Embed Size (px)
Citation preview
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
MIGLĖ BUDREVIČIŪTĖ
LIETUVOJE AUGANČIŲ SIAURALAPIŲ GAUROMEČIŲ
(CHAMERION ANGUSTIFOLIUM (L.) HOLUB) AUGALINĖJĖ
ŽALIAVOJE ESANČIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ IR
ANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc. dr. Rūta Marksienė
KAUNAS, 2018
2
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
MEDICINOS AKADEMIJA
FARMACIJOS FAKULTETAS
ANALIZINĖS IR TOKSIKOLOGINĖS CHEMIJOS KATEDRA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr.,
Ramunė Morkūnienė
Data:
LIETUVOJE AUGANČIŲ SIAURALAPIŲ GAUROMEČIŲ
(CHAMERION ANGUSTIFOLIUM (L.) HOLUB) AUGALINĖJĖ
ŽALIAVOJE ESANČIŲ FENOLINIŲ JUNGINIŲ
IRANTIOKSIDANTINIO AKTYVUMO ĮVERTINIMAS
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
Doc., dr. Rūta Marksienė
Data
Recenzentas Darbą atliko
Magistrantė
Miglė Budrevičiūtė
Data Data
KAUNAS, 2018
3
TURINYS
SANTRAUKA ..................................................................................................................................... 5
SUMMARY ......................................................................................................................................... 6
SANTRUMPOS ................................................................................................................................... 7
ĮVADAS ............................................................................................................................................... 8
1. LITERATŪROS APŽVALGA ...................................................................................................... 10
1.1. Siauralapio gauromečio (Chamerion angustifolium (L.) Holub) morfologiniai požymiai,
paplitimas ........................................................................................................................................ 10
1.2. Vaistinė augalinė žaliava ......................................................................................................... 11
1.3. Biologiškai aktyvios medžiagos .............................................................................................. 11
1.4. Siauralapio gauromečio (Chamerion angustifolium (L.) Holub) farmakologinės savybės ..... 12
1.5.Fenolinių junginių apžvalga ...................................................................................................... 13
1.6. Fenolinių junginių išskyrimas ir analizės metodai................................................................... 14
1.6.1. Spektrofotometrinis metodas............................................................................................. 15
1.6.2. Efektyvioji skysčių chromatografija ................................................................................. 16
1.7. Laisvieji radikalai, antioksidantai ............................................................................................ 16
1.8. Antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai ....................................................................... 17
1.9. CUPRAC metodo pritaikymas antioksidacinio aktyvumo nustatymui ................................... 19
2. TYRIMO METODIKA .................................................................................................................. 20
2.1. Tyrimo objektas ....................................................................................................................... 20
2.2. Naudoti reagentai ..................................................................................................................... 20
2.3. Naudota aparatūra .................................................................................................................... 21
2.4. Siauralapių gauromečių ekstraktų paruošimas......................................................................... 21
2.5. Tyrimo metodikos .................................................................................................................... 21
2.6. Statistinė duomenų analizė ...................................................................................................... 23
REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ................................................................................................. 25
3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas................................................................................................ 25
3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu su Folin – Ciocalteu
reagentu ........................................................................................................................................... 26
4
3.2.1.Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas siauralapių gauromečių augalinės žaliavos
ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu ............................................ 26
3.2.2. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas siauralapių gauromečių lapų ekstraktuose
skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu ................................................................. 27
3.2.3. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas siauralapių gauromečių visos augalinės
žaliavos ir lapų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu .................. 28
3.2.4. Suminis fenolinių junginių kiekio nustatymas siauralapio gauromečio lapuose ir visoje
augalinėje žaliavoje spektrofotometriniu Folin – Ciocalteu metodu .......................................... 29
3.3. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu CUPRAC metodu ..................... 30
3.3.1. Siauralapių gauromečių visos augalinės žaliavos antioksidantinis vertinimas ................. 30
3.3.2. Siauralapių gauromečių lapų ekstraktų antioksidantinis vertinimas ................................. 31
3.3.3. Siauralapių gauromečių visos augalinės žaliavos ir lapų ekstraktų antioksidantinis
vertinimas .................................................................................................................................... 32
3.3.4. Suminis siauralapių gauromečių visos augalinės žaliavos ir lapų ekstraktų
antioksidantinis vertinimas .......................................................................................................... 33
3.4. Efektyvioji skysčių chromatografija ........................................................................................ 34
3.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija ................................................ 34
3.5.1. Specifiškumas.................................................................................................................... 35
3.5.2. Glaudumas ......................................................................................................................... 35
3.5.3. Tiesiškumas ....................................................................................................................... 36
3.5.4. Aptikimo ir nustatymo ribos ............................................................................................. 37
3.5. Siauralapio gauromečio fermentuotos arbatos ir visos žaliavos fenolinių junginių kiekybinis
įvertinimas ESC metodu ................................................................................................................. 38
3.6. Tyrimo rezultatų apibendrinimas ............................................................................................. 39
IŠVADOS ........................................................................................................................................... 41
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ................................................................................................. 42
LITERATŪROS SĄRAŠAS .............................................................................................................. 43
SANTRAUKA
M. Budrevičiūtės magistro baigiamasis darbas „Lietuvoje augančių siauralapių
gauromečių(Chamerion angustifolium (L.) Holub) augalinėje žaliavoje esančių fenolinių junginių ir
antioksidantinio aktyvumo įvertinimas“, mokslinė vadovė doc. Dr. R. Marksienė, Lietuvos sveikatos
mokslų universiteto, Farmacijos fakulteto, Analizinės ir toksikologinės chemijos katedra – Kaunas,
2018.
Raktiniai žodžiai:Chamerion angustifolium, siauralapis gaurometis, fenoliniai junginiai,
Folin – Ciocalteu, CUPRAC, efektyvioji skysčių chromatografija (ESC), antioksidantai.
Darbo tikslas: Įvertinti Lietuvoje augančių siauralapių gauromečių(Chamerion
angustifolium (L.) Holub ) augalinėje žaliavoje esančius fenolinius junginius ir antioksidantinį
aktyvumą.
Uždaviniai:Parinkti tinkamiausias ekstrahavimo sąlygas fenolinių junginių ir antioksidantų
išskyrimui iš gauromečio augalinės žaliavos. Nustatyti ir įvertinti bendrą fenolinių junginių kiekį
lapuose ir visoje siauralapių gauromečių augalinėje žaliavoje, taikant spektrofotometrinį Folin–
Ciocalteu metodą skirtingose žaliavos rinkimo vietose. Nustatyti ir įvertinti siauralapių gauromečių
ekstraktų antioksidantinį aktyvumą spektrofotometriniu CUPRAC metodu. Pritaikyti ESC metodiką,
fenolinių junginių kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui siauralapių gauromečių augalinėje
žaliavoje, bei atlikti metodikos validaciją. Įvertinti ir palyginti siauralapių gauromečių fermentuotos
arbatos ir augalinės žaliavos kiekybinę fenolinių junginių cheminę sudėtį validuotu ESC metodu.
Tyrimo objektas ir metodai: Siauralapių gauromečių(Chamerion angustifolium (L.)
Holub)fenoliniųjunginių kokybinės ir kiekybinės sudėties ir antioksidacinio aktyvumo tyrimas.
Suminis fenolinių junginių kiekis nustatytas spektrofotometriniu Folin – Ciocalteu metodu.
Antioksidacinis aktyvumas nustatytas spektrofotometriniu CUPRAC metodu. ESC metodu
kiekybiškai ir kokybiškai nustatyti fenoliniai junginiai ekstraktuose.
Rezultatai ir išvados: Visi tyrimo mėginiai rinkti žydėjimo periodo metu. Buvo nustatytas
geriausias augalinės žaliavosekstrahentas – 70 % (v/v) etanolis. Didžiausias bendras fenolinių
junginių kiekis, nustatytas spektrofotometriniu Folin – Ciocalteu metodu, Plateliuose 94,139 ± 0,22
mg/g lapų augalinėje žaliavoje.Didžiausia redukcine geba pasižymėjo Plateliuose
augusiossiauralapių gauromečių žaliavos 9,033 ± 0,01 mg/g.Didžiausi antioksidantų kiekiai gauti
augalo lapuose lyginant su visa augaline žaliava visuose augavietėse.ESC analize nustatyti fenoliniai
junginiai: dihidro benzoinė rūgštis, neochlorogenas, chlorogeno rūgštis, hiperozidas, izokvercitrinas,
kvercitrinas, kvercetinas.
SUMMARY
Master's Thesis by M. Budrevičiūtė "The evaluation of phenolic compounds and antioxidant
activity of Chamerion Angustifolium (L.) Holub, growing in Lithuania", Scientific Supervisor
Assoc. Dr. R. Marksienė, Lithuanian University of Health Sciences, Faculty of Pharmacy,
Department of Analytical and Toxicological Chemistry, Kaunas, 2018.
Keywords: Chamerion angustifolium, willow herb, phenolic compounds, Folin - Ciocalteu,
CUPRAC, High-performance liquid chromatography (HPLC), antioxidants.
The aim of the study.To evaluate the phenolic compounds and antioxidant activity in the
raw material of Chamerion angustifolium (L.) Holub growing in Lithuania.
Objectives: To select the most suitable extraction conditions for the extraction of phenolic
compounds and natural antioxidants from willow herb raw material. Determine and evaluate the
total amount of phenolic compounds in the leaves and throughout the willow herbplant material
using a spectrophotometric Folin-Ciocalteu method in different raw material collection sites.
Determine and evaluate the antioxidant activity of the willow herb extracts by spectrophotometric
CUPRAC method. To apply ESC methodology for qualitative and quantitative evaluation of
phenolic compounds in willow herbraw material, and to validate the methodology. To evaluate and
compare the quantitative composition of phenolic compounds of squamous willow herbfermentation
tea and vegetable raw material by validated ESC method.
Object and methods of the study: Qualitative and quantitative composition and antioxidant
activity of phenolic compounds of willow herb(Chamerion angustifolium (L.) Holub). The total
amount of phenolic compounds was determined by spectrophotometric Folin - Ciocalteu method.
Antioxidant activity was determined by spectrophotometric CUPRAC method. ESC method for the
quantitative and qualitative determination of phenolic compounds in extracts.
Results and Conclusions: All samples were collected during the flowering period. The best
extraction solvent for raw material was determined - 70% (v / v) ethanol. Maximum total phenolic
compounds determined by spectrophotometric Folin - Ciocalteu method, in Plateliai 94,139 ± 0,22
mg / g leaves raw material. The highest reductive ability was observed in the leaves raw material of
9,033 ± 0,01 mg / g. The highest amounts of antioxidants are obtained on plant leaves compared
with all the raw material in all plants. ESC analyzed phenolic compounds: dihydrobenzoic acid,
neochlorogen, chlorogenic acid, hyperoside, isoquercitin, quercitin, quercetin.
7
SANTRUMPOS
ESC – efektyvioji skysčių chromatografija (angl. High performance liquid chromatography)
ROS - reaktyviosios deguonies formos
RNS - reaktyviosios azoto formos
ABTS - 2,2'-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis)
CUPRAC - vario jonų redukcijos antioksidantinė geba (angl. Cupric ion reducing antioxidant
capacity)
DPPH - 2,2-difenil-1-pikrilhidrazilo laisvasis radikalas
FRAP - geležies redukcijos antioksidantinė galia (angl. Ferric reducing antioxidant power)
GAE – galo rūgšties ekvivalentai (angl. Gallic acid equivalents)
TE – trolokso ekvivalentai (angl. Trolox equivalents)
UV – ultravioletiniai spinduliai
8
ĮVADAS
Augalinių vaistinių preparatų paklausa, dėl jų didesnio saugumo ir platesnio veikimo
lyginant su cheminiais preparatais, pasaulyje didėja. Dėmesys yra skiriamas vaistinių augalinių
žaliavų tyrimams, siekiant nustatyti biologiškai aktyvias medžiagas. Svarbus vaistinės augalinės
žaliavos racionalus ir tikslingas rinkimas, kad būtų išsaugotas gamtinių sistemų tvarumas ir išteklių
gausumas.
Siauralapio gauromečio (Chamerion angustifolium (L.) Holub) žaliava pasižymi įvairialypiu
biologiniu aktyvumu ir gali būti naudojama vaistų gamybai. Vaistinė augalinė žaliava – gauromečių
lapai arba žolė, kuri yra renkama žydėjimo metu. Vaistinėje augalinėje žaliavoje kaupiasi įvairūs
polifenoliniai junginiai, rauginės medžiagos, gleivės, vitaminas C. Siauralapis gaurometis pasižymi
antimikrobiniu, antioksidaciniu, priešuždegiminiu, skausmą malšinančiu poveikiu, vartojamas
sutrikus prostatos funkcijai.
Darbo naujumas. Apžvelgus mokslinės literatūros duomenis, Lietuvoje augančio siauralapio
gauromečio žaliavoje esantys fenoliniai junginiai ir antioksidantai yra mažai ištirti, todėl būtų
tikslinga atlikti skirtinguose Lietuvos vietose surinktų siauralapių gauromečių fitocheminę analizę,
nustatant fenolinių junginių kiekius ir antiokidacinį aktyvumą bei jų įvairavimą, kuris įtakoja
siauralapio gauromečio vaistinės augalinės žaliavos tinkamumą ligų prevencijai ir profilaktikai.
Kadangi, kol kas, nėra vaistinių preparatų su gauromečių augaline žaliava, kuriuos būtų galima
įsigyti, gauta informacija gali būti panaudota kuriant ir gaminant vaistinius preparatus iš augalinės
žaliavos.
Šiame darbe bendras fenolinių junginių kiekis siauralapio gauromečio (Chamerion
angustifolium (L.) Holub – Epilobium angustifolium (L.) augalinėje žaliavoje buvo nustatytas
spektrofotometriniu būdu, naudojant fenolinį Folin – Ciocalteu reagentą. Antioksidacinis aktyvumas
nustatytas spektrofotometriniu CUPRAC metodu, bei atlikta kiekybinė ir kokybinė fenolinių
junginių analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.
Darbo tikslas: Įvertinti Lietuvoje augančių siauralapių gauromečių(Chamerion
angustifolium (L.) Holub) augalinėje žaliavoje esančius fenolinius junginius ir jųantioksidantinį
aktyvumą.
Darbo uždaviniai:
1. Parinkti tinkamiausias ekstrahavimo sąlygas siauralapio gauromečio augalinei žaliavai.
9
2. Nustatyti ir įvertinti bendrą fenolinių junginių kiekį lapuose ir visojesiauralapių gauromečių
augalinėje žaliavoje taikant spektrofotometrinį Folin– Ciocalteu metodą skirtingose žaliavos
rinkimo vietose.
3. Nustatyti ir įvertinti siauralapių gauromečių ekstraktų antioksidacinį aktyvumą
spektrofotometriniu CUPRAC metodu.
4. Pritaikyti ESC metodiką, fenolinių junginių kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui
siauralapių gauromečių augalinėje žaliavoje, bei atlikti metodikos validaciją.
5. Įvertinti ir palyginti siauralapių gauromečių fermentuotos arbatos ir augalinės žaliavos
kiekybinę fenolinių junginių cheminę sudėtį validuotu ESC metodu.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Siauralapio gauromečio (Chamerion angustifolium (L.) Holub)
morfologiniai požymiai, paplitimas
1pav. Siauralapis gaurometis Chamerion angustifolium (L.) Holub
Chamerion angustifolium (L.) Holub – siauralapis gaurometis priklauso nakvišinių
(Onagraceae) šeimai. Tai daugiametis žolinis augalas, kuris užauga 60 – 120 cm aukščio. Stiebas
stačias arba kylantis, apvalus arba nežymiai briaunotas, paprastas, rečiau šakotas, plikas arba
apaugęs pasišiaušusiais ar prigulusiais plaukeliais, raudono atspalvio; nuo pamato iki žiedyno
lapuotas [31, 39, 64].Lapai pražanginiai, lancetiškiviršutinėje pusėje tamsiai žali, apatinėje –
melsvai žali, su rusvomis gyslomis, lygiakraščiai arba su liaukiniais danteliais, smailūs, bekočiai ar
su mažais koteliais, 5-12 cm ilgio, iki 2 cm pločio. Lapai bekočiai arba su trumpais koteliais (iki 7
mm), pražanginiai arba mentūriniai, pailgi arba linijiškai lancetiški, [31, 64].Šakniastiebis –storas,
ilgas, šliaužiantis su daugeliu požeminių ūglių,[4]. Žiedai iki 30 mm skersmens, išorinėje pusėje
rausvo atspalvio, plaukuoti, nesuaugę su taurele, netaisyklingi, susitelkę į gana ilgas, viršūnines
kekes [39, 40, 49].
Siauralapis gaurometis žydi vasarą: birželį – rugsėjį, o sėklos subręsta rupjūtį – spalį.
Vaisius 4-9 mm ilgio, ankšties pavidalo keturbriaunė dėžutė. Dauginasi šakniastiebio palaipomis ir
sėklomis, kurias išnešioja vėjas [6].
11
Gaurometis paplitęs įvairiuose dirvožemiuose, bet dažniausiai auga pažeistose žemės vietose
- miškuose, pamiškėse, ypač miškų aikštelėse, kirtimuose, gaisravietėse (angliškai siauralapis
gaurometis vadinamas fireweed (fire – gaisras, weed – piktžolė), sausuose durpynuose, šlaituose,
retai smėlio kopose, ant geležinkelio pylimų, pakelėse, vietomis gali sudaryti nemenkussąžalynus
[39, 40, 43, 52].Paplitęs visoje Lietuvoje, bet daugiausiai aptinkamas pietinėje ir rytinėje šalies
dalyse. Lietuvoje paplitę ir gerai žinomi pavadinimai yra kazokas, siauralapė ožrožė, ožkarožė.
Lietuvoje natūraliose Chamerion (Raf.) Raf. genties augavietėse auga viena rūšis – siauralapis
gaurometis (Chamerion angustifolium (L.) Holub.) [39].
1.2. Vaistinė augalinė žaliava
Siauralapio gauromečio vaistinė augalinė žaliava yra lapai arba žolė. Žaliavaantžeminė dalis:
lapai, žolė ruošiama birželio viduryje – liepą, žydėjimo metu. Nupjauta žydėjimo metu žolė
džiovinama paskleidus plonu sluoksniu nuo tiesioginių saulės spindulių apsaugotoje ir gerai
vėdinamoje patalpoje. Paruošta žaliava laikoma sausoje, gerai vėdinamoje patalpoje supakuota į
daugiasluoksnius popierinius maišus. Taip paruoštą žaliavą tinka vartoti 2 -3 metus [14, 40, 61].
1.3. Biologiškai aktyvios medžiagos
Susisteminus mokslinių tyrimų ir literatūros duomenis, buvo įvertinta siauralapio
gauromečio biologiškai aktyvių junginių sudėtis. Antžeminėje dalyje kaupiasi raugai (10,0 proc.),
gleivės (iki 15 proc.), vitaminas C, fitosterinai, flavonoidai [39]. Vienos iš pagrindinių biologiškai
aktyvių medžiagų yra fenoliniai junginiai, kurie randami visoje augalo antžeminėje dalyje. Buvo
nustatyta, kad Chamerion angustifolium (L.) Holub augalai kaupia šias veikliąsias
medžiagas:flavonoidusiš orasausės vaistinės augalinės žaliavos išskirta apie 1-2 proc. flavonoidų.
Randami nedideli kiekiai laisvų flavonolių aglikonų miricetino, kemferolio ir kvercetino, nežymūs
kiekiai flavonolių glikozidų kemferolio-3-O-ramnozido, izomiricitrino (miricetino-3-O-gliukozido),
kvercetinas, kvercitrinas (kvercetino-3-O-β-D-ramnozidas), izokvercitrinas (kvercetino-3-O-
gliukozido), hiperozidas (kvercetino-3-O-galaktozido), rutinas (kvercetino-3-O-rutinozidas),
guaiaverinas (kvercetino-3-O-arabinozidas), ramnetinas (7-metoksi-kvercetinas), izoramnetinas (3-
metil-kvercetinas), izoramnetino-3-gliukozidas, kemferolis; flavonai ir jų glikozidai: luteolinas,
cinarozidas (luteolino-7-gliukozidas), apigetrinas. Rauginės medžiagos: elagotaninai - oenoteinas
12
A, oenoteinas B. Fenolinės rūgštys – galo, elago, kofeino, chlorogeno rugštys. Fitosteroliai [1, 5, 9,
16, 20, 24, 25, 29, 37, 58, 60].
1.4. Siauralapio gauromečio (Chamerion angustifolium (L.) Holub)
farmakologinės savybės
Siauralapis gaurometis pasižymi gydomosiomis savybėmis ir nuo seno yra naudojamas kaip
vaistažolė liaudies medicinoje. Gauromečio poveikis žmogaus organizmui:
Antimikrobinis, priešgrybelinis ir priešvirusinis poveikis: tyrimai parodė, kad etanolinis
ekstraktas veikia antimikrobiškai. Tiriant gauromečio poveikį etanoliniai ir vandeniniai ekstraktai
pagaminti iš šviežios žydinčios vaistinės augalinės žaliavos – žolės pasižymėjo didžiausiu
aktyvumu ir slopina šių gram teigiamų ir gram neigiamų bakterijų kultūrų, mieliagrybių ir grybelių
augimą ir šis poveikis daugeliu atvejų yra baktericidinis[5, 62]:Bacillus subtilis, Candida albicans,
Candida glabrata, Cryptococcus neoformans, Escherichia coli, Micrococcus luteus
bakterijų,Pseudomonas aeruginosa, Saccharomyces cerevisiae, Staphylococcus albus ir
Staphylococcus aureus [5, 18, 30, 62].
Piešuždegiminis ir antioksidancinis poveikis: Šiuo povekiu siauralapis gaurometis
pasižymi dėl jame randamų miricetino-3-O-gliukuronido ir miricetino-3-O-ramnozido, kvercetino-
3-O-gliukuronido, elagotaninų: oenoteino A, oenoteino B. Tyrimų metu nustatyta, kad
hialuronidazę slopina ekstrakte esantis oenoteinas B, taip skatina žaizdų gijimą. Didžiausi oenoteino
B kiekiai nustatyti E.angustifolium vaistinės augalinės žaliavos ekstrakte. Taip pat nustatyta, kad iš
E. Angustifolium pagaminti vandeniniai ekstraktai slopina ciklooksigenazes (COX-1 ir COX-2).
Miricetino-3-gliukuronidas prostaglandinų biosintezę slopina efektyviai kaip ir priešuždegiminis
vaistas indometacinas [24, 37, 47, 53].
Vieno tyrimo, kuriame buvo įvertintas UV šviesos sukeltam odos ląstelių senėjimui
antioksidacinis siauralapio gauromečio poveikis,metu nustatytos trys grupės turinčios antioksidacinį
poveikį: augale esantys flavonoidai, elagotaninai (oenotinas B) ir fenolinės rūgštys (galo r.).
Ekstraktas iš siauralapio gauromečio senstančioms ląstelėms padidino gyvybingumą, apsaugo odos
ląsteles nuo UV šviesos sukeliamo eritemos formavimosi [50].
Imunomoduliacinis poveikis: viena iš siauralapio gauromečio biologiškai aktyvių junginių
grupių yra elagotaninai, kurios atstovas oenotinas B pasižymi antioksidaciniu, priešvėžiniu,
antibakteriniu, antivirusiu poveikiu. Jis turi įtakos NADPH oksidazės aktyvumui to pasekoje
13
aktyvinama citokinų gamyba, chemotaksis, fagocitozė. Manoma, kad siauralapio gauromečio
ekstraktų gebėjimas moduliuoti makrofagų funkcijas lemia savybę skatinti žaizdų gijimą ir stabdyti
auglių augimą [53, 54].
Gerybinės prostatos hiperplazijos gydymui: Vis dažniausiekiant ištirti ir nustatyti
siauralapio gauromečio poveikį, prostatos ir su šlapinimusi susijusių ligų gydymui, vykdomi tyrimai
su Chamerion angustifolium vaistine augaline žaliava. Dažniausiai tyrinėjami etanoliniai ekstraktai,
rečiau vandeninės ištraukos. Taip pat ir liaudies medicinoje sauralapio gauromečio vaistinė augalinė
žaliava naudojama prostatos negalavimams gydyti, tokiems kaip beprasidedanti gerybinė prostatos
hiperplazija (GPH). Tyrimo metu su E.angustifolium etanoliniu ekstraktu nustatyta, kad augalas
stiprus prostatos vėžinių ląstelių inhibitorius.Šis povekis siejamas su įvairiais augale esančiais
junginiais. Tiriant buvo išsiaiškinta, kad stipriausiai veikia veiklioji medžiaga - oenotinas B, kuris
aktyvesnis nei miricetinas, kvercetino-3-O-gliukoronidas bei kemferolis. Siaurapalio gauromečio
ekstraktai gali trukdyti 5-α-reduktazės ir aromatazės veikimui, kurios dalyvauja prostatos
hiperplazijos vystime.Oenotino a ir B 5α-reduktazę slopinantis poveikis didesnis už GPH gydyti
vartojamo vaisto finasterido gebėjimą inhibuoti fermentą. Be to oenotinas B aktyviausiai mažina
prostatos ląstelių proliferaciją, prostatos specifinio antigeno sekreciją bei arginazės veiklą.Tam tikri
flavonoidai gali stabdyti hormonams jautrių ir nejautrių ląstelių augimą, todėl manoma, kad
gauromečio ekstraktuose esantys flavonoidai gali tiesiogiai inhibuoti žmogaus prostatos epitelio
ląstelių proliferaciją[9, 27, 57, 60]. Dėja, bet dėl nepakankamų klinikinių duomenų gauromečio
preparatai nėra parduodami Europoje.
1.5.Fenolinių junginių apžvalga
Fenoliniai junginiai yra viena plačiausių antrinių metabolitų grupė augaluose. Jie užima
svarbią vietą augalų augime ir reprodukcijoje, saugo augalą nuo kenkėjų, ligų sukelėjų. Sujungia
susiformavusius laisvuosius radikalus taip apsaugodami augalų ląsteles nuo deguonies trūkumo ir
oksidacinio streso. In vitro tyrimų metu mokslininkai nustatė, kad šios molekulės pasižymi stipriu
antioksidantiniu aktyvumu. Dauguma fenolių dalyvauja žmogaus organizme neutralizuojant
žalingus procesus [7, 45].
Fenoliniai junginiai pasižymi dideliu biologiniu aktyvumu ir yra paplitę augalų
karalystėje.Žinoma daugiau nei 8000 fenolinių junginių. Iš jų apie 4000 priskiriama flavonoidams.
Vieni jų yra paprasti, tokie kaip fenolinės rūgštys, o kiti turi labai sudėtingą struktūrą, pavyzdžiui
14
taninai. Augalams spalvą, kai kurias organoleptines savybes: kartumą, sutraukiantį skonį suteikia
fenoliai [17, 48].
Fenolius sieja aromatinis žiedas, prie kurio prijungtos viena ar keletas hidroksilo grupių bei
galimos kitos cheminės modifikacijos [7, 33]. Fenoliniai junginiai varijuoja nuo paprastų iki stipriai
polimerizuotų darinių dažnai vadinamų – polifenoliais, dėl fenolinių žiedų skaičiaus junginyje
[23].Fenoliniai junginiai gali būti klasifikuojami remiantis jų kilme, biologinėmis savybėmis,
chemine struktūra [rong]. Fenoliniai junginiai pagal cheminę struktūrą skirtomi į klases (2 pav.).
Fenolinės rūgštys ir flavonoidai yra labiausiai ištyrinėtos ir daugiausiai junginų turinčios grupės [33,
44].
2 pav. Fenolinių junginių klasifikacija
1.6. Fenolinių junginių išskyrimas ir analizės metodai
Norint nustatyti fenolinių junginių kiekybinį ir kokybinį įvairavimą pirmiausia reikia juos
išekstrahuoti iš augalinės žaliavos. Tiriamosios medžiagos gali būti ekstrahuojamos iš šviežių,
šaldytų ir džiovintų mėginių. Po to dažniausiai yra smulkinama arba malama augalinė žaliava, nes
manoma, kad tokiu būdu ekstrahentas prasiskverbia geriau ir efektyviau vyksta ekstrakcija [13].
Fenoliniai junginiai
Fenolinės rūgštys
Hidroksibenzen -
karboksirūgštys
Galo; Vanilino; Siringo;
Protokatecho rūgštys
Hidroksicinamono rūgštys
Chlorogeno; P-kumaro ;
Sinapo; Ferulo ; Kavos rūgštys
Ligninai Stilbentai Flavonoidai
Flavonoliai
Kvercetinas; Kemferolis; Miricetinas; Galantinas; Gisetinas
Flavonai
Apigeninas; Chritezinas; Liuteolinas
Katechimai
Katechimas; Apikatechimas;
Epigalokatechimas; Epikatechimo
galatas; Epigalokatechimo
galatas
Flavononai
Eriodiktionas; Hesperidinas; Naringeninas
Antocianidai
Cianidinas; Pelargonidinas; Delfinidinas;
Peonidinas; Malvidinas
Izaflavonoidai
Genisteinas; Daidzeinas; Glyciteinas;
Formononitinas
15
Nors metodų kaip išskirti fenolinius junginius yra nemažai, tačiau dažniausiai vykdoma
augalinių žaliavų ekstrakcija su tirpikliais. Cheminės ekstrakcijos efektyvumas ir greitis priklauso
nuo naudojamo tirpiklio, temperatūros, ekstrakcijos laiko, pH, mėginio fizikocheminių
charakteristikų, auglinės žaliavos kaupiamų aktyvių junginių.Dažniausiai naudojami fenolinių
junginių ekstrakcijai iš augalinės vaistinės žaliavos tokie tirpikliai kaip metanolis, etanolis, acetonas,
etilo acetatas ir jų kombinacijos, mišiniai šių tirpiklių su vandeniu. Svarbu yra tinkamai parinkti
tirpiklį, nes nuo to priklauso išekstrahuojamų junginių kiekis [11]. Augalinių žaliavų ekstrakcijai
galima naudoti superkritinius skysčius, ultragarsą, mikrobangas, suslėgtus skysčius, Soksleto aparatą
ir maceraciją, pastarieji du metodai yra tradiciniai ir ankščiau dažnai naudojami, tačiau mažai
efektyvūs [3, 34].
Dėl didelės fenolinių junginių įvairovės analizė yra laikoma gana sudėtinga, bet naudojami
modernūs skirstymo ir nustatymo metodai tinka polifenoliniams junginiams ir taip palengvina
vaistinės augalinės žaliavos analizę. Populiariausi ir dažniausiai naudojami metodai yra
efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC), dujų chromatografija (DC), efektyvioji skysčių
chromatografija kartu su masių spektrometrija (ESC-MS), taip pat spektrofotometrija, plonasluoksne
chromatografija. Taip pat galima taikyti kapiliarinę elektroforezę ir kapiliarinę zonų elektroforezę.
Naudojami Folin – Denis, Folin – Ciocalteu (FC), vanilino, reakcija su 2, 4 – dinitrofenilhidrazinu
(DNPH) spektrometriniai metodai, kolorimetrija su geležies druskomis ir UV absorbcija [17, 32].
1.6.1. Spektrofotometrinis metodas
Spektrofotometrinis metodas tai vienas iš paprasčiausių kiekybiniam įvertinimui taikomų
metodų. Spektrofotometriniu metodu nustatant fenolinių junginių kiekį augalinių žaliavų ėminiuose
gali būti taikomas fenolinių junginių komplekso sudarymas šarminiame tirpale su molibdenu ar
volframo fosforo rūgštimis (Folin – Denis ar Folin – Ciocalteu fenoliniu reagentu). Folin – Ciocalteu
yra plačiai taikomas bendro fenolinių junginių kiekio nustatymo metodas. Šios reakcijos metu Folin
– Ciocalteu reagento spalva kinta nuo geltonos iki mėlynos. Gautų ekstraktų absorbcija matuojama
UV spektrofotometru, esant 760 nm bangos ilgiui. Bendras fenolinių junginių kiekis išreiškiamas
pagal galo rūgšties ekvivalentą. Šis metodas nėra specifiškas fenolinių junginių atskirų klasių
identifikavimui. Augalinėje žaliavoje yra kitų redukuojančių medžiagų: askorbo rugšties, aromatinių
aminų, cukrų, kurie trukdo analizei [23, 56, 63].
16
Kitas spektrofotometrinis metodas – tai reakcija su aliuminio (III) chloridu. Šis
spektrofotometrinis metodas tinkamas panašios struktūros flavonoidų rutininei analizei atlikti.
Metodas pagrįstas flavonoido ir aliuminio komplekso susidarymu rūgštinėje terpėje. Absorbcija
matuojama esant 410 – 423 nm, nes tada absorbcija yra didžiausia. Analizei svarbūs tokie faktoriai:
reakcijos laikas, cheminė polifenolių struktūra, reagentų kiekis [35, 56].
Dar vienas spalvinis metodas – tai reakcija su 2, 4 – dinitrofenilhidrazinu (DNPH). Metodas
pagrįstas raudonos spalvos 2, 4 - dinitrofenilhidrazono junginių susidarymu, kai DNPH reagentas
reaguoja su ketoninėmis ar aldehidinėmis grupėmis. Reakcija vykdoma 50 °C temperatūroje 50
minučių vandens vonelėje. Tirpalui atvėsus iki kambario temperatūros, matuojama absorbcija 486
nm šviesos bangos ilgyje. Flavonoidų kiekis apskaičiuojamas sudarant standartinę kreivę [19].
1.6.2. Efektyvioji skysčių chromatografija
Efektyvioji skysčių chromatografija – metodas tinkamas tiek kiekybinei tiek kokybinei
fenolinių junginių analizei. Analizė efektyvi, kolonėlių pasirinkimas yra didelis, padidinta skiriamoji
geba. Naturalios kilmės fenoliniai junginiai tirpsta poliniuose tirpikliuose, dėl to susidaro galimybės
naudoti atvirkštinių fazių ESC sorbentus, reikalingos rūgštinės sąlygos, siekiant išvengti jonizuotų
bandinio formų susidarymo ir taip leidžiant gauti ryškesnes smailes, dažniausiai naudojamoC8 ar
C18 kolonėlės. Gradientiniam eliuavimui naudojamos dviejų tirpiklių sistemos:
acetonitrilas (ACN) ar metanolis arba jų vandeniniai tirpalai. Kartais naudojami ir kiti tirpikliai,
tokie kaip tetrahidrofuranas, izopropanolis, n-propanolis.Efektyvioji skysčių chromatografija
atliekama palaikant pastovią temperatūrą. Taip garantuojamas atkuriamumas analizę atliekant ilgai.
ESC analizę galima atlikti kambario temperatūroje, tačiau rekomenduojama kolonėlėje palaikyti
apie 30°C – 40°C temperatūrą, tuomet sutrumpinamas analizės laikas [1, 46].
1.7. Laisvieji radikalai, antioksidantai
Laisvieji radikalai – tai molekulės, turinčios neporinį elektroną išorinėje orbitoje, kurios yra
nestabilios ir labai reaktyvios. Veikia laisvieji radikalai toje vietoje kur susiformuoja. Jie dažniausiai
formuojasikaip metabolizmo produktas įprastų organizmo funkcijų ir reakcijų metu arba veikiant
egzogeniniams veiksniams tokiems kaip - rūkymas, ore esantys teršalai, rentgeno spinduliai, ozonas
ir dėl fiziologinių veiksnių tokių kaip stresas. Ląstelei normaliai funkcionuoti nedidelė jų
17
koncentracija reikalinga, tačiau dideli jų kiekiai gali pažeisti ląstelių lipidus, angliavandenius,
baltymus ir DNR ir taip slopinti jų normalias funkcijas. Organizmui nespėjant slopinti laisvųjų
radikalų reakcijų gali didėti žalojantis poveikis, kuris susijęs su žmogaus organizmo funkcijų
sutrikimu ir ligomis: širdies-kraujagyslių sistemos ligos, neurodegeneracinės ligos, odos ligos,
autoimuninės ligos, kvėpavimo takų funkcijos pablogėjimas ar ligos [2, 28, 55].
Organizmas, norėdamas apsisaugoti gamina medžiagas, galinčias stabilizuoti arba
deaktyvuoti laisvuosius radikalus – endogeninius antioksidantus. Taip pat galimi ir egzogeniniai
antioksidantai, kurie gaunami kartu su maistu ar papildais. Nutraukdami grandininę laisvųjų radikalų
susidarymo reakciją antioksidantai kovoja su oksidaciniu stresu, nes stiprus oksidacinis stresas
sukelia ląstelės mirtį. Tyrimais įrodyta kad padidėjus oksidaciniam stresui pagreitėja ląstelių
senėjimas. Oksidacinį stresą galima kontroliuoti mažinant laisvųjų radikalų kiekį optimalia
antioksidantų koncentracija [36].
Antioksidantai – tai medžiagos, kurios geba neutralizuoti laisvuosius radikalusir mažina jų
sukeliamą žalingą poveikį. Jie skirstomi į fermentinius ir nefermentinius antioksidantus. Vieni
fermentiniai antioksidantai yra normalios organizmo medžiagų apykaitos produktai: superoksido
dismutazė, glutationo reduktazė, katalazė. Kiti tokie kaip α-Tokoferolis (vitaminas E), askorbo
rūgštis (vitaminas C), B-karotenas gaunami su maistu. Nefermentiniai antioksidantai yra
karotenoidai, flavonoidai, kiti polifenoliniai junginiai, α-lipoinė rūgštis glutationas ir t.t. [8].
Antioksidantai dar gali būti klasifikuojami ir į sintetinius ir natūralius. Sintetiniai
antioksidantai naudojami maisto pramonėje siekiant prailginti maisto galiojimo terminą, tam kad
produktas ilgenį laiką išliktu šviežus, tačiau buvo nustatyta, kad dėl toksinio poveikio žmogaus
organizmui, sintetinių antioksidantų vartojimas turi būti ribojamas, todėl kur kas geresnė ir saugesnė
žmogaus organizmui alternatyva naturalūs antioksidantai, kurių gausu vaistiniuose augaluose.
Norint išvengti laisvųjų radikalų sukeliamų lėtinių susirgimų bei apsaugoti nuo oksidacinio streso,
būtina organizmą aprūpinti antioksidantais. Flavonoidai – gausiai aptinkami augaluose, dėl savo
cheminės struktūros veikia kaip stiprūs antioksidantai. Jie didina antioksidantinį aktyvumą kraujo
serume, o taip pat gali didinti ir kai kurių antioksidantų, tokių kaip vitamino E, vitamino C,
koncentraciją organizme, taigi didėja ir antioksidantinis aktyvumas [26, 28].
1.8. Antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodai
18
Natūraliųantioksidantų moksliniai tyrimai vykdomi vis aktyviau. Antioksidantų gebėjimas
neutralizuoti reaktyvias deguonies (ROS) ir azoto (RNS) formas, taip apsaugant biologines sistemas
ir yra antioksidantinis aktyvumas. Norint nustatyti antioksidacinį aktyumą augaluose ar maisto
produktuose, svarbus tinkamo tyrimo metodo pasirinkimas. Nuo metodo pasirinkimo priklausys
rezultatų patikimumas.
Antioksidantai laisvuosius radikalus veikia dviem mechanizmais [21, 42]:
1) Vandenilio perdavimo reakcijomis (HAT)
AH + X• → XH + A•
2) Elektronų perdavimo reakcijomis (ET)
X• + AH → X– + AH•+
AH•+ + H2O ↔ A• + H3O+
X– + H3O+ → XH + H2O
M(III) + AH → AH+ + M(II)
Pagal antioksidacinio poveikio mechanizmą metodai skirstomi į dvi grupes: metodai pagrįsti
HAT tipo reakcijomis (ORAC, TRAP) ir metodai pagrįsti ET tipo reakcijomis (TEAC, DPPH,
FRAP, CUPRAC).
Vandenilio perdavimo (HAT) reakcijų metu vyksta konkurencinės reakcijos tarp
antioksidanto ir substrato. Vandenilio atomas perduodamas laisvajam radikalui, kuris
neutralizuojamas ir tampa stabilus. ORAC - deguonies radikalų absorbcinė geba. Jo metu
antioksidantas absorbuoja deguonies radikalą, taip yra nutraukiama deguonies radikalų sukelta
oksidacija, nes prie radikalo prijungiamas vandenilio atomas. Išmatuojant fluorescencijos pokytį yra
vertinamas reakcijos greitis ir antioksidacinis aktyvumas. Kitas HAT reakcijomis pagrįstas metodas
– TRAP. Tai antioksidanto sugaudytų radikalų suma, metodo metu nustatinėjama antioksidantų
reakcijos kinetika. Pagal kinetines kreives apskaičiuojamas antioksidantinis aktyvumas [12, 42].
Elektronų perdavimo (ET) reakcijomis nustatomas antioksidanto gebėjimas prisijungti
nesuporuotą laisvojo radikalo elektroną.Metodo principas oksidanto redukavimas iki kitokios
spalvos junginio [41].
Prie ET grupės priskiriami metodai: ABTS arba kitaipTEAC Trolokso ekvivalento
antioksidantinės gebos laisvųjų radikalų surišimo metodas – paprastas ir patogus metodas bendram
antioksidaciniam aktyvumui nustatyti, šiuo metodu nustatomas antioksidanto gebėjimas blukinti
2,2´-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgšties) radikalo (ABTS˙+) spalvą. Reakcijos metu
mėlynai žalios spalvos chromogeninis reagentas praranda savo spalvos intensyvumą [10].DPPH
laisvųjų radikalų surišimo metodas – pagrįstas antioksidanto ar bet kurios kitos molekulės, turinčios
19
silpną vandenilinę jungtį, reakcija su organiniu azoto DPPH radikalu. Tai metodas kuriuo
įvertinamas antioksidanto gebėjimas blukinti 2,2-difenil-1- pikrilhidrazilo radikalo (DFPH˙) spalvą
[51 ]. FRAP - ( geležies antioksidacinė redukcijos galia) šis metodas įvertina antioksidantų gebėjimą
redukuotis iš juodos spalvos geležies 2,4,6-tripyridyl-s-triazino (Fe(III)-TPTZ) komplekso į
intensyviai mėlynos spalvos (Fe(II)-TPTZ) kompleksą, jis atliekamas rūgštinėje terpėje esant pH
3,6. Ir vario jonų redukcijos antioksidantinės galios tyrimas (CUPRAC) [41].
1.9. CUPRAC metodo pritaikymas antioksidacinio aktyvumo nustatymui
CUPRAC redukcinio aktyvumo nustatymo metodas pagrįstas redukcija antioksidantu
dvivalenčio vario ir neokuproino (2,9-dimetil-1,10-fenan-trolino) (Cu(II)-Nc) komplekso į
chromogeninį Cu(I)-Nc kompleksą.Metodo metu redukuojamas dvivalentis varis (Cu (II)) į
vienvalentį (Cu (I)).Vyksta redukcija antioksidantu į geltonai I oranžinės spalvos junginį. CUPRAC
reagentą sudaro vienodomis dalimis sumaišyti CuCl2, neokuproino ir buferio amonio acetato
tirpalai, procesas vyksta neutralioje terpėje (pH 7,0). Absorbcija matuojama prie 450 nm bangos
ilgio. Pagrindinis šio metodo trūkumas tai, kad reakcija tarp CUPRAC reagento ir antioksidantų
tokių, kaip askorbo, šlapimo ir galo rūgštis bei kvercetinas, įvyksta per vieną minutę, o
kompleksinių mišinių reakcija vyksta per 30–60 min., iki tol kol pasiekiama pusiausvyra. Kitą
vertus jis yra stabilesnis ir prieinamesnis nei kiti reagentai (pavyzdžiui: ABTS, DPPH). CUPRAC
reagento neveikia oras, saulės spinduliai, tirpiklio tipas ir pH. Šis redukcinės galios nustatymo
metodas yra paprastas, nebrangus ir sudėtingos aparatūros nereikalaujantis metodas [21, 42].
20
2. TYRIMO METODIKA
2.1. Tyrimo objektas
Tirta natūraliose augimvietėse auganti – siauralapio gauromečio (Chamerion angustifolium
(L.) Holub) žolė, rinkta žydėjimo metu įvairiuose Lietuvos miestuose ir kaimuose 2016 metų
birželio – liepos mėnesiais. Žaliavos rinkimo vietos: Pakruojis, Šaukotas, Giruliai, Prienai,
Radviliškis, Plateliai, Pašušvys. Augalinės žaliavos rinkimo vietos pateiktos paveiksle:
3 Pav. Siauralapio gauromečio rinkimo vietos
2.2. Naudoti reagentai
Folin-Ciocalteu reagentas (Galo rūgštis 98%, “ACROS ORGANICS”), metanolis 99,8%
(Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija), natrio karbonatas (Sigma-Aldrich, Scnelldorf, Vokietija),
rutino reagentas (97,11%, “HWI ANALYTIK GMBH”), etanolis 96% (Vilniaus degtinė),
išgrynintas vanduo (vandens gryninimo sistema Milipore, Bedford MA, JAV). CUPRAC reagentui
sudaryti buvo naudojamas vario (II) chlorido dihidratas, gautas iš „Alfa Aesar GmbH & Co KG“
21
(Karlsruhe, Vokietija), neokuproinas, įsigytas iš „Sigma-Aldrich Chemie“ (Vokietija). Buferinei
sistemai sudaryti buvo naudojamas amonio acetatas, įsigytas iš „Sigma -Aldrich“ (Belgija). Buvo
naudotas trolokso (98%) referentinis standartas, įsigytas iš „FlukaChemika“ (Buchs, Šveicarija).
2.3. Naudota aparatūra
1. Ekstraktai gaminami ultragarso vonelėje (WiseClean);
2. Vandensgryninimosistema Millipore (Bedford, MA);
3. Spektrofotometras - Halo DH – 20 UV – Vis Dinamika GmbH (Šveicarija);
4. Analitinėssvarstyklės (Shimadzu Auw 120 D, Bellingen, Vokietija);
5. Automatinėspipetės (Eppendorf Research, Eppendorf, JAV);
6. Chromatografas Waters 2690/5 (Waters Corporation, Milford, 23 JAV);
7. YMC kolonėlė 150×4,6 mm, 3 μm (YMC Europe GmbH, Vokietija);
2.4. Siauralapių gauromečių ekstraktų paruošimas
Siauralapis gaurometis džiovintas kambario temperatūroje, apsaugotoje vietoje nuo
tiesioginių saulės spindulių. Sausa žaliava susmulkinta elektriniu malunėliu, atsverta 0,5 g. augalinės
žaliavos ir užpilta 10 ml 70 proc. etanolio, laikoma ultragarso vonelėje 30 min.
2.5. Tyrimo metodikos
Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas. Bendras fenolinių junginių kiekio išreikšto
galo rūgšties ekvivalentu, nustatymas Folin-Ciocalteu metodu. Tyriamieji tirpalai ruošiami: 1 ml
augalinės žaliavos etanolinio ekstrakto, sumaišomas su 1 ml Folin-Ciocalteu reagento, 9 ml
distiliuoto vandens ir po 5 min. įpilama 10 ml 7% natrio karbonato tirpalas ir praskiedžiama iki 25
ml. Sumaišoma ir paliekama stovėti 90 min. tamsioje vietoje, kambario temperatūroje. Po 90 min
spektrofotometru išmatuojama mišinio absorbcija 760 nm šviesos bangos ilgyje. Matavimai
kartojami tris kartus. Lyginamasis tirpalas ruošiamas tomis pačiomis sąlygomis, kaip ir tiriamasis
tirpalas, bet vietoje 1 ml ekstrakto yra pilama 1 ml 70 % (v/v) etanolio [63].Galo rūgšties kalibracinė
22
kreivė, koreliacijos koeficientas (R2) ir tiesinė regresijos lygtis (y), kur y absorbcijos dydis,o x
bendras fenolinių junginių kiekis, išreikštas GRE (galo rūgšties ekvivalentu) mg/ml pavaizduoti
paveiksle.
4pav. Galo rūgšties kalibracinė kreivė
Redukcinio aktyvumo nustatymas CUPRAC metodu.
CUPRAC metodas paremtas dvivalenčio vario ir neokuproino komplekso redukcija į
chromogeninį vienvalenčio vario ir neokuproino kompleksą [42].CUPRAC reagentas ruošiamas
sumaišant vario druską (CuCl2x2H2O), 7,5 % neokuproino ir 1 M amonio acetato (pH= 7) buferio
tirpalus lygiomis dalimis. Sumaišytas tirpalas 1 valandą buvo laikomas tamsoje, kambario
temperatūroje. Į kiuvetę įpilama 3 ml sumaišyto reagento tirpalo ir automatinėmis pipetėmis įpilama
10 µl tiriamojo ekstrakto mėginio. Spektrofotometru matuojamas tiriamųjų mėginių šviesos
absorbcija, esant 450 nm bangos ilgiui. Lyginimasis tirpalas ruošiamas tokiomis pačiomis
sąlygomis, tik vietoje 10 µl tiriamojo ekstrakto dedama 10 µl 70 % (v/v) etanolio.Redukcinis
aktyvumas vertinamas lyginant absorbcijos dydį pagal etalono trolokso kalibracinę kreivę. Trolokso
kalibracinė kreivė, koreliacijos koeficientas (R2) ir tiesinė regresijos lygtis (y) pateikti žemiau
esančiame paveikslėlyje (5 pav.)
23
5 pav. Trolokso kalibracinė kreivė CUPRAC metodu
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodas. Polifenolinių junginių chromatografiniui
skirstymui siauralapio gauromečio augalinėje žaliavoje buvo naudojama M.Marksos ir kt.
optimizuota ir validuota ESC skirstymo metodika skirta fenolinių junginių identifikavimui ir
kiekybiniai analizei atlikti augalinės žaliavos ekstraktuose [38].Chromatografinis skirstymas atliktas
naudojant "Waters Alliance 2695" ("Waters", Milfordas, JAV) atskyrimo modulinė sistema, turinti
Waters 996 PDA diodų-matricos detektorius. YMC-Pack ODS-A (3.0 μm, 150 mm × 4.6 mm i.d.)
kolonėlė su YMC apsaugine kasete ODS-A (3.0 μ m, 10 mm × 4.0 mm). Injekcijos tūris – 10 µl,
mobiliosios fazės greitis – 1,0 ml/min, temperatūra 25 ◦C. Tyrimo metu naudota mobiliosios fazės
gradientinė sistema, sudaryta iš tirpalo A - 0,05% trifluoracto rūgštis vandenyje ir tirpalo B
acetonitrilo. Junginių identifikavimas atliktas pagal analičių ir standartinių juginių sulaikymo laikų
bei UV absorbcijos spektrų 210 – 550 nm intervalo ribose atitikimus.
2.6. Statistinė duomenų analizė
Gautų duomenų analizė atlikta „Microsof Office Excel 2015” (Microsoft, JAV), „SPSS 20“
(IBM, JAV) programinėmis įrangomis, taip pat duomenų apdorojimui naudota „ Empower 2
Chromatography Data Software“ (Waters, Milfordas, JAV) sistema.
24
Gauti duomenys apskaičiuoti pagal formules, suvesti į duomenų bazę, statistiškai įvertinti,
apskaičiavus eksperimentinių tyrimų duomenų matematinį vidurkį, standartinį nuokrypį (SN),
standartinį santykinį nuokrypį (SSN). Visi bandymai kartoti po tris kartus, o rezultatai pateikti kaip
vidutinė reikšmė ± standartinis nuokrypis. Statistiškai reikšmingas skirtumas nustatytas, jeigu
p<0,05.
25
REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Ekstrakcijos sąlygų parinkimas
Ekstrahento parinkimas. Norint nustatyti tinkamiausią ekstrahentą ir jo koncentraciją buvo
atliktas tirpiklių pasirinkimas, naudotas metanolis ir etanolis 70 proc., atsverta 0,5g augalinės
siauralapių gauromečių žaliavos. Analizuoti 3 pagrindiniai junginiai, nustatyti ESC metodu:
neochlorogenas, hiperozidas, izokvercitrinas.
6 pav. Ekstrahento parinkimas
Tyrimų eigoje nustatyta, kad ekstrahuojant siauralapio gauromečio žaliavą etanoliu
atsipalaiduoja daugiau analizuotų tiriamųjų junginių, nei ekstrahuojant metanoliu. Pasirinkta
metodika tolimesniems tyrimams yra: 0,5 g augalinės žaliavos užpilama 10ml 70 proc. etanolio,
gautas ekstraktas laikomas ultragarso vonelėje 30 min.
30.464
48.929 50.043
30.058
38.729 38.527
0.000
10.000
20.000
30.000
40.000
50.000
60.000
Neochlorogenas Hiperozidas Izokvercitrinas
Ko
nce
ntr
acija
mµ
g/g
Etanolis % Metanolis %
26
3.2. Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas spektrofotometriniu metodu su
Folin – Ciocalteu reagentu
Spektrofotometriniai tyrimai buvo atliekami naudojant etanolinius (70%) siauralapių
gauromečių visos augalinės žaliavos ir lapų ekstraktus. Tiriant ekstraktus buvo nustatytas
bendras fenolinių junginių įvairavimas augalinėje žaliavoje.
Tyrime analizuota iš septynių skirtingų Lietuvos vietų surinkta siauralapių gauromečių
(Chamerion angustifolium (L.) Holub) augalinė žaliava, bandymai pakartoti tris kartus (n=3).
Buvo statistiškai įvertintas rezultatų reikšmingumas tarpusavyje. Statistiškai reikšmingas
skirtumas buvo laikomas, kai p<0,05. Gauti rezultatai pateikiami 7 - 10 paveiksluose.
3.2.1.Bendro fenolinių junginių kiekio nustatymas siauralapių gauromečių augalinės žaliavos
ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu
Suminis fenolinių junginių kiekis buvo nustatytas siauralapių gauromečių augalinės žaliavos
etanoliniuose ekstraktuose. Tyrimo rezultatai pateikti 7 pav. Didžiausias fenolinių junginių kiekis
visoje žaliavoje nustatytas Plateliuose 82,229± 0,16 mg/g. Mažesnis kiekis nustatytas – Pašušvyje
66,404± 0,22 mg/g. Tarp Radviliškyje, Šaukote, Prienuose ir Giruliuose rinktos augalinės žaliavos
gautų rezultatų yra nedidelis fenolinių junginių kiekio skirtumas. Mažiausi rezultatai nustatyti
Pakruojyje 49,697± 0,16 mg/g augusiame siauralapyje gaurometyje. Atlikus statistinę duomenų
analizę, nustatyta, kad žaliavose iš skirtingų augaviečių fenolinių junginių kiekių skirtumai yra
statistiškai nereikškingi, p>0,05.
27
7 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) siauralapių gauromečių (Chamerion
angustifolium (L.) Holub) visoje augalinėje žaliavoje, taikant spektrofotometrinį Folin –
Ciocalteu metodą; n=3.
3.2.2. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas siauralapių gauromečių lapų ekstraktuose
skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu
Pagal gautus rezultatus išreikštus galo rūgšties ekvivalentu ir iš jų sudarytą diagramą
nustatyta, kad didžiausia fenolinių junginių gausa lapuose pasižymi siauralapio gauromečio
augalinė žaliava surinkta Plateliuose 94,139 ±0,22mg/g. Mažiausiai fenolinių junginių
siauralapio gauromečio lapų ekstrakte nustatyta Pakruojyje 53,391 ±0,28 mg/g. Nors bendras
fenolinių junginių kiekis tarp augalinės lapų žaliavos rintos Plateliuose ir rinktos Pakruojyje
skiriasi beveik du kartus, bet statistiškai šis skirtumas nėra reikšmingas, p>0,05.
49.697
57.085 54.880 56.53459.236
82.229
66.404
0.000
10.000
20.000
30.000
40.000
50.000
60.000
70.000
80.000
90.000
100.000
Pakruojis Šaukotas Giruliai Prienai Radviliškis Plateliai Pašušvys
Fen
olin
ių ju
ngi
nių
kie
kis
GR
E m
g/g
28
8 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) siauralapių gauromečių (Chamerion
angustifolium (L.) Holub) lapuose, taikant spektrofotometrinį Folin – Ciocalteu metodą; n=3.
3.2.3. Bendras fenolinių junginių kiekio nustatymas siauralapių gauromečių visos augalinės
žaliavos ir lapų ekstraktuose skirtingose augavietėse, spektrofotometriniu metodu
Atlikus tyrimus su siauralapių gauromečių visa augaline žaliava ir lapų ekstraktais gauti
panašūs fenolinių junginių kiekiai. Rezultatai pavaizduoti 8 paveiksle. Ryškiausias skirtumas
matomas tarp Radviliškyje surinktų augalinių žaliavų. Lapuose nustatyta 89,259 ± 0,03 mg/g
fenolinių junginių, o visoje augalinėje žaliavoje 59,236± 0,55 mg/g. Kituose regionuose nustatyti
panašūs fenolinių junginių kiekiai, kurie svyruoja nuo 49,697 GRE mg/g iki 941,387 GRE mg/g.
Pagal gautus ir įvertintus duomenis galima teigti, kad siauralapio gauromečio augalinė žaliava yra
vertinga fenolinių junginių išgavimui. Nenustatyta statistiškai reikšmingų skirtumų tarp augaviečių,
p>0,05.
53.391
70.429 72.497
62.268
89.25994.139
76.908
0.000
20.000
40.000
60.000
80.000
100.000
120.000
Pakruojis Šaukotas Giruliai Prienai Radviliškis Plateliai Pašušvys
Fen
olin
ių ju
ngi
nių
kie
kis
GR
E m
g/g
29
9 pav. Bendras fenolinių junginių kiekis (mg/g) siauralapių gauromečių (Chamerion
angustifolium (L.) Holub.) lapuose ir visoje augalinėje žaliavoje, taikant spektrofotometrinį
Folin – Ciocalteu metodą; n=3.
3.2.4. Suminis fenolinių junginių kiekio nustatymas siauralapio gauromečio lapuose ir visoje
augalinėje žaliavoje spektrofotometriniu Folin – Ciocalteu metodu
Įvertinus bendrą fenolinių junginių kiekį mg/g visoje augalinėje žaliavoje ir lapuose
nustatyta, kad siauralapio gauromečio lapai kaupia didesnį fenolinių junginių kiekį – 518,8901 GRE
mg/g, o visoje augalinėje žaliavoje 426,064 GRE mg/g. Rezultatai pavaizduoti 10 paveiksle.
49.697
57.085 54.880 56.53459.236
82.229
66.404
53.391
70.429 72.497
62.268
89.25994.139
76.908
0.000
20.000
40.000
60.000
80.000
100.000
120.000
Pakruojis Šaukotas Giruliai Prienai Radviliškis Plateliai Pašušvys
Fen
olin
ių ju
ngi
nių
kie
kis
GR
E m
g/g
Visa žaliava Lapai
30
10 pav. Suminis fenolinių junginių kiekis (mg/g) siauralapių gauromečių(Chamerion
angustifolium (L.) Holub.) visoje augalinėje žaliavoje ir lapuose, taikant spektrofotometrinį
Folin – Ciocalteu metodą; n=3.
3.3. Antioksidacinio aktyvumo nustatymas spektrofotometriniu CUPRAC
metodu
Tyrimo metu buvo nustatynėjamas skirtingose Lietuvos vietose rinktų siauralapių
gauromečių (Chamerion angustifolium (L.) Holub) lapų ir visos augalinės žaliavos etanolinių
ekstraktų antioksidacinis aktyvumas. Įvertinta antioksidantinio aktyvumo priklausomybė nuo
augimo vietos.
3.3.1. Siauralapių gauromečių visos augalinės žaliavos antioksidantinis vertinimas
Buvo tirtas ir įvertintas siauralapių gauromečių iš visos augalinės žaliavos pagamintų
ekstraktų antioksidacinis aktyvumas CUPRAC redukcinio aktyvumo nustatymo metodu. Duomenys
pateikti žemiau esančiame paveikslėlyje (11 pav.). Didžiausiu redukciniu aktyvumu pasižymėjo
visos augalinės žaliavos ekstraktai surinkti Plateliuose 6,584 ± 0,06 mg/g, tai 1,78 karto didesnis
aktyvumas už Pakruojyje surinktas žaliavas, kurių antioksidantinė geba buvo mažiausia 3,686 ±
0,01 mg/g. Iš pateiktų duomenų matome, kad Plateliuose surinkta siauralapio gauromečio lapų
žaliava pasižymėjo didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu, lyginant su kitomis tirtomis Lietuvos
vietovėmis.
426.064
518.891
0.000
100.000
200.000
300.000
400.000
500.000
600.000
Visa augalinė žaliava Lapų augalinė žaliava
Ko
nce
ntr
acija
GR
Em
g/g
31
11 pav. Skirtingose vietovėse surinktos siauralapio gauromečio augalinės žaliavos ekstraktų
antioksidacinis aktyvumas
3.3.2. Siauralapių gauromečių lapų ekstraktų antioksidantinis vertinimas
Atlikus tyrimus su siauralapių gauromečių lapų etanoliniais ekstraktais, nustatytas jų
redukcinis aktyvumas septyniose Lietuvos vietovėse. Kiekvienos vietovės siauralapio gauromečio
(Chamerion angustifolium (L.) Holub) lapų augalinės žaliavos antioksidantinis aktyvumas buvo
nustatytas UV spektrofotometriniu CUPRAC metodu ir apskaičiavus šių mėginių vidurkį, nustatytos
vidutinės antioksidantinės reikšmės, kurios svyravo nuo 4,417 ± 0,08 mg/g iki 9,033 ± 0,01 mg/g.
Lapų ekstraktai, pasižymėję didžiausiu antioksidantiniu aktyvumu 9,033 ± 0,01 mg/g ir 8,738 ± 0,06
mg/g, buvo surinkti Plateliuose ir Radviliškyje. Mažesniu antioksidantiniu aktyvumu 6,84 ± 0,21
mg/g; 6,109 ± 0,23 mg/g ir 5,558 ± 0,06 mg/g pasižymėję augalai buvo surinkti Pašušvyje,
Giruliuose bei Šaukote. Mažiausias siauralapio gauromečio lapų ekstraktų antioksidantinis
aktyvumas 4,878± 0,23 mg/g ir 4,417± 0,08 mg/g nustatytas Prienuose ir Pakruojyje.
3.6864.109 3.993 3.904
5.032
6.584
5.173
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Pakruojis Šaukotas Giruliai Prienai Radviliškis Plateliai Pašušvys
Ko
nce
ntr
acija
mg/
g
32
12 pav. Skirtingose vietovėse surinktos siauralapio gauromečio lapų augalinės žaliavos
ekstraktų antioksidacinis aktyvumas.
3.3.3. Siauralapių gauromečių visos augalinės žaliavos ir lapų ekstraktų antioksidantinis
vertinimas
13 paveiksle pateikti duomenys apie Chamerion angustifolium (L.) Holub lapų ir visos
augalinės žaliavos etanolinių ekstraktų antioksidantinį kiekį žaliavoje mg/g. Norint nustatyti
antioksidantų kiekį augalo lapuose ir palyginti su visa augaline žaliava, tyrimams buvo paimti
Lietuvoje augantys siauralapiai gauromečiai iš skirtingų augaviečių. Tyrimais nustatyta, kad
siauralapių gauromečių lapų ir visos augalinės žaliavos etanolinių ekstraktų antioksidantiniai
kiekiai žaliavose surinktose skirtingose augavietėse skyrėsi. Didžiausi antioksidantų kiekiai gauti
augalo lapuose lyginant su visa augaline žaliava visuose augavietėse. Rezultatai svyravo nuo 4,417
± 0,08 mg/g iki 9,033 ± 0,01 mg/g. Tuo tarpu visos augalinės žaliavos ekstraktuose buvo aptikta
nuo3,686 ± 0,01 mg/g iki 6,584 ± 0,06 mg/g.
Iš pateiktų duomenų galime spręsti, kad didesniu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėjo
Chamerion angustifolium (L.) Holub lapai visose tirtose augavietėse. Plateliuose rinktos augalinės
žaliavos antioksidantinis kiekis buvo didžiausias ir lapuose ir visoje augalinėje žaliavoje, o
mažiausias antioksidantinis aktyvumas nustatytas Pakruojyje rinkoje visoje augalinė žaliavoje ir
4.417
5.5586.109
4.878
8.738 9.033
6.84
0
2
4
6
8
10
12
Pakruojis Šaukotas Giruliai Prienai Radviliškis Plateliai Pašušvys
Ko
nce
ntr
acija
mg/
g
Vietovės
33
lapuose. Atlikus statistinį duomenų apdorojimą, statistiškai reikšmingi skirtumai nėra nustatyti
p>0,05.
13 pav. Skirtingose vietovėse surinktos siauralapio gauromečio lapų ir viso augalo žaliavos
antioksidacinis aktyvumas
3.3.4. Suminis siauralapių gauromečių visos augalinės žaliavos ir lapų ekstraktų
antioksidantinis vertinimas
Įvertinus suminį anioksidantinį aktyvumą mg/g visoje augalinėje žaliavoje ir lapuose
nustatyta, kad siauralapių gauromečių lapų antioksidantinis aktyvumas didesnis, nei visos augalinės
žaliavos. Lapuose 45,573 mg/g, o visoje augalinėje žaliavoje 32,481 mg/g. Iš pateiktų duomenų
galime spręsti, kad didesniu antioksidantiniu aktyvumu pasižymėję Chamerion angustifolium (L.)
Holub lapai yra vertingesni kaip antioksidantų šaltinis, nei visa augalinė žaliava. Rezultatai pateikti
14 paveikslėlyje.
3.6864.109 3.993 3.904
5.032
6.584
5.1734.417
5.558
6.109
4.878
8.7389.033
6.84
0
2
4
6
8
10
12
Pakruojis Šaukotas Giruliai Prienai Radviliškis Plateliai Pašušvys
Ko
nce
ntr
acija
mg/
g
Visa žaliava Lapai
34
14 pav. Suminis antioksidantinis aktyvumas siauralapio gauromečio augalinėje žaliavoje ir
lapuose
3.4. Efektyvioji skysčių chromatografija
Efektyviosios skysčių chromatografijos metodu buvo analizuota gauromečio išdžiovinta
augalinė žaliava, bei fermentuota gauromečio arbata. Šiuo būdu analizuoti fenoliniai junginiai:
dihidro benzoinė rūgštis, neochlorogenas, chlorogeno rūgštis, hiperozidas, izokvercitrinas,
kvercitrinas, kvercetinas.
3.5. Efektyviosios skysčių chromatografijos metodikos validacija
Norint taikyti efektyviosios skysčių chromatografijos metodą šiame darbe tiriamųjų
siauralapių gauromečių ekstraktų nustatymui, būtina įrodyti metodikos tinkamumą. ESC metodikos
validacija vertinama pagal šiuos parametrus:
• specifiškumą;
32.481
45.573
0
10
20
30
40
50
60
Visa augalinė žaliava Lapų augalinė žaliava
Ko
nce
ntr
acija
mg/
g
35
• rezultatų glaudumą – rezultatų pakartojamumas ir rezultatų tarpinis
preciziškumas;
• tiesiškumą;
• aptikimo ir nustatymo ribas;
Metodo validacija atliekama remiantis ICH (angl. International
ConferenceonHarmonisation) analitinių procedūrų validacijos gairėmis [15].
3.5.1. Specifiškumas
Vertinant metodo specifiškumą buvo lyginamos analizuojamų tirpalų ir standartinių tirpalų
chromatogramos ir smailių sulaikymo laikai.
Lyginant siauralapių gauromečių ir standartinių junginių sulaikymo laikus, nustatyta, kad
spektriniai duomenys ir sulaikymo laikas sutampa.
3.5.2. Glaudumas
Glaudumas nustatomas vertinant metodikos pakartojamumą ir tarpinį preciziškumą.
Pakartojamumas rodo tyrimo tikslumą tomis pačiomis sąlygomis per trumpą laiko tarpą,
dirbant su tuo pačia įranga, tą pačią dieną. Pakartojamumas įrodomas nustatytomis sąlygomis
atliekant kelis to pačio mėginio matavimus ir apskaičiavus santykinį standartinį nuokrypį (SSN) (1
lentelė).
1 lentelė. Metodikos rezultatų pakartojamumas
Junginys Santykinis standartinis nuokrypis
(SSN) %
Dihidrobenzoinė rūgštis 0,8
Neochlorogenas 0,5
Chlorogeno rūgštis 0,8
Hiperozidas 2,4
Izokvercitrinas 0,9
Kvercitrinas 1,8
Kvercetinas 0,6
36
Pagal gautus rezultatus matome, kad santykinis standartinis nuokrypis junginių yra
skirtingas, tačiau ne didesnis nei 5%. Galima teigti, kad rezultatų pakartojamumas atitinka
reikalavimus ir remiantis šiuo kriterijumi, metodas yra tinkamas kiekybiniam fenolinių junginių
nustatymui.
Tarpinis preciziškumas yra įrodomas nustatytomis sąlygomis naudojant tą patį mėginį ir
atliekant analizę dvi dienas iš eilės, tiriamos vienodos tirpalų injekcijos (2 lentelė).
2 lentelė. Metodikos rezultatų tarpinio preciziškumo įvertinimas
Junginys Santykinis standartinis nuokrypis
(SSN) %
Dihidrobenzoinė rūgštis 1,0
Neochlorogenas 0,6
Chlorogeno rūgštis 1,1
Hiperozidas 3,0
Izokvercetinas 1,3
Kvercitrinas 2,3
Kvercetinas 0,8
Įvertinus tarpinio preciziškumo gautus santykinio standartinio nuokrypio rezultatus galima
teigti, kad metodas atitinka glaudumo reikalavimus ir yra tinkamas kiekybiniam fenolinių junginių
nustatymui.
3.5.3. Tiesiškumas
Metodo tiesiškumui įrodyti yra sudaromas gradavimo grafikas, kuriam naudojami
standartiniai tirpalai. Gaunama kalibracinė kreivė, kuri įrodo, kad smailės ploto priklausomybė nuo
koncentracijos yra tiesiška.
Tiesiškumą taip pat įrodo koreliacijos koeficientas (𝑅2), jis privalo būti kuo artimesnis
vienetui. Analizuojamų tiriamųjų tirpalų gradavimo grafikų koreliacijos koeficientai 𝑅2= 0.999 (3
lentelė).
3 lentelė. Tiriamųjų junginių kalibracinės kreivės lygtys ir koreliacijos koeficientai
37
Junginys Kalibracinės kreivės
lygtis
Koreliacijos
koeficientas 𝑹𝟐
Dihidrobenzoinė rūgštis Y=3.59*107x+1.11*104 0,999
Neochlorogenas Y=2.43*107x-8.96*103 0,999
Chlorogeno rūgštis Y=4.26*107x+1.4*104 0,999
Hiperozidas Y=2.05*107x+1.24*104 0,999
Izokvercetinas Y=6.42*107x+1.13*103 0,999
Kvercitrinas Y=2.02*107x+1.41*104 0,999
Kvercetinas Y=3.45*107x+4.67*104 0,999
Remiantis šiuo rodikliu galima teigti, kad metodas atitinka tiesiškumo parametrus.
3.5.4. Aptikimo ir nustatymo ribos
Aptikimo riba yra apibūdinama kaip mažiausias medžiagos kiekis, kuris yra aptinkamas
mėginyje, o nustatymo riba – mažiausias medžiagos kiekis, kuris gali būti kiekybiškai įvertintas.
ESC metodo validacijos metu nustatytos tiriamųjų junginių aptikimo ir nustatymo ribos pateikiamos
4 lentelėje.
4 lentelė. Tiriamųjų junginių aptikimo ir nustatymo ribos.
Junginys Aptikimo riba µg/ml Nustatymo riba µg/ml
Dihidrobenzoinė rūgštis 0.6 1.0
Neochlorogenas 1.9 3.0
Chlorogeno rūgštis 0.3 1.0
Hiperozidas 0.3 1.0
Izokvercetinas 0.1 0.4
Kvercitrinas 0.3 0.9
Kvercetinas 0.2 1.0
Pagal gautus rezultatus matoma, kad tiriamųjų junginių aptikimo ir nustatymo ribos yra
skirtingos. Didžiausios aptikimo ir nustatymo ribos yra neochlorogeno, mažiausios – izokvercetino.
38
Įvertinus visus pasirinktus metodo validacijos kriterijus ir remiantis gautais rezultatais,
galima teigti, kad ESC metodika yra tinkama dihidrobenzoinės rūgšties, neochlorogeno, chlorogeno
rūgšties, hiperozido, izokvercetino, kvercitrino ir kvercetino kokybiniam ir kiekybiniam nustatymui.
Validuota ESC metodika bus taikoma šių junginių kiekybiniam nustatymui.
3.5. Siauralapio gauromečio fermentuotos arbatos ir visos žaliavos fenolinių
junginių kiekybinis įvertinimas ESC metodu
Siauralapio gauromečio fermentuotoje arbatoje ir augalinėje žaliavoje fenolinių junginių
kiekybinė analizė buvo atlikta naudojant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą. Rezultatai
pateikti 15 paveikslėlyje. Buvo identifikuoti ir kiekybiškai įvertinti fermentuotos arbatos ir augalinės
žaliavos fenoliniai junginiai, kurie kaip matyti iš pateikto paveikslėlio ryškiai skiriasi.
Fermentuotoje gauromečio arbatoje nustatytas didžiausias kiekis izokvercitrino, o augalinėje
gauromečio žaliavoje neochlorogeno junginio.
Didžiausias kiekis izokvercitrino 52,039 mg/g buvo nustatytas fermentuotoje siauralapio
gauromečio arbatoje, kai gauromečio žaliavoje jo kiekis tesiekė 4,8 mg/g. Tačiau gauromečio
žaliavoje buvo identifikuotas didelis kiekis 27,118 mg/g neochlorogeno, palyginus su fermentuotoje
arbatoje gautu rezultatu 1,104 mg/g. Visų identifikuotų fenolinių junginių kiekiai buvo didesnis
fermentuotoje gauromečio arbatoje, lyginant su siauralapio gauromečio augaline žaliava, išskyrus
chlorogeno rūgštį, jos fermentuotoje arbatoje buvo 0,469 mg/g, o augalinėje žaliavoje 1,204 mg/g.
Siauralapio gauromečio augalinėje žaliavoje nebuvo aptikta dihidro benzoinės rūgšties.
Apibendrinus gautus tyrimų rezultatus galima daryti prielaidą, kad fermentuota siauralapio
gauromečio arbata yra vertingesnė fenolinių junginių kiekiu, nei augalinė siauralapio gauromečio
žaliava, joje ypač gausu flavonoido izokvercitrino.
39
15 pav. Fenolinių junginių kiekybinis vertinimas fermentuotoje gauromečio arbatoje ir
gauromečio žaliavoje, naudojant ESC metodą
3.6. Tyrimo rezultatų apibendrinimas
Tyrimui naudota augalinė žaliava buvo surinkta 2016 metais iš natūralių siauralapio
gauromečio augimo vietų. Visi tyrimo mėginiai rinkti žydėjimo periodo metu. Buvo nustatytas
geriausias augalinės žaliavos ekstrahentas – 70 % (v/v) etanolis.
Suminis fenolinių junginių kiekis nustatytas siauralapių gauromečių augalinėje žaliavoje ir
jo lapuose, surinktose iš septynių skirtingų augaviečių. Didžiausias bendras fenolinių junginių
kiekis, nustatytas spektrofotometriniu Folin – Ciocalteu metodu, Plateliuose 94,139 ± 0,22 mg/g
lapų augalinėje žaliavoje.
Siauralapių gauromečių ekstraktų antioksidacinis aktyvumas buvo nustatytas spektrofoto-
metriniu CUPRAC metodu. Didžiausia redukcine geba pasižymėjo Plateliuose augusios siauralapių
gauromečių žaliavos 9,033 ± 0,01 mg/g. Didžiausi antioksidantų kiekiai gauti augalo lapuose
lyginant su visa augaline žaliava visuose augavietėse.
0.847 1.104 0.4694.925
52.039
0.781 0.2810.000
27.118
1.2043.530 4.800
0.268 0.0850.000
10.000
20.000
30.000
40.000
50.000
60.000
Ko
nce
ntr
acija
mg/
g
Fenoliniai junginiai
Fermentuota arbata Gauromečio žaliava
40
Buvo parinktos geriausios sąlygos ESC analizei atlikti ir nustatyti siauralapių gauromečių
augalinės žaliavos ir fermentuotos arbatos ekstraktuose esantys fenoliniai junginiai: dihidro
benzoinė rūgštis, neochlorogenas, chlorogeno rūgštis, hiperozidas, izokvercitrinas, kvercitrinas,
kvercetinas. Didžiausias kiekis izokvercitrino 52,039 mg/g buvo nustatytas fermentuotoje
siauralapio gauromečio arbatoje, kai gauromečio žaliavoje jo kiekis tesiekė 4,8 mg/g. Tačiau
gauromečio žaliavoje buvo identifikuotas didelis kiekis 27,118 mg/g neochlorogeno, palyginus su
fermentuotoje arbatoje gautu rezultatu 1,104 mg/g. Visų identifikuotų fenolinių junginių kiekiai
buvo didesnis fermentuotoje gauromečio arbatoje, lyginant su siauralapio gauromečio augaline
žaliava, išskyrus chlorogeno rūgštį, jos fermentuotoje arbatoje buvo 0,469 mg/g, o augalinėje
žaliavoje 1,204 mg/g. Siauralapio gauromečio augalinėje žaliavoje nebuvo aptikta dihidro benzoinės
rūgšties.
Šiame darbe pateiktų rezultatų negalime lyginti su kitų autorių moksliniais darbais, kadangi
nebuvo rasta tyrimų atliktų atitinkamomis sąlygomis bei metodais.
41
IŠVADOS
1. Tinkamiausios sąlygos siauralapių gauromečių augalinei žaliavai ekstrahuoti yra su 70 %
(v/v) etanoliu, laikant ultragarso vonelėje 30 min.
2. Didžiausias bendras fenolinių junginių kiekis, nustatytas spektrofotometriniu Folin –
Ciocalteu metodu, Plateliuose 94,139 ± 0,22 mg/g rinktoje lapų augalinėje žaliavoje.Pagal
gautus ir įvertintus duomenis galima teigti, kad siauralapių gauromečių augalinė žaliava yra
vertinga fenolinių junginių išgavimui. Nenustatyta statistiškai reikšmingų skirtumų tarp
augaviečių, p>0,05.
3. Didžiausiu antioksidaciniu aktyvumu, nustatytu CUPRAC metodu, pasižymėjo Plateliuose
9,033 ± 0,01 mg/g augusios siauralapių gauromečių žaliavos. Didžiausi antioksidantų kiekiai
gauti augalo lapuose lyginant su visa augaline žaliava visuose augavietėse.
4. ESC tyrimams, fenolinių junginių kokybiniam ir kiekybiniam įvertinimui siauralapių
gauromečių augalinėje žaliavoje, buvo pritaikyta skirstymo metodika skirta fenolinių
junginių identifikavimui ir kiekybiniai analizei atlikti augalinės žaliavos ekstraktuose.
Parinkta tinkamiausia ESC metodika kokybiniam ir kiekybiniam fenolinių junginių
nustatymui buvo validuota.
5. ESC analizės metu nustatyti siauralapių gauromečių augalinės žaliavos ir fermentuotos
arbatos ekstraktuose esantys fenoliniai junginiai: dihidro benzoinė rūgštis, neochlorogenas,
chlorogeno rūgštis, hiperozidas, izokvercitrinas, kvercitrinas, kvercetinas. Didžiausias kiekis
buvo nustatytas izokvercitrino fermentuotoje siauralapio gauromečio arbatoje. Tačiau
gauromečio žaliavoje buvo identifikuotas didelis kiekis neochlorogeno.Visų identifikuotų
fenolinių junginių kiekiai buvo didesnis fermentuotoje gauromečio arbatoje, lyginant su
siauralapio gauromečio augaline žaliava, išskyrus chlorogeno rūgštį.
42
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Remiantis atliktais spektrofotometriniais tyrimais ir gautais rezultatais nustatyta, kad
siauralapių gauromečių (Chamerion angustifolium (L.) Holub) lapų augalinė žaliava yra vertingesnė
fenoliniais junginiais ir jos lapų antioksidacinis aktyvumas didesnis lyginant su visa augaline
žaliava. Galima teigti, jog siauralapių gauromečių lapai yra vertingesni preparatų gamyboje
Būtų tikslinga atlikti tyrimus su didesniu kiekiu mėginių, surinktų skirtingu laiku ir iš
daugiau skirtingų augaviečių; įvertinti rinkimo laiko ir vietos daromą įtaką fenolinių junginių kiekiui
augalinėje žaliavoje.
43
LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Andersen ØM, Markham KR, editors. Flavonoids: chemistry, biochemistry, and
applications. Boca Raton: Taylor & Francis; 2006. p. 13, 30.
2. Agrawal S, Kulkarni GT, Sharma VN. A comparative study on the antioxidant activity of
methanolic extracts of Terminalia paniculata and Madhuca longifolia. Free Radic
Antioxid. 2011 October;1(4):62–8
3. Azmir J., Zaidul I.S.M., Rahman M.M., Sharif K.M, Mohamed A., Sahena F., Jahurul
M.H.A., Techniques for extraction of bioactive compounds from plant materials: A
review. Journal of Food Engineering. 2013 January: p. 426–436.
4. Balvočiūtė J, Dagytė S, Juknevičienė G. Medingieji augalai. Vilnius: Mokslas; 1987. p.
11-2.
5. Battinelli L, Tita B, Evandri MG, Mazzanti G. Antimicrobial activity of Epilobium spp.
extracts. Il Farmaco 2001; 56: 345–348.
6. Bond W., Davies G., Turner R.The biology and non-chemical control of Rosebay
Willowherb (Chamerion angustifolium (L.) Holub) October 2007.
https://www.gardenorganic.org.uk/sites/www.gardenorganic.org.uk/files/organic-
weeds/chamerion-angustifolium.pdf [prieiga per internetą, žiūrėta 2016-07-20]
7. Dai J, Mumper R. Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and
Anticancer Properties. Molecules. [Internet]; 2010 [žiūrėta 2017-04-10];. 15(10):7313-
7352. Prieiga per internetą: http://www.mdpi.com/1420-3049/15/10/7313?trendmd-
shared=0>
8. TPA Devasagayam, JC Tilak, KK Boloor, Ketaki S Sane, Saroj S Ghaskadbi, RD Lele.
Free Radicals and Antioxidants in Human Health:Current Status and Future Prospects.
Japi 2004;52:794-804
9. Ducrey B, Marston A, Göhring S, Hartmann RW, Hostettmann K. Inhibition of 5α-
Reductase and Aromatase by the Ellagitannins Oenothein A and Oenothein B from
Epilobium Species. Planta Medica 1997; 63: 111-114.
10. Fereidoon Shahidi, Ying Zhong. Measurement of antioxidant activity. Journal of
Functional Foods. 2015 October: p. 757–781.
44
11. Garcia-Salas P, Morales-Soto A, Segura-Carretero A, Fernández-Gutiérrez A. Phenolic-
compound-extraction systems for fruit and vegetable samples. Molecules.
2010;15(12):8813–26.
12. Garrett, A, Murray B, Robison R, O’Neill K. Measuring Antioxidant Capacity Using the
ORAC and TOSC Assays.Methods In Molecular Biology. [interaktyvus]. 2009 [žiūrėta
2016-10-21];.251-262. Prieiga per internetą:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20072922
13. Giao, M.S.; Pereira, C.I.; Fonseca, S.C.; Pintado, M.E.; Malcata FX. Effect of particle
size upon the extent of extraction of antioxidant power from the plants Agrimonia
eupatoria, Salvia sp. And Satureja montana. 2009. 412-416 p.
14. Gudžinskas Z., Balvočiūtė J. Lietuvos vaistiniai augalai. Kaunas, Šviesa, 2007; p. 50.
15. ICH HARMONISED TRIPARTITE GUIDELINE VALIDATION OF ANALYTICAL
PROCEDURES. [Internet].; 2014 [cited 2017 October 16] Available from:
https://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_
R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf
16. Hevesi Toth B., Blazics B., Kery A. Polyphenol composition and antioixidant capasity of
Epilobium species. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2009; 49: p. 26-
31.
17. Jin D., Mumper R.J. Plant phenolics: Extraction, analysis and their antioxidant and
anticancerproperties. Molecules. 2010, 15(10), 7313-7352
18. Jones NP, Arnason JT, Abou-Zaid M, Akpagana K, Sanchez-Vindas P, Smith ML.
Antifungal activity of extracts from medicinal plants used by First Nations Peoples of
eastern Canada. Journal of Ethnopharmacology. 2000; 73: 191-8.
19. Jonierison Alves Pontis, Luiz Antonio Mendonça Alves da Costa, Silvio José Reis da
Silva, Adriana Flach. Color, phenolic and flavonoid content, and antioxidant activity of
honey from Roraima, Brazil. Food Science and Technology(Campinas). 2014 March: p.
69-73.
20. Kaškonienė V., Stankevičius M., Drevinskas T., Akuneca I., Kaškonas P., Bimbiraitė -
Survilienė K., Maruška A., Ragažinskienė O., Kornyšova O., Briedis V., Ugenskienė R.
Evaluation of phytochemical composition of fresh and dried raw material of introduced
Chamerion angustifolium L. Using chromatographic, spectrophotometric, and
chemometric techniques. Phytochemistry 2015; 115: p. 184-193.
45
21. Ayse Karadag & Beraat Ozcelik & Samim Saner. Review of Methods to Determine
Antioxidant Capacities. Food Anal. Methods 2009; 2:41–60.
22. Kaunienė V, Kaunas E. Vaistingieji augalai. Kaunas: Varpas; 1991. p. 34-5, 128.
23. Khoddami Ali, Wilkes Meredith A., Roberts Thomas H. Techniques for Analysis of
Plant Phenolic Compounds. Molecules. 2013; (18): 2328-2375
24. Kiss AK, Bazylko A, Filipek A, Granica S, Jaszewska E, Kiarszys U, Kośmider A,
Piwowarski J. Oenothein B’s contribution to the anti-inflammatory and antioxidant
activity of Epilobium sp. Phytomedicine 2011; 18: 557–560.
25. Kiss AK, Kowalski J, Melzig MF. Compounds from Epilobium angustifolium Inhibit the
Specific Metallopeptidases ACE, NEP and APN. Planta Medica 2004; 70: 919-923.
26. Kuršvietienė L, Stanevičienė I. Aktyviųjų deguonies formų ir antioksidantų poveikis
biomolekulėms ir reikšmė patogenezėje. Visuomenės Sveikata, 2012; 4(59): 10–3.
27. Lesuisse D, Berjonneau J, Ciot C, Devaux P, Doucet B, Gourvest JF, Khemis B, Lang C,
Legrand R, Lowinski M, Maquin P, Parent A, Schoot B, Teutsch G. Determination of
Oenothein B as the Active 5-α-Reductase-Inhibiting Principe of the Folk Medicine
Epilobium parviflorum. Journal of Natural Products 1996; 59: 490-492.
28. V. Lobo, A. Patil, A. Phatak NC. Free radicals, antioxidants and functional foods: Impact
on human health. Pharmacogn Rev. 2010;4(8):118–126
29. Maruška A., Ragažinskiene O., Vyšniauskas O., Kaškonienė V., Bartkuvienė V.,
Kornyšova O., Briedis V., Ramanauskienė K. Flavonoids of willow herb (Chamerion
angustifolium (L.)Holub) and their radical scavenging activity during vegetation.
Advances in Medical Sciences2014; 59: p. 136-141.
30. McColl J. Willowherb (Epilobium angustifolium L.): Biology, chemistry, bioactivity and
uses. Agro Food Industry Hi Tech. 2002; 13: 18-22.
31. Natkevičaitė-Ivanauskienė M, redaktorė. Lietuvos TSR flora IV. Vilnius: Mintis; 1971.
p. 766-9.
32. Naczk M, Shahidi F. Extraction and analysis of phenolics in food. J Chromatogr A.
2004;1054(1-2):95–111.
33. Pandey K.B, Rizvi S.I. Plant Polyphenols as Dietary Antioxidants in Human Health and
Disease. Oxidative Medicine And Cellular Longevity. Landes: Bioscience. [Internet].
2009 [žiūrėta 2017-04-10];. 2(5), 270-278. Prieiga per internetą:
http://www.hindawi.com/journals/omcl/2009/897484/abs/
46
34. Patricia Garcia-Salas, Aranzazu Morales-Soto, Antonio Segura-Carretero and Alberto
Fernández-Gutiérrez. Phenolic-Compound-Extraction Systems for Fruit and Vegetable
Samples. Molecules. 2010 December: p. 8813-8826.
35. Perumalla S, Nayeem N. Research Article Determination of Total phenolic acids ,
condensed tannins and flavonoids in the leaves of Caesalpinia pulcherrima ( Linn .).:16–
9.
36. Pham-Huy LA, He H, Pham-Huy C. Free Radicals, Antioxidants in Disease and Health.
International Journal of Biomedical Science 2008; 4(2): 89-96.
37. Ramstead A. G., Schepetkin I. A., Jutila M. A., Qiunn M. Oenothein B, a Cyclic Dimeric
Ellagitannin Isolated from Epilobium angustifolium, Enhances IFNγ Production by
Lymphocytes. PLoS One. 2012;7(11):e50546. doi: 10.1371/journal.pone.0050546.
38. Radusiene, J., Marska, M., Ivanauskas, L., Jakstas, V., Karpaviciene, B. Assessment of
phenolic compound accumulation in two widespread goldenrods. Industrial Crops and
Products 63; 2015; 158-166.
39. Ragažinskienė O., Rimkienė S., Sasnauskas V. Vaistinių augalų enciklopedija. Kaunas,
Lututė, 2005; p. 118-120.
40. Ragažinskienė O., Vyšniauskas O., Karnyšova O., Maruška A., Kazlauskienė D.
Chamerion angustifolium (L.) Holub – vaistinis augalas žmogaus sveikatos gerinimui.
Žmogaus ir gamtos sauga 2009- 1 dalis, LŽŪU, Kaunas.
41. Raudonis R. Skysčių chromatografijos pokolonėlinių metodų optimizavimas augalinių
antioksidantų tyrimams. Daktaro disertacija [interaktyvus]. 2012 [žiūrėta 2017-04-11];.
Prieiga per internetą: http://vddb.laba.lt/fedora/get/LT-eLABa-
0001:E.02~2012~D_20120918_151438-68335/DS.005.0.01.ETD
42. Raudonis R, Raudonė L, Janulis V, Viškelis P. Antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo
nustatymo metodai (apžvalga). Sodininkystė ir daržininkystė. 2012;31(3-4):15-35.
43. Rautavara T. Kam tinka augalai. Vilnius: Mintis; 1984. p. 92-93.
44. Reis Giada M. Food Phenolic Compounds: Main Classes, Sources and Their Antioxidant
Power, Oxidative Stress and Chronic Degenerative Diseases - A Role for Antioxidants,
Dr. Jose Antonio Morales-Gonzalez [Internet]. 2013 [žiūrėta 2017-04-10];. 978-953-51-
1123-8. Prieiga per internetą: http://www.intechopen.com/books/oxidative-stress-and-
chronic-degenerative-diseases-a-role-for-antioxidants/food-phenolic-compounds-main-
classes-sources-and-their-antioxidant-power
47
45. Rice-Evans, C., Miller, N., & Paganga, G. Antioxidant properties of phenolic
compounds. Trends in plant science, (1997);2(4), 152-159.
46. de Rijke E, Out P, Niessen WMA, Ariese F, Gooijer C, Brinkman UAT. Analytical
separation and detection methods for flavonoids. Journal of Chromatography A 2006;
1112: 31–63.
47. Rogers R. D. Fireweed –a treasured medicine of the boreal forest. Discovery
Phytomedicine; 1: 10-15. [internet] 2014 [žiūrėta 2016-05-10];
https://www.phytomedicine.ejournals.ca/index.php/phytomedicine/article/view/16
48. Rong Tsao. Chemistry and Biochemistry of Dietary Polyphenols. Nutrients. 2010 Dec;
2(12): 1231-1246 )
49. Routley MB, Husband BC. Responses to selection on male-phase duration in Chamerion
angustifolium. Journal of Evolutionary Biology 2005; 18: 1050–1059.
50. Ruszová E., Cheel1 J., Pávek1 S., Moravcová1 M., Hermannová1 M., Matějková1 I.,
Spilková J., Velebný1 V., Kubala L. Epilobium angustifolium extract demonstrates
multiple effects on dermal fibroblasts in vitro and skin photo-protection in vivo Gen.
Physiol. Biophys. (2013), 32, 347–359
51. Sagar B. KedareR. P. Singh. Genesis and development of DPPH method of antioxidant
assay. Journal of Food Science and Technology. 2011 August: p. 412–422.
52. Sasnauskas V. Miško vaistiniai augalai. Vilnius: Asveja; 2006. p. 118-20.
53. Schepetkin I. A., Ramstead A. G., Kirpotina L. N., Voyich J. M., Jutila M. A., Qiunn
M.T.Therapeutic Potential of Polyphenols from Epilobium Angustifolium (Fireweed).
Phytotherapy research 2016; vol. 30 (8): p. 1287-1297.
54. Schepetkin IA, Kirpotina LN, Jakiw L, Khlebnikov AI, Blaskovich CL, Jutima MA,
Quinn MT. Immunomodulatory Activity of Oenothein B Isolated from Epilobium
angustifolium. The Journal of Immunology 2009; 183: 6754-6766.
55. Shymala Gowri S, Pavitha S, Vasantha K. Free radical scavenging capacity and
antioxidant activity of young leaves and barks of Acacia nilotica. International Journal of
pharmacy and Pharmaceutical sciences. 2010 November; 3 (1): 160–164.
56. Stalikas C. D. Extraction, separation and detection methods for phenolic acids and
flavonoids. Journal of Separation Science. 2007, 30, 3268 – 3295
57. Stolarczyk M., PiwowarskiJ.P., Granica S.,Stefańska J., Naruszewicz1M. and Kiss A.K.
Extracts from Epilobium sp. Herbs, Their Components and Gut Microbiota Metabolites
of Epilobium Ellagitannins, Urolithins, Inhibit Hormone-Dependent Prostate Cancer
48
Cells- (LNCaP) Proliferation and PSA Secretion. Phytotherapy reasearch. Phytother.
Res. 27: 1842–1848 (2013).
58. Tita B, Abdel-Haq H, Vitalone A, Mazzanti G, Saso L. Analgesic properties of
Epilobium angustifolium, evaluated by the hot plate test and the writhing test. Il Farmaco
2001; 56: 341– 343.
59. Vilkonis K. K. Lietuvos žaliasis rūbas. Kaunas, Lututė, 2001; p. 164-166.
60. Vitalone A, Bordi F, Baldazzi C, Mazzanti G, Saso L, Tita B. Anti-proliferative effect on
a prostatic epithelial cell line (PZ-HPV-7) by Epilobium angustifolium L. Il Farmaco
2001; 56:483–489.
61. Vyšniauskas O., Markauskienė A., Bimbiraitė-Survilienė K., Kaškonienė V., Briedis V.,
Ramanauskienė K., Maruška A., Ragažinskienė O. Siauralapio gauromečio (Chamerion
angustifolium (L.) Holub) farmakognostinės savybės ir jo panaudojimas ligų prevencijai.
ISSN 1822-1823 Žmogaus ir gamtos sauga 2011, LŽŪU.
62. Webster D, Taschereau P, Belland RJ, Sand C, Rennie RP. Antifungal activity of
medicinal plant extracts; preliminary screening studies. Journal of Ethnopharmacology
2008; 115: 140–146.
63. Zadernowski R, Czaplicki S, Naczk M. Phenolic acid profiles of mangosteen fruits
(Garcinia mangostana). Food Chem. 2009;112(3):685–9.
64. Zhengyi W et al. Flora of China, Text Volume 13, Clusiaceae-Araliaceae. St. Louis:
Missouri Botanical Garden Press; 2007.p. 409–411.
