mulig.

Udgangspunktet for at forudsige, om et lægemiddelstof kantrænge gennem tarmvæggen, er molekylets kemiske struktur.Her ses strukturen af Nikotinsyre, methylester.

Lægemiddelstoffet passerer Caco-2 cellelaget på samme mådesom var det en rigtig tarmslimhinde.

Lægemiddelstof

Caco-2 cellelag

VandFilter


E-screening af lægemidler

af et nyt lægemiddel. Man er derfor begyndt at udvikle com-puterbaserede metoder, som alene ud fra et stofs kemiskestrukturformel kan forudsige stoffets opløselighed, absorpti-on, transport, metabolisme, udskillelse og senest toksicitet.Den største betydning af de nye metoder er, at beregninger-ne gør det muligt at kombinere de medicinalkemiske og far-maceutiske undersøgelser. Med computernes hjælp kanmedicinalkemikerne nu samtidig med optimeringen af akti-vitet og selektivitet sikre sig, at de fremstillede stoffer harpassende egenskaber og biotilgængelighed i kroppen.Denne integration af de traditionelle medicinalkemiske ogfarmaceutiske områder stiller store krav til uddannelsen afpersoner indenfor begge discipliner. Det projekt, som beskri-ves her, er da også inspireret af og stærkt påvirket af et sam-arbejde mellem Institut for Medicinalkemi og Institut forFarmaci.

Forudsigelse af egenskaberVi har som udgangspunkt valgt at udvikle to forholdsvisenkle metoder, fordi de skal være tilstrækkeligt hurtige til, athundredvis eller måske tusindvis af stoffers egenskaber kanforudsiges i løbet af nogle minutter.Tidsfaktoren er vigtig, fordi man i dag designer og fremstil-ler biblioteker med tusindvis af stoffer i de indledende faserunder udviklingen af et nyt lægemiddel. Her er det nødven-digt, at stofferne - samtidig med, at de er strukturelt forskel-lige - opfylder bestemte krav til opløselighed, absorption,

Computerbaserede metoder integrerer medicinalkemi ogfarmaci og gør det muligt både at optimere et lægemid-delstofs biologiske aktivitet og dets biotilgængelighed.

Af Flemming Steen Jørgensen, Jørgen Bonefeld Kristensenog Inge Thøger Christensen

Udviklingen af et nyt lægemiddel er en kompliceret, langva-rig og kostbar proces. Ofte er det nødvendigt at fremstilletitusindvis af stoffer, hvoraf et eller måske et par stykkerefter 5-10 års arbejde ender som nye lægemidler. Det er selv-sagt klart, at medicinalindustrien forsøger at optimere udvik-lingsprocessen, som kan sammenlignes med et forhindrings-løb, hvor der ved hver forhindring skilles nogle deltagere fra.Oprindelig var det medicinalkemikernes job at fremstille etpotentielt lægemiddelstof med passende aktivitet og selekti-vitet. Lægemiddelkandidaten blev derefter sendt videre i sy-stemet med henblik på at opnå en farmaceutisk formulering,som sikrede, at lægemiddelstoffets biotilgængelighed varpassende, så det blev optaget i kroppen og nåede det ønske-de virkningssted.For blot få år siden indså man nødvendigheden af at bestem-me disse egenskaber så tidligt som muligt under udviklingen

30

Beregning af acetylsalicylsy-res vandopløselighed efter

ATW WASA princippet.ATW står for Atom-Type

Weigthed og WASA står forWater-Accessible Surface

Area. Baseret på en traditi-onel kemisk formel konstru-

eres en tre-dimensionelmodel af molekylet. Dennemodel bruges til at bereg-ne, hvor meget de enkelte

atomer bidrager til denvandtilgængelige overflade.

Overfladearealet for hvert atom multipliceres med enkoefficient, som er karakteristisk for hver atomtype, og der-ved opnås tal for, hvor meget de enkelte atomer bidrager tilden vandige opløselighed. Endelig summeres bidragene fraalle atomerne og man får molekylets vandige opløselighed.

HCar henviser til brintatomer bundet til et aromatisk kulstofatomog Osp2 henviser til iltatomerne i carbonylgrupperne.

D a n m a r k sF a r m a c e u t i s k e

Ph.d. Flemming Steen

Jørgensen er docent

ved Institut for

Medicinalkemi.

Stud.pharm. Jørgen

Bonefeld Kristensen

er Novo Nordisk

Scholarstipendiat

ved Institut for

Medicinalkemi, hvor

han udfører sit speci-

aleprojekt.

Ph.d. Inge Thøger

Christensen er

kemiker ved Novo

Nordisk A/S.

31

transport, metabolisme og udskillelse. Tidsforbruget forbegge beregningsmetoder er kun omkring 1 sekund pr. stof.Den ene metode, vi har udviklet, bygger på det princip, at etstof består af forskellige atomer og hvert af disse atomerbidrager til stoffets egenskaber. En tre-dimensionel modelkonstrueres ud fra stoffets kemiske struktur, og hvert atomsbidrag til stoffets vandtilgængelige overflade beregnes. Forhver atomtype vægtes arealet nu med en koefficient, som erkarakteristisk for atomtypen, og endelig lægges bidragenefra alle atomerne sammen.Ved den anden metode, fragmentmetoden, deles stoffet opi fragmenter svarende til funktionelle grupper og ringsyste-mer. Hvert fragment antages at bidrage med en karakteri-stisk værdi og ved sammenlægning af bidragene fås værdienfor den aktuelle egenskab, som vi vil vide noget om.Begge metoder har indtil nu været anvendt til forudsigelseaf egenskaber som vandopløselighed, absorption i mave-tarm-kanalen og transport over blod-hjerne-barrieren.

VandopløselighedNår et lægemiddel indtages gennem munden, typisk i formaf en tablet, skal lægemiddelstoffet først opløses i maveneller tarmen, dernæst passere tarmvæggen og endelig opta-ges i blodet, som sørger for den videre transport.Vandopløseligheden har altså stor betydning for mængdenaf tilgængeligt lægemiddelstof i mave-tarm-systemet og der-med for absorptionen og biotilgængeligheden af lægemid-delstoffet.Vi har brugt begge de nye computermetoder til at beregnevandopløseligheden af 1292 strukturelt meget forskelligestoffer. Til denne type forudsigelse var fragmentmetodenbedst (for andre egenskaber er det omvendt), og vandopløs-eligheden af stofferne kunne forudsiges relativt sikkert.

pH-afhængig opløselighedDet er ikke kun et stofs vandopløselighed ved neutral pH, somhar interesse i lægemiddelsammenhæng. Såfremt stoffet skalopløses i mavesækken, er det også vigtigt at kende detsopløselighed i sur væske.Vi har derfor forsøgt at udvide begge metoder til ikke blot atkunne forudsige opløseligheden i rent vand, men også til atestimere opløselighedens afhængighed af pH. Desværre van-skeliggøres dette af manglen på eksperimentelt bestemte pH-opløselighedsdata. Indtil nu er det dog lykkedes os at forud-sige opløseligheden som funktion af pH for simple stoffer,som kun indeholder en svagt sur eller en svagt basisk gruppe.Ovennævnte er kun nogle eksempler på de mange egenska-ber, som computerbaserede metoder kan bruges til at forud-sige. Metoderne er for tiden inde i en rivende udvikling, ogde anvendes allerede ved udvikling af nye lægemidler.

Figuren viser en tredimesionelmodel af acetylsalicylsyre, hvoratomerne er farvet efter type (ilter rød, kulstof hvid og brint lyse-blå). Den vand-tilgængeligeoverflade, dvs. den overflade,som afspejler, hvor tæt et vand-molekyle kan komme på ace-tylsalicylsyre, er vist som en hal-vgennemsigtig sky rundt ommodellen.

Beregning af acetylsalicyl-syres vandopløselighedved hjælp af fragmentme-toden. Med udgangs-punkt i stoffets kemiskeformel identificeres karak-teristiske grupper ellerfragmenter og deres antalbestemmes. For acetylsali-cylsyre finder vi f.eks. enmethylgruppe, fire-CH=grupper, en estergruppeosv. Opløselighedenberegnes derefter ved atsummere bidragene frahver af disse fragmenter.

EN SAMLET VURDERING

Computere er allerede i 25 år blevet brugt til at beregne,hvor aktivt et potentielt lægemiddelstof er. Her givermodellerne et bud på, hvor effektivt stoffet er til at aktive-re relevante receptorer på målcellerne.Men det er ikke nok, at et lægemiddelstof er virksomt. Detskal også nå frem til virkningsstedet i kroppen. I de senereår er vi begyndt at bruge computere til at beregne egen-skaber som absorption, distribution, metabolisme ogudskillelse fra kroppen.Ved at kombinere de to typer beregninger får man mulig-hed for både at forudsige lægemiddelstoffets biologiskeaktivitet og dets biotilgængelighed. Man finder med andreord på et tidligt tidspunkt i processen ud af, om et læge-middelstof er egnet til videre udvikling.

O

O

O

OH

CH3

CH3

O

O

O

OH

=CH–

Fragment Counts Coefficient log S

–CH3 1 -0.3915 -0.39=CH in a ring 4 -0.3382 -1.35–C(=O)OH aromatic 1 -0.0338 -0.03–C(=O)O– ester 1 0.2613 0.26CH=CH–CH=C–C= 2 -0.1248 -0.25CO–O–C–CH= 1 -0.1088 -0.11

-1.88


Optagelse af nye vaccineri kroppens immunceller

Indenfor de seneste år har bioteknologien gjort det muligt atfremstille en ny type vacciner, som består af mindre enhederaf de sygdomsfremkaldende mikroorganismer, nemlig prote-iner og små proteinstumper kaldet peptider samt DNA.Fordelen ved de nye vacciner er færre bivirkninger, fordi kunen lille del af mikroorganismerne præsenteres for kroppensimmunforsvar. Samtidig undgår man risikoen for sygdom.Til gengæld er de nye vacciner endnu ikke så effektive til atstimulere immunforsvaret som de traditionelle vacciner.

Nye transportsystemerEffekten af de bioteknologiske vacciner kan muligvis forbed-res, hvis de transporteres direkte hen til de celler i immun-forsvaret, som de skal sætte i alarmberedskab. På Institut forFarmaci fremstiller vi forskellige former for transportsyste-mer, som kan dirigere de nye vacciner hen til de celler i krop-pen, hvor de har størst effekt. Vi prøver at udnytte det prin-cip, som bakterier og virus har udviklet til perfektion, nemligat inficere på den mest effektive måde.Vi koncentrerer os om partikler i mikro- og nanometer skala-en til transport af vaccinerne; partiklerne har de sammedimensioner som mikroorganismer. Partiklerne skal indkap-sle de artsfremmede vacciner, beskytte dem mod nedbryd-ning og sørge for, at vaccinen frigives på kontrolleret vis pådet rigtige sted i kroppen. Endelig skal partiklerne forbedreimmunresponset overfor vaccinerne. På verdensplan satsesder på forskellige former for bionedbrydelige partikler affedtstoffer kaldet lipider samt på polymerpartikler af bl.amælkesyre, stivelse og gelatine. I gruppen arbejder en ph.d.-studerende med faste lipid-nanopartikler til DNA-vaccinationog en anden ph.d.-studerende undersøger et polymerbaseretsystem til en kræftvaccine.

Måling af cellulær optagelseEt af vore mål er at undersøge, hvilken betydning partikler-nes fysisk-kemiske egenskaber såsom størrelse, ladning ogfedtopløselighed har for deres optagelse i immunsystemetsceller.Vi bruger kulturer af en type immunceller, der kaldes dendri-tiske celler til undersøgelserne. Forstadier til dendritiske cel-ler dannes i knoglemarven og cirkulerer hele tiden rundt iblodet. De fungerer som immunsystemets skildvagter, deropfanger faresignaler og bevæger sig til infektionsstedet,hvor de optager artsfremmede stoffer. Derpå sætter de gangi et meget effektivt immunrespons. Dendritiske celler kannemlig provokere immunforsvaret til at reagere på to måder:For det første dannes der antistoffer, som kan neutralisere syg-domsfremkaldende mikroorganismer, og for det andet stimule-rer de dendritiske celler dannelsen af dræberceller, som kangenkende inficerede celler og eliminere dem. Til forsøgene isolerer vi forstadier til dendritiske celler fra don-

En række nye vacciner er baseret på proteiner eller DNAfra sygdomsfremkaldende mikrober. Vaccinerne er udenrisiko for brugeren, men de virker ikke så effektivt somtraditionelle vacciner. Derfor skal de nye vacciner trans-porteres hen til og optages i netop de celler i immunfor-svaret, som vaccinerne skal sætte i alarmberedskab.

Af Camilla Foged, Birger Brodin og Sven Frøkjær

Det er nu mere end 200 år siden, at Edward Jenner opdage-de, at levende ko-kopper kan beskytte mennesker mod kop-per, og han lagde dermed grunden for den del af lægevi-denskaben, som kaldes immunologi. For 100 år siden skabteLouis Pasteur et nyt gennembrud ved at bruge dræbtemikroorganismer som vacciner. Han understregede det vigti-ge princip, at stimulering af menneskets immunsystem meden lille smule af en sygdomsfremkaldende mikroorganismekan beskytte mod efterfølgende infektion.De traditionelle vacciner har været en stor succes i hele ver-den, og flere sygdomme som f.eks. kopper er i dag udryddetglobalt. Men trods successen er vor viden om, hvordan vacci-ner virker langt fra tilbundsgående, for der findes stadigmange sygdomsfremkaldende mikroorganismer, som hvertår forårsager millioner af dødsfald, og som vi endnu ikke harværet i stand til at udvikle vacciner imod. Nogle eksempler erHIV og malaria.

32

Transmissionsbillede af dendritiske celler. Bemærk den megetfoldede overflade, der giver cellerne en stor overflade til opta-gelse af mikroorganismer samt til omrøring af det omgivendevandlag og til samspil med andre immunceller.

Cand.scient. Camilla

Foged er ph.d.-stude-

rende ved Institut for

Farmaci. Ph.d.-projek-

tet er støttet af

Statens Teknisk

Videnskabelige

Forskningsråd og

Centre for Drug

Design and Transport.

Ph.d. Birger Brodin er

forskningslektor ved




for Farmaci.

33

orblod og dyrker dem i kultur en uge ved tilstedeværelse af enrække stoffer, som fremkalder dannelsen af dendritiske celler.Som modelpartikler anvender vi kommercielt tilgængeligelatex-partikler, som har flere fordele; de er velkarakterisere-de, de findes i mange veldefinerede størrelser, og de kanmærkes med fluorescerende molekyler, hvilket gør detmuligt at detektere dem. Desuden varierer vi ladning og fed-topløselighed på overfladen af partiklerne.Dendritiske cellers optagelse af disse modelvacciner målesmed en type fluorescens-mikroskopi, som kaldes konfokallaser-scanningsmikroskopi, samt ved fluorescens-aktiveretcellesortering.Projektet har til dato koncentreret sig om opsætning ogkarakterisering af cellekulturer med dendritiske celler, ogdesuden har vi udviklet metoder til at bestemme optagelseni cellerne og koblingen af diverse makromolekyler til model-partikler. I den næste fase vil vi gå i gang med at kvantifice-re optagelsen af vaccinerne i de dendritiske celler ved hjælpaf fluorescens-aktiveret cellesortering, hvorved man kanmåle intensiteten af det fluorescerende lys fra hver enkelt

celle. Desuden vil vi se på, hvordan forskellige typer partiklerpåvirker præsentationen af artsfremmede peptider og der-med det efterfølgende immunrespons.

Langsigtede perspektiverVi tror, at studier af partiklernes egenskaber og deres betyd-ning for optagelsen i cellerne kan give os en større forståel-se af, hvilke faktorer der er vigtige for at starte et immunre-spons ved vaccination med nye bioteknologiske vacciner. Ensådan viden vil være værdifuld til design af nye transportsy-stemer, og vil måske kunne fortælle os, hvilke stoffer, der erbedst egnede som vacciner.Endelig ønsker vi at undersøge mulighederne for at forøgeimmunresponset ved specifikt at kunne dirigere vacciner tildendritiske celler i kroppen. Det kunne gøres ved at koble etmolekyle til vaccinen, der genkendes af receptorer på over-fladen af de dendritiske celler. Potentialet af de nye vacciner er stort, og vacciner rettet modinfektionssygdomme, autoimmune sygdomme og kræftudgør spændende nye lægemiddelkandidater.

Her ses en overlejring af et transmissionsbillede og et konfokaltoptisk snit gennem en dendritisk celle, der har været inficeretmed E.coli i tre timer. Den røde farve stammer fra E.coli. Nubefinder bakterierne sig i cytoplasmaet tæt på cellekernen.Bemærk den lille T-celle til højre, der scanner dendritcellensoverflade for artsfremmede peptider.

Overlejring af et transmissionsbillede og et konfokalt optisk snitgennem en dendritisk celle, der har været inficeret med 10 µmlatexpartikler i fire timer. Latexpartiklerne er grønne.


Konfokalmikroskopi er en avanceretform for fluorescensmikroskopi, hvorman ved hjælp af en laser og fin optiker i stand til at detektere fluorescensfra et meget tyndt optisk snit uden atmedtage forstyrrende lys fra de nærlig-gende planer. Således kan man ved atmærke celler med fluorescerende mar-kører både se strukturer på overfladenog inde i cellen. Figuren viser et konfo-kalt billede af en dendritisk celle, somhar optaget E.coli. Den grønne farvestammer fra E.coli. Den røde farvestammer fra et antistof rettet mod enoverflademarkør på dendritiske celler.Det ses, at E.coli efter to timer befindersig nær cellens ydre membran.


DNA-vaccine mod salmonella

Forsøg med vaccinering af rotter skal vise, om en ny DNA-vaccine gør dyrene immune over for salmonella.Forskningen kan føre til udvikling af DNA-vacciner modbakterier, som ofte findes i fødevarer.

Af Jesper Drøgemüller, Peter Thygesen, Erik Riise og Jan Engberg

Vacciner består traditionelt af svækkede bakterier eller virus, somaktiverer immunsystemet til at modstå fremtidige infektionermed den pågældende mikroorganisme. Men der er ulemper vedde traditionelle vacciner. Svækkede bakterier og virus fremkaldertypisk de karakteristiske symptomer for sygdommen i mild grad.Selvom symptomerne er mildere end ved den egentlige sygdom,kan de give anledning til en del ubehag, især hos mindre børn.Man kan også vaccinere med komponenter af bakterier og virus,hvorved man ofte undgår disse problemer. Sådanne vacciner akti-verer især den del af immunforsvaret, som sørger for dannelsenaf antistoffer, som kan opspore de pågældende mikroorganismer.Men det er ikke altid nok til at nedkæmpe sygdomsfremkalden-de bakterier og virus.For at vaccinationen skal virke optimalt, må man også aktivereden anden del af immunforsvaret. Immunforsvarets anden arm erbaseret på dræberceller, som destruerer de celler i kroppen, derer inficeret af mikroorganismer. Dræbercellerne spiller en vigtigrolle ved bekæmpelsen af en række infektionssygdomme, speci-elt intracellulære bakterier og virus, og her er de traditionelle for-mer for vaccination ikke altid tilstrækkelige til at opnå en effek-tiv beskyttelse.På grund af ulemperne ved de eksisterende vacciner forskes derintenst i nye måder at vaccinere på. Adskillige studier har vist, atDNA-vacciner er i stand til at stimulere immunforsvaret.Princippet er, at der indføres et stykke DNA fra en mikroorganis-me i kroppens egne celler. Genet indeholder opskriften på et pro-tein fra den bakterie eller virus, som man ønsker beskyttelseimod. Når genet er kommet ind i cellerne, producerer de protei-net, hvorpå det bliver præsenteret på cellernes overflader. Détsætter immunforsvarets celler i alarmberedskab mod den pågæl-dende bakterie eller virus. På den måde opnår man en situation,der ligner en egentlig infektion med intracellulære bakterier.For at øge beskyttelsen yderligere kan genet for bakterieprotei-net indgives i kombination med gener for immunforsvarets sig-nalstoffer, og ved hjælp af dem kan immunresponset stimuleres iden retning, man ønsker.

Rotter som modelsystemSom modelsystem har vi valgt infektion med Salmonella typhi-murium i rotter. S. typhimurium er en af de salmonellabakterier,der optræder hyppigt i fødevareforgiftninger hos mennesker. Iorganismen lever bakterien inde i cellerne, og dens infekti-onsmønster ligner en anden salmonellaart, Salmonella typhi, der

34

er årsag til den langt farligere infektionssygdom tyfus hos men-nesker. Tyfus optræder hyppigt i situationer, hvor mange menne-sker er samlet på et lille areal med få vandressourcer og dårligesanitære forhold.Til at alarmere immunforsvaret mod S. typhimurium har vi valgtet protein fra bakteriens overflade, det såkaldte flagelprotein(FliC).For at forstærke immunresponset vil vi samtidig forsøge at stimu-lere det cellulære immunsystem. Reguleringen af det cellulæreimmunsystem er meget kompliceret, og der indgår flere forskelli-ge hjælperceller og signalstoffer, der stimulerer hjælpercellerne.Et af vigtigste signalstoffer er et gamma-interferon. Af dennegrund indeholder vaccinen også DNA, der danner gamma-inter-feron.Genet for flagelproteinet er blevet isoleret fra S. typhimurium vedhjælp af PCR-teknik. Med denne metode kan man mangfoldig-gøre et bestemt gen fra en organisme, så genet efterfølgendekan isoleres. Genet for gamma-interferon er blevet fremstillet påsamme måde ud fra hvide blodlegemer fra rotter. For at sikre atrottecellerne udtrykker gamma-interferon, anvendte vi blodlege-mer, som blev isoleret fra rotter, der er stimuleret med en ikkedødelig dosis af S. typhimurium. Disse celler har en øget produk-tion af gamma-interferon.Ved opformeringen af generne for flagelproteinet og forgamma-interferon kobles de to gener sammen således, at de syn-tetiseres som et sammenhængende protein. De fusioneredegener indsættes derpå i et plasmid, et lille ringformet stykke DNA,der fungerer som genfærge. Plasmidet kan indføre de indsattegener i både colibakterier og i rotteceller.Fordelen ved at bruge en sådan genfærge er, at alt DNA-arbej-

det kan foretages i colibakterier. Ved at analysere sammensæt-ningen af DNA-molekylerne har vi sikret os, at generne er opfor-meret fejlfrit, at de er koblet rigtigt sammen, samt at de sidderkorrekt i forhold til den gensekvens, der starter produktionen afproteinet fra salmonella i kombination med gamma-interferon.

Forsøg med rotterI første omgang undersøgte vi, om fusionsproteinet kan udtryk-kes i cellekultur af celler fra mus. Her brugte vi en analyseteknik,der er baseret på antistoffer, som genkender fusionsproteinet.Metoden er meget følsom, og tilstedeværelsen af det ønskedeprotein kan spores i meget små mængder. Undersøgelsen viste, atcellerne danner fusionsproteinet.Næste trin er at afprøve vaccinen i rotter, hvilket vi netop er gåeti gang med. DNA’et indgives ved direkte injektion i musklerne,fordi muskelceller er i stand til at optage og udtrykke fremmedDNA. Vaccinationen gentages efter 14 dage på samme måde somi traditionel vaccination for at forstærke immuniseringseffekten.14 dage efter den sidste vaccination gives rotterne en normaltdødelig dosis af S. typhimurium, og vaccinens effekt på overlevel-sen anvendes som mål for vaccinens effektivitet.


Cand.pharm. Jesper

Drøgemüller er

undervisningsassistent

ved Institut for

Farmakologi.

Ph.d. Peter Thygesen

er research scientist,

Farmakokinetisk Afd.

Novo Nordisk A/S.

Ph.d. Erik Riise er

lektor ved Institut

for Farmakologi.

Dr.scient. Jan Engberg

er professor ved

Institut for

Farmakologi.

35

Figuren viser princippet i fremstilling af en DNA-vaccine. Genet for flagelproteinet fra salmonella samt genet for gammainterferon,der stimulerer det cellulære immunforsvar, indsættes i et lille ringformet stykke DNA, der fungerer som genfærge. Plasmidet indsæt-tes i cellekulturer (tv), og cellerne danner nu et fusionsprotein af flagelproteinet og gammainterferon. Plasmidet kan bruges til atindføre de to gener i både colibakterier og i rotteceller. Når man ved arbejdet med cellekulturer har sikret sig, at fusionsproteinetdannes og fungerer korrekt, afprøves DNA-vaccinen i rotter (th). DNA’et indgives ved direkte injektion i musklerne, fordi muskelcel-ler er i stand til at optage og udtrykke fremmed DNA.

Genet forgammainteferon Genet for

flagelprotein

FusionsproteinInkubationsperiode

Infektion med salmonella


Højfølsomme mikroteknikker

til analyse af blod og urinbasal analytisk kemisk forskning og målrettet udviklingsar-bejde. På Institut for Analytisk og Farmaceutisk Kemi har vinetop kombineret to teknikker på en måde, som muliggøranvendelse af mikroteknikken kapillarelektroforese til analy-se af biologiske prøver.Når det er nødvendigt med meget følsomme metoder vedanalyser af blod og urin skyldes det, at de forbindelser, derønskes analyseret, ofte findes i lav koncentration blandttusindvis af andre forbindelser. Derfor må man anvendemetoder, der først adskiller så mange af stofferne sommuligt, og som derefter måler mængderne af de relevantestoffer i en detektor.Målet med vor forskning har været at kombinere en af demest effektive separationsteknikker med nogle af de mestselektive og samtidig mest følsomme detektionsmetoder.

Adskillelse og målingSeparationsprincippet for kapillarelektroforese er baseret på, atprøvens indholdsstoffer vandrer med forskellige hastigheder i etelektrisk felt; små molekyler med en høj elektrisk ladning vil såle-des vandre hurtigere end store molekyler med lav elektrisk lad-ning. Separationerne foretages i tynde kvartsrør med indre dia-metre på typisk 25-75 µm, under indflydelse af elektriske felt-styrker på op til ca. 100.000 V/m. Det er en yderst effektiv mikro-separationsteknik, men desværre er følsomheden ved anvendel-se af den traditionelle UV-detektionsteknik ikke altid tilstrække-lig til, at metoden kan anvendes ved analyse af biologiske prøver,hvor mange relevante stoffer kun findes i meget små mængder.To nye teknikker har ændret dette forhold radikalt. Den første erbaseret på en sammenkobling af kapillarelektroforese med in-duktivt-koblet-plasma-massespektrometri (ICP-MS). Her føresprøven ind i et plasma, som har en temperatur på omkring8.000°C. Den høje temperatur i plasmaet medfører, at alt stof iprøven atomiseres og ioniseres. De positive ioner, der dannes vedprocessen, føres hen til et massespektrometer, som sorterer demefter deres masse-ladningsforhold. Man kan altså måle selektivtpå udvalgte grundstoffer og oven i købet på enkelte isotoper afet givet grundstof. Tilmed er denne målemetode generelt megetfølsom for en lang række grundstoffer.Problemet med at koble kapillarelektroforese on-line til ICP-MSligger i, at kapillarelektroforese er en mikroteknik, mens masse-spektrometrien må betegnes som en makroteknik, der kræverstore prøvemængder tilført – flere milliliter i minuttet. Til sam-menligning er mængden, der kommer fra kapillarelektroforesenmindre end en mikroliter i minuttet.Hvis massespektrometret skal kunne analysere denne meget lillevolumen, skal prøven føres direkte ind i plasmaet. Her er det lyk-kedes os at udvikle et billigt mellemled mellem kapillarelektro-foresen og massespektrometret, som koster under tusind kroner.Interfacet fungerer som en forstøver og er udformet således, atden forstøvede sky kan sprayes direkte ind i det varme plasma.

For at få tilladelse til at sælge et lægemiddel, må mankunne dokumentere, hvad der sker med lægemiddels-toffet efter optagelsen i kroppen. Normalt omsætteslægemiddelstoffer i leveren, og et kendskab til omdan-nelsesprodukterne og deres udskillelse fra kroppen giveren sikkerhed for lægemidlets uskadelighed.

Af Lars Bendahl, Bente Gammelgaard, Ole Jøns, Ole Farverog Steen Honoré Hansen

Hvad sker der med et lægemiddel efter indtagelsen? Hvilkestoffer omdannes medicinen til? Er omdannelsesprodukterneuskadelige eller giftige? Svarene kan findes ved at analysereblodprøver eller urinprøver fra patienten. Men analysernekræver, at man råder over meget følsomme og selektivemålemetoder.For at udvikle nye teknikker, der øger mulighederne forfølsom og selektiv detektion, er det nødvendigt med både

36

Br79Br

82Br

Time/min

Br

NH2

CH3

NN

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1

3000

2500

2000

1500

1000

500

0

Co

un

ts/s

at

m/z

82

30000

25000

20000

15000

10000

5000

0

Co

un

ts/s

at

m/z

79

Eksempler på anvendelser af CE-ICP-MS ved bioanalyse. Øverst, et elektro-ferogram fra en analyse for selen i human urin, der viser, at prøven inde-holder 4 forskellige selenforbindelser. Den totale koncentration af selen iprøven er ca. 30 ng/mL. Nederst, et elektroferogram fra en analyse forbrom i human urin fra en person, der har indtaget hostemidlet bromhex-in. Analysen viser, at størstedelen af hostemidlet er blevet omdannet til enrække forskellige bromholdige omdannelsesprodukter.


Plasma

CE-ICP-MS Interface

CE-kapillar

Argon til forstøvning

Elektrolytopløsning CE-buffer

Højspændingsstrømforsyning

Cand.scient. Lars

Bendahl er ph.d.-stu-

derende ved Institut

for Analytisk og

Farmaceutisk Kemi.

Ph.d. Bente

Gammelgaard er

lektor ved Institut

for Analytisk og

Farmaceutisk Kemi.

Lic.pharm. Ole Jøns er

lektor ved Institut for

Analytisk og

Farmaceutisk Kemi.

Dr.scient. Ole Farver

er professor ved

Institut for Analytisk

og Farmaceutisk

Kemi.

Dr.pharm. Steen

Honoré Hansen er


for Analytisk og

Farmaceutisk Kemi.

37

En analyse for selen i human urin viser, hvad den kombineredemålemetode kan præstere. Her er det lykkedes at påvise fire for-skellige selenforbindelser, som findes i koncentrationer på fånanogram pr. ml urin. Vi har også analyseret urinprøver fra en person, som har indta-get hostemidlet bromhexin. Kun en lille fraktion af lægemidletudskilles uomdannet. Størstedelen af lægemidlet er blevetomdannet til en række stofskifteprodukter, hvoraf i alt otte for-skellige kan detekteres. Kun stoffer indeholdende brom bliverdetekteret her.

Billigt og effektivtMassespektrometri er som nævnt en teknik, hvor ioner kanblive sorteret efter forholdet mellem deres masse og ladning.Der findes flere forskellige metoder til ionisation af prøven imassespektrometri.Vi har også koblet kapillarelektroforese med elektrospray-ionisation-massespektrometri. Her forstøves prøven ved hjælpaf et elektrisk felt til en spray af ladede aerosoler, dvs. partik-ler på dråbeform. På vej ind i massespektrometret fordamper

opløsningsmidlet fra partiklerne, og ladningen overgår til deefterladte forbindelser.Da forbindelsernes kemiske struktur bevares ved denne ioni-sationsform, er det muligt at opnå information om et stofsmolekylvægt og formodede struktur, samtidig med at det eren følsom målemetode. Igen er det af stor vigtighed, at mest muligt af prøven frakapillarelektroforesen bliver ført ind i massespektrometret. Damassespektrometret fungerer bedst med små væskemængder,går kunststykket ud på, at få dannet en meget fin forstøvningaf prøven direkte fra analysekapillaret til massespektrometret.Dette er tidligere gjort muligt ved hjælp af de såkaldte nano-spray-interfaces, som er kommercielt tilgængelige, og somkoster omkring 100.000 kr. Her er det lykkedes for os at frem-stille et interface til under tusind kroner. Den elektrisk ladedespray udgår fra selve kapillaret, der er pålagt et elektriskledende lag af nikkel. Ved hjælp af justeringsskruer kan detnikkelbelagte kapillar placeres således, at størstedelen afsprayen rettes direkte mod indgangen til massespektrometret.Ved at benytte begge typer af koblede teknikker ved bioana-lyse af et stof som hostemidlet bromhexin, der indeholder tobromatomer pr. molekyle, kan vi få oplysninger om, hvilkeomdannelsesprodukter i urinen, der indeholder brom, og hvormeget der er af de enkelte produkter. Endvidere får vi oplys-ning om stoffernes molekylvægt, hvorefter en foreløbigkemisk struktur kan optegnes.

Kraftfuldt værktøjEn intensiv forskning i og udvikling af nye højfølsomme ogselektive analyseteknikker er vigtig i forbindelse med fort-satte bioteknologiske landvindinger.Specielt er sammenkoblingen af meget effektive separati-onsteknikker med selektive og følsomme detektionsprincip-per et kraftfuldt værktøj ved analyse af meget komplekstsammensatte prøver. Ved yderligere at kombinere data frasammenkobling af kapillarelektroforese med de to forskelli-ge former for massespektrometri, kan vi på få dage opnåresultater, som det tidligere ville tage uger eller måneder atopnå. Da der samtidig er tale om en mikrometode kanprøver i nanoliter-størrelsen analyseres.

Skematisk illustration af separationsprincippet i kapillarelektro-forese. A: En prøve bestående af anioniske •, kationiske • ogneutrale forbindelser • indføres i kapillaret. B: Kapillaretpålægges en elektrisk spænding, og de ladede forbindelser vilnu vandre med forskellig hastighed og retning. En overordnetvæskestrømning i kapillaret, benævnt det elektroosmotiskeflow (EOF), sikrer, at alle forbindelserne føres imod detektoren.

Figuren illustrerer princippet for CE-ICP-MS koblingen.Den elektriske forbindelse til udgangen af kapillaret eropnået gennem en elektrolytopløsning, der strømmerlangs udgangsenden af kapillaret. Forbindelser, der for-lader udgangsenden af kapillaret under separationen,føres med den strømmende elektrolytopløsning og fors-tøves ved hjælp af argon direkte ind i plasmaet.

Den elektriske kontakt til udgangsenden af kapillaret er opnåetgennem et pålagt nikkellag, der samtidigt fungerer som elek-trisk pol ved elektrosprayionisationen. Forbindelser, der underseparationen forlader kapillarets udgangsende, forstøves vedhjælp af et elektrisk felt til en sky af ladede areosoler. På vejmod massespektrometret omdannes areosolerne til en sky afmolekylære ioner.

A

B

Detektor

EOF

CE-MS interfaceNikkelbelagtkapillar

Z-justerings-skrue

Y-justerings-skrue

X-justerings-skrue

s

s

Farmaceutisk omsorg handler om at sikre, at patienternefår de rigtige lægemidler i de rigtige doseringer samtgod besked om, hvordan medicinen skal anvendes oghvorfor. På danske apoteker har farmaceuterne dårlig tidtil opgaven. En vej til at forbedre situationen er, at apo-tekerne får mulighed for at tjene penge på farmaceutiskomsorg.

Af Charlotte Rossing, Ebba Holme Hansen og Janine Marie Morgall

Målet med farmaceutisk omsorg er at sikre, at enhver medi-cinsk behandling er rettet mod at opnå resultater, som forbed-rer patientens livskvalitet. Konceptet blev udviklet i USA i slut-ningen af 1980’erne, og ideen var, at farmaceuter i samarbejdemed læger og sygeplejersker kunne reducere og forebyggelægemiddelrelaterede problemer på hospitalerne.Der er god grund til at gøre en indsats. I USA - og sandsynligvisogså i Danmark og Europa - oplever en ud af halvtreds hospi-


Farmaceutisk omsorg på apotekerne

talspatienter problemer med lægemidler - f.eks. forkert medi-cin, forkert dosering, bivirkninger eller manglende behandling.Ideen om at trække på farmaceuters faglige kompetence tilat afhjælpe problemerne blev godt modtaget af farmaceuterog deres faglige organisationer i mange lande. Farmaceutiskomsorg er efterfølgende blevet overført fra hospitaler tilapoteker i primærsektorer.Farmaceutisk omsorg er en professionsstrategi, som søger atopfange og forebygge problemer i forbindelse med anvendel-se af lægemidler. I arbejdet tænker farmaceuten helhedsorien-teret på patienten og dennes anvendelse af medicin.Farmaceutisk omsorg indgår i Danmarks Apotekerforeningskvalitetssikringsprogram som en metode til at sikre lægemid-delbehandlingen blandt patienterne. Dette kan ske ved: ”atidentificere, løse og forebygge lægemiddelrelaterede proble-mer samt at overvåge og dokumentere resultaterne af behand-lingen”. Information til patienterne om problemer ved brug aflægemidler er et væsentligt aspekt af farmaceutisk omsorg.

Problemer med lægemidlerI USA udgav ”Committee on Quality of Health Care inAmerica” i 2000 rapporten ”Det er menneskeligt at fejle”,som vakte stor opsigt, også i Danmark, med sin dokumenta-tion af de problemer, som findes ved anvendelsen af læge-midler. I rapporten skønner komiteen, at to procent af allehospitalsindlagte patienter i USA oplever et lægemiddelrela-teret problem, som kunne have været undgået. At det ikkesker, resulterer i en årlig merudgift på 2 milliarder dollar tilbehandling af de gener, patienterne må døje med. Komiteenvurderer endvidere, at der dør 7000 mennesker om året iUSA på grund af fejlmedicinering.Der findes ingen nyere opgørelse over omfanget af læge-middelrelaterede problemer i Danmark. En undersøgelselavet i 1996 på svenske apoteker viste, at der var problemermed lægemidler hos 2,5 procent af patienterne. Proble-merne vedrørte især receptpligtig medicin. De oftest rappor-terede vanskeligheder var patientens usikkerhed om formå-let med at tage lægemidlet, problemer med doseringen,praktiske problemer og receptfejl.I vinteren 1999/2000 gennemførte vi en spørgeskemaunder-søgelse om farmaceutisk omsorg på Danmarks 288 apoteker,hvor spørgsmålene blev besvaret af den farmaceut, som varansvarlig for farmaceutisk omsorg eller information på apo-teket. Svarprocenten var 75,7 procent.De resultater, vi fremlægger i denne artikel, er relateret til

38

Konsultation ved skranken. Farmaceuter har en god faglig bag-grund for at tale med patienterne om deres brug af medicin ogfor derigennem at identificere, løse og forebygge lægemiddel-relaterede problemer. Men i praksis kniber det med at få tid tilfarmaceutisk omsorg på danske apoteker.


Cand.pharm.

Charlotte Rossing er

ph.d.-studerende ved

Institut for

Samfundsfarmaci.

Cand.pharm. Ebba

Holme Hansen er pro-

fessor ved Institut for

Samfundsfarmaci.

Fil.dr. Janine Marie

Morgall er lektor ved

Institut for

Samfundsfarmaci.

39

besvarelsen af to spørgsmål: Hvordan prioriterer farmaceu-terne information om lægemiddelrelaterede problemer? Oghvilke forhindringer for farmaceutisk omsorg oplever farma-ceuterne på apotekerne?

Information på apotekerFarmaceuterne prioriterede emner af en teknisk karakterhøjest, og mere end to tredjedele vurderede, at ”informati-on om den tekniske brug af lægemidler” er vigtig. Emnernevar: Hvordan lægemidlet skal indtages, hvilken dosis der skalindtages, hvor lang tid lægemidlet skal bruges, og hvordandet skal opbevares.”Information relateret til lægemidlers kliniske virkninger”blev vurderet som betydningsfuld af færre farmaceuter. Et afemnerne var behovet for at informere om, hvordan læge-midler, som indtages samtidig, kan skabe problemer for pati-enten. Halvdelen af farmaceuterne vurderede, at dette ervigtig information. En tredjedel mente, at ”information omlægemidlers bivirkninger” er vigtig.Inden for området ”information om formålet med at tagelægemidlet” var emnerne: Hvordan virker lægemidlet, oghvad er formålet med at tage medicinen? Omkring halvdelenaf farmaceuterne mente, at det var vigtigt at give denneform for information til patienterne. Sådanne oplysningerkan kaldes motiverende information, og det er den typeinformation, som prioriteres højt inden for farmaceutiskomsorg.

Forhindringer på apotekerneTidligere undersøgelser i bl.a. USA og Irland har vist, at detkan være svært at indføre farmaceutisk omsorg i det dagligearbejde på apotekerne. I denne undersøgelse blev følgendeforhindringer for farmaceutisk omsorg oplevet af mindst entredjedel af farmaceuterne:Den oftest oplevede interne forhindring var manglendemulighed for at forlade de daglige arbejdsrutiner for atarbejde med farmaceutisk omsorg, hvilket var et problem for65 procent af de adspurgte. 40-46 procent svarede, at mang-lende arbejdskraft var en forhindring. 37 procent anførte, at

manglende lyst fra ledelsen var en forhindring for imple-menteringen af farmaceutisk omsorg. Endelig mente 35 pro-cent af farmaceuterne, at manglende driftsmidler var et pro-blem. Dette kan tolkes som en lav prioritering af ressourcertil at indarbejde farmaceutisk omsorg på danske apoteker. Den vigtigste eksterne forhindring var manglende samarbej-de med læger, hvilket blev nævnt af 35 procent af farmaceu-terne. Andre forhindringer var manglende samarbejde medpatientforeninger og manglende samarbejde med andetsundhedspersonale.

Lang vej igenNår farmaceuterne på de danske apoteker primært priori-terer teknisk information om lægemiddelrelaterede pro-blemer, kan det hænge sammen med opbygningen af far-maceutstudiet, der primært er fokuseret på tekniske fag.En sådan fagsammensætning fremmer ikke nødvendigvisen helhedsorienteret opfattelse af patient og lægemidde-lanvendelse.Den vigtigste eksterne forhindring for farmaceutiskomsorg - manglende samarbejde med lægerne – og deinterne forhindringer vedrørende manglende prioriteringog manglende ressourcer bør afhjælpes for at fremmearbejdet med farmaceutisk omsorg. Dette er afhængig afledelsen på det enkelte apotek. Et større engagement fraledelsens side kan måske medvirke til at reducere de ople-vede forhindringer.Derimod kan det være vanskeligt for den enkelte apotekerat finde øgede driftsmidler til farmaceutisk omsorg. Attage betaling for sådanne sundhedsydelser kan være enløsning på dette problem. Danmarks Apotekerforeningarbejder nu med modeller for ”prisbærende sundhedsydel-ser”, hvor apotekerne netop kan tjene penge på at udøvefarmaceutisk omsorg. Konklusionen er, at der stadig mangler et stykke vej, førfarmaceutisk omsorg bliver en del af hverdagen på danskeapoteker. Hvis apotekerne ønsker at implementere farma-ceutisk omsorg, peger denne undersøgelse på nogle områ-der, hvor man kan sætte ind.

PROBLEMER I FORBINDELSE MED ANVENDELSE AF LÆGEMIDLER

Ubehandlet indikation Patienten har et medicinsk problem, som burde behandles med lægemidler

Uhensigtsmæssig præparatvalg Patienten har en behandlingskrævende tilstand, men det anvendte præparat er ikke det optimale

For lav dosering Patienten får det rigtige lægemiddel, men i for lav dosis til at det har den ønskede virkning

Uhensigtsmæssig anvendelse Patienten får det rigtige lægemiddel, men anvender det ikke hensigtsmæssigt på grund af tekniske, fysiske, psykiske, sociale eller økonomiske årsager

Overdosering Patienten får det rigtige lægemiddel, men i for høj dosis til at det har den ønskede virkning

Bivirkninger Patienten oplever bivirkninger

Interaktioner Patienten har et medicinsk problem, som skyldes, at lægemidlet reagerer uheldigt med andre lægemidler eller med levnedsmidler

Medicinering uden grund Patienten anvender medicin, selv om der ikke er behov for det

Lægemiddelforskningudgives af Danmarks Farmaceutiske Højskole

Redaktion:Mette Rasmussen (ansvarshavende),Jesper Munck og Rolf Haugaard

Grafisk design og produktion:ProGrafica as

Fotos:Jesper Munck, Anne Sørensen, Image State (s. 2),Isabelle Rozenbaum/PhotoAlto (s. 7) og Polfoto (s. 8)

ISSN 1601-8850 (online)

Danmarks Farmaceutiske HøjskoleUniversitetsparken 22100 København ØTlf · 35 30 60 00Fax · 35 30 60 01E-mail · [email protected] · www.dfh.dk

Documents

LÆGEMIDDELFORSKNING - ku · Af Jette Christensen, Dan Stærk, Hanne L. Ziegler, Majid Sairafianpour og Jerzy W. Jaroszewski 4. Skræddersyede lægemidler til individuelle genomer