LIFE - klinikum.uni-muenchen.de · Laser- und Immunologie-Forschungseinrichtungen mit den Lasereingriffen an Zellstrukturen auftun und das so genannte Laserröntgen wird hierfür

LIFE F O R S C H U N G FÜR DAS LEBEN Laser- und Immunologie- Forschungseinrichtungen Klinikum der Ludwig-Maximilians-Universität München

Forschungsbericht 2005-2006

Forschung für das Leben 1

Vorwort

Trotz schwieriger finanzieller Situation auf-grund einer lahmenden Wirtschaft und fast völliger Einstellung der Forschungsförderung durch staatliche Stellen hat das LIFE-Zentrum in den Jahren 2005/2006 seine wissen-schaftliche Bedeutung für das Universitäts-klinikum und die klinische Forschung im Allgemeinen beweisen können.

Das Konzept dieser Forschungseinrichtung beruht auf dem bewährten Grundprinzip: Wissenschaftliche Fragestellung aus der Klinik an die Grundlagenforschung und von dort wieder zurück in die Klinik. Die Effektivität eines solchen Konzeptes wird durch die Beiträge in der vorliegenden Broschüre belegt.

Darüber hinaus zeigt das LIFE-Zentrum eine Besonderheit, die andere derartige Ein-richtungen vermissen lassen, nämlich die Tat-sache, dass hier zwei zunächst völlig unab-hängige Fachdisziplinen - nämlich die Immu-nologie und die Physik unter einem Dach kooperieren. Was ist der Sinn einer derartigen Konstruktion, wird sich der eine oder andere fragen?

In Zeiten, da es möglich ist, mit Lasern in die Ultrastruktur der Zellen einzudringen und operative Eingriffe vorzunehmen, sollte diese von mir seit langem verfolgte Strategie neue wissenschaftliche Gebiete eröffnen, um so wissenschaftliche Erkenntnisse für die Klinik nutzbar machen zu können. Dabei sollten aber die beiden Fachgebiete Immunologie und Physik nicht so aneinander gekettet werden, dass nur eine gemeinsame Forschung möglich ist, sondern nur dort zusammenarbeiten, wo sinnvoll neue Bereiche betreten werden können, wie zum Beispiel bei der Untersuchung der synergistischen Wirkung von 5-Aminolävulinsäure-basierter Therapie und Immuntherapie beim Glioblastom und Prostata-karzinom, bei den experimentellen Studien zur Diagnostik und Therapie von Mikrometastasen kindlicher Tumoren durch photodynamische Verfahren, beim Fluoreszenz-vermittelten Nachweis von Markerenzymen zur In-vivo-Visualisierung von Tumoren und deren Vorstufen und schließlich bei der Wund-heilungsmodulation durch lokal integrierte Betastrahler.

Neben diesen gemeinsamen Forschungs-aktivitäten beweist die vorliegende Broschüre die unabhängigen Forschungsaktivitäten sowohl der Immunologie als auch der Physik.

Wichtige Fragen der Immunologie der letzten Jahre waren die Klärung und Verwendung von Immunmechanismen zur Bekämpfung des Nierenzell- und Prostatakarzinoms. Erste klinische Auswertungen einer Vakzine-Studie scheinen hoffnungsvoll und ergeben neue Impulse für eine breit angelegte modifizierte Grundlagenforschung. Eine wesentliche Rolle spielt hierbei auch ein über Jahre erarbeitetes Immunmonitoring-Konzept sowie die Her-stellung von Antikörpern durch genetische Immunisierung.

In der Physik konnten in einer Kooperation mit der Industrie wichtige Projekte bzw. Teil-projekte in der Grundlagenforschung konzipiert bzw. erarbeitet werden, wie die Evaluierung der Multi-Faser-PDT des inoperablen malignen Glioms, ein Konzept, das auch für den Einsatz der PDT beim Prostatakarzinom vorgesehen wird, die Entwicklung eines Lichtapplikators für die adjuvante Gliomtherapie sowie das Projekt „Femtoscope“ im Exzellenzcluster „Munich Advanced Photonics“ (MAP).

Auch in diesem Berichtszeitraum konnte die Firmenausgründung „Curalux“ mit Unterstüt-zung des BMBF (Dipl. Phys. T.J. Beck, Dipl. Ing. A. Obermeier sowie Dipl. Phys. R. Meier) weitergeführt werden.

Mit diesem Vorwort verabschiede ich mich von der Leitung einer äußerst erfolgreichen Forschungseinrichtung der Ludwig-Maximilians-Universität, wobei ich mich in erster Linie bei meinen langjährigen Mitar-beitern bedanken möchte, aber auch bei den Doktoranden und Habilitanden, die die inter-nationale Anerkennung des LIFE-Zentrums und die wissenschaftlichen Erfolge erarbeitet haben. Sie haben unter anderem bewiesen, dass die Lasertechnologie weiterhin in der Medizin eine große Rolle spielt und spielen wird, vor allem, wenn man die Forschungsergebnisse auf dem Sektor Biophotonik und den klinisch etablierten Lasereinsatz im Allgemeinen betrachtet. Neue Forschungsareale werden sich

Laser- und Immunologie-Forschungseinrichtungen

mit den Lasereingriffen an Zellstrukturen auftun und das so genannte Laserröntgen wird hierfür die Voraussetzungen schaffen.

Bedanken möchte ich mich aber auch bei der Klinikumsleitung, die die Bedeutung und wissenschaftliche Effizienz des LIFE-Zentrums anerkannte und hoffentlich auch weiterhin ihre

schützende Hand über diese wichtige For-schungseinrichtung halten wird.

Ich wünsche dem LIFE-Zentrum: Vivat, crescat, floreat ad maiorem honorem Universitatis Monacencis et ad utilitatem aegrorum.

Univ.-Prof. Dr. med. Dr. h. c. mult. A. Hofstetter

März 2007


Herausgeber:

Laser- und Immunologie-Forschungseinrichtungen (LIFE) Klinikum der Universität München Marchioninistraße 23 81377 München Fax: 089/7095-4864 http://life.klinikum.uni-muenchen.de

Redaktion:

Dr. Reinhold Baumgartner Dr. Ronald Sroka Dr. Wolfgang Beyer

Druck:

Buchdruckerei B. Märkl, München


Inhalt

Vorwort 1

Inhalt 4

Historie und Struktur 7

Forschungsberichte Laser-Forschungslabor (LFL)

Gefäßchirurgie und Phlebologie

Untersuchung der Ergebnisse von Radiofrequenz- und Lasertherapien bei Krampfadern mittels optischer Kohärenztomografie 10

Basisuntersuchungen zu thermische Effekten an Venengewebe 12

Gynäkologie

Detektion von Lymphknotenmetastasen beim Ovarialkarzinom 13

Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde

Intrinsische Autofluoreszenzspektroskopie zur Tumordetektion in der Mundhöhle 14

In-vitro-Untersuchung zur laserinduzierten Ablation von Nasen-Muschel-Gewebe 15

In-vitro-Untersuchung zur Laser-Lithotripsie von Speichelgangssteinen 16

Kinderchirurgie

Photodynamische Therapie für kindliche Tumoren 17

Neurochirurgie

Klinische Phase-I/II-Studie zur Photodynamischen Therapie von malignen Gliomen nach fluoreszenzgestützter Resektion 18

Interstitielle Photodynamische Therapie des rezidivierenden Glioblastoms 20 Nachweis von männlichen Nervenzellen im Gehirn weiblicher

Knochenmarksempfängerinnen 22

Radiologische Forschung

Einfluss der Röhrenspannung auf die Erkennbarkeit von Gallen- und Nierensteinen in der Multidetektor-Computertomographie 23

Urologie

Fluoreszenzzytologie mit 5-Aminolävulinsäure – ein quantitativer Ansatz 24 Phase-I-Studie zur Photodynamischen Therapie des Harnblasenkarzinoms mit

Hexyl-Aminolävulinsäure und Weißlicht 25 Dioden-Laser-Behandlung zur Vaporisation der humanen Prostata – Klinische

Erfahrungen 26


Fragmentierung von urologischen und künstlichen Steinen mit klinischen Lasersystemen der laserinduzierten Stoßwellenlithotripsie 27

Kollateralschäden an urologischem Instrumentarium bei der laserinduzierten Stoßwellenlithotripsie 28

Untersuchung von Stoßwellen klinischer Lasersysteme bei der laserinduzierten Stoßwellenlithotripsie 29

Pendelmodell zur Messung des Rückstoßes an Harnsteinen bei der laserinduzierten Stoßwellenlithotripsie 30

Technische Entwicklungen

Fasergestützte Bestimmung der Fluorophorkonzentration in Gewebe 31 Stellenwert einer intrinsischen Spektralanalyse 32 Konzept einer LED-Weißlichtquelle für die Endoskopie 33 Weißlichtapplikator für die Photodynamische Therapie

von penilen Kondylomen 34 EndoTrain-Kidney 35 Harnröhrendilatation am Strikturmodell mittels Everting-Katheter 36

Mitarbeiter (LFL) 37

Kooperationen (LFL) 38

Firmenprofil curalux GbR (LFL) 40

Diplomarbeiten und Promotionen (LFL) 41

Publikationen (LFL) 42

Drittmittelförderungen (LFL) 44

Veranstaltungen, Ausbildung, Lehre (LFL) 45

Forschungsberichte Labor für Tumorimmunologie (LTI)

Einleitung 48

Immunologische Grundlagen

Bedeutung von „gepaarten Immunrezeptoren“ bei der Immunantwort 50

Immune-escape-Mechanismen

Funktionelle Inaktivierung Tumor-infiltrierender natürlicher Killerzellen beim Nierenzellkarzinom 53

Die Rolle der Chemokine in soliden Tumoren 55 Indolamin-2,3-dioxygenase-Expression in Tumorendothelzellen korreliert

bei Nierenzellkarzinompatienten mit einer besseren Prognose 57

Antigene Zielstrukturen

Identifizierung antigener Zielstrukturen auf RCC-26 und primären RCC-Zellen 59


Identifizierung von Prognosefaktoren und antigenen Zielstrukturen an Laser-mikrodissezierten Nierenzellkarzinom-Metastasen mittels Transkriptomanalysen 60

Funktionelle Analyse von CEACAM20, einem potentiellen Zielmolekül für die Tumorimmuntherapie des Prostatakarzinoms 63

Optimierung von Tumorvakzinen

Generierung dendritischer Zellen für die klinische Anwendung 65 Konstruktion und Charakterisierung von T-Zell-Rezeptor-Gen-modifizierten

T-Zellen für den adoptiven Transfer 68 Die Rolle der CEACAM-Moleküle bei der DC-T-Zell-Interaktion 70 Induktion von Anti-Tumor-Immunantworten durch Photodynamische Therapie 72

Tiermodelle

Erfolgreiche Immuntherapie des Magenkarzinoms in einem spontanen autochthonen Mausmodell 74

Klinische Studien

Allogene genetisch modifizierte Tumorzellvakzine (RCC-26/CD80/IL-2) zur Therapie von Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom (klinische Phase-I-Studie) 76

Einsatz einer Zytokin-Gentherapie beim hormonrefraktären Prostatakarzinom (klinische Phase-I-Studie) 81

Einsatz einer Multipeptidvakzine zur Behandlung des metastasierten Nierenzellkarzinoms (klinische Phase-I-Studie) 84

Erste Pilotstudie zur Therapie von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (The Munich NSCLC Vaccine Study Group) 85

Immunmonitoring

Das Immunmonitoring – Techniken zur Evaluierung immuntherapeutischer Behandlungskonzepte 87

Antikörperplattform

Herstellung von Antikörpern durch genetische Immunisierung 91

Mitarbeiter (LTI) 93 Kooperationen (LTI) 94 Promotionen (LTI) 97 Publikationen (LTI) 98 Drittmittelförderungen (LTI) 100 Veranstaltungen, Ausbildung, Lehre (LTI) 101


Historie

Bereits Anfang der 70er Jahre wurde in der damaligen GSF (Gesellschaft für Strahlen und Umweltforschung) in München, Neuherberg intensive Lasermedizinforschung in den Arbeitsgruppen Urologie (Prof. Hofstetter), Gastroenterologie (Prof. Kiefhaber) und Neurochirurgie (Prof. Leheta) unter der wissenschaftlichen Betreuung durch das Institut für angewandte Optik (Prof. Waidelich) betrieben. Nach den ersten Laseranwendungen in den Kliniken Thalkirchner Straße im Jahr 1975 entstanden bei wachsendem Forschungs-bedarf neue medizinische Lasereinrichtungen in Berlin (Prof. Müller), Düsseldorf (Prof. Kaufmann), Lübeck (Prof. Hofstetter) und Ulm (Prof. Steiner). Mit zunehmend innovativen Applikationstechniken auf dem Gebiet der Laser-Technologie zeigte sich immer mehr das Defizit einer technisch-wissenschaftlich orientierten Schnittstelle zwi-schen Industrie und Klinik.

Um einen in Bezug auf Qualität und Zeit optimierten Technologietransfer zu gewähr-leisten, ist somit die räumliche Nähe zum Anwender wünschenswert. Als optimale Lösung bot sich die Errichtung eines Forschungslabors auf dem Gelände des Klinikums Großhadern an. Mit der offiziellen Eröffnung im Oktober 1995 nahm das Laser-Forschungslabor zusammen mit dem Labor für Tumorimmunologie als Forschungseinheit der Urologischen Klinik seinen Betrieb auf. Das Labor für Tumorimmunologie widmet sich dabei ergänzend der Therapie von metas-tasierten Tumorerkrankungen, die nur eingeschränkt oder nicht durch lichtbasierte Ansätze erreichbar sind. Aufgrund seiner interdisziplinären Ausrichtung wurde das Laser-Forschungslabor im April 2004 aus der Urologie ausgegliedert und wird seitdem als selbstständige Betriebseinheit des Klinikums gemeinsam mit dem Labor für Tumor-immunologie mit der Bezeichnung LIFE-Zentrum (Laser- und Immunologie-Forschungs-Einrichtungen) weitergeführt.

Struktur

Trotz seiner ursprünglichen Zuordnung an die Urologische Klinik war das Laser-Forschungs-labor von Beginn an als fach- und standort-übergreifende Einrichtung gedacht, mit den Möglichkeiten, klinische Forschung mit allen interessierten medizinischen Fachdisziplinen durchzuführen und Forschungsergebnisse auf ihre klinische Wertigkeit in Bezug auf den jeweiligen Benefit für den Patienten zu überprüfen. Bereits existierende Kontakte zu externen Kliniken werden somit beständig intensiviert und darüber hinaus neue geknüpft.

Im Laser-Forschungslabor werden drei zentrale Themen schwerpunktmäßig bearbeitet. Neben der Einführung neuer Laserverfahren in die Klinik sind dies die Photodynamische Therapie sowie die Fluoreszenzdetektion von humanen Neoplasien, vorzugsweise von Tumoren, die endoskopisch oder über Operationsmikroskope visualisiert werden können. Für die Kooperation mit der Industrie bestehen ideale Möglichkeiten, da im Großraum München mehrere Firmen aus der Medizintechnologie sowie die Geschäftsstelle von „Bayern Photonics“, dem Kompetenznetz Optische Technologien, angesiedelt sind. Für diese Firmen ist es ein wesentlicher Vorteil, dass die Produktentwicklung in möglichst enger und direkter Abstimmung mit den Anwendern voll-zogen werden kann. Hier bietet das Laser-Forschungslabor durch die direkte Anbindung an den klinischen Betrieb ausgezeichnete Voraussetzungen. Durch den zunehmenden Anspruch, Industriepartner in Forschungs-verbünde einzubringen, speziell vonseiten des BMBF, erwiesen sich diese bereits existierenden Kontakte als vorteilhaft. Die Bearbeitung von Projekten zur Fluoreszenz-diagnostik von Neoplasien und die dabei erzielten klinischen Erfolge erwiesen sich als ausschlaggebend für die Akzeptanz des Laser-Forschungslabors innerhalb der BMBF-Verbünde, die sich auf der Basis des Förder-schwerpunktes „Biophotonik“ bildeten. Dieses Schwerpunktsthema wird aufgrund seines Erfolgs regelmäßig fortgeschrieben.

Erwähnenswert ist auch die Integration des Laser-Forschungslabors in den Münchner Exzellenzcluster „Munich Advanced Photonics“. Mit dem Projekt „Femtoscope“ ist es gelungen, ein medizinisch orientiertes Forschungsthema in einem Physikcluster zu etablieren. Damit eröffnen sich neue Perspektiven auf dem Gebiet der Medizinphysik.


Nach der Ausgliederung aus der Urologischen Klinik bildet das Laser-Forschungslabor zusammen mit dem Labor für Tumorimmuno-logie den Kern des LIFE-Zentrums. Durch ein gefördertes Forschungsvorhaben auf dem Gebiet „Immunologische Aspekte der Photodynamischen Therapie“ wird die Kooperation zwischen beiden Einrichtungen zunehmend enger.

Durch die Aufnahme des neuen Forschungs-labors der Urologie, unter Leitung von Herrn Prof. Dr. med. Christian Stief, verbreitert sich zukünftig das Dach des LIFE-Zentrums. Synergien in der zukünftigen Forschung sind zu erwarten durch die gemeinschaftliche Nutzung von Forschungsgeräten sowie der Kompetenzen im Bereich Physik und Biologie.

Verbindungen zum Labor für Biomechanik und experimentelle Orthopädie in unmittelbarer Nachbarschaft des LIFE-Zentrums sind im Aufbau begriffen, mit dem Ziel, die regenerative Medizin in Urologie und Orthopädie zu vernetzen.

Das LIFE-Zentrum entwickelt sich demnach rasch als Keimzelle für eine integrative interdisziplinäre medizinische Forschungsein-heit. Es ist nun Aufgabe des Klinikums, die räumlichen und personellen Voraussetzungen für ein „erwachsenes“ Clinical Research Center vor ihren Toren zu erstellen.

Dr. rer. nat. R. Baumgartner

Leiter des Laser-Forschungslabors


Forschungsberichte Laser-Forschungslabor (LFL)


Untersuchung der Ergebnisse von Radiofrequenz- und Laser-therapien bei Krampfadern mittels optischer Kohärenztomografie

Einführung: Endoluminale thermische Methoden für die Behandlung der Stammveneninsuffizienz (Krampfadern oder Varikosis) werden zunehmend angewendet und bilden somit eine innovative Alternative zur chirurgischen Ligatur oder dem Venen-Stripping. Ziel dieser neuen Behandlungsform ist es, eine kontrollierte thermische irreversible Schädigung der Gefäßwand zu bewirken, welche in der Abheilungsphase zu einem kompletten Verschluss des Venengefäßes führt. Obwohl erste klinische Anwendungen mittels Radiofrequenz- und Laserlicht-Applikation durchgeführt und publiziert sind, fehlen grundlegende Untersuchungen, die für eine Optimierung und Effizienzsteigerung dieser Methode notwendig sind.

Daher wurde ein Modell entwickelt, an welchem unter standardisierten Bedingungen reproduzierbare und vergleichbare Experimente durchgeführt werden können. Die morpho-logische Beurteilung der induzierten Gewebe-veränderungen erfolgte anhand der optischen Kohärenztomographie (OCT).

Material und Methoden: Als Modell diente der Kuhfuß. Die gleichmäßige subkutane Vene des Kuhfußes ist hinreichend groß, um klinische Applikationssysteme aufzunehmen. Mittels Kathetersystemen kann eine Durchströmung mit Blut oder Kochsalz und ein konstanter intraluminaler Druck während der Behandlung, vergleichbar mit dem klinischen Prozedere, hergestellt werden (Abb. 1).

Abb. 1: Rinderfuß-Modell mit chirurgischem Zugang zur Vena digitalis dorsalis communis III.

Nach der Standardisierungsphase und ersten Pilotexperimenten wurden endoluminale Behandlungen nach klinischem Protokoll durchgeführt. In einer ersten Serie wurde die endoluminale Radiofrequenztherapie (n = 5,

VNUS Medical Technologies, San Jose, USA) und die endoluminale Laserbestrahlung (n = 5, CERALAS D15 ELVeS, CeramOptec GmbH) am Rinderfußmodell vollzogen. Während der Laserbehandlung wurde Licht der Wellenlänge 980 nm über einen Lichtwellenleiter mit planem Faserende und entsprechenden Kathetern in die Vene eingeführt.

Unmittelbar nach der jeweiligen Behandlung wurde sowohl der Zustand des Equipments als auch das In-situ-Gewebe makroskopisch beobachtet und dokumentiert. Danach wurde das Gewebe für histologische licht-mikroskopische Untersuchungen aufbereitet. Zusätzlich wurde unmittelbar vor der thermischen Behandlung die gespülte Vene auf den Behandlungssegmenten mittels endo-luminaler optischer Kohärenztomographie (OCT) untersucht. OCT-Querschnittsbilder und histologische Querschnittsbilder wurden korreliert und die beobachteten Effekte beschrieben.

Ergebnisse: Dieses Ex-vivo-Modell ermög-licht es erstmals reproduzierbare Bedingungen für den komplexen Behandlungsvorgang endo-luminaler Verfahren zu erstellen und damit die Voraussetzung zu wissenschaftlichen Arbeiten, z. B. der Applikation definierter Energie-dosierungen, zu schaffen. Die makroskopische Inspektion des Equipments belegt unter-schiedliche Grade von Karbonisierungen und Schädigungen sowohl an den Elektroden, den Lichtwellenleitern und den Kathetern.

Die standardisierte In-situ-Präparation des Radiofrequenz-behandelten Venengewebes zeigte nur Anzeichen einer Verhärtung, einer Verdickung der Gefäßwand und einer Verringerung des Gefäßlumens. Eine ent-sprechende Kontraktion konnte bereits während der Behandlung beobachtet werden. Endotheliales Gewebe zeigte eine Weiß-verfärbung. Infolge der Laserbehandlung konnten Blutgerinsel auch im perivaskulären Bindegewebe und transmurale thermische Schäden festgestellt werden. Longitudinale Eröffnung der Gefäße legten karbonisierte Bereiche und komplette Perforationen der Gefäßwand frei.

Präinterventionell endovenös durchgeführte OCT-Querschnitts-Untersuchungen machen die Schichtung der Gefäßwand sichtbar. OCT und Histologie an unbehandelten Gewebe-abschnitten weisen die gleichen Strukturen auf (Abb. 2). Die Intima (Abb. 2, I) und die

Gefäßchirurgie und Phlebologie 11

Lamina elastica interna repräsentieren den ersten Reflex des OCT-Bildes. Neben Venenklappen-Strukturen (Abb. 3) und den Abzweigungen von Venenästen stellt sich eine unbeschädigte Intima dar. Die Media (Abb. 2, M) stellt sich im OCT-Querschnittsbild als eine inhomogene Schicht mit wechselnden Reflexen dar, welche als fibröse Strukturen der Kollagen und Elastin-Fasern interpretiert werden können. Der Übergang von Media zur Adventitia (Abb. 2, A) stellt sich als kreisförmiger reduzierter Reflexbereich (Abb. 2, Pfeile) dar. Aufgrund der limitierten optischen Eindring-tiefe des OCT-Lichts und wegen der Gewebestreuung, ist eine Unterscheidung von Adventitia und perivaskulären Strukturen nicht möglich.

Abb. 2: Vergleich von HE-Schnitt (links) und OCT-Bild (rechts) einer unbehandelten Vene mit deutlichem Übergang von Media zur Adventitia.

Abb. 3: Vergleich von OCT-Bild und HE-Schnitt einer RF-behandelten Vene mit Venenklappen und deutlicher zirkumferentiell gleichmäßiger Schädigung (Verdickung der Media).

Während die Behandlung mittels Radio-frequenz (Abb. 3) in einer gleichmäßigen zirkumferentiellen Verdickung der Media resultiert, werden nach Laserbehandlung (Abb. 4) lokal umschriebenen einseitigen

Schädigungen unschiedlichen Grades bis hin zur Perforation mit Karbonisierung und Koagulation erzeugt.

Abb. 4: Vergleich von OCT-Bild und HE-Schnitt einer Laser-behandelten Vene mit Perforation, Karbonisierung und zirkumferentiell ungleichmäßiger Schädigung.

Die endovenöse Applikation von Radiofrequenz- oder Laser-Energie erzeugt nicht nur die hier vorgestellten Akut-Effekte. Vielmehr werden Restrukturierungs- und Reparaturprozesse induziert, welche in der Heilungsphase einen kompletten Verschluss der Vene nach sich ziehen. Untersuchungen zu derartigen Mechanismen sind allerdings nur in der In-vivo-Situation möglich. Mit diesem Ex-vivo-Modell sind nur akute und direkte Gewebeveränderungen nachweisbar.

Die vorliegenden Ex-vivo-Erfahrungen belegen, dass die Methode der endovenösen Lasertherapie modifiziert werden sollte, um eine kontrollierte zirkumferentielle Schädigung der Gefäßwandschichtung zu erzielen ohne jedoch transmurale oder perivaskuläre Strukturen zu beeinflussen. Das Ex-vivo-Modell ist für diese Art der Optimierung eines Behandlungsverfahrens hinreichend geeignet, an dem reproduzierbare wissenschaftliche Basisuntersuchungen durchgeführt werden. Die optische Kohärenztomographie erweist sich bei diesen Studien als eine praktische und zeitsparende Bewertungsmethode in Verbindung mit der Histologie.

R. Blagova 1, C. Burgmeier 1, S. Steckmeier 1, B. Steckmeier 1, O.A. Meissner 2, U. Müller-Lisse 2, M. Barbaryka 3, K. Hunger 3, T.J. Beck, V. Hecht, C.G. Schmedt 1, R. Sroka

Koop.: 1 Chirurgische Klinik, Abt. für Gefäßchirurgie und Phlebologie, 2 Institut für Klinische Radiologie, 3 Pathologisches Institut, Klinikum der Universität München.


Basisuntersuchungen zu thermischen Effekten an Venengewebe

Einführung: Die endoluminale thermische Behandlung einer insuffizienten Vena saphena magna (Varikosis, Krampfader) ist Bestandteil von Studien innovativer klinischer Behandlungsoptionen. Obwohl bereits Systeme zur endoluminalen Wärmeinduktion mittels Radiofrequenz oder Laser zur Verfügung stehen, ist über die grundlegenden Prozesse während der Behandlung wenig bekannt.

Ziel dieser Untersuchung war es, eine definierte Wärmebehandlung von Venen-gewebe durchzuführen und den Einfluss auf die mechanischen Eigenschaften des Gewebes zu studieren.

Material und Methoden: Zu diesem Zweck wurden Venen des Ex-vivo-Rinderfußmodells explantiert, in 5 cm lange Teilstücke zerkleinert und deren Lumendurchmesser und Gefäß-wandstärke gemessen. Danach wurden die Proben einzeln in ein Wärmebad mit konstanter Temperatur (65°C < T < 85°C) für eine festgelegte Dauer (15 s < t < 300 s) getaucht. Unmittelbar nach der Wärmebehandlung wurden die geometrischen Messungen wieder-holt und die Veränderungen ermittelt. In einer zweiten Versuchsserie wurde natives und im Wärmebad erwärmtes Gewebe in eine Zugvorrichtung gespannt, um die Elastizität und den dafür maximalen Kraftaufwand für das jeweilige Venengewebe zu bestimmen.

Abb. 1: 5 cm Venengewebe nativ (oben) vor und nach der Wärmebehandlung (Wärmebad für 30 s bei 85°C).

Ergebnisse: Die Erwärmung von Venen-gewebe erzeugt eine Schrumpfung in der Länge von bis zu 35% (Abb. 1). Eine ähnliche Schrumpfung ist auch bei dem äußeren Venendurchmesser zu beobachten, wohingegen die Venenwandstärke auf fast 140% ansteigt. Zusätzlich ist eine Weißverfärbung als Anzeichen des Koagulationsprozesses des Gewebes zu beobachten. Der Tastbefund weist auf eine Zunahme der Rigidität hin. Die elastische Streckfähigkeit reduziert sich durch die Behandlung von 40 mm im nativen auf 20 mm im denaturierten Zustand. In gleicher Weise steigt die Kraft, ab der Rupturen auftreten, von 60 N auf 120 N (Abb. 2).

Abb. 2: Venengewebe beim Elastizitätstest in der Zugvorrichtung.

Zusammenfassung: Anhand dieser Unter-suchungen wird deutlich, dass die mechanischen Eigenschaften aufgrund des thermischen Einflusses verändert werden. Klinische Beschreibungen von Zugschmerzen nach einer entsprechenden Behandlung könnten auf der Basis dieser Erkenntnisse erklärt werden. Eine Optimierung des klinischen Behandlungsprotokolls kann mit diesen Hinweisen und Daten erfolgen.

C. Burgmeier, B. Steckmeier 1, M. Barbaryka 2, K. Hunger 2, T.J. Beck, V. Hecht, C.G. Schmedt 1, R. Sroka

Koop.: 1 Chirurgische Klinik, Abt. für Gefäßchirurgie und Phlebologie, 2 Institut für Pathologie, Klinikum der Universität München.

Gynäkologie 13

Detektion von Lymphknotenmetastasen beim Ovarialkarzinom

Einführung: Eine schonende Entfernung der nur wirklich von Tumor befallenen Lymph-knoten könnte Patientinnen mit Ovarial-karzinom erhebliche Nebenwirkungen er-sparen. Dies setzt die sichere Erkennung positiver Lymphknoten voraus. Dies wurde an einer Patientin durch Einsatz der Fluoreszenz-detektion mit 5-ALA getestet.

Material und Methoden: 5-ALA (medac, Hamburg) wurde oral in einer Dosis von 10 mg/kg Körpergewicht in Mineralwasser verabreicht. Nach 6 Stunden wurde mit einem Fluoreszenzlaparoskop (Storz, Tuttlingen) im eröffneten Abdomen nach fluoreszenzpositiven Arealen gesucht. Verdächtige Stellen wurden über die Endoskopoptik und einen Strahlteiler auch spektroskopisch untersucht. Ent-nommenes Gewebe wurde ex situ bildgebend und spektral auf PPIX-Fluoreszenz untersucht und ein Teil davon anschließend in einem Fluoreszenzmikroskop.

Ergebnisse: Intraperitoneale Metastasen des voroperierten Ovarialkarzinoms konnten weder mit Standard-Weißlichtendoskopie noch mit Fluoreszenzendoskopie nachgewiesen werden. Multiple Biopsien waren alle negativ. Es fanden sich jedoch mehrere fluoreszenzpositive Lymphknoten. Die Fluoreszenz der positiven Lymphknoten war bereits durch die Kapsel und dünnes überliegendes Fett- und Bindegewebe sichtbar (Abb. 1). Die Spektraldetektion zeigte eindeutig die für PPIX typische Fluoreszenz. Der histopathologische Befund bestätigte die Infiltration der fluoreszenzpositiven Lymph-knoten mit Ovarialkarzinomzellen. Auch im fluoreszenzmikroskopischen Bild zeigten die befallenen Anteile der Lymphknoten selektive und starke PPIX-Fluoreszenz (Abb. 2).

Abb. 1: links Grün- (Autofluoreszenz) und rechts Rotkanal (PPIX-Fluoreszenz) eines infiltrierten Lymphknotenpakets unmittelbar nach chirurgischer Entfernung.

Abb. 2: links Grün- (Autofluoreszenz) und rechts Rotkanal (PPIX-Fluoreszenz) eines infiltrierten Lymphknotens unter dem Fluoreszenzmikroskop (Gefrierschnitt).

Diskussion: Das klinische Erscheinungsbild befallener Lymphknoten reicht von leicht palpablen vergrößerten Knoten bis hin zu unauffälligen Knoten, in denen erst die Mikroskopie einen Befall nachweisen kann. In der Hoffnung, durch eine radikale Entfernung aller infrage stehender Lymphknoten eine Überlebenszeitverlängerung zu erzielen, findet häufig eine exzessive Resektion statt. Der klinische Vorteil ist mehr als fraglich, die Nebenwirkungen erheblich. Eine Methode, die sensitiver als die Palpation einen Lymph-knotenbefall bereits intraoperativ anzeigen bzw. ausschließen könnte, ist daher von großem Interesse.

Überraschenderweise war die PPIX-Fluores-zenz fluoreszenzendoskopisch bereits durch die intakte Lymphknotenkapsel hindurch sichtbar. Damit erscheint eine fluoreszenzgestützte Identifizierung positiver Lymphknoten durch-aus viel versprechend. Da eine radioaktive Markierung zur Aufspürung der Schildwächter-Lymphknoten nach der sentinel-Technik beim Ovarialkarzinom kaum praktikabel ist und damit nicht zur Verfügung steht, eröffnet die ALA-gestützte Fluoreszenztechnik hier vielleicht den einzigen Weg, bereits intra-operativ ausreichend zuverlässig den Befall-status abschätzen zu können.

P. Hillemanns 1,2, J. Reiff 1, P. Soergel 2, H. Stepp

Koop.: 1 Gynäkologische Klinik, Klinikum der Universität München; 2 Frauenklinik, MH Hannover.


Intrinsische Autofluoreszenzspektroskopie zur Tumordetektion in der Mundhöhle

Einführung: Mit der im Bericht auf Seite 32 beschriebenen Apparatur wurden Messungen an Karzinomen und Normalgewebe in der Mundhöhle vorgenommen. Damit sollte unter-sucht werden, welche Anregungswellenlänge die beste Diskriminierung zwischen gut- und bösartigem Gewebe erlaubt, und ob die Ver-rechnung der Originalspektren zu intrinsischen Spektren zu einer Verbesserung der Ergebnisse führt.

Material und Methoden: Die gewählten Anregungswellenlängen entsprechen den Anre-gungsmaxima der gewebeeigenen Fluorophore Tryptophan, NADH, FAD und Porphyrine. Da nur in einem Fall Spuren von Porphyrinen im Originalspektrum erkennbar waren, erfolgte hier keine weitere Auswertung. Bei allen ande-ren Spektren wurde die Intensität im Maximum des Original- bzw. des intrinsischen Spektrums gegen den histologischen Befund aufgetragen. Durch eine Auswertung der „area under curve“ (AUC) einer Auftragung der „receiver operator characteristic“ (ROC, entspricht Spezifität gegen 1 minus Sensitivität) wurde die Aussage-qualität der Verfahren verglichen. Dabei wurde auch der von de Veld et al. (Las. Surg. Med. 36, 2005) vorgeschlagene vereinfachte Algo-rithmus einer einfachen Division des Fluores-zenzspektrums durch das Remissionsspektrum mit untersucht. Die Messungen konnten an ins-gesamt 22 Patienten und 7 freiwilligen Proban-den ohne Tumor durchgeführt werden.

Ergebnisse und Diskussion: Abb. 1 zeigt die Intensitätsmaxima aus den Originalspektren für die Anregungsmodi Tryptophan, NADH und FAD. Abb. 2 ist die entsprechende Darstellung für das intrinsische Spektrum im NADH-Mo-dus. Der Tryptophanmodus liefert die eindeutig schlechtesten Ergebnisse, der T-Test ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen Tumor- und Normalgewebsmessungen. Die beste Diskriminierbarkeit ergibt sich für den NADH-Modus. Durch die Berechnung intrin-sischer Spektren ergeben sich individuelle Verschiebungen der Messwerte und eine leichte Verbesserung der Diskriminierbarkeit. Dies wird auch in der Gegenüberstellung der AUC-Werte deutlich (Tab. 1). Hier ergibt sich eine erheblich schlechtere Diskriminierung für den vereinfachten Algorithmus nach de Veld.

Obwohl die Anregungswellenlängen auf die genannten Gewebefluorophore abgestimmt sind, besteht eine Überlagerung mit der

Fluoreszenz von Kollagenen, Elastin und Lipoproteinen.

Patientennummer1 4 5 181927 2 3 7 9 10141720212329 6 8 16222811121315242526

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GesundeProbanden

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Abb. 1: Maxima der Rohspektren in den Anregungsmodi Tryptophan (oben), NADH (Mitte) und FAD (unten).


Rel

ativ

es In

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bodenGesundeProbanden

Abb. 2: Maxima der intrinsischen Spektren im Anregungs-modus NADH (vgl. mit Abb. 1, Mitte).

Roh de Veld Müller Tryptophan 0,61 0,49 0,56

NADH 0,97 0,85 0,99 FAD 0,90 0,89 0,93

Tab. 1: AUC-Werte der ROC-Auswertung der intrin-sischen Patientenspektren.

R. Pauli, H. Stepp, R. Sroka, R. Meier, C.S. Betz 1, M. Havel 1, A. Leunig 1, W. Assmann 2

Koop.: 1 HNO-Klinik, Klinikum der Universität München; 2 Lehrstuhl für Kernphysik, Universität München.

Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde 15

In-vitro-Untersuchung zur laserinduzierten Ablation von Nasen-Muschel-Gewebe

Einführung: Für die Laserbehandlung in der Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde werden unter-schiedlichste Laserwellenlängen genutzt. Neben den bekannten Standard-Systemen der Lichtwellenleiter-geführten Strahlung von Nd:YAG- und Ho:YAG-Lasern wird der Einsatz neuer kompakter Diodenlaser-Systeme mit verschiedenen Emissionswellenlängen immer populärer. Unter reproduzierbaren Testbedingungen wurde die Wechselwirkung dieser Laserstrahlung mit Gewebe vergleichend untersucht.

Material und Methoden: Fünf klinisch relevante Lasersysteme wurden verglichen, der Ho:YAG- (λ = 2080 nm), der Nd:YAG- (λ = 1064 nm) und drei verschiedene Diodenlaser (λ = 830, 940, 1470 nm). Das Laserlicht wurde zunächst punktförmig und dann in linearer Bewegung sowohl mit Gewebekontakt als auch im nicht-Kontakt appliziert. Die entsprechenden Lichtwellenleiter waren zu diesem Zweck an eine lineare Schrittmotoreinheit fixiert. Die Testgewebe bestanden aus schlachtfrischer Leber und Muskeln zur Simulation blutreicher und blutarmer Gewebearten. Das experimentelle Prozedere folgte einem strikten Protokoll hinsichtlich identischer emittierter Laser-leistung und reproduzierbarer Lichtapplikation (Applikationswinkel, Applikationsgeschwin-digkeit). Nach dem Experiment wurden die Ausmaße der thermischen Effekte auf dem Gewebe (Koagulation, Ablation, Karbonisa-tion) vermessen und dokumentiert.

Ergebnisse: In Abhängigkeit von der genutzten Wellenlänge entstanden unter-schiedliche Ausdehnungen der entsprechenden Gewebeeffekte. Nd:YAG- und Diodenlaser-strahlung (λ = 830, 940 nm) erzeugten in der

Gewebetiefe Koagulation und an der Oberfläche Karbonisierung. Diodenlaser-strahlung der Wellenlänge 1470 nm und Ho:YAG-Laserstrahlung erzeugten Ablations-krater bzw. Ablationsfurchen umgeben von einer breiten Koagulationszone.

Zusammenfassung: Laserbehandlung hyper-plastischer Nasenmuscheln mittels Ho:YAG-Laser bewirkt eine präzise und effektive Verminderung des Gewebes bei gleichzeitig guter Koagulation mit konsekutiver Hämostase. Bisherige In-vitro-Untersuchungen mittels 1470-nm-Diodenlaser zeigen vergleich-bare Effekte, so dass unter klinischem Gesichtspunkt eine ähnliche blutarme instantane Gewebereduktion erzielbar er-scheint. Im Vergleich dazu zeigen Nd:YAG-, 830-nm- und 940-nm-Diodenlaser eine rein thermische Koagulation, die tief ins Gewebe hineinreicht und somit innerhalb einer Abheilungsdauer von ca. 1 Woche eine zeitlich verzögerte Gewebereduktion bewirkt. Aus den In-vitro-Untersuchungen geht gleichfalls hervor, dass sich die Effekte bei Laserlicht-Applikationen im Kontakt-Verfahren erheblich von denen im Nicht-Kontakt-Verfahren unterscheiden. Somit sollten sich Laser-mediziner bewusst sein, dass sowohl die Laserlicht-Wellenlänge als auch der Laserlicht-Applikations-Modus die induzierten Gewebe-effekte und damit das Behandlungsergebnis maßgeblich beeinflussen.

M. Havel 1, C.S. Betz 1, P. Janda 1, B. Mundweil, W. Kunz, B. Grabowski, A. Leunig 1, R. Sroka

Koop.: 1 HNO-Klinik, Klinikum der Universität München.


In-vitro-Untersuchung zur Laser-Lithotripsie von Speichelgangssteinen

Einführung: Speichelgangssteine verlegen den Speichelgang, verursachen Entzündungen und behindern. Als therapeutische Maßnahmen stehen die chirurgische Explantantion, häufig mitsamt dem gesamten Speichelgang, elektrohydraulische Zertrümmerung oder extra-korporale Ultraschall-Stoßwellenlithotripsie zur Verfügung. Neueste Laser- und Endoskop-systeme motivieren, ein minimal-invasives Therapieverfahren zu entwickeln.

In dieser In-vitro-Studie wurden die Laserparameter von zwei unterschiedlichen Lasersystemen zur Fragmentierung von Speichelgangssteinen untersucht. In der urologischen Klinik zeigen bisher beide Lasersysteme eine gute Steinfragmentierungs-rate kombiniert mit nur einer geringen Gefahr der Schädigung benachbarten Weichgewebes. Hinsichtlich der Speichelsteinlithotripsie ist bisher keine Vergleichsuntersuchung unter reproduzierbaren Bedingungen bekannt.

Material und Methoden: Die Fragmen-tierungseffektivität der Laser wurde an 15 humanen Speichelgangssteinen unterschied-licher Größe und Zusammensetzung untersucht. Als Laser wurden der FREDDY-Laser (� = 532 nm und 1064 nm) mit Pulsenergien von 120 - 160 mJ/Puls mit dem Ho:YAG-Laser (� = 2100 nm) bei Pulsenergien zwischen 300 – 800 mJ/Puls verglichen. Das Licht wurde jeweils in einem Lichtwellenleiter (Kerndurchmesser: 230 µm) gekoppelt und zum Target geführt. Der jeweilige Stein befand sich unter Wasser auf einem Gitter mit rhombischer Maschenweite von 0,1 bis 0,3 mm (Abb. 1). Diese Steinfragmentgröße wird als spontan abgangsfähig angesehen. Für die Fragmentierung wurde der Lichtwellenleiter unmittelbar vor den Steinen positioniert (n = 8 FREDDY, n = 7 Ho:YAG). Die Frag-mentierungsrate wurde bestimmt durch den Quotienten aus der Masse der Steine, die kleiner als die Maschenweite sind, dividiert durch die applizierte Laserenergie. Die Steinzusammensetzung wurde per IR-Spektrometrie ermittelt. Zusätzlich wurde die Wechselwirkung der Laserstrahlung auf das

umliegende Gewebe, dem Speichelgang, histologisch untersucht.

��

��

�=J

mgEm

Zges

E0

Abb. 1: Experimenteller Aufbau zur Steinfragmentierung und Bestimmung der Fragmentierungsrate ZE.

Ergebnisse: Alle Steine bestanden hauptsächlich aus Carbonatappatit mit einem geringeren Anteil Protein. Der Proteinanteil variierte zwischen 5 - 25%. Beim Einsatz des Ho:YAG-Laser konnten sämtliche Steine in einer eher mahlenden Weise sanft zerstört werden (Fragmentierungsrate 0,2 - 1 mg/J). Im Gegensatz dazu erfolgte die Zerstörung mittels FREDDY-Laser sprengend explosiv und misslang in drei Fällen. Eine Abhängigkeit von der Steinzusammensetzung konnte bei dieser Stückzahl nicht belegt werden. Die Wirkung der gepulsten Laserstrahlung auf das Speichelganggewebe war für beide Laser-systeme auf die Mukosa beschränkt.

Zusammenfassung: Diese Studie belegt einerseits die unterschiedlichen Zerstörungs-prozesse der jeweiligen Lasersysteme. Obwohl beide Wellenlängen nur eine geringe Beschädigung am benachbarten Gewebe erzeugen, bleibt zu überprüfen, ob die explosiv beschleunigten Steinkompartimente im Falle des FREDDY-Lasers zusätzliche Neben-wirkung erzeugen. Diese In-vitro-Unter-suchungen motivieren in ausgewählten klinischen Fällen den Einsatz der laser-induzierten Speichelgangsteinlithotripsie.

V. Siedek 1, V. Hecht, M. Vogeser 2, A. Seweryn, C.S. Betz 1, A. Leunig 1, R. Sroka

Koop.: 1 HNO-Klinik, 2 Institut für Klinische Chemie, Klinikum der Universität München.

Kinderchirurgie 17

Photodynamische Therapie für kindliche Tumoren

Einführung: Die frühkindlichen Tumoren Hepatoblastom und Neuroblastom stellen den Chirurgen vor eine schwierige Aufgabe. Einer-seits müssen bei den kleinen Patienten die teil-weise infiltrativ wachsenden Tumoren so kom-plett wie möglich entfernt werden, andererseits sind die körperlichen Reserven dieser Kinder teilweise sehr beschränkt und die räumlichen Verhältnisse eng. So kommt es, je nach Entität derzeit in ca. 5-30% zu Rezidiven. Ausgehend von Zellkulturuntersuchungen an Monolayern und Sphäroiden und anschließend im Tier-versuch, soll in diesem Projekt das Potenzial einer Photodynamischen Therapie mit 5-Ami-nolävulinsäure untersucht werden. Das klini-sche Konzept besteht dabei in einer photodyna-mischen Nachbestrahlung der Resektionsrän-der. Durch die direkten phototoxischen Effekte und die indirekten immunstimulatorischen Effekte, die ebenfalls untersucht werden, soll verhindert werden, dass bei der Operation im Patienten verbliebene Tumorzellen für Rezidi-ve sorgen. Als „Nebenprodukt“ könnte eine intraoperative Fluoreszenzdiagnostik die Radi-kalität des Eingriffs erhöhen, während gleich-zeitig die Invasivität reduziert wird.

Material und Methoden: Bisher wurden Zellen der Linien HuH6 (Hepatoblastom) und NB11 (Neuroblastom) auf ihre photodynami-schen Eigenschaften im Vergleich zu Normal-zellen N1 (Fibroblasten) untersucht. Die Zellen wurden auf speziell beschichteten 96-well-Plat-ten ausgesät, 24-48 Stunden ankultiviert, mit variablen Zeitdauern und Konzentrationen von 5-ALA inkubiert. Vor und nach Bestrahlung mit einem 633-nm-Diodenlaser erfolgte eine Vermessung der Fluoreszenz in einem automa-tisierten Fluoreszenzreader. Die phototoxische Wirkung auf die Zellen wurde mit Hilfe eines Vitalitätstests (Cell-Titer-Blue) quantifiziert.

Ergebnisse und Diskussion: Abb. 1 zeigt für die Normalzelllinie N1 (Monolayer) eine signi-fikant niedrigere Fluoreszenzintensität als für die Tumorzellen unter gleichen Inkubations-bedingungen. Ein Ausbleichen der Fluoreszenz bei der Normalzelllinie wird erst nach etwa 4 J/cm² erkennbar. Bei dieser Lichtdosis sind die HuH6-Zellen, die die höchste Ausgangs-fluoreszenz zeigten, bereits vollständig zerstört (Abb. 2). Die NB11-Zellen erreichen nach etwa 2 J/cm² eine Vitalitäts-reduktion um ca. 50%, während die N1-Zellen erst oberhalb von 6 J/cm² erkennbar reagieren. Gleichzeitig wird bei dieser Zellinie der synthetisierte Photo-sensitizer durch die Bestrahlung zerstört (die Fluoreszenz bleicht aus). Spätestens nach

10 J/cm² ist bei den N1-Normalzellen das Ausbleichen vollständig erfolgt (Abb. 1) und es tritt dann auch keine weitere Vitalitätsabnahme mehr auf (Abb. 2). Es verbleibt ein vitaler Zell-anteil von etwa 30% unter den gewählten Inkubationsbedingungen. Die beiden Tumor-zelllinien zeigen im Gegensatz dazu eine Vitalitätsabnahme bereits bei Lichtdosen, die noch nicht zu einem signifikanten Ausbleichen führen.

Lichtdosis [J/cm²]0.2 0.4 0.6 1 2 4 6 10 20 40

Flu

ores

zenz

inte

nsitä

t [re

l. E

.]

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

N1

NB11

HuH6

vor

Abb. 1: Relative Fluoreszenzintensität der angegebenen Zellinien nach 4 Stunden Inkubation mit 150 µg/ml 5-ALA vor Bestrahlung und nach Bestrahlung in Abhängigkeit von der applizierten Lichtdosis. Fehlerbalken = 1 Standardab-weichung.

Lichtdosis [J/cm²]0.2 0.4 0.6 1 2 4 6 10 20 40

rel.

Vita

lität

[% K

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lle]

0

20

40

60

80

100

N1NB11

HuH6

Abb. 2: Relative Vitalität der identisch wie in Abb. 1 inkubierten Zellen in Abhängigkeit von der applizierten Lichtdosis.

Die bisher durchgeführten Untersuchungen zei-gen die erwünschte differenzielle Anreicherung des Photosensibilisators zwischen Tumor- und Normalzelllinie. Die erzielbare Phototoxizität verhält sich entsprechend der induzierbaren Photosensibilisatorkonzentration ebenfalls tu-morselektiv. Damit besteht die Aussicht, diese frühkindlichen Tumoren durch Verabreichung von 5-ALA suffizient und mit deutlichem Kontrast zur Umgebung photosensibilisieren zu können.

Die Ergebnisse werden zukünftig mit anderen sinnvollen Inkubationsbedingungen und durch Untersuchungen an Zellsphäroiden zu unter-mauern sein.

M. Heide, H. Stepp, F. Bergmann 1, H. Till 2

Koop.: 1 Kinderchirurgie, Klinikum der Universität München; 2 Kinderchirurgische Klinik, Uniklinik Leipzig.

Förderung: PDT kindlicher Tumoren, DFG.


Klinische Phase-I/II-Studie zur Photodynamischen Therapie von malignen Gliomen nach fluoreszenzgestützter Resektion

Einführung: Maligne Gliome, darunter das Glioblastoma multiforme, sind die häufigsten Tumoren des Gehirns. Das Glioblastom ist der dabei prognostisch ungünstigste Tumor. Es tritt mit einer Inzidienz von 2 - 3 Neuerkrankungen pro Jahr und 100.000 Einwohner auf. Die gegenwärtig übliche Therapie einer operativen Entfernung des Tumors mit anschließender Strahlentherapie gefolgt von einer Chemo-therapie mit Temozolamid führt zu einer mittleren Überlebenszeit von 15 Monaten. Die Ursache für diese schlechte Prognose sind Tumorrezidive, die ausgehend vom Rand der Resektionshöhle das umliegende gesunde Gewebe infiltrieren. Diese Rezidive lassen sich aufgrund des Risikos schwerer neurologischer Störungen nur selten chirurgisch entfernen. Die Photodynamische Therapie mit 5-Amino-lävulinsäue (5-ALA) stellt eine lokale, nicht-chirurgische Methode dar, die als adjuvante Therapie unmittelbar nach der Operation angewandt die Überlebenszeit der Patienten ohne schwerwiegende Nebenwirkungen ver-längern könnte. Dazu wird dem Patienten 5-ALA verabreicht, das sich in den Tumorzellen anreichert und dort in den Photosensibilisator Protoporphyrin IX (PPIX) umgewandelt wird. Bei einer anschließenden Bestrahlung der Resektionshöhle mit rotem Laserlicht der Wellenlänge 633 nm werden Zellgifte freigesetzt, die aufgrund der Tumorselektivität von 5-ALA nur den Tumor und nicht das gesunde Gewebe schädigen.

Material und Methoden: Die operative Entfernung des Tumors erfolgte unter Fluoreszenzkontrolle. Anschließend wurden nicht entfernbare fluoreszierende Bereiche mit Resttumor bestrahlt. Dazu wurde ein Mikrolinsenstrahler am Ende eines Lichtleiters verwendet, der eine homogen ausgeleuchtete, kreisförmige Bestrahlungsfläche liefert. Der erforderliche Durchmesser dieser Bestrahlungs-fläche wurde über den Abstand zum Gewebe eingestellt. Die Laserleistung wurde so eingestellt, dass sich auf der Bestrahlungs-fläche eine Bestrahlungsstärke von 200 mW/cm2 ergab. Jeweils sieben Patienten wurden mit einer Lichtdosis von 100, 150 und 200 J/cm2 bestrahlt.

Bei der Photodynamischen Therapie kommt es durch die Einwirkung des Lichts neben der Zerstörung von Tumorzellen auch zum Ausbleichen des Photosensibilisators PPIX. Im Rahmen dieser Studie sollte untersucht werden,

inwieweit dieses so genannte Photobleaching zu einer dosimetrischen Analyse dienen kann.

Ergebnisse: Das Ausbleichen von PPIX wurde über die Abnahme des Fluoreszenzsignals während der Bestrahlung gemessen. Abb. 1 zeigt die entsprechenden Veränderungen des Fluoreszenzspektrums von PPIX.

Abb. 1: Abnahme des Fluoreszenzsignals bei 635 nm während der Bestrahlung. Das Signal wurde auf den Peak des Anregungslichtes bei 450 nm normiert.

In Abb. 2 ist die Restfluorenszenz nach Beendigung der Bestrahlung in Prozent des Ausgangssignals in einem Boxplot für die drei Dosisgruppen dargestellt. Bei einer Dosis bis 150 J/cm2 sind noch bis zu 20% von PPIX erhalten. Bei 200 J/cm2 wird das PPIX fast vollständig ausgeblichen. Dies ist ein Hinweis darauf, dass 200 J/cm2 eine ausreichende Lichtdosis für die Therapie darstellt.

D o s e le v e l

1 0 0 J /c m ² 1 5 0 J /c m ² 2 0 0 J /c m ²Per

cent

age

of P

PIX

-sig

nal l

eft a

fter P

DT

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

3 0

Abb. 2: Box-Plot des nach PDT verbleibenden Fluoreszenzsignals in Prozent des Ausgangssignals.

Ein weiteres Ziel der Untersuchung war die Analyse des Patientenzustands als Folge von Operation und PDT. Dazu wurde die Leistungsfähigkeit und das Befinden der Patienten über den Karnofsky-Index KPS charakterisiert. Für die Beurteilung der neurologischen Funktionen wurde zusätzlich der NIH-stroke-Index herangezogen. Weder beim NIH-stroke-Index noch beim KPS wurden signifikante Veränderungen beo-

Neurochirurgie 19

bachtet. Beim KPS wurde eine gewisse nicht signifikante Verschlechterung beobachtet, die jedoch im Rahmen dessen blieb, was auch ohne PDT zu erwarten gewesen wäre.

Abb. 3: Anteil der Patienten mit progressionsfreiem Überleben nach OP mit PDT für die verschiedenen Lichtdosisgruppen.

Um erste Hinweise auf die Wirksamkeit der Therapie zu erfassen, wurden die progres-sionfreie Überlebenszeit, beurteilt anhand des Kernspinbefunds, sowie das Überleben der Patienten insgesamt anhand von Kaplan-Meier-Kurven ausgewertet. Zum Zeitpunkt der Erstellung dieses Berichts betrug der Median der progressionsfreien Zeit in den Gruppen 100 und 150 J/cm2 8,2 bzw. 13,2 Monate (Abb. 3). Der Median der progressionsfreie Zeit in der Gruppe mit 200 J/cm2 war zum Zeitpunkt der Analyse mit einer maximalen Nach-beobachtungszeit von 9 Monaten noch nicht erreicht. Das zum Zeitpunkt der Analyse beobachtete Überleben insgesamt betrug bei 100 und 150 J/cm2 im Median 13,8 bzw. 15,3 Monate (Abb. 4). Auch hier wurde bei 200 J/cm2 der Median noch nicht erreicht.

Abb. 4: Anteil der insgesamt überlebenden Patienten, für die verschiedenen Lichtdosisgruppen.

Zusammenfassung: Es wurde die Verträglichkeit der PDT nach Resektion von malignen Gliomen untersucht. Weder die Analyse NIH-stroke-Index noch die des KPS-Index ergab Rückschlüsse auf signifikante Nebenwirkungen. Insbesondere wurden keine PDT-bedingten Nebenwirkungen beobachtet.

Die Untersuchungen zur Wirksamkeit der PDT konnten noch nicht abgeschlossen werden. Die bislang erfassten Überlebenszeiten erwiesen sich als sehr günstig. Aufgrund der kurzen Nachbeobachtungszeit wurde das mittlere Überleben in der Gruppe mit der höchsten Lichtdosis von 200 J/cm2 bislang noch nicht erreicht. Im Vergleich hierzu liegt z. B. das mittlere Überleben bei rezidivierenden malignen Gliomen, die mit Temodal behandelt wurden, für Patienten mit malignen Gliome des Grades III bei 49 Wochen und bei Grad IV, d. h. Glioblastomen, bei 32 Wochen.

T.J. Beck, T. Pongratz, H. Stepp, W. Beyer, T. Meinel 3, C. Götz 1, W. Stummer 2

Koop.: 1 Neurochirurgische Klinik, Klinikum der Uni-versität München; 2 Neurochirurgische Klinik, Uni-versitätsklinikum Düsseldorf; 3 Clinstud GmbH.

Förderung: Deutsche Krebshilfe (70-2864).


Interstitielle Photodynamische Therapie des rezidivierenden Glioblastoms

Einführung: Das Glioblastom (glioblastoma multiforme) ist der häufigste und bösartigste Gehirntumor beim Menschen. Das mittlere Überleben der Patienten beträgt trotz mehrerer Therapiemöglichkeiten nur etwa 15 Monate, nach einem Rezidiv im Median nur etwa 7 Monate. Eine mögliche Alternative stellt die Photodynamische Therapie (PDT) mit 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) dar, die derzeit in klinischen Studien untersucht wird. Dabei wird dem Patienten die Substanz 5-ALA verabreicht, die selektiv in den Tumorzellen zu dem Photosensibilisator Protoporphyrin IX (PPIX) umgewandelt wird. Bei einer anschließenden Bestrahlung mit Licht geeigneter Wellenlänge werden Zellgifte freigesetzt, die gezielt den Tumor schädigen. Die Eindringtiefe des bei der PDT üblicherweise verwendeten roten Lichts in Gehirngewebe beträgt jedoch nur wenige Millimeter, so dass eine äußerliche Bestrahlung nur zu einem oberflächlichen Effekt führt.

Bei der interstitiellen Photodynamischen Therapie (iPDT) wird dieses Problem durch die Positionierung mehrerer Lichtdiffusoren im Inneren des Tumors umgangen. Auf diese Weise kann überall im Tumorvolumen eine ausreichende Lichtdosis erzielt werden.

Im folgenden wird über die klinische Umsetzung dieser neuen Behandlungsform und erste Ergebnisse einer Machbarkeitsstudie berichtet.

Material und Methoden: Insgesamt wurden im Rahmen dieser Machbarkeitsstudie 10 Patienten mit einem Rezidiv mit der iPDT behandelt. Die Tumorgröße sollte vor der Therapie einen Durchmesser von 3 cm nicht überschreiten. Den Patienten wurde 20 mg/kg Körpergewicht 5-ALA oral verabreicht.

Die Lichtapplikation erfolgte mit vier bis sechs dünnen, zylindrisch abstrahlenden Licht-diffusoren mit strahlenden Längen von 20 und 30 mm jeweils am Ende eines Lichtleiters. Als Lichtquelle diente ein Diodenlaser mit einer Lichtleistung von 4 W bei einer Wellenlänge von 633 nm. Das Licht wurde mittels eines eigens entwickelten Strahlteilers mit variablem Teilungsverhältnis auf alle Lichtdiffusoren verteilt.

Die Lage der Lichtleiter im Tumor wurde vor dem Einführen mit Unterstützung einer speziellen Planungssoftware festgelegt. Sie ermöglichte es, aktuelle CT- und MR-Bilder

des Patienten zu fusionieren, den kontrast-mittelanreichernden Tumoranteil zu markieren und die Position der Lichtleiter im Tumorareal 3-dimensional zu visualisieren. Die Licht-diffusoren wurden mit einem seitlichen Abstand von etwa 9 mm positioniert, um einerseits eine signifikante Temperatur-erhöhung im Gewebe zu vermeiden und andererseits eine Mindestbestrahlungsstärke im Tumor zu gewährleisten. Ferner wurde darauf geachtet, dass der Abstand der einzelnen Diffusoren zum Tumorrand 3 mm nicht überschreitet, um eine Mindestdosis am Rand des Bestrahlungsvolumens zu erreichen. Diese Vorgaben resultierten aus den Ergebnissen von Computersimulationen der Lichtverteilung in Gehirngewebe.

Abb. 1: Die Lichtleiter werden über metallische Führungs-hülsen in den Tumor eingeführt.

Zur Umsetzung der Planung und zum Platzieren der Lichtdiffusoren im Situs, diente ein modifiziertes Riechert-Stereotaxie-System. Die dafür notwendigen Systemkoordinaten konnten ebenfalls mit dem Planungsprogramm berechnet werden. Für jeden Lichtdiffusor wurde ein eigenes Bohrloch gesetzt. Dies ermöglichte ein schnelles und genaues Platzieren der Lichtleiter und eine stabile Positionierung, da jeder Lichtdiffusor durch den Schädel zusätzlich fixiert wurde (siehe Abb. 1).

Die Bestrahlung erfolgte mit 200 mW/cm in der strahlenden Zone jedes Diffusors und einer Bestrahlungszeit von einer Stunde. Dadurch ergab sich eine applizierte Lichtdosis von 720 J/cm.

Ergebnisse und Diskussion: Im Rahmen der vorliegenden Machbarkeitsstudie konnten 10 Patienten mit Rezidiven des Glioblastoms behandelt werden. Die klinische Umsetzung der Therapieform konnte ohne größere

Neurochriurgie 21

Schwierigkeiten mit zunehmender Routine erfolgen. Durch die Bestrahlung von Tumoren unterschiedlicher Größe (2,1 - 10,2 cm3) und durch das Einhalten der Mindestabstände, kamen 4 - 6 Lichtdiffusoren zum Einsatz. Entsprechend der Anzahl der Lichtdiffusoren und deren aktiven Länge ergaben sich für die gesamte applizierte Dosis Werte zwischen 4320 und 11520 J (siehe Tab. 1).

Nr. KPS vor OP

Tumor- volumen

[cm³]

Licht-dosis [J]

Über-leben

[Monate]

1 100 6.9 7200 49

2 80 4.8 5700 4

3 90 4.5 7500 11

4 90 2.1 4320 32

5 90 6.3 6600 7

6 100 10.2 11520 5

7 80 9.9 10080 39

8 90 2.9 4800 27

9 80 9.2 8640 17

10 90 2.5 5760 13

Tab. 1: Tabelle mit den relevanten Bestrahlungs-parametern der Patienten und deren Überleben.

Ein Untersuchungsziel dieser Studie war es, mögliche Nebenwirkungen der iPDT mit 5-ALA-induziertem PPIX aufzudecken und zu bewerten. Dazu wurden die behandelten Patienten sowohl direkt nach der Therapie als auch zu späteren Zeitpunkten regelmäßig untersucht. Eine der wichtigsten Unter-suchungen stellte das MRT dar, mit dem sowohl mögliche induzierte Gehirnödeme als auch therapieinduzierte Veränderungen im Tumorvolumen dargestellt werden konnten. Bei keinem der Patienten konnte nach der iPDT ein Gehirnödem festgestellt werden und auch sonst gab es keine relevanten Nebenwirkungen der Therapie. Des Weiteren zeigten die frühen MR-Bilder bei allen Patienten ein vorübergehendes Verschwinden der Kontrast-

mittelanreichung im Tumorvolumen, was auf einen positiven therapeutischen Effekt durch die Behandlung hinweist.

Months

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50S

urvi

val [

%]

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Abb. 2: Anteil der überlebenden Patienten nach iPDT.

In Abb. 4 ist der Anteil an überlebenden Patienten in Monaten nach der Behandlung aufgetragen. Die 1-Jahres-Überlebensrate betrug 60% und der Median des Überleben 15 Monate. Vier Patienten lebten länger als 24 Monate und zwei leben derzeit noch. Beim jeweils letzten Follow-Up der Patienten betrug der Karnofsky-Index über 80.

Zusammenfassung: Die stereotaktisch durchgeführte interstitielle Photodynamische Therapie (iPDT) stellt ein sicheres Behandlungsverfahren für Patienten mit Rezidiven des Glioblastoms dar. Durch das minimal invasive Einführen der Licht-diffusoren und die Verwendung eines tumorselektiven Photosensibilisators konnten therapiebedingte Schädigungen des gesunden Normalgewebes und andere Nebenwirkungen, wie Ödembildungen, vermieden werden. Die Wirksamkeit der Therapie wird derzeit in einer multizentrischen klinischen Phase-I/II-Studie an 15 Patienten evaluiert.

T.J. Beck, F.W. Kreth 1, H. Stepp, W. Beyer, J.H. Mehrkens 1, W. Stummer 2

Koop.: 1 Neurochirurgische Klinik, Klinikum der Uni-versität München; 2 Neurochirurgische Klinik, Uni-versitätsklinikum Düsseldorf.

Förderung: Flügge, Tobias J. Beck.


Nachweis von männlichen Nervenzellen im Gehirn weiblicher Knochenmarksempfängerinnen

Einführung: Bei der Therapie von Leukämie-Patienten wird häufig eine Knochenmark-transplantation durchgeführt, nachdem zuvor das eigene erkrankte blutbildende System durch Chemo- oder Strahlentherapie möglichst weitgehend zerstört worden ist. Mit dem Knochenmark des Spenders erhält der Patient neue blutbildende Stammzellen, aus denen prinzipiell auch nichthämatopoietische Zellen wie z. B. Nervenzellen hervorgehen können. Dies wurde in Tierversuchen bereits gezeigt.

Sollte dies in größerem Umfang auch beim Menschen der Fall sein, bestünde die Chance, zerstörtes Gewebe, z. B. nach einem Schlag-anfall ersetzen zu können. Dies würde erfor-dern, dass die verabreichten blutbildenden Stammzellen durch die Blutgefäße wandern, am Ort der Verletzung zu Nervenzellen (Neu-ronen) ausdifferenzieren und dabei auch die korrekte Funktion übernehmen.

Ob eine Neurogenese aus Knochenmark beim Menschen stattfindet, lässt sich überprüfen, indem man das männliche Y-Chromosom als natürlichen Marker verwendet. Hierzu untersucht man das Gehirn von Frauen, die zuvor von einem männlichen Spender wegen einer hämatologischen Grunderkrankung Knochenmark erhalten haben. Alle Y-Chromosom-haltigen Nervenzellen im Gehirn dieser Patientinnen müssen vom Knochenmark des männlichen Spenders stammen.

Material und Methoden: Aus einer Autopsie-Datenbank konnten 7 geeignete Präparate identifiziert werden. Die Gewebeschnitte wur-den verschiedenen Färbeverfahren unterzogen, um den neuronalen Ursprung (immunhistoche-misch, NeuN, DAB-Braunfärbung), die Kerne (Propidium-Jodid, Rotfluoreszenz, bzw. DAPI, Blaufluoreszenz) und das Y-Chromosom (In-situ-Hybridisierung, Spectrum-Green, Grün-fluoreszenz). Die Beurteilung erfolgte mit zur Deckung gebrachten digitalen Aufnahmen mit dem Lichtmikroskop (braune Neuronenfär-bung), Fluoreszenzmikroskop (Identifizierung „interessanter“ Zellen über die Kern-assoziierte Grünfluoreszenz) und konfokalen Laser-Scan-ning-Mikroskop (3-dimensionale Darstellung der vorselektierten Zellkerne). Mit der konfokalen Mikroskopie gelang auch eine eindeutige spektrale Differenzierung des Y-Chromosom-Signals von gewebeeigener Grünfluoreszenz (v. a. Lipofuscin).

Ergebnisse und Diskussion: Bei Kontroll-untersuchungen konnten Y-Chromosom-Signale bei nichttransplantierten weiblichen Präparaten in keinem Fall nachgewiesen werden, während erwartungsgemäß in männlichen Kontrollen fast alle Zellkerne ein Y-Signal aufwiesen.

In allen 7 Test-Proben konnten Y-Signale - oft perivaskulär - identifiziert werden, allerdings meist nicht in Kernen von als Neuronen identifizierten Zellen. Der Nachweis Y-haltiger Neuronen gelang nur bei 3 Patientinnen (Beispiel: Abb. 1), die als einzige eine Graft-versus-Host-Reaktion entwickelt hatten und bei denen entzündliche Infiltrate im ZNS nachweisbar waren. Insgesamt waren < 0,013% der markierten Neuronen Träger eines Y-Signals. Die Morphologie dieser Neuronen war typisch für unreife Neuronen, was konsistent ist mit den relativ kurzen Überlebenszeiten der Patientinnen nach Transplantation.

Abb. 1: Einer der zu einer Nervenzelle gehörenden Zell-kerne mit intranukleärem Signal des Y-Chromosomen-markers. Konfokalmikroskopische Aufnahme: oben links: Draufsicht, Projektion, oben rechts und unten: die zum Cursorpunkt gehörenden Schnittansichten. Balken: 10 µm.

Die Ergebnisse zeigen, dass blutbildende Stammzellen in der Lage sind, im Gehirn zu Nervenzellen auszureifen, wenn dies auch nur in sehr geringer Zahl zu beobachten war. Durch geeignete Konditionierung von blutbildenden Stammzellen könnte dieser Anteil aber mögli-cherweise erhöht werden und damit eine Thera-piestrategie zur Reparatur zerstörter Hirnareale zur Verfügung stehen.

P. Sostak 1, H. Stepp

Koop.: 1 Neurologische Klinik, Klinikum der Universität München.

Radiologische Forschung 23

Einfluss der Röhrenspannung auf die Erkennbarkeit von Gallen- und Nierensteinen in der Multidetektor-Computertomographie

Einleitung: Neben einer ausführlichen Anamnese wird das Vorliegen von Nieren- und Gallensteinen durch Computertomographie bildgebend nachgewiesen und deren exakte Lage bestimmt. Die Röntgenbelastung für den Patienten könnte durch eine Reduktion der Röhrenspannung in der Multidetektor-Computertomographie wesentlich verringert werden. Zur Beurteilung der Erkennbarkeit von Gallen- und Nierensteinen bei Änderung der entsprechenden Röhrenspannung von 120 kV auf 90 kV wurde eine In-vitro-Studie durchgeführt.

Material und Methoden: 20 Nierensteine und 15 Gallensteine unterschiedlicher Größe zwischen 0,15 und 9,1 ml und unter-schiedlicher Zusammensetzung (Calcium-oxalat, Calciumphosphat, Struvit, Brushit, Harnsäure, Cholesterin) wurden in einem flüssigkeitsgefüllten Behälter mit Wasser oder Kontrastmittel-Lösung (7,5 mg/ml Jod) positio-niert. An einem Röntgendiagnosegerät, dem 4-Zeilen-Multidetektor-Spiral-Computertomo-graph (Philips, MX 8000) wurde die Röhrenspannung bei jeweils 90 kV und 120 kV, das Röhrenstrom-Zeit-Produkt (15 – 100 mAs/slice) und der Pitch (0,875, 1,25) variiert. Für die Bewertung der bildgebenden Darstellung wurde die Computertomographie-Dichte sowie das Kontrast-Rausch-Verhältnis (KRV, CT-Dichtedifferenz von Steinen und umgebender Flüssigkeit geteilt durch das Bildrauschen der umgebenden Lösung) für jede Stein-Probe bestimmt.

Ergebnisse: Die CT-Dichte der Kontrast-mittellösung war bei 90 kV höher (456 ± 2 HU) als bei 120 kV (319 ± 3 HU). Steine, die bei 120 kV eine hohe CT-Dichte (400 – 1200 HU) aufwiesen, zeigten eine weitere Erhöhung der CT-Dichte bei 90 kV. Dahingegen zeigten Steine mit geringer CT-Dichte bei 120 kV (30 – 200 HU) eine weitere Erniedrigung der CT-Dichtewerte bei 90 kV. Unabhängig von der Röhrenspannung zeigten Steine mit höherer CT-Dichte (> 200 HU) ein gutes KRV (> 5) in der Wasserumgebung und Steine einer geringen CT-Dichte (30 – 200 HU) ein optimales KVR in der Umgebung von Kontrastmittellösung.

Zusammenfassung: Die Ergebnisse zeigen, dass Steine mit hoher CT-Dichte am besten im Nativ-CT entdeckt werden, während Steine mit CT-Dichten von 0 – 80 HU am besten in der Kontrastmittellösung gesehen werden. Auch wenn CT-Dichtewerte von Nierensteinen und Kontrastmittel abhängig von der angewendeten Röhrenspannung sind (unterschiedliche Absorptionsmaxima), wird die Erkennbarkeit durch eine Erniedrigung der Röhrenspannung im In-vitro-Experiment nicht beeinträchtigt. Damit sind die Vorraussetzung gegeben, in weiteren Untersuchungen die klinische Erkennbarkeit von Steinen bei reduzierter Röntgenbelastung zu prüfen.

E. Coppenrath 1, T. Meindl 1, S. Bodenberger 1, R. Sroka, M. Vogeser 3, M. Bader 2, U.L. Müller-Lisse 1, M. Reiser 1, U.G. Müller-Lisse 1

Koop.: 1 Klinische Radiologie, 2 Urologische Klinik, 3 Institut für Klinische Chemie, Klinikum der Universtität München.


Fluoreszenzzytologie mit 5-Aminolävulinsäure – ein quantitativer Ansatz

Einführung: Bei der Fluoreszenzendoskopie mit 5-Aminolävulinsäure (5-ALA) erkennt man Tumoren in der Harnblase, auch unscheinbare flache Befunde, sehr deutlich anhand ihrer selektiven roten Fluoreszenz. Das Grund-konzept der Fluoreszenzzytologie basiert auf der These, dass die während einer Fluoreszenz-endoskopie sichtbaren makroskopischen Tumorareale als einzelne Tumorzellen auch in Blasenspülflüssigkeit oder Urin zu finden sein sollten. Um dieses Auftreten zudem quantitativ untersuchen zu können, wurde eine spezielle Spektrometrieeinheit aufgebaut, klinisch getestet und weiterentwickelt.

Material und Methoden: Nach intravesikaler Inkubation mit einer 3%-igen 5-ALA Instillationslösung für 1 - 3 Stunden wurden spülzytologische Proben von insgesamt 62 Patienten entnommen, die parallel auch einer Routinezytologie zugeführt wurden. Die histologische Beurteilung erfolgte durch Biopsieentnahme, die durch Auffälligkeiten in Weißlicht- oder Fluoreszenzbildgebung gesteu-ert wurde. Bei 24 Patienten zeigte sich ein Uro-thelkarzinom, 28 Patienten hatten in früheren Untersuchungen bereits einmal einen positiven Befund, waren jedoch zum Zeitpunkt der Untersuchung, wie die zehn übrigen, tumorfrei. Die spülzytologischen Proben wurden zentrifugiert und mit isotonischer Kochsalz-lösung auf ca. 200 µl aufsuspendiert und bei einer breitbandigen Anregung von ca. 380 – 440 nm ab 560 nm spektral untersucht. Um auch eine geringe Anzahl fluoreszenzpositiver Zellen nachweisen zu können, wird das Ausbleichen der 5-ALA-induzierten Proto-porphyrin-IX-Fluoreszenz ausgenutzt. Hierzu wird zunächst vom Ausgangsspektrum das Spektrum nach weitgehendem Ausbleichen der Probe subtrahiert. Die resultierenden Spektren lassen sich dann im Wesentlichen mit zwei Komponenten anpassen, die ausbleichende Komponente der Eigenfluoreszenz, gewonnen aus porphyrinfreien Proben, und dem Reinspektrum einer PPIX-Lösung.

Ergebnisse: Von den an die Ausbleichspektren angepassten Fluoreszenzsignalen wurde der PPIX-Anteil zu dem Gewebeeigenfluoreszenz-anteil (Maß für die Zelldichte innerhalb der Probe) ins Verhältnis gesetzt. Dies ergibt die in Abb. 1 dargestellte Auftragung als Boxplot bzw. Receiver-Operator-Charakteristik (ROC-Kurve) in Abb. 2.

Abb. 1: Fluoreszenz (ausbleichende Komponenten) bei 635 nm relativ zur Gewebeeigenfluoreszenz (AF) (p = 0,001).

Abb. 2: Receiver-Operator-Charakteristik der Werte aus Abb. 1.

Fazit und Ausblick: Obwohl der Unterschied im PPIX-Signal zwischen malignen und benignen Befunden hochsignifikant ist (p = 0,001) ist die Überlappung der Signale sehr deutlich, was sich konsequent in Form der Fläche unter der Kurve von 0,76 im ROC-Plot bestätigt. Dennoch ist dieser Wert vergleichbar mit Ergebnissen, die andere zytologische Testverfahren, wie etwa NMP22 oder TATI, derzeit liefern können.

Abb. 3: Integrierte routinetaugliche Messeinheit.

Daher wurde konsequenterweise die bisher ver-wendete Spektrometrieeinheit zu einem kompakten, integrierten und voll software-gesteuerten System ausgebaut, das die effiziente Integration in den Klinikalltag ermöglicht (Abb. 3).

R. Meier, M. Brodner, A. Bone 1, S. Tauber 1, H. Stepp

Koop.: 1 Urologische Klinik, Klinikum der Universität München.

Förderung: EXIST Seed, Richard Meier.

Urologie 25

Phase-I-Studie zur Photodynamischen Therapie des Harnblasen-karzinoms mit Hexyl-Aminolävulinsäure und Weißlicht

Einführung: Das Hexyl-Derivat der 5-Aminolävulinsäure (h-ALA, Hexvix®) hat kürzlich die Zulassung für die Fluoreszenz-zystoskopie zur Erkennung oberflächlicher Blasentumoren erlangt. Dabei wird nach intravesikaler Instillation von h-ALA intrazellulär fluoreszierendes Proto-porphyrin IX (PPIX) synthetisiert. Da PPIX auch als Photosensibilisator für die Photodynamische Therapie (PDT) geeignet ist, stellt die Bestrahlung der Harnblase nach Sensibilisierung mit h-ALA eine mögliche Therapieoption für das oberflächliche Urothel-karzinom der Harnblase dar.

Ziel dieser prospektiv kontrollierten Studie war es, die Umsetzbarkeit und Sicherheit der h-ALA-PDT unter Verwendung einer Hoch-leistungsweißlichtquelle und eines neu entwickelten Bestrahlungskatheters zu unter-suchen.

Material und Methoden: Bei 14 Patienten mit High-grade- oder rezidivierendem Low-grade-Urothelkarzinom wurden 3 PDT-Sitzungen in 6-wöchigen Abständen durchgeführt. Die Bestrahlung erfolgte mit einer Hochleistungs-Weißlichtquelle. Das Licht wurde über eine Glasfaser mit 1,5 mm Durchmesser, die in einem flexiblen Spülkatheter eingebettet war, eingeleitet und mit einem Streukörper sphärisch auf die Blasenwand verteilt.

16 oder 8 mM h-ALA aufgelöst in 50 ml wurden 2 ± 1 Stunde vor der PDT über einen Einmalkatheter instilliert. Während der PDT wurde ein Blasenvolumen eingestellt, das eine faltenfrei ausgedehnte Harnblasenwand ge-währleistet. Es wurde zystoskopisch bestimmt und während der Bestrahlung alle 10 Minuten per Ultraschall kontrolliert. Über das Volumen wurde die Fläche der Blasenwand berechnet. Die Zielvorgabe für die Bestrahlungsdosis betrug 100 J/cm². Die dazu erforderlichen Bestrahlungszeiten betrugen 52 - 100 Minuten mit einem Mittelwert von 72 Minuten. Unmittelbar vor und nach jeder PDT wurde eine Fluoreszenzzystoskopie durchgeführt.

Ergebnisse: Die Bewertung der Effektivität der PDT war nicht das primäre Studienziel. Die vorläufige Auswertung zeigt ein initial vollständiges Ansprechen bei den 12 Patienten, bei denen alle drei PDT-Behandlungen durchgeführt wurden, entweder nach der ersten PDT (9 Patienten) oder nach der zweiten PDT (3 Patienten).

Schlussfolgerung: Die Weißlicht-PDT mit h-ALA unter Verwendung einer Hoch-leistungsweißlichtquelle und eines speziellen Bestrahlungskatheters ist technisch problemlos durchführbar und sicher.

Die vorliegenden Daten zur Bestrahlungs-effektivität verweisen auf ein optimiertes PDT-Protokoll mit 2 PDT-Behandlungen in 6-wöchigem Abstand gefolgt von Erhaltungs-PDTs nach einem längeren Intervall.

An der Reduktion der postoperativen Neben-wirkungen und der Durchführbarkeit der PDT in Lokalanästhesie wird derzeit gearbeitet.

Date

Jan Mai Sep Jan Mai Sep Jan

Pow

er [W

]

0

1

2

3

4

5

6

Test fiberTreatment fiberlin. regression

Abb. 1: Abnahme der Lampenleistung während der Dauer der Studie gemessen mit der Behandlungs- und einer Testfaser. Diese Abnahme wurde durch entsprechend verlängerte Bestrahlungszeiten kompensiert.

Date

Jan Mai Sep Jan Mai Sep Jan

Flue

nce

[J/c

m²]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Abb. 2: Tatsächlich applizierte Lichtdosen in J/cm² pro Bestrahlung im Verlauf der Studie anhand einer Lichtleistungskontrolle nach PDT durch Messung am demontierten und zerlegten Bestrahlungskatheter.

M. Bader 1, D. Zaak 1, M. Kriegmair 1, M. Ehlers 2, T. Pongratz, W. Beyer, C. Stief 1, H. Stepp

Koop.: 1 Urologische Klinik, Klinikum der Universität München; 2 Urologische Klinik, Planegg.

Studiensponsor: Photocure ASA, Oslo.


Dioden-Laser-Behandlung zur Vaporisation der humanen Prostata – Klinische Erfahrungen

Einleitung: Die lasergestützte Vaporisation von prostatischem Gewebe zur Behandlung der Blasen-Auslass-Obstruktion wird derzeit insbesondere mittels KTP-Laser (Greenlight-Behandlung) klinisch durchgeführt. Alternative Laserlichtquellen sind zwar verfügbar, jedoch fehlt es an der klinische Expertise zu diesen Geräten.

Ziel dieser Untersuchung war es, Erfahrungen in einer klinischen Situation über die Leistungsfähigkeit, die Ausführung und das postoperative Ergebnis dieser Behandlung mit einem Diodenlaser zu sammeln.

Material und Methoden: Nach eingehenden In-vitro-Untersuchungen wurde ein 50-W-Diodenlaser der Wellenlänge � = 1470 nm (biolitec AG) ausgewählt. Das Laserlicht wurde über einen Lichtwellenleiter mit seitlich-abstrahlendem distalen Ende und einem Zystoskop dem Zielgewebe zugeführt. Die Spülflüssigkeit beinhaltetet 1% Ethanol zur Beobachtung des Auftretens eines TUR-Symptoms. In diese Pilotstudie wurden 10 Patienten mit diagnostizierter Blasen-Auslass-Obstruktion aufgrund benigner Prostata-Vergrößerung (Prostatavolumen 35 – 78 ml) eingeschlossen. Das prostatische Gewebe wurde innerhalb der Prostatakapsel bei 50 W Laserleistung vaporisiert. In Abhängigkeit von der Vaporisationsmasse betrug die reine Laserzeitdauer zwischen 1220 s und 4000 s (im Mittel 2400 ± 750 s), während der zwischen 60 kJ und 200 kJ (im Mittel 121 kJ ± 38 kJ) Laserenergie appliziert wurde. Das operative Ergebnis wurde über eine Nachbeobachtungs-zeit von 6 Monaten ausgewertet.

Ergebnisse: Während der Operation wurde kein signifikanter Blutverlust festgestellt. Es konnte kein Ethanol-Gehalt im Blut als Hinweis auf das Einschwemmsyndrom ermittelt werden. Die Katheter wurden im Mittel nach 2 Tagen entfernt. 8 der 10 Patienten waren sofort mit ihrem Harnfluss zufrieden. Der mittlere Urinfluss war von 8,9 ml/s ± 2,9 ml/s pre-operativ gegenüber 15,7 ± 5 ml/s postoperativ signifikant (p = 0,049) erhöht. Über Anzeichen von Harndrang, Dysurie, Hämaturie oder Inkontinenz berichtete keiner dieser Patienten. 2 der 10 Patienten benötigten eine Re-Katheterisierung und in der Folge eine transurethrale Resektion der Prostata. Über den Beobachtungszeitraum von 6 Monaten waren die 8 Patienten mit dem operativen Ergebnis und ihrem damit gesteigerten Lebensgefühl zufrieden.

Zusammenfassung: Diese ersten und zur Zeit noch begrenzten Erfahrungen belegen die Machbarkeit der Prostata-Vaporisation mit einem 50-W-Diodenlasersystem geeigneter Wellenlänge. Die Behandlung erscheint als eine für den Patienten sichere und effektive Methode zur Behebung der Blasen-Auslass-Obstruktion, jedoch sind die Langzeit-ergebnisse abzuwarten. Die Langzeit-Effektivität und die Beständigkeit sind in einer klinischen Studie zu erheben.

M. Seitz 1, O. Reich 1, A. Karl 1, A. Bachmann 1, V. Stein-brecher, C. Stief 1, R. Sroka


Urologie 27

Fragmentierung von urologischen und künstlichen Steinen mit klinischen Lasersystemen der laserinduzierten Stoßwellenlithotripsie

Einführung: Für die Behandlung von Urolithiasis stellt die laserinduzierte intrakorporale Stoßwellenlithotripsie (LISL) eine wichtige Alternative zur extrakorporalen Stoßwellenlithotripsie (ESWL) dar.

Das Ziel dieser Untersuchung war der Vergleich von kommerziell erhältlichen Lasersystemen hinsichtlich der Fragmentierung von Kunststeinen sowie deren Wirkungsweisen auf urologische Harnsteinverbindungen.

Material und Methoden: Für die Untersuchung standen 5 gepulste Lasersysteme zur Verfügung, welche Licht entweder im IR-Bereich (Ho:YAG: � = 2100 nm) oder im VIS (FREDDY®: � = 532 nm und 1064 nm sowie FLPD: � = 594 nm) emittieren. In einem Unterwasseraufbau wurden zwei Siebstufen für spontan abgangsfähige (d < 3,15 mm) und pulverisierte (d < 1,50 mm) Steinkonkremente angebracht. Durch Bildung des Quotienten aus Anfangsmasse m0 eines Steins und applizierter Gesamtenergie Eges bis zur Fragmentierung in spontan abgangsfähige Konkremente wurde die Fragmentierungsrate ZE bestimmt. Zur Ermitt-lung der Zerstäubungsrate ZZ wurden nur die durch Siebstufe II gelangten Konkremente berücksichtigt.

��

��

�=J

mgEm

Zges

E0

��

��

�−=J

mgE

mmZ

ges

stZ

Re0

Abb. 1: Experimenteller Aufbau zur Steinfragmentierung und Bestimmung von Fragmentierungs- und Zerstäubungsrate ZE und ZZ.

Für jede Einstellung der Laserparameter (Laserpulsenergie, Faserkerndurchmesser) wurden fünf Kunststeine fragmentiert. Ferner wurden Fragmentierungs- und Zerstäubungs-raten für 10 unterschiedliche Zusammen-setzungen von Urolithen bestimmt.

Ergebnisse: Zwischen den drei untersuchten Ho:YAG-Lasern konnte kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Kunststein-fragmentierung festgestellt werden. Eine höhere Fragmentierungsrate wurde mit zunehmendem Kerndurchmesser des Licht-wellenleiters in gleichzeitig niedrigeren Energiedichtebereichen erreicht. Die VIS-Laser zeigten eine wesentlich höhere Fragmen-tierungs- und Zerstäubungsrate an Kunststeinen als die IR-Laser.

Abb. 2: Fragmentierungsrate ZE aller untersuchten Lasersysteme.

Während die Fragmentierungsraten der IR-Laser weitgehend nicht von den Zusammensetzungen urologischer Harnsteine abhing, konnte dagegen mit VIS-Lasern an bestimmten Steinstrukturen nur wenig bis gar kein Abtrag erzielt werden.

Fazit: Untersuchungen an Kunststeinen liefern einen nützlichen Vergleich für mögliche Einstellungen der Laserparameter, können aber nur eingeschränkt auf klinische Steinzusammensetzungen übertragen werden. Die Ablation durch photothermische Effekte der Ho:YAG-Laser liegt zwar deutlich unter den erzielten Werten der VIS-Laser, doch lässt sich ein präziser und äußerlich sichtbarer kontrollierter Abtrag an der Steinoberfläche erreichen. Aufgrund der damit gegebenen Nachverfolgbarkeit des Geschehens während eines Eingriffs wird dem Operateur seine Handlungsfähigkeit bestätigt.

M. Bader 2, A. Becker 2, D. Tilki 2, V. Hecht, F. Wondra-zek 1, M. Staehler 2, C. Stief 2, R. Sroka

Koop.: 1 Fachhochschule München; 2 Urologische Klinik, Klinikum der Universität München.


Kollateralschäden an urologischem Instrumentarium bei der laserinduzierten Stoßwellenlithotripsie

Einführung: Bei der Behandlung der Urolithiasis mittels laserinduzierter intra-korporaler Stoßwellenlithotripsie (LISL) kann es vorkommen, dass urologische Instrumente der Laserstrahlung ausgesetzt werden.

Ziel dieser Studie war der Vergleich der Wechselwirkung unterschiedlicher klinischer Lasersysteme im Bezug auf ihre Schadens-wirkung an urologischem Instrumentarium.

Material und Methoden: In einem Unterwasseraufbau wurden drei IR-Lasersysteme (Ho:YAG: � = 2100 nm) und zwei VIS-Lasersysteme (FREDDY®: � = 532 nm und 1064 nm sowie FLPD: � = 594 nm) verglichen. Unter verschiedenen Parametern wurden drei einzelne Laserpulse jeweils an verschiedenen Stellen auf Führungsdrähte, Bergungsinstrumente und Dormiakörbchen aus Nitinoldraht abgegeben. Die experimentellen Parameter variierten mit dem Durchmesser der Lichtwellenleiter, der Laserpulsenergie und dem Abstand zwischen distalem Faserende und urologischem Instrument. Die Schadensbewertung erfolgte mikroskopisch anhand des Schweregrades und der Fläche des Schadens.

Ergebnisse: Der am urologischen Equipment beobachtete Schaden hing sowohl von der Energiedichte als auch von der Laserpulsdauer der jeweiligen Laserstrahlung ab. Der maximale Schaden am Führungsdraht trat für IR-Laser in einem Abstand 0 < a < 2 mm in Abhängigkeit der Laserpulsenergie auf, während der maximale Schaden durch die beiden VIS-Laser in einem größeren Abstand a = 5 mm der Faserspitze zum Führungsdraht auftrat (Abb. 1). Die Nitinoldrähte der Bergungsinstrumente und die Dormiakörbchen konnten mittels IR-Laserpulsen mit Pulsenergien Ep > 1600 mJ komplett durch-trennt werden. Hier zeigten VIS-Laserpulse eine sehr geringe Wirkung.

Abb. 1: Wirkung eines Laserpulses auf Nitinoldraht: Ho:YAG-Laser (links) und FREDDY®-Laser (rechts).

Ho:YAG-Laserstrahlung bewirkt an allen untersuchten urologischen Instrumenten einen wesentlich höheren Schaden als gepulste VIS-Laserstrahlung.

Fazit: Durch den hohen Absorptionsgrad von IR-Strahlung in Wasser nimmt die Schadens-wirkung der Ho:YAG-Laser in größeren Abständen des Lichtwellenleiters zum urologischen Instrument exponentiell ab, was für die Schadenswirkung der VIS-Laser durch die hohe Transmission deren Strahlung in Wasser nicht der Fall ist. Im Nahbereich (a < 2 mm) reicht die IR-Pulsenergie aus, um das Wasser zwischen Faserspitze und Materialoberfläche zu vaporisieren und einen Tunnel für den verbleibenden Teil der Laserpulsenergie durch die Wasserdampfblase zu erzeugen (Moses-Effekt). Das vaporisierte Wasservolumen steigt mit wachsendem Faserkerndurchmesser an, was eine Zunahme der Fläche des induzierten Schadens zur Folge hat. Eine Durchtrennung der Nitinoldrähte von Bergungsinstrumenten konnte durch VIS-Laserstrahlung nicht erreicht werden, es konnte allerdings eine Ausweichbewegung des Drahtes in kürzerer Zeit als der Einwirkzeit einer induzierten Stoßwelle beobachtet werden. Somit ist eine Laserlithotripsie unter Verwendung von VIS-Lasern in Kombination mit Bergungsinstrumenten ohne größeres Kollateralschadensrisiko möglich.

V. Hecht, M. Bader 2, M. Staehler 2, F. Wondrazek 1, A. Becker 2, C. Stief 2, R. Sroka


Urologie 29

Untersuchung von Stoßwellen klinischer Lasersysteme bei der laserinduzierten Stoßwellenlithotripsie

Einführung: Bei der laserinduzierten intrakorporalen Stoßwellenlithotripsie (LISL) wird ein Lichtwellenleiter endoskopisch vor dem Harnstein positioniert. Nach Applikation eines Laserpulses kommt es zur Ausbildung eines Plasmas und zu damit verbundenen Kavitationseffekten, was zu Stoßwellen und Steinfragmentierung führt. Im Rahmen dieser Studie wurde die photomechanische Wirkungsweise von einem IR- und zwei VIS-Lasersystemen für verschiedene urologische Steinzusammensetzungen verglichen.

Material und Methoden: In einem Unterwasseraufbau wurde die distale Lichtwellenleiterspitze knapp vor der Steinoberfläche positioniert. Die nach Applikation eines Laserpulses auftretenden Stoßwellen wurden unter einem Winkel von 45° zum Lichtwellenleiter in einem Abstand h = 3 mm durch ein PVDF-Nadelhydrophon detektiert. Der durch das Hydrophon in ein Spannungssignal umgewandelte Druckverlauf wurde mit einem Oszilloskop dargestellt. Für die Untersuchung standen ein IR-Lasersystem (Ho:YAG: � = 2100 nm) und zwei VIS-Lasersysteme (FREDDY®: � = 532nm und 1064 nm sowie FLPD: � = 594 nm) zur Verfügung. Es konnten urologische Harnstein-proben aus Whewellit, Weddellit, Carbonat-appatit, Uricit, Cystin, Brushit und Struvit untersucht werden.

Ergebnisse: Für alle Lasersysteme konnten bis zu drei Druckspitzen als Folge eines applizierten Laserpulses detektiert werden. Mit Kontakt der Faserspitze zur Steinoberfläche wurden unter Einsatz der unterschiedlichen Lasersysteme die in Tab. 1 aufgeführten durchschnittlichen Druckamplituden erreicht.

p [bar] Peak Nr.

Ho:YAG FREDDY FLPD

1 4 52 34

2 21 13 20

3 4 2 2

Tab. 1: Durchschnittlich erzielte Druckamplituden durch klinische Lasersysteme an urologischen Steinen.

Die höchsten Druckamplituden von bis zu 100 bar wurden mit dem VIS-Laser FREDDY® an Whewellit-, Weddellit- und Carbonat-

appatitverbindungen erzielt. Dieses Laser-system zeigte jedoch für die Steinstrukturen Brushit, Struvit und Cystin keine bis nur sehr geringe Wirkung. Für Struvit- und Cystin-Verbindungen wurden auch mit dem FLPD-Laser nur geringe Effekte erzielt. Ein typischer Druckverlauf nach Applikation eines VIS-Laserpulses ist in Abb. 1 zu sehen.

Abb. 1: Druckverlauf nach einem FLPD-Laserpuls auf eine Whewellit-Weddellit-Verbindung.

Die Ausbildung von Stoßwellen geringerer Druckamplitude durch den Ho:YAG-Laser erwies sich tendenziell als unabhängig von der Zusammensetzung der Harnsteine.

Fazit: Für die Fragmentierung von Harnsteinen durch IR-Laserpulse können photomechanische Effekte nur in sehr geringem Ausmaß verantwortlich gemacht werden. Die nach Applikation eines IR-Pulses primär detektierte Druckspitze lässt sich aufgrund ihres Entstehungszeitpunkts der Ausdehnung einer im Wasser erzeugten Vaporisationsblase zuordnen (Moses-Effekt). Die sekundär detektierte Stoßwelle rührt von der Ausbildung eines geringfügig ausgeprägten Plasmas an der Steinoberfläche her. Die dabei auftretenden Druckamplituden liegen im Vergleich deutlich unter den der primär detektierten Stoßwellen nach Abgabe von VIS-Laserpulsen. Der Einsatz von photomechanischen VIS-Lasern beschränkt sich auf das Gebiet der Stoßwellenlithotripsie, wohingegen die photothermische Wirkungsweise der IR-Laser weitere Anwendungsbereiche zulässt.

M. Bader 2, A. Becker 2, D. Tilki 2, V. Hecht, F. Wondra-zek 1, M. Staehler 2, C. Stief 2, R. Sroka



Pendelmodell zur Messung des Rückstoßes an Harnsteinen bei der laserinduzierten Stoßwellenlithotripsie

Einführung: Bei der laserinduzierten intra-korporalen Stoßwellenlithotripsie (LISL) werden Laserpulse auf einen Harnstein abgegeben. Infolgedessen kommt es zur Entstehung eines Plasmas und anschließenden Kavitationseffekten und damit zur Ausbildung von Stoßwellen, die den Harnstein zerbrechen. Gleichzeitig erfährt der Harnstein einen Rückstoß, was im Allgemeinen den Eingriff erschwert.

Im Rahmen dieser Untersuchung wurde dieser Rückstoß am Modell eines Bleipendels simuliert und der Impulsübertrag für unterschiedliche klinische Lasersysteme verglichen. Die Ergebnisse lassen Rück-schlüsse auf die Wirkung an Harnsteinen zu.

Material und Methoden: In einem Unterwasseraufbau wurde ein scheiben-förmiges Stück Blei an einem dünnen Faden aufgehängt. Die Masse dieses Pendels wurde mit einer Analysenwaage bestimmt. Es wurden die Rückstoßwirkungen induziert durch ein IR-Lasersystem (Ho:YAG: � = 2100 nm) und 2 VIS-Lasersysteme (FREDDY®: � = 532 nm / 1064 nm, FLPD: � = 594 nm) verglichen. Für jedes Lasersystem wurden zwei verschiedene Pulsenergien (Ho:YAG: 800 mJ / 1200 mJ, FREDDY®: 120 mJ / 160 mJ, FLPD: 100 mJ / 150 mJ) untersucht. Die durch einen Laserpuls induzierte Pendelbewegung wurde mit einer Videokamera aufgenommen. Es wurden 20 Experimente pro Pulsenergie durchgeführt. Der Beschleunigung des Pendels im Wasser wirkt eine Rückstellkraft FRück und die Stokes’sche Reibung FStokes entgegen:

StokesRück FFF +=

Aus diesem Kraftansatz folgt die allgemeine Differentialgleichung für die Auslenkung s:

02 20 =⋅+⋅⋅+ sss ωδ ��

mit der Pendelfrequenz ω0 und Dämpfungs-konstante 2·δ.

Auf der Basis dieses Ansatzes kann der auf das Blei übertragene Impuls sowie der Wirkungsgrad �Rück aus kinetischer Energie des Pendels zur applizierten Laserpulsenergie berechnet werden.

Ergebnisse: Der durch den IR-Laser bewirkte Impulsübertrag auf das Pendel betrug trotz deutlich höherer Pulsenergien nur die Hälfte des durch die VIS-Laser übertragenen Impulses. Der ermittelte Wirkungsgrad �Rück der VIS-Lasersysteme lag um das 20- bis 50-fache über dem des IR-Lasers. Nach Applikation eines IR-Laserpulses konnte ferner ein Abtrag am Bleipendel beobachtet werden, Der durch die VIS-Laser induzierte Schaden fiel verhältnismäßig gering aus (Abb. 1).

Abb. 1: Bleipendel nach 10 applizierten Laserpulsen: Ho:YAG-Laser (links) und FREDDY®-Laser (rechts).

Fazit: Als Ursache des hohen Impulsübertrags der VIS-Laserpulse auf das Bleipendel kann das Auftreten von Stoßwellen hoher Druckamplitude mit großem Energiegehalt angenommen werden. Für den IR-Laser kann neben der Ausbildung energieärmerer Stoßwellen die Expansion einer im Wasser entstehenden Vaporisationsblase (Moses-Effekt) für den Pendelrückstoß vermutet werden. Nach Betrachtung der durch die Laserpulse erzeugten Schäden am Bleipendel wird die photothermische Wirkungsweise des IR-Lasers deutlich, während der durch die VIS-Laser als geringfügig einzustufende Schaden für eine photomechanische Wirkungsweise spricht. Die Verwendung eines Bleipendels lässt einen Vergleich der unterschiedlichen Wirkungsweisen zwischen den untersuchten Lasersystemen zu, kann aber nicht auf deren Verhalten gegenüber urologischen Steinen übertragen werden.

V. Hecht, M. Bader 2, M. Staehler 2, F. Wondrazek 1, A. Becker 2, C. Stief 2, R. Sroka


Technische Entwicklungen 31

Fasergestützte Bestimmung der Fluorophorkonzentration in Gewebe

Einführung: Bei der interstitiellen Photo-dynamischen Therapie von Tumoren wird der photosensibilisierte Tumor von innen bestrahlt. Für eine Beurteilung der zu erwartenden Wirkung wäre die Kenntnis der absoluten Konzentration des Photosensibilisators im Gewebe wünschenswert. Eine Messung der Fluoreszenz mittels einer interstitiellen Faser liefert jedoch ein Signal, das nicht nur von dieser Konzentration, sondern auch von den optischen Gewebeeigenschaften abhängt. Grundgedanke dieser Untersuchung ist der Umstand, dass bei hinreichend dünner Faser diese unerwünschten Abhängigkeiten verschwinden.

Material und Methoden: Es wurde die Anordnung untersucht, bei der das Anregungs- und das Fluoreszenzlicht in der selben interstitiell platzierten Faser transportiert werden. Dazu wurden sowohl Monte-Carlo-Rechnungen durchgeführt als auch Messungen an Gewebephantomen mit Fettemulsion als Streumedium und Tinte oder Blut als Absorber. Bei den Rechnungen wurde angenommen, dass das Licht nur in axialer Richtung und nur über den Mittelpunkt des planen Faserendes ins Gewebe eintritt. Ferner wurde angenommen, dass die Faser nur oberflächlichen Kontakt mit dem Gewebe hat. Auf diese Weise ließ sich durch Analyse der Verteilung des Fluoreszenz-lichts an der Gewebeoberfläche in Kombination mit Skalierungsgesetzen der erforderliche Rechenaufwand drastisch reduzieren.

Ergebnisse: Die Rechnungen ergaben wie erwartet ein Fluoreszenzsignal, das für einen hinreichend kleinen Faserradius zu einem konstanten Wert strebt, der nach entsprechender Kalibration zur Bestimmung der absoluten Konzentration des Sensibilisators geeignet wäre. Nimmt man an, dass die Faser das Fluoreszenzlicht unabhängig von seinem Eintrittswinkel auf die Faserendfläche nachweist, erhält man bereits für einen Faserradius r kleiner als 20% der optischen Eindringtiefe 1/µeff nur noch Signalvariationen von weniger als ± 10% (Abb. 1 links). Für den realistischeren Fall einer numerischen Apertur von NA = 0,34 erhält man ausgehend von r = 0 jedoch zunächst einen steilen Abfall (Abb. 1 rechts). Ursache ist der Umstand, dass bei hinreichend kleinem r nur ungestreute Photonen nachgewiesen werden. Eine Diskriminierung von Licht durch den begrenzten Nachweiskegel der Faser tritt daher erst mit zunehmender Streuung auf, wenn Licht

zur Seite und wieder zurück gestreut wird. Durch diesen steilen Abfall ergibt sich jedoch die Forderung nach derartig kleinen Faserradien, dass der Nachweis der Fluoreszenz messtechnisch problematisch wird. Dennoch lässt sich auch hier ein Parameterbereich finden, für den die Fluoreszenz auch bei größeren r ein Plateau ausbildet (Abb. 2). Es ist vor allem für den weit verbreiteten Fall µa = 0,1 µ s’ sehr ausgedehnt, da die entsprechenden Kurve in Abb. 1 bereits sehr flach verläuft. Ist der Mittelwert der optischen Parameter eines Gewebetyps bekannt, so lässt sich daraus ein optimaler Faserradius ableiten, für den das gemessene Signal nahezu unabhängig von realistischen räumlichen oder patientenspezifischen Varia-tionen von Streuung und Absorption ein Maß für die gesuchte Konzentration darstellt.

µeff * r

0 1 2

I F/(I

0*m

u af*

r)

0,0

0,5

1,0

1,5

µa/µs' = .01

µa/µs' = .1

µa/µs' = 1

µeff * r

0 1 2

I F/(

I 0*m

u af*

r)

0,0

0,1

0,2

µa/µs' = .01

µa/µs' = .1

µa/µs' = 1

Abb. 1: Berechnete Abhängigkeit des normierten Fluoreszenzsignals von den optischen Gewebeeigen-schaften. Links eine numerische Apertur von NA = 1, rechts ein realistischeres NA = 0,34.

Abb. 2: Kontour-Plot des Fluoreszenzsignals in Abhängig-keit von Streu- und Absorptionskoeffizient. Das Plateau mit einer Variation von nur ± 20% ist grau hinterlegt. Das Signal wurde auf den Wert des Plateauzentrums normiert.

Trotz der Näherungen in den Rechnungen zeigten die Ergebnisse hinsichtlich der Abhängigkeiten von den optischen Eigen-schaften eine gute Übereinstimmung mit den entsprechenden Experimenten. Es zeigte sich ferner, dass Unterschiede in den optischen Eigenschaften zwischen Anregungs- und Fluoreszenzlicht nur eine geringe Rolle spielen.

H. Stepp, W. Beyer, C. Pfaller


Stellenwert einer intrinsischen Spektralanalyse

Einführung: Bei der Spektralanalyse von Fluorophoren in Gewebe erschweren die Einflüsse von Streuung und Absorption eine quantitative Konzentrationsangabe. Für eine bestimmte fasergestützte Messsonde wurde von Müller et al. (Applied Optics 40/25, 2001) ein Verfahren angegeben, wie aus einem gemes-senen Fluoreszenzspektrum durch Verrechnung mit einem am gleichen Ort aufgezeichneten Weißlichtremissionsspektrum diese Einflüsse beseitigt werden können. Diese so genannten „intrinsischen“ Spektren sollen in Intensität und Spektralverlauf das gleiche Ergebnis bringen wie eine Messung an einer klaren Lösung. Wir untersuchten die Gültigkeit dieses Ansatzes an flüssigen Phantomen.

Material und Methoden: Bei der Messsonde handelt es sich um eine Anordnung aus 7 Fasern mit je 400 µm Kerndurchmesser, wobei eine zentrale Detektionsfaser von 6 Anregungs-fasern umgeben ist. In die Anregungsfasern wird Licht aus einer UV-Lichtquelle (D-Light-uv, Karl Storz) über einen Filtersatz einge-koppelt. Vier verschiedene Filtersätze auf einem schrittmotorgesteuerten Filterrad ermög-lichen Fluoreszenzanregung um 296 nm, 350 nm, 465 nm bzw. 410 nm. In einer fünften Position wird breitbandig Licht zwischen 380 nm und 800 nm gefiltert. Das von der Detektionsfaser erfasste Licht wird über ein Miniaturspektrometer (S2000, Ocean Optics) ausgelesen und anschließend nach der Vorschrift von Müller et al. verrechnet:

x : Anregungswellenlänge m : detektierter Fluoreszenzwellenlängenbereich

fxm : intrinsisches Spektrum Fxm : Rohspektrum der Fluoreszenz Rx : Remission bei der Anregungswellenlänge R0x : wie vor, ohne Absorber Rm : Remissionsspektrum R0m : Remissionsspektrum ohne Absorber ax , εm: Konstanten

Werte für das Spektrum R0m wurden an einer Lösung mit physiologisch relevanter Streu-mittelkonzentration ohne Absorber gewonnen. Die Konstanten ax und �m wurden durch Fit einer Messkurve in streuendem und absorbie-rendem Medium an einer Messkurve aus klarer Lösung gleicher Fluorophorkonzentration ermittelt.

Zu einer klaren Stammlösung von in Wasser gelöstem NADH wurde Lipofundin als Streuer bzw. heparinisiertes Vollblut als Absorber in mehreren Schritten zugegeben und die Fluores-zenzspektren bei einer Anregungswellenlänge von 350 nm aufgenommen.

Ergebnisse und Diskussion: Abb. 1 zeigt Fluoreszenz- und Remissionsspektren bei stei-gender Absorberkonzentration und konstanter Streumittel- und Fluorophorkonzentration, Abb. 2 entsprechend bei steigender Streumittel-konzentration. Durch Verrechnung der jeweils zusammen gehörenden Fluoreszenz- und Remissionsspektren mit obiger Formel ergeben sich die in Abb. 3 dargestellten Spektren. In Intensität und Form entsprechen sie in sehr guter Näherung dem Spektrum der klaren Lösung. Damit ist gezeigt, dass zumindest in homogenen Gemischen der von Müller et al. vorgeschlagene Algorithmus im untersuchten Bereich eine sehr gute Korrektur störender Einflüsse von Gewebestreuung und -absorption ermöglicht.

Wellenlänge [nm]

400 450 500 550 600 650 700

Inte

nsitä

t [co

unts

]

0

200

400

600 Absorber 1 Absorber 2 Absorber 3 Absorber 4

Wellenlänge [nm]

400 500 600 700 800

Rem

issi

on [%

]

0

20

40

60

80

100

Absorber 1Absorber 2Absorber 3Absorber 4

Abb. 1: NADH (links) und Remissionsspektren (rechts) bei zunehmender Absorberkonzentration.

Wellenlänge [nm]

400 450 500 550 600 650 700

Inte

nsitä

t [co

unts

]

0

200

400

600

Streuer 1 Streuer 2 Streuer 3 Streuer 4 Streuer 5

Wellenlänge [nm]

400 500 600 700 800

Rem

issi

on [%

]

0

20

40

60

80

100

Streuer 1Streuer 2Streuer 3Streuer 4Streuer 5

Abb. 2: NADH (links) und Remissionsspektren (rechts) bei zunehmender Streumittelkonzentration.

Wellenlänge [nm]

400 450 500 550 600 650 700

Rel

ativ

e In

tens

ität

0

200

400

600

800

Absorber 1 Absorber 2 Absorber 3 Absorber 4 Reinlösung

Wellenlänge [nm]

400 450 500 550 600 650 700

Rel

ativ

e In

tent

sitä

t

0

200

400

600

800 Streuer 1 Streuer 2 Streuer 3 Streuer 4 Streuer 5 Reinlösung

Abb. 3: Spektren aus Abb. 1 (links) bzw. Abb. 2 (rechts) nach Verrechnung zu intrinsischen Spektren inkl. Spektrum an der klaren Lösung.

R. Pauli, H. Stepp, R. Sroka, R. Meier, C.S. Betz 1, M. Havel 1, A. Leunig 1, W. Assmann 2

Koop.: 1 HNO-Klinik, Klinikum der Universität München; 2 Lehrstuhl für Kernphysik, Universität München.

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Konzept einer LED-Weißlichtquelle für die Endoskopie

Einführung: Lichtleistung und Lichtleistungs-dichte von Leuchtdioden (LEDs) haben in den letzten Jahren deutlich zugenommen. LEDs zeichnen sich durch eine lange Haltbarkeit und hohe Lichtausbeute aus. Damit könnten sie herkömmliche Lichtquellen für die Endoskopie ersetzen. Lediglich ihr breit gefächertes Abstrahlverhalten erschwert die Einkopplung in die dünnen Lichtleiter von Endoskopen. Wir untersuchten den LED-Markt nach geeigneten LEDs und die Effizienz der Fasereinkopplung in Lichtleiter.

Material und Methoden: Untersuchungsziel war die Effizienz einer direkten Einkopplung des von LEDs emittierten Lichts in Lichtleiter aus Quarz oder PMMA mit Kerndurchmessern von 600 µm bis 1,5 mm. Dazu wurden plan geschliffene Faserenden mit einem schritt-motorgesteuerten xyz-Mikromanipulator so nahe wie möglich an die emittierende LED-Oberfläche positioniert und die am anderen Faserende austretende Lichtleistung gemessen. Im Vergleich zur mit einer Ulbrichtkugel bestimmten insgesamt emittierten Lichtleistung der LED ergibt sich die Effizienz.

Ergebnisse und Diskussion: Die entscheiden-den Kriterien, die eine effiziente Fasereinkopp-lung ermöglichen sind: freier Zugang zur emittierenden Fläche, in eine Raumrichtung möglichst gerichtete Abstrahlung, hohe Leistung und Leistungsdichte. Diese Kriterien erfüllt derzeit am Besten die Serie Ostar® bzw. Golden DRAGON® (neu: Platinum DRAGON®) von Osram.

Abb. 1 zeigt ein mikroskopisches Bild der abstrahlenden Oberfläche. Dort ist auch zu sehen, dass die Kontaktierung an einem Eck der quadratischen Fläche erfolgt und damit eine Faser mit 1 mm Durchmesser sehr nah fast optimal deckend an die abstrahlende Fläche positioniert werden kann. Auf diese Weise erreichten wir bei einer 3-Farb-Ostar-LED Effizienzen von 10% für Rot und 20% für Blau und Grün, entsprechend 27 mW für Rot, 2 x 24 mW für Grün und 42 mW für Blau aus den Faserenden. Als für die Endoskopie erfor-derlichen Wert wurden 40 mW Weißlicht ermittelt, wobei das Kriterium die volle Aussteuerung eines Kamerabildes eines starren Zystoskopes in 3 cm Abstand von der Gewebe-oberfläche war.

Ein weiteres Kriterium ist die Farbechtheit, die mit der gewählten Beleuchtung erzielt werden kann. Durch Aussteuerung der einzelnen

Farben im Verhältnis R:G:B = 2:2:3 konnte der Weißpunkt im CIE-Diagramm erreicht werden, wobei sich die in Abb. 2 dargestellte spektrale Verteilung ergab. Damit sollte eine Lichtquelle mit einer 3-Farb-Ostar-LED 91 mW am Ausgang liefern können. Bei überschlägig 50% Transmissionsverlusten durch ein Endoskop wären somit 45 mW erreichbar und damit der geforderte Mindestwert. Hierzu wäre allerdings eine Fläche von 4 mm² für die Lichtübertragung im Endoskop erforderlich. Dies wird bei Standardendoskopen i. d. Regel nicht erreicht. Die experimentell ermittelte Transmission durch einen dünnlumigen Lichtleiter und das Beleuchtungsbündel eines Zystoskopes (4-mm-Optik) betrug 23%, womit maximal 21 mW verfügbar sind und der Mindestwert noch deutlich unterschritten wird.

Die Untersuchung zeigt, dass LED-Lichtquellen für die Endoskopie demnächst die erforderliche Lichtstärke erreichen könnten. Durch die höhere Lebensdauer, leichte Ansteuerbarkeit, spektrale Anpassbarkeit und geringen Kosten dürften sie sich dann rasch gegen die heute eingesetzten Halogen- und Kurzbogenlampen durchsetzen. In weiteren Experimenten soll die Tauglichkeit zur Fluoreszenzanregung untersucht werden.

Abb. 1: Abstrahlende Oberfläche einer Ostar®-LED.

Abb. 2: Spektrum einer RGB-Ostar-Projection-LED. Die relativen Intensitäten der einzelnen Farben sind so justiert, dass die Ausleuchtung durch eine PMMA-Faser sehr nahe am Weißpunkt des CIE-Diagramms liegt.

S. Mitterer, H. Stepp, T. Pongratz, T.J. Beck, R. Meier, R. Sroka

Förderung: TumorVision, BMBF.


Weißlichtapplikator für die Photodynamische Therapie von penilen Kondylomen

Einführung: Das Risiko, im Verlauf des Lebens sich mit humanen Papillomaviren (HPV) zu infizieren, beträgt etwa 80%. Diese Viren können am äußeren Genital sowie in der Harnröhre die so genannten spitzen Feigwarzen induzieren. Bei länger anhaltender Infektion mit kanzerogenen High-risk-HP-Viren ist auch eine Progression zum Peniskarzinom möglich. Konventionelle Therapien dieser Kondylome sind die Elektro- oder Kryochirurgie, die Behandlung mit lokalen Immunmodulatoren sowie die Laserbehandlung. Alle diese Methoden haben jedoch eine hohe Rezidivrate.

Aufgrund der Selektivität bestimmter Photo-sensiblitatoren für Kondylome, wie z. B. bei 5-ALA-induziertem PPIX, könnte die Photo-dynamische Therapie eine aussichtsreiche Alternative darstellen. Aufgrund seiner hohen Eindringtiefe ins Gewebe wird dazu gewöhnlich rotes Licht verwendet. Die geringe Gewebetiefe von Kondylomen lässt jedoch auch eine ein hohe Wirksamkeit von weißem Licht erwarten. Weißes Licht hätte den Vorteil der zusätzlichen Wirkung des photochemisch besonders effektiven Blauanteils sowie die im Vergleich zum Laser niedrigeren Kosten. Es wurde daher ein Weißlichtapplikator ent-wickelt, der eine gleichzeitige und räumlich homogene Bestrahlung des distalen Bereichs der Harnröhre und des äußeren Genitals beim Mann ermöglicht.

Material und Methoden: Als Lichtquelle wurde eine Xenon-Kurzbogenlampe D-Light (Karl Storz GmbH) verwendet, wie sie zur Fluoreszenzdiagnose in der urologischen Praxis weit verbreitet ist. Das Licht wird über ein Glasfaserbündel zum Applikator geleitet.

Abb. 1: Weißlichtapplikator und Penis. Die Bestrahlung der äußeren Areale erfolgt durch das Licht, das an der Innenseite der Hohlkugel zurückgestreut wird, die der Urethra über das eingeführte Rohr mit Streumedium.

Ein mit Streumedium gefülltes Plexiglasrohr verteilt das Licht auf die zu bestrahlenden Areale. Der größere Teil des Lichtes wird über eine erste Streuzone aus dem Rohr herausgestreut und durch ein- oder mehrfache Rückstreuung an der rückstreuenden Innen-wand einer Hohlkugel entsprechend des Prinzips einer Ulbricht-Kugel räumlich homogenisiert und dient zur Bestrahlung des distalen Bereichs des äußeren Genitals. Ein kleinerer Teil des Lichts verlässt das Plexiglasrohr erst durch Streuung an der zweiten Streuzone und bestrahlt damit die Urethra. Ein Spiegel am Ende des Plexi-glasrohres verbessert die Homogenität der Lichtverteilung.

Zum Einführen der Streustange in die Harnröhre kann die Hohlkugel auf einem Führungsrohr zurückgeschoben werden. Zur axialen Positionierung des Penis dient ein optisch partiell transparenter Anschlag für die Glans. Damit eine ausreichende Menge von Licht die Urethra erreicht, wurde das Plexiglasrohr als Lichtleiter konzipiert. Dazu wurde das Streumedium mit quadratischem Querschnitt geformt, so dass es nur an den Kanten Kontakt mit dem Rohr herstellt. Auf diese Weise bildet sich zwischen Streumedium und Rohr ein Luftspalt mit einem Brechungs-indexsprung.

Die Lichtverteilung im Gesamtsystem aus Applikator und Gewebe wurde mit dem Ray-Tracing-Programm ASAP (ASAP Software, Inc.) modelliert. Auf diese Weise wurden die für eine homogene Bestrahlung erforderlichen optischen Eigenschaften der Streuzonen und des Anschlags ermittelt.

Ergebnisse: Mit der gewählten Anordnung ist eine weitgehend homogene Lichtverteilung mit einer Restvariation von ± 15% erreichbar. Bei einer Lichtleistung von 6 W im Glasfaser-bündel werden 100 mW/cm² auf der Gewebe-oberfläche erzielt. Die Differenzen zwischen berechneten und gemessenen Lichtverteilungen betrugen jedoch z. T. über einen Faktor 2. Als Ursache werden materialtechnische und geometrische Details vermutet, die bei der näherungsweisen Modellierung der komplexen Geometrie nicht erfasst wurden.

R. Meyer, B. Schlenker 1, W. Beyer



EndoTrain-Kidney

Der EndoTrain-Kidney ist ein speziell entwickeltes plastisches 3D-Modell der Niere für das Training endourologischer Eingriffe aus dem klinischen Alltag. Das Nierenmodell ist in transparentes Plexiglas eingearbeitet und besteht aus einem Nierenbecken und in 3 Ebenen abzweigenden 7 Nierenkelchen. Die Transparenz ermöglicht das Training unter Sichtkontrolle und ist somit vergleichbar der Röntgendurchleuchtung am OP-Tisch. Eine Vorrichtung zur Veränderung der Nieren-neigung ermöglicht die Einstellung unter-schiedlicher Schwierigkeitsgrade.

Der EndoTrain-Kidney eignet sich speziell für die Vorbereitung auf die flexible Ureterorenoskopie (URS) als alltäglichen Eingriff in der Urologie. Das spezifische Handling flexibler Endoskope sowie die Orientierung in den verschiedenen Kelch-gruppen kann erlernt und in unterschiedlichen Schwierigkeitsstufen trainiert werden. Zusätzlich können sämtliche endourologischen Instrumente in die Niere eingebracht und positioniert werden. Auch das Legen von Kathetern ist durchführbar.

Neben dem reinen Endoskopie- und Orientierungstraining kann die Behandlung von Nierensteinen simuliert und geübt werden. Das wasserdichte Modell erlaubt das gezielte Einbringen und Positionieren von Probe-Steinen in die obere, mittlere und untere Nierenkelchgruppe. Diese können dann per Dormiakörbchen oder anderem Equipment geborgen werden, oder mittels Elektro-Hydraulischen Sonden und Lasersonden zertrümmert werden. Die Spülflüssigkeit sorgt für die Möglichkeit der entsprechende induzierten Effekte.

Eine Erweiterung des EndoTrain-Kidney durch Ankopplung an plastische Trainingsmodelle aus Blase und äußeren Genitalien ist vorgesehen.

Derzeit befindet sich ein Prototyp des EndoTrain-Kidney in der urologischen Klinik und Poliklinik des Klinikums der Universität München im Einsatz.

Trainingsmöglichkeiten:

• funktionelles 3D-Endoskopie-Training in der oberen, mittleren und unteren Kelchgruppe der Niere

• organspezifisches Handling mit Endoskop und endourologischem Equipment

• optische Kontrolle der intrakorporalen (vgl. mit Röntgen-Bogen) Vorgänge

• variabler Schwierigkeitsgrad durch variable Neigung

• Bergen von Kunststeinen

• Zertrümmerung von Kunststeinen.

Abb. 1: EndoTrain-Kidney mit äußerem Genital und Harnröhre (ohne Harnblase).

Abb. 2: Abgewinkelter EndoTrain-Kidney-Aufbau für erschwerte endoskopische Handhabung.

V. Hecht, S. Heide, R. Meier, T.J. Beck, M. Bader 1, R. Sroka



Harnröhrendilatation am Strikturmodell mittels Everting-Katheter

Einführung: Die Bougierung der Urethra bei Harnröhren-Strikturen hat wegen der erhöhten Restrikturrate und der Entwicklung endos-kopischer Operationsverfahren an Bedeutung verloren. Als Ursache für die hohe Zahl der Rezidivstrikturen wird eine Verletzung der Schleimhaut durch axial wirkende Reibungs-kräfte während der Passage der Verengung verantwortlich gemacht. Strikturhäufigkeit und -ausdehnung hängen vom Ausmaß der wirkenden Kräfte ab.

Ein neu entwickelter Dilatator (Everting-Katheter, Abb. 2) erlaubt die Bougierung einer Striktur von ca. 3 mm auf ca. 8 mm Durch-messer durch das einmalige Einführen eines speziellen Katheters mit einem sich dabei ausstülpendem Inneren, welches sich beim Einführen als Schutzschicht über die Schleimhaut legt und sich nicht mit dem Bougie mit bewegt, so dass eine Verletzung der Schleimhaut durch Reibung vermieden wird.

Ziel dieser Untersuchung war es, die axial wirkende Kraft bei der Bougierung einer 6 mm und einer 7 mm messenden Striktur durch einen 8-mm-Everting-Katheter mit der Kraft durch herkömmliche Bougies an einem Urethramodell zu vergleichen.

Material und Methoden: Zunächst wurde je ein Silikon-Modell mit einer 5-mm- und einer 6,5-mm-Striktur über 1 cm Länge konstruiert und aus flexiblem Kunststoff gefertigt. Wie aus dem experimentellen Aufbau hervorgeht, wurde dann dieses System an eine Kraftmessvorrichtung fixiert, so dass das Einführen eines Dilatators schrittmotor-gesteuert mit einer definierten Geschwindigkeit erfolgen und gleichzeitig die dabei auftretende Maximalkraft gemessen werden konnte. Jedes Striktur-Modell wurde jeweils 10 mal mit dem Everting-Katheter (Cystoglide, Percutaneous Systems, Mountain View, CA, USA) sowie die 5-mm-Striktur mit einem herkömmlichen 6-mm-Bougie und die 6,5-mm-Striktur mit einem herkömmlichen 7,5-mm-Bougie (beide Cook Urological, Spencer, IN, USA) dilatiert. Dabei wurde jeweils der Maximalwert der axial wirkenden Kraft durch ein digitales Messgerät bestimmt. Der Mittelwert dieser Maximalkraft wurde anhand des Student's t-Tests auf Signifikanz überprüft.

Ergebnisse: Die Ergebnisse in Tab. 1 zeigen, dass die maximale axiale Krafteinwirkumg auf die Urethra bei der Bougierung der 6,5-mm-

Striktur ohne Gleitmittel einen signifikanten Unterschied zwischen dem Everting-Katheter und dem Cook-Bougie aufweist, während mit Gleitgel die Kraft bei der Passage der 5-mm-Striktur vergleichbar ist, obwohl der Everting-Katheter fast 2 mm größer ist als der Cook-Bougie.

Modell-Striktur Bougie

5 mm 6,5 mm

Evert.-K., 8 mm, mG 9,7 N 5,4 N

Cook, 6 mm, mG 3,8 N -

Cook, 6 mm, oG 20,5 N -

Cook, 7,5 mm, mG - 9,5 N

Cook, 7,5 mm, oG - 32,9 N

Tab. 1: Mittelwerte der axialen Kraft für verschiedene Bougierungsgeräte (oG und mG: ohne bzw. mit Gleitmittel).

Schlussfolgerung: Mit dem 8-mm-Everting-Katheter wird am Striktur-Modell eine signifikant niedrigere axiale Kraft aufgewendet, um eine 6,5-mm-Striktur zu überwinden als mit einem 7,5-mm-Cook-Bougie. Ob dies auch Auswirkung auf die Restrikturrate hat, wird in einer folgenden klinische Studie zu untersuchen sein.

Abb. 1: Experimenteller Aufbau zur Bestimmung des Kraftaufwandes bei der definiert reproduzierbaren Einführung von Harnröhren-Dilatationsvorrichtungen.

Abb. 2: Dilatations-Everting-Katheter.

P. Weidlich 1, C. Adam 1, R. Horvath, R. Sroka, D. Zaak 1, C. Stief 1



Mitarbeiter (LFL)

Wissenschaftlicher Leiter LFL

Dr. rer. nat. Reinhold Baumgartner

Sekretariat

Kornelia Eberle

Physik

Dr. rer. nat. Wolfgang Beyer Dr. rer. biol. hum. Ronald Sroka Dr. rer. biol. hum. Herbert Stepp

Ingenieure (FH)

Dipl. Ing. Thomas Pongratz

Technische Assistenten

Michael Heide Sabine Sandner

Doktoranden (Dr. rer. biol. hum.)

Dipl. Phys. Tobias Beck Dipl. Phys. Mirna Castro Dipl. Ing. André Ehrhardt Dipl. Phys. Frank Ließmann Dipl. Phys. Richard Meier Dipl. Phys. Hilmar Schachenmayr

Doktoranden (Dr. med.)

Alexander Ackermann, Urologie Markus Bader, Urologie Radka Blagova, Gefäßchirurgie Agnes Bone, Urologie Patrick Bössner, Urologie Wolfgang Bruckmeier, HNO Christine Burgmeier, Gefäßchirurgie Michael Höppner, Urologie Jürgen Leicht, Urologie Julia Malsy-Mink, Urologie Boris Mundweil, HNO Tamara Mundweil, Urologie Walter Rachinger, Neurochirurgie Jessica Reif, Gynäkologie Verena Steinbrecher, Urologie Cornelia Tillack, Gastroenterologie Andikyan Vagn, Gynäkologie Pjetr Zelenkov, Neurochirurgie

Diplomanden und Praktikanten

Melanie Brodner, FH Münster Volkmar Hecht, FH München Melanie Hohberg, Universität München Robert Meyer, FH München Simone Mitterer, FH München Romana Pauli, Universität München Christian Pfaller, FH München Corinna Spirres, FH Münster

Praktikanten

Lars Bäßler, FH Mittweida Peter Bartl, Uni Innsbruck Alexander Druse, FH München Markus Eisenreich, FH München Ruben Horvath, FH München Wolfgang Klammer, FH München Joachim Knaur, FH München Sarah Lamsfuß, FH Weihenstephan Lucille Mollon, ENSPS, Strasbourg Philipp Novotny, FH München Florian Paul, FH München Christian Raith, FH München Marc Ritz, ENSPS, Strasbourg Matthias Schuppler, TU München Adam Seweryn, FH München Stefan Türkes, FH München Jürgen Warthmüller, FH München

Zivildienstleistende

Benjamin Grabowski Stefan Heide Wolfgang Kunz Alin Schake


Kooperationen (LFL)

Nationale wissenschaftliche Einrichtungen

Klinkum der Universität München:

Urologische Klinik und Poliklinik

Dr. med. Christoph Adam Dr. med. Markus Bader Dr. med. Alexander Karl Dr. med. Ulrike Müller-Lisse PD Dr. med. Oliver Reich Dr. med. Boris Schlenker Dr. med. Michael Seitz Prof. Dr. med. Christian Stief Dr. med. Stefan Tritschler PD Dr. med. Raphaela Waidelich Dr. med. Patrick Weidlich PD Dr. med. Dirk Zaak

Klinik und Poliklinik für Hals-Nasen-Ohren-heilkunde

Prof. Dr. med. A. Berghaus Dr. med. Christian Betz Dr. med. Miriam Havel Dr. med. Philip Janda PD Dr. med. Andreas Leunig Dr. med Vanessa Siedek

Neurochirurgische Klinik u. Poliklinik

Dr. med. Claudia Götz PD Dr. med. Friedrich-Wilhelm Kreth Dr. med. Jan Mehrkens Dr. med. Walter Rachinger PD Dr. med. Walter Stummer Prof. Dr. med. Jörg-Christian Tonn PD Dr. med. Eberhard Uhl

Chirurgische Klinik und Poliklinik - Innenstadt

Prof. Dr. med. Wolf Mutschler Dr. med. Mojtaba Sadeghi-Azandaryani Dr. med. Claus-Georg Schmedt Prof. Dr. med. Bernd Steckmeier

Institut für Klinische Radiologie

Dr. med. Eva Coppenrath PD Dr. med. Ullrich Müller-Lisse Dr. rer. nat. Michael Peller Prof. Dr. med. Dr. h.c. Maximilian Reiser

Kinderchirurgische Klinik, Dr. von Haunersches Kinderspital

PD Dr. med. Florian Bergmann Prof. Dr. med Dietrich von Schweinitz

Neurologische Klinik und Poliklinik

Prof. Dr. med. Dr. h.c. Thomas Brandt Dr. med. Petra Sostak

Medizinische Klinik II

Prof. Dr. med. Burkhard Göke PD Dr. med. Jörg Schirra

Zentrum für Neuropathologie und Prion-forschung

Dr. med. Karl Bise Prof. Dr. Hans A. Kretzschmar

Pneumologische Klinik Innenstadt

Dr. med. Hubert Hautmann Prof. Dr. med. Rudolf Huber

Weitere:

Urologische Klinik München-Planegg

Prof. Dr. med. Martin Kriegmair

Urologische Klinik Diakoniekrankenhaus Rotenburg a.d. Wümme

Prof. Dr. med. Rolf Muschter

Frauenklinik, Medizinische Hochschule Hannover

Prof. Dr. med. Peter Hillemanns

Institut für Pathologie, Universitätsklinikum Aachen

Univ.-Prof. Dr. med. Ruth Knüchel-Clarke

Klinik für Kinderchirurgie, Universität Leipzig

Prof. Dr. med. Holger Till

Urologische Klinik, Klinikum rechts der Isar, TU München

Dr. med. Michael Straub

Urologische Klinik, Asklepios Klinik St Georg, Hamburg

Dr. med. Stephan Tauber

Institut für Lasermedizin, ILM Ulm

Prof. Dr. rer. nat. Rudolf Steiner Dr. rer. nat. Klaus Stock Dr. rer. nat. Wolfgang Strauß

ACUR (Institut für Analytische Chemie), Universität Regensburg

Prof. Dr. Otto S. Wolfbeis


Institut für Wasserchemie und Chemische Balneologie, TU München

Dr. rer. nat. Christoph Haisch

BINAS (Bielefeld Institute for Biophysics and Nanoscience), Universität Bielefeld

Prof. Dr. Markus Sauer

Hochschule für Technik und Wirtschaft Aalen

Prof. Dr. Herbert Schneckenburger

Fachhochschule München

Prof. Dr. Heinz Huber Prof. Dr. Benno Reuter Prof. Dr. Jürgen Schörner Prof. Dr. Fritz Wondrazek

Department für Physik, Beschleunigerlabor, LMU München

PD Dr. Walter Assmann

Forschungszentrum Borstel, Borstel

PD Dr. Andreas Frey

Internationale wissenschaftliche Einrichtungen

Institut für Molekularbiologie, Universität Salzburg, Österreich

Prof. Dr. Barbara Krammer

Royal Military College, Kingston, Kanada

Prof. Dr. Roy Pottier

Universität Vilnius, Litauen

Dr. Saulius Bagdonas Prof. Dr. Ricardas Rotomskis

Skin Diseases and STD Hospital, Shanghai, VR China

Prof. Dr. med. Xiuli Wang

Industriepartner

• Biolitec AG, Jena

• CeramOptec GmbH, Bonn

• curalux GbR, München

• Dornier Medizintechnik GmbH, Germering

• Karl Storz GmbH, Tuttlingen

• Medac GmbH, Hamburg

• Mikropack, Ostfielden

• Möller-Wedel GmbH, Hamburg

• OptiMed GmbH, Ettlingen

• Photocure, Oslo, Norwegen

• Photonamic GmbH, Hamburg

• R-Biopharm, Darmstadt

• StarMedTech, Starnberg

• Toptica, Gräfelfing

• TUI-Laser AG, Gräfelfing

• Wavelight AG, Erlangen


curalux GbR c/o LIFE-Zentrum Marchioninistraße 23, 81377 München Tel.: +49 (0)89 / 7095-4884 Fax: +49 (0)89 / 7095-4864

Email: [email protected] www.curalux.de

Das Geschäftsmodell des Unternehmens curalux besteht in der Weiterentwicklung, Produktion und Vermarktung von Prototypen aus der Medizintechnik. Durch langjährige Erfahrung und hohe Kompetenz in der Diagnostik und Therapie mit Licht sollen innovative Entwicklungen aus diesem Bereich erfolgreich am Markt positioniert werden. Die Konzentration auf Systeme zur Lichtdiagnostik und Lichttherapie spiegelt sich im Namen curalux wider.

Vor der Markteinführung von Medizin-produkten muss ein umfangreiches und zeitaufwändiges Produktzulassungsverfahren durchlaufen werden, während dessen nur geringe Umsätze mit eigenen Produkten erwirtschaftet werden. Zur Sicherung der Finanzierung in dieser Phase der Unternehmensentwicklung, bietet curalux Dienstleistungen an, die im Bereich optische Diagnostik und Therapie angesiedelt sind. Dazu gehören unter anderem die technische Betreuung klinischer Studien, die Entwicklung und der Aufbau von Messständen, die Fertigung von Kleinserien bestimmter Lichtapplikatoren und Simulationen zur Lichtausbreitung in Gewebe.

Die ersten Produkte, die von curalux vertrieben werden, haben noch keine medizinische Zulassung und werden nur im Laborbereich eingesetzt. Dazu gehören optische Strahlteiler, diverse Lichtapplikatoren mit diffuser Abstrah-lung und weitere Komponenten zur Licht-

applikation bei der Photodynamischen Therapie.

Bei curalux handelt es sich um eine Ausgründung aus dem Laser-Forschungslabor der Universität München. Das Gründerteam besteht derzeit aus Dipl.-Physiker Tobias Beck und Dipl.-Physiker Richard Meier, die beide seit mehreren Jahren am Laser-Forschungs-labor beschäftigt sind.

Daher besteht mit dem Forschungslabor eine enge, strategisch wichtige Verbundenheit, welche es langfristig ermöglichen wird, viel versprechende Verfahren und Techniken aus dem Bereich der Diagnostik und Therapie in einem frühen Entwicklungsstadium zu erkennen, zu sichern und abgeleitete medizintechnische Neuentwicklungen kunden-nah auf den Markt zu bringen.

Finanzielle Unterstützung erhielt das Unternehmen bereits durch Förderprogramme vom Bayerischen Staatsministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst und vom BMBF. Des Weiteren wird curalux bei diversen Fragestellungen zur Ausgründung umfassend und intensiv durch das Gründerbüro der Ludwig-Maximilians-Universität München betreut. Die jüngst erworbene Mitgliedschaft bei Bayern Photonics stellt einen weiteren wichtigen Schritt in der Entwicklung des Unternehmens dar, mit dem das vorhandene Netzwerk im Bereich Optische Technologien ausgebaut und vertieft werden kann.


Diplomarbeiten und Promotionen (LFL)

Diplomarbeiten Melanie Brodner (Dipl. Ing.), Aufbau einer Vorrichtung zur Ex-vivo-Diagnostik des Harnblasenkarzinoms (auf Basis tumorselek-tiver Fluorochrome), 2006

Volkmar Hecht (Dipl Ing.), Vergleich klinischer Lasersysteme in der Laserinduzierten Intrakorporalen Stoßwellen-lithotripsie, 2006

Robert Meyer (Dipl. Ing.), Entwicklung eines Weißlichtapplikators für Photodynamische Therapie in der Urologie, 2006

Simone Mitterer (Dipl. Ing.), Konzept einer LED-Weißlichtquelle für die Endoskopie, 2006

Romana Pauli (Dipl. Phys.), Analyse intrinsischer Autofluoreszenzspektren zur Gewebedifferenzierung, 2007

Christian Pfaller (Dipl. Ing.), Entwicklung eines interstitiellen Fluoreszenzdetektorsystems zur semiquantitativen Auswertung, 2004

Corinna Spirres (Dipl. Ing.), Entwicklung eines Weißlichtapplikators für die Photo-dynamische Therapie von Condyloma acuminata, 2004

Promotionen

Markus Bader (Dr. med.), Untersuchung zur Photodynamischen Therpaie im CAM-Modell, 2005

Agneta Bone (Dr. med), 5-ALA-induzierte Fluoreszenz-Zytologie und -Spektrometrie zur Diagnostik des Harnblasenkarzinoms, 2007

Patrick Bössner (Dr. med.), In-vitro-Untersuchungen zur interstitiellen und ablativen Laserbehandlung mittels gepulster Laserstrahlung, 2005

Mirna Castro (Dr. med.), Pharmacokinetic studies on protoporphyrin IX induced by 5-aminolevulinic acid and its esters in a three-dimensional lung tumor mini-organ culture model, 2005

André Ehrhardt (Dr. rer. biol. hum.), Inkohärente Lichtsysteme für die Fluoreszenz-diagnostik und die Photodynamische Therapie, 2005

Michael Hoeppner (Dr. med.), Tierexperi-mentelle Untersuchungen zur Photodynami-schen Therapie des Prostatakarzinoms mit 5-Aminolävulinsäure induziertem Protoporphy-rin IX an einem Ratten-Tumor-Modell, 2005

Jürgen Leicht (Dr. med. dent.), In-vitro-Untersuchung zur interstitiellen Mikrowellen-therapie, 2005

Frank Ließmann (Dr. rer. biol. hum.), Zeitaufgelöste Fluoreszenzbildgebung für die Tumordiagnostik, 2004

Boris Mundweil (Dr. med. dent.), In-vitro-Untersuchungen zu Koagulations- und Ablationseigenschaften minimal invasiver Behandlungsverfahren für die Anwendung im Fachbereich HNO, 2004

Walter Rachinger (Dr. med.), Unter-suchungen zur Porphyrin-Akkumulation im perifokalen Gliomgewebe und normalen Hirngewebe nach Gabe von 5-Amino-lävulinsäure, 2006

Cornelia Tillack (Dr. med), Dysplasie-detektion bei Patienten mit chronisch entzündlicher Darmerkrankung mittels 5-ALA-induzierter Fluoreszenzendoskopie, 2005

Andikyan Vaagn (Dr. med.), Pharmakokineti-sche, fluoreszenzmikroskopische Studie zur Gewebeaufnahme und Verteilung von 5-Ami-nolävulinsäure aus 5-ALA-Thermogel bei zer-vikaler intraepithelialer Neoplasie (CIN 1-3), 2004

Xiuli Wang (Dr. med), Pharmacokinetics and Selectivity of ALA-induced Porphyrin Synthesis after Topical Application of Hexyl-Aminolevulinic-Acid in Cervical Intraepithelial Neoplasia, 2004


Publikationen (LFL)

2005

R. Baumgartner, R. Waidelich, W. Beyer, H. Stepp, R. Knüchel-Clarke, A. Hofstetter: Integral Photodynamic therapy of bladder cancer using 5-ALA and white light. Proceedings of SPIE, 5686, 207-213 (2005)

T.J. Beck, M. Burkanas, S. Bagdonas, Z. Krivickiene, R. Baumgartner, R. Rotoms-kis: Two-Photon excitation photodynamic therapy of C6 cells by means of 5-amilolevulinic acid-induced proto-porphyrin IX. Med. Las. Appl. 20(2), 149-150 (2005)

T.J. Beck, F.W. Kreth, W. Beyer, A. Ober-meier, H. Stepp, R. Sroka, W. Stummer, R. Baumgartner: Interstitial photodynamic therapy of malignant glioma recurrences using 5-aminolevulinic acid-induced protopor-phyrin IX. Med. Las. Appl. 20(2), 149 (2005)

W. Beyer, S. Tauber, A. de Nigris, T.J. Beck, K. Schorn, R. Baumgartner: Double-blind study for low level laser therapy in patients with chronic cochlear dysfunction. Med. Las. Appl. 20(2), 155 (2005)

S. Ito, W. Rachinger, H. Stepp, H.J. Reulen, W. Stummer: Oedema formation in experimental photo-irradiation therapy of brain tumours using 5-ALA. Acta Neurochir. 147(1), 57-65 (2005)

P. Janda , T. Killian , R. Sroka , C.S. Betz , A. Leunig: Longterm results of Ho:YAG- and Diode-Laser treatment of hyperplastic inferior Nasal Turbinates. Med. Las. Appl. 20(2), 147 (2005)

R. Meier, S. Tauber, H. Stepp, A. Hofstetter, C. Stief: Integral-spectrophotometric analysis of 5-aminolevulinic acid-induced fluorescence cytology of the urinary bladder. Med. Las. Appl. 20(2), 146 (2005)

B. Michel, T.J. Beck: Raytracing im Einsatz für die Medizin. Laser+Photonik 5, 38-41 (2005)

A. Muacevic, M. Peller, L. Ruprecht, D. Berg, L. Fend, R. Sroka, H.J. Reulen, M. Reiser, J.C. Tonn, F.W. Kreth: Image guided interstitial laser thermotherapy: a canine model evaluated by magnetic resonance imaging and quantitative autoradiography. Acta Neurochir. 147(2), 175-85; discussion 185-6 (2005)

M. Peller, R. Sroka, M. Reiser: A new optical device for the online detection of the local tissue coagulation in MRI-assisted interstitial thermotherapy. ESHO 2005 Programm

M. Peller, R. Sroka, M. Reiser: MRI assisted thermotherapy enhanced by optical invasive measurement. ISMRM´05, International Society for Magnetic Resonance in Medicine 2005 in Miami, USA: Proc. Intl. Soc. Magn. Reson. Med.13, 2147 (2005)

C.G. Schmedt, S. Steckmeier, R. Sroka, V. Ruppert, M. Sadeghi-Azandaryani, J. Maierl, S.S. Bolz, W. Mutschler, B. Steckmeier: Endoluminale thermische Venenocclusion mit Laser (ELT) und Radiofrequenz (VNUS) zur Therapie der Stammveneninsuffizienz: Vergleichende Evaluation am Ex-vivo-Modell. Deutsche Gesellschaft für Chirurgie, 122. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie, München, 05.-08.04.2005. (Vortrag); Düsseldorf, Köln: German Medical Science, Doc 05dgch3059 (2005)

H. Stepp, T.J. Beck, W. Beyer, T. Pongratz, R. Sroka, R. Baumgartner, W. Stummer, B. Olzowy, J.H. Mehrkens, J.C. Tonn, H.J. Reulen: Fluorescence-guided resections and photodynamic therapy for malignant gliomas using 5-aminolevulinic acid. Proceedings of SPIE 5686, 547-557 (2005)

D. Zaak, A. Karl, R. Knüchel, H. Stepp, A. Hartmann, O. Reich, A. Bachmann, M. Siebels, G. Popken, C. Stief: Diagnosis of urothelial carcinoma of the bladder using fluorescence endoscopy. BJU Int. 96(2), 217-22; Review (2005)

Preise

1. Preis der Deutschen Gesellschaft für Gefäßchirurgie für besten „Short Message Vortrag“: C.G. Schmedt, S. Steckmeier, R. Sroka, V. Ruppert, M. Sadeghi-Azandaryani, M. Steger, B. Steckmeier: Ex-vivo-Modell zur Evaluation endoluminaler Therapieverfahren der Stammvenenin-suffizienz. (Vortrag), 21. Jahreskongress der Deutschen Gesellschaft für Gefäßchirurgie, Stuttgart, 21.-24.September 2005


2006

M. Burkanas, T.J. Beck, N. Gerasimcik, Z. Krivickiene, S. Bagdonas, R. Baum-gartner, R. Rotomskis: Dwufotonowa fotosensibilizacja komorek in vitro. Inzynieria Biomedyczna 12, 53-56 (2006)

T. Ochsenkuhn, C. Tillack, H. Stepp, J. Diebold, S.J. Ott, R. Baumgartner, S. Brand, B. Goke, M. Sackmann: Low frequency of colorectal dysplasia in patients with long-standing inflammatory bowel disease colitis: detection by fluorescence endoscopy. Endoscopy 38(5), 477-82 (2006)

O. Reich, M. Noll, C. Gratzke, A. Bach-mann, R. Waidelich, M. Seitz, B. Schlenker, R. Baumgartner, A. Hofstetter, C. Stief: High-level virtual reality simulator for endourologic procedures of lower urinary tract. Urology 67(6), 1144-8 (2006)

C.G. Schmedt, O.A. Meissner, G. Babaryka, R. Sroka, S. Steckmeier, K. Hunger, V. Ruppert, M. Sadeghi-Azandaryani, B. Steckmeier: Endovaskuläre Optische Kohärenztomographie (OCT) zur Evaluation der Gewebsalteration nach endovenöser Radiofrequenz- und Lasertherapie. Deutsche Gesellschaft für Chirurgie, 123. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie, Berlin, 02.-05.04.2006, (Vortrag); Kongresspublika-tion: Chirurgisches Forum 35, 439-441 (2006)

C.G. Schmedt, R. Sroka, S. Steckmeier, O.A. Meissner, G. Babaryka, K. Hunger, V. Ruppert, M. Sadeghi-Azandaryani, B. Steckmeier: Investigation on radio-frequency and laser (980 nm) effects after endoluminal treatment of saphenous vein insufficiency in an ex-vivo model. Eur. J Vasc. Endovasc. Surg. 32(3), 318-25 (2006)

R. Sroka, C.G. Schmedt, S. Steckmeier, O.A. Meissner, W. Beyer, G. Barbaryka, B. Steckmeier: Ex-vivo investigation of endoluminal vein treatment by means of radiofrequency and laser irradiation. Med. Las. Appl. 21, 15-22 (2006)

H. Stepp, T.J. Beck, W. Beyer, C. Pfaller, R. Sroka, R. Baumgartner: Measurement of fluorophore concentration in scattering media by one single optical fiber. Progress in Biomedical Optics and Imaging - Proceedings of SPIE 6139, 0S (2006)

H. Stepp, T.J. Beck, T. Pongratz, T. Meinel, J.C. Tonn, W. Stummer: Fluorescence guided resection for malignant glioma using 5-aminolevulinic acid. Proceedings of SPIE 6078, 2W (2006)

S. Tauber, H. Stepp, R. Meier, A. Bone, A. Hofstetter, C. Stief: Integral spectro-photometric analysis of 5-aminolaevulinic acid-induced fluorescence cytology of the urinary bladder. BJU Int. 97(5), 992-6 (2006)

P. Zelenkov, R. Baumgartner, K. Bise, M. Heide, R. Meier, S. Stocker, R. Sroka, R. Goldbrunner, W. Stummer: Acute morphological sequelae of photodynamic therapy with 5-aminolevulinic acid in the C6 spheroid model. J Neurooncol. 82(1), 49-60 (2007)

Buchbeiträge

T.J. Beck, F.W. Kreth, W. Beyer, H. Stepp, A. Obermeier, J.H. Mehrkens, W. Stummer, R. Baumgartner: Interstitial photodynamic therapy of malignant glioma recurrences using 5-aminolevulinice acid induced proto-porphyrin IX. 321; R. Sroka, M. Peller, M. Reiser: MRI assisted thermo therapy: additional informations of the local state of tissue by means of optical invasive measurements. 325-326, R. Sroka, C.G. Schmedt, S. Steckmeier, O.A. Meissner, G. Babaryka, B. Steckmeier: Investigations of endoluminal vein treatment with radiofrequency and laser irradiation by means of optical coherence tomography. 323-324, in: L. Bogner, B. Dobler (eds.): Medizinische Physik 2006, Deutsche Gesellschaft für Medizinische Physik; Tagungsband 2006, 20-23, Regensburg, ISBN 3-925218-87-4 (2006)

B. Krammer, Z. Malik, R. Pottier, H. Stepp: Charter 2: Basic Principles. 15-78; W. Stummer, R. Baumgartner: Chapter 5: ALA-PDT and ALA-FD in the brain: New Prospects for treating malignant Gliomas. 155-177; R. Waidelich, H. Stepp: Chapter 4: ALA-PDT and ALA-FD in Urology. 127-154, in: R. Pottier, B. Krammer, H. Stepp, R. Baum-gartner (eds.): Photodynamic Therapy with ALA – A Clinical Handbook, RSC Publishing, Cambridge, UK (2006)


Drittmittelförderungen (LFL)

Projekttitel / Förderer / Laufzeit

Exist Seed Existenzgründung: Dipl. Phys. T.J. Beck, Dipl. Ing. A. Obermeier. BMBF - Exist Seed, 01.11.2004 - 31.10.2005

Exist Seed Existenzgründung: Dipl. Phys. R. Meier. BMBF - Exist Seed, 01.01.2005 - 31.12.2005

Flügge (Förderprogramm zum leichteren Übergang in eine Gründerexistenz): Dipl. Phys. T.J. Beck. Bayerisches Staatsministerium für Wissenschaft, Forschung und Kunst - Flügge, 02.01.2006 - 31.12.2006

Experimentelle Studien zur Diagnostik und Therapie von Mikrometastasen kindlicher Tumoren durch photodynamische Verfahren. DFG, ab 12.05.2006 für 2 Jahre

Untersuchung der synergistischen Wirkung von 5-Aminolävulinsäure-basierter Therapie und Immuntherapie beim Glioblastom und Prostata-

karzinom. Deutsche Krebshilfe, ab 18.05.2006 für 2 Jahre

TumorVision (Fluoreszenz-vermittelter Nach-weis von Markerenzymen zur In-vivo-Visuali-sierung von Tumoren und deren Vorstufen). BMBF, ab 01.08.2006 für 3 Jahre

BRIOLAS (Brillante Hochleistungs-diodenlaser), Unterprogramme: Evaluierung der Multi-Faser-PDT beim Prostatakarziom; Entwicklung eines Lichtapplikators für die adjuvante Gliomtherapie. BMBF, ab 01.07.2006 für 2 Jahre

Exzellenzcluster „Munich Advanced Photonics“ (MAP), Teilprojekt: “Femtoscope”. BMBF, ab 01.09.2006 für 3 Jahre

Wundheilungsmodulation durch lokal inte-grierte Betastrahler (BetaMod). Bay. Forschungsstiftung, ab 22.11.2006 für 3 Jahre


Veranstaltungen, Ausbildung, Lehre (LFL)

Biophotonik-Symposium Das LFL trat als Organisator des Biophotonik-Symposiums in München zum Thema „Bilder vom Leben“ (27. - 29.04.06) auf.

LFL-Doktoranden-Seminar In diesem Seminar sind die klinischen und wissenschaftlichen Doktoranden aufgefordert, in Form von Kurzvorträgen den aktuellen Status ihrer wissenschaftlichen Tätigkeit zu präsentieren und zu diskutieren. Das Seminar bildet ein Forum, um übergeordnete Frage-stellungen zu erörtern und in den Forschungs-rahmen des LIFE-LFLs einzupassen, sowie den Stellenwert der eigenen wissenschaftlichen Aktivitäten einzuordnen.

Öffentlichkeitsarbeit und Nachwuchsförderung Es werden Vorträge und Führungen angeboten, bei denen einem interessierten Publikum die Struktur, das Aufgabengebiet und das Tätig-keitsfeld des LFL vermittelt werden. Bei ausgewählten Experimenten können darüber hinaus Interessierte persönliche Erfahrungen mit den Geräten machen. Insbesondere werden sowohl Exkusionen von Schulklassen unter speziellen Themengebieten und Schulpraktikas unterstützt.

Folgende Artikel aus der Tagespresse wurden zudem durch das LFL fachlich betreut:

B. Dorra, R. Sroka: Wucherung in der Prostata verdampft unblutig. VDI Nachrichten Apr.17, 13 (2005)

B. Dorra, R. Sroka: Grünes Licht für die Operation der Prostata. Stuttgarter Zeitung 24.05.05, 10 (2005)

T. Näser, R. Sroka: Laserlicht im Inneren des Menschen. Focus Online, http://www.focus.de/wissen/wissenschaft/laser/medizin_aid_26994.html (2006)

K. Gockel, R. Sroka: Laser in der Medizin. GesundheitPro, http://www.gesundheitpro.de/-Laser-in-der-Medizin-Eine-Auswahl-Therapien-A061129GOKAP037713.html (2006)

Vorlesung an der Universität München: Laser in der Medizin: Grundlagen und klinische Anwendungen in HNO, Urologie

In Kooperation mit Vertretern der entsprechen-den Fachbereiche (D. Zaak, A. Leunig,) werden Studenten im Praktischen Jahr im Rahmen einer seminaristischen Unterrichts-folge in die entsprechende physikalischen und biologischen Grundlagen eingeführt und an ausgewählten Beispielen die klinische Relevanz dieser minimal invasiven Diagnose- und Therapiekonzepte aufgezeigt (A. Leunig, D. Zaak, R. Sroka).

MECUM-Vorlesung an der Universität München: Physik an medizinischen Beispielen Den Studenten im Vorklinischen Semester wird diese Vorlesung als Wahlpflichtfach-Blockveranstaltung (14 Tage, jeweils 2-stündig) seitens des Fachbereiches Physik der Universität München angeboten. Im Rahmen dieser Vorlesung werden medizinische Frage-stellungen und ihre Physik beleuchtet. Insbesondere handelt es sich um die unterschiedlichsten Strahlenarten und ihre biologische Wirkung, sowie deren medi-zinische Anwendungen für die Diagnostik mittels CT, MRT, PET, Ultraschall und Laser und in der Therapie mittels Photonen, Ionen und Laserstrahlung (W. Assmann, R. Sroka).

Physik-Hauptseminar an der Universität München: Anwendungen physikalischer Methoden in der Medizin Zusammen mit Medizinphysikern der Uni-Kliniken werden in einer Mischung aus Vorlesung und Seminarvorträgen die Grund-lagen der wichtigsten physikalischen Methoden in der Medizin behandelt. Durch die teilnehmenden Kliniker kann die Anwendungs-nähe sichergestellt und der aktuelle Stand der Forschung vermittelt werden. Im Rahmen dieses Seminars finden auch Exkursionen in die Kliniken statt. Neben der fachlichen Seite werden auch grundsätzliche Punkte zur Vortragstechnik selbst behandelt (W. Assmann, W. Dünnweber, R. Sroka).


Themengebiete sind:

• Wechselwirkung von Strahlung mit Materie

• Röntgen- und Synchrotonstrahlung

• Tumortherapie mit ionisierender Strahlung

• Grundlagen der Bildgebung mit PET und NMR

• Diagnostik und Therapie mit Lasern

• Ultraschall in der Medizin

Das LFL betreut Themen wie:

• Laser in der Medizin

• Low-Level-Lasertherapie

• Organspezifische Konzepte zur PDT

• Fluoreszenzdiagnostik in der Medizin

• Gewebediagnostik mit 2-Photonen-Mikroskopie

• Gewebediagnostik mit bildgebender Kurzzeitspektroskopie

• Licht-Gewebe-Wechselwirkung

• Konfokale Mikroendoskopie

• Thermische und nicht-lineare Laseranwendungen

• Optische Kohärenz-Tomographie

Im Rahmen dieser interfakultativen Zusammenarbeit werden physikalische Diplomarbeiten betreut

Fachhochschule München

Im Rahmen der engen Kooperation mit dem Fachbereich 06 – Feinwerk- und Mikrotechnik, Physikalische Technik – der Fachhochschule München übernehmen Wissenschaftler des LFL Lehr- und Betreuungsaufgaben von FH-Studenten in folgenden Lehrveranstaltungen:

• Lasertechnik, Prof. Huber, Prof. Röder

• Technische Optik, Prof. Schörner

• Medizinische Optik, Prof. Wondrazek

Sowohl für die Fachhochschule München als auch für die Fachhochschule Mittweida werden im LFL pro Semester mehrere Praktikanten und Diplomanden betreut.

Beratung

Die Wissenschaftler des LFL beantworteten jährlich zahlreiche schriftliche und telefonische Anfragen von Patienten, deren Angehörigen sowie von Kranken- und Ersatzkassen.

Aufgrund von Beiträgen in Fach- und anderen Zeitschriften oder durch Sendungen in den elektronischen Medien wird das LFL als kompetente Forschungseinrichtung hinsichtlich lasermedizinischer und photodynamischer Behandlungs- und Diagnosemethoden um In-formationen gebeten.

Fortbildung und Kurse zur Lasersicherheit für Ärzte und OP-Personal Das LFL bietet mehrmals jährlich Laser-Sicherheits-Kurse für spezielle medizinische Fachgebiete (HNO, Urologie, Gynäkologie) für niedergelassene und angestellte Ärzte (national und international) an. In kompakter Form werden bei stark begrenzter Teilnehmerzahl die Grundlagen der Lasertechnik, die Wechsel-wirkung Licht und Gewebe und der Laser-schutz erörtert, was den Sachkundekurs für die zertifizierte Qualifikation zur Ernennung zum Laserschutzbeauftragten bildet. Auf dieser Basis baut der klinische Laserkurs auf, in dem die wichtigsten der fachspezifischen Laser-operationen in Theorie und Praxis vorgestellt und im Rahmen eines Hands-on-Trainings vervollständigt werden. Diese Kurse werden entsprechend den Richtlinien der Deutschen Gesellschaft für Lasermedizin e.V. durch-geführt, und sind von den jeweiligen medizi-nischen Berufsfachverbänden und der Bayer-ischen Landesärztekammer anerkannt und empfohlen.

In regelmäßigen Abständen werden die Ärzte und das OP-Personal der unterschiedlichen medizinischen Fachbereiche im Klinikum der Universität München in der Lasersicherheit unterwiesen. Ausgehend von den physikalischen Grundlagen des Lasers wird die Palette der Wechselwirkungen zwischen Laserlicht und biologischem Gewebe erörtert. Diese theoretischen Betrachtungen werden an Beispielen aus den verschiedenen Fach-bereichen verdeutlicht.


Forschungsberichte Labor für Tumorimmunologie


Einleitung

Krebs ist nach Erkrankungen des Herzkreis-laufsystems die zweithäufigste Todesursache in den westlichen Industrienationen. Die Ge-fährlichkeit der Krebserkrankung ist bedingt durch das unkontrollierte, invasive Wachstum der Tumorzellen, insbesondere aber durch die Fähigkeit zur Metastasenbildung in Kombina-tion mit einer fehlenden oder unzureichenden Reaktion der körpereigenen Abwehr. Obwohl Tumorzellen weniger immunogen als Patho-gene sind (es ist schwer für das Immunsystem, die geringen Unterschiede zwischen gesundem Gewebe und Tumorgewebe zu erkennen), hat eine überwältigende Zahl von experimentellen und klinischen Befunden gezeigt, dass das Im-munsystem eindeutig in der Lage ist, Tumor-zellen zu erkennen und abzutöten. Als beson-ders immunogen haben sich im Menschen Me-lanome und Nierentumoren erwiesen. Allerdings gelingt es den Tumorzellen häufig, durch Tarnung oder durch Manipulation des Immunsystems der Immunabwehr zu entkommen und Tumoren zu bilden. Auch beobachtet man oft eine Schwächung des Immunsystems des Patienten durch die fortgeschrittene Tumorerkrankung.

Die Tumorimmunologie hat sich zur Aufgabe gemacht, die körpereigenen Abwehrmechanis-men zu erforschen und neue Wege zu finden, die Zellen des Immunsystems oder Tumorzel-len gezielt therapeutisch zu beeinflussen, um Krebserkrankungen zu bekämpfen. Aufgrund der immer besseren technischen Möglichkeiten und dem damit verbundenen enormen Wissens-zuwachs wurde in den letzten Jahren eine Reihe von neuen Immuntherapien erarbeitet und in der Klinik getestet. Hierzu gehören Therapien mit Zytokinen (körpereigene Botenstoffe zur gezielten Beeinflussung von Immunzellen oder Tumorzellen), Tumor-vakzinen (Impfstoffe zur spezifischen Stimulation der Immunabwehr), adoptive Zelltherapien (Immunzellen des Patienten werden außerhalb des Körpers stimuliert, vermehrt und reinfundiert), sowie Antikörper-therapien (Hemmung oder Zerstörung von Tu-morzellen durch selektive Bindung von Anti-körpern). Einen neuen Aspekt der Tumorimmunologie stellt die immun-therapeutische Wirkung von Photodynamischer Therapie (PDT) dar. Sie erlaubt die Tötung von Tumorzellen mit Hilfe von Photosensibili-satoren nach Lichtbestrahlung bei gleich-zeitiger Stimulation einer Tumorimmun-antwort.

Das aufgrund von wissenschaftlichen Untersu-chungen der letzten Jahre entwickelte Konzept der Tumorstammzelle wird auch Einfluss auf die Entwicklung von Tumorimmuntherapien nehmen. Die für den Fortbestand und Metasta-sierung verantwortlichen Tumorstammzellen machen nur einen sehr geringen Bruchteil der Tumormasse aus. Sie zeigen in vielen Fällen eine ausgeprägte Unempfindlichkeit gegenüber Chemo- und Strahlentherapie und werden daher für das Wiederauftreten des Tumors nach zunächst erfolgreich erscheinender Therapie verantwortlich gemacht.

Die Erfahrungen mit auftretenden Resistenzen bei neuen Wirkstoffen (niedermolekulare Kina-seinhibitoren, sog. small molecule drugs), die gezielt aufgrund der Kenntnis molekularer Vorgänge bei der Krebsentstehung entwickelt wurden, zeigen, dass Krebs wahrscheinlich nur erfolgreich mit Kombinationstherapien be-kämpft werden kann. Daher wird auch der Im-muntherapie ein wichtiger Stellenwert zukom-men, da die Resistenzmechanismen für immun-therapeutische und Small-molecule-drug-Therapieansätzen sehr verschieden sein dürften und so eine Kreuzresistenz von Tumoren ver-mieden werden kann.

Die Forschungsaktivitäten im Labor für Tu-morimmunologie (LTI) betreffen hauptsächlich urologische Tumoren, insbesondere Nieren- und Prostatatumoren. Für die Entwicklung und Verbesserung der Immuntherapie solider Tumoren forschen wir auf folgenden Gebieten:

• Identifizierung und Evaluierung von antige-nen Zielstrukturen

Ziel: Herstellung von polyvalenten Tumor-vakzinen für die adjuvante Tumortherapie

• Identifizierung von Immune-escape-Strate-gien in Tumoren

Ziel: Verständnis der Tumortoleranz des Immunsystems; neue therapeutische An-sätze

• Evaluierung von neuen Immuntherapien im Tiermodell (z. B. Stimulation von Anti-Tu-morimmunreaktionen durch PDT)

Ziel: Grundlage für klinische Versuche

• Immunphänotypisierung von Immun- und Chemotherapie-resistenten Tumorzellen (Tumorstammzellen?)

Ziel: Therapeutische Adressierung von Tu-morstammzellen


• Identifizierung, rekombinante Herstellung und Expression von Tumor-erkennenden Rezeptoren zytotoxischer T-Zellen (TCR) - Designer-T-Zellen

Ziel: Umgehung von Toleranz und Suppres-sionsphänomenen durch Überexpression der TCR in T-Zellen von Patienten

• Entwicklung, Optimierung und Testung von Tumorvakzinen (gentechnisch modifizierte allogene Tumorzellvakzine; mit Tumoranti-genen beladene dendritische Zellen (DC) als Tumorvakzine; Erhöhung der Immuno-genität von Tumorantigenen)

Ziel: Klinische Testung und Therapieopti-mierung

• Weiterentwicklung von standardisierten Methoden zum immune monitoring

Ziel: Überprüfung der Wirksamkeit und Vergleich von Immuntherapien

Im LIFE-Zentrum haben wir die einmalige Möglichkeit, interdisziplinäre Forschung zu betreiben. Neben der Nähe zu den Kliniken, die eine patientennahe Forschung stimuliert, eröffnet das Know-How des Laser-Forschungslabors (LFL) und des LTI neuartige Versuchsansätze. Dies wird besonders deutlich in einem von der Deutschen Krebshilfe geförderten Projekt zur Stimulation von Anti-Tumorreaktionen des Immunsystems durch Photodynamische Therapie.

In weiteren regionalen Kooperationen mit der Abteilung für Klinische Pharmakologie und Immuntherapie, der Medizinischen Klinik Innenstadt (Prof. Stefan Endres; Dr. Carole Bourquin) und der Chirurgischen Klinik (Prof. Rudolph Hatz, PD Dr. Hauke Winter, Dr. Natasja van den Engel) werden neue immuntherapeutische Ansätze mit CpG-Oligo-nukleotidadjuvantien und neuartigen Tumor-zellvakzinen an einem von uns entwickelten Spontantumormodell erprobt.

In den vergangenen Jahren haben wir eine neuartige Methode zur Gewinnung von Anti-körpern mittels genetischer Immunisierung bei uns etabliert, die zu einer Antikörper-Plattform

ausgebaut werden soll. Diese Methode erlaubt die rasche Generierung von vielseitig verwend-baren monoklonalen Antikörpern. Ein proof of principle mit einem externen Partner (PD Dr. Frank Kolligs und Dr. Andreas Herbst, Med. II) ist bereits erfolgreich abgeschlossen worden.

Mit der Chirurgischen Klinik (Prof. Christo-pher Heeschen) und dem Institut für Chirurgi-sche Forschung (Prof. Georg Enders) haben wir eine Zusammenarbeit zur (Immun-)Therapie von Tumorstammzellen begonnen.

Im Rahmen einer zwischen dem Institut für Molekulare Immunologie (IMI) der GSF (Prof. Dolores Schendel) und der Urologischen Klinik des Klinikums der Universität München (Prof. Christian Stief), vereinbarten Klinischen Kooperationsgruppe „Immuntherapien bei urologischen Tumoren“ (Leiterin Dr. Heike Pohla) wurde im Berichtszeitraum eine Pati-entenstudie zur Erprobung einer genetisch mo-difizierten Nierenzellkarzinom-Vakzine er-folgreich abgeschlossen. Im Mittelpunkt der weiteren gemeinsamen Forschungsarbeiten ste-hen Designer-T-Zellen und dendritische Zellen, eine Immunzellpopulation, die wichtig für die optimale Stimulierung des körpereigenen Ab-wehrsystems für den Kampf gegen Tumor-zellen ist.

In Zusammenarbeit mit der Urologischen Kli-nik der TU München (Prof. Rudolf Hartung) und dem Institut für Experimentelle Onkologie und Therapieforschung (Prof. Bernd Gänsba-cher; Dr. Thomas Brill) wurde eine klinische Phase-I/II-Studie zur Erprobung einer genmodifizierten Tumorzellvakzine für die Therapie des hormonrefraktären Prostatakarzi-noms ebenfalls abgeschlossen. Die Hinweise auf eine Verlangsamung der Tumorprogression bei einzelnen Patienten haben sich bei dem größeren Patientenkollektiv bestätigt. Durch die gewonnene Erfahrung mit dem immune monitoring dieser Studien und dem Zulassungsprozedere wurden wichtige Grund-lagen für nachfolgende Studien geschaffen.

Prof. Dr. rer. nat. W. Zimmermann

Leiter des Labors für Tumorimmunologie


Bedeutung von „gepaarten Immunrezeptoren“ bei der Immunantwort

Einführung: Die Funktion von Leukozyten wird durch positive und negative Signale, die durch Zelloberflächenmoleküle übermittelt werden, gesteuert. Die Zugänglichkeit von Genomdatenbanken und so genannten EST-Datenbanken (expressed sequence tag) hat es ermöglicht, relativ einfach neue Mitglieder von Genfamilien und neue Spleißvarianten von Proteinen, zu identifizieren. Eine der überraschendsten Ergebnisse der durchge-führten Datenbankanalysen war die Entdeckung von Genen, die für nahverwandte Immunrezeptoren mit entgegengesetzter Funktion kodieren. Diese so genannten „gepaarten Immunrezeptoren“ haben extrem ähnliche extrazelluläre Domänen, wodurch sie meist mit den gleichen Liganden interagieren. Sie verfügen jedoch über entgegengesetzte Sig-nalmotive im zytoplasmatischen Bereich oder verbinden sich intrazellulär mit Adaptorprote-inen, die über entgegengesetzte Signalmotive verfügen. Bisher bekannte „gepaarte Immun-rezeptoren“ gehören zwei Molekülfamilien an, der Immunglobulinsuperfamilie (IgSF) und der C-Typ-Lektin-Familie. Zu diesen Rezeptorpaa-ren oder Rezeptorfamilien gehören die killer cell Ig-like receptors (KIR) und die leukocyte Ig-like receptors (LILR) der Primaten, sowie die paired Ig-like receptors (PIR), die myeloid-associated Ig-like receptors (MAIR) und die Ly49-Familie der Nager, sowie die CD94/NKG2-Familie, die sowohl in Primaten und Nagern vorkommt. Die funktionelle Rele-vanz der gepaarten inhibitorischen und aktivie-renden Immunrezeptoren ist bisher kaum ver-standen. Es liegt jedoch nahe, eine Funktion bei der Feinabstimmung der Immunantwort zu vermuten. Einen wichtigen Hinweis auf die Entstehung der Immunrezeptorpaare lieferte die Entdeckung eines aktivierenden Moleküls innerhalb der Ly49-Familie in der Maus. Die bisher bekannten Mitglieder der Ly49-Familie sind inhibitorische Immunrezeptoren, die von natürlichen Killerzellen exprimiert werden und über die Erkennung von MHC-I-Molekülen eine Attacke gegen gesunde Zellen verhindern. Das murine Cytomegalievirus (MCMV) kodiert für ein MHC-ähnliches Protein (m157). Dieses viruseigene Protein bindet an die inhibitorischen Ly49-Rezeptoren und verhindert dadurch die Elimination virusinfi-zierter Zellen in MCMV-empfindlichen Mäu-sen. In MCMV-resistenten Mäusen wird ein zum Ly49 sehr nahe verwandter aktivierender Rezeptor (Ly49H) von NK-Zellen exprimiert, der an das m157-Protein bindet, was zu einer Aktivierung der NK-Zellen und dadurch zu

einem Schutz gegenüber dem MCMV führt. Aufgrund der hohen Homologie der beiden Rezeptoren wird vermutet, dass der aktivie-rende Rezeptor, als Reaktion auf den starken Selektionsdruck, der durch das Pathogen aus-geübt wurde, ausgehend vom inhibierenden Rezeptor entstanden ist. Dieser Mechanismus könnte für das Vorkommen vieler der „gepaarten Immunrezeptoren“ verantwortlich sein, obwohl dies bisher für keinen weiteren Rezeptor gezeigt werden konnte. Angata und Mitarbeiter haben kürzlich gepaarte Rezeptoren innerhalb der Siglec Familie beschrieben. Siglecs sind Lektine, die zu der IgSF gehören und Zuckerreste binden, die Sialinsäure enthalten. Das Siglec-Rezeptorpaar ist durch Genkonversion entstanden, eine Pathogen induzierte Entstehung wurde deshalb bezweifelt. Wäre der Grund für die Entstehung des aktivierenden Rezeptors der selektive Druck eines Pathogens, das an den inhibieren-den Rezeptors bindet, so sollte die Genkonver-sion vom inhibierenden Rezeptor zum aktivie-renden Rezeptor statt gefunden haben, dies war jedoch nicht der Fall. Um die Gründe für die Entstehung von „gepaarten Immunrezeptoren“ besser verstehen zu können haben wir die Evolution der CEA-Genfamilie untersucht. Die CEA-Genfamilie ist Mitglied der IgSF und zeichnet sich durch eine einzigartige spezies-spezifische Evolution aus. Das CEACAM1, eines der Urgene der CEA Genfamilie, hat durch extensive Genduplikation die Zusam-mensetzung und den Umfang der CEA-Genfa-milie bestimmt. CEACAM1 ist ein inhibieren-der Immunrezeptor, der von unterschiedlichen Leukozyten exprimiert wird. Sowohl im Men-schen als auch in der Maus konnten Pathogene identifiziert werden, die an CEACAM1 binden. Die CEA-Genfamilie und besonders die von CEACAM1 abstammenden Mitglieder sind daher interessante Kandidaten für die Suche nach Pathogen-induzierten „gepaarten Immun-rezeptoren“.

Ergebnisse: Innerhalb der CEA-Familie der Nager gibt es keine Oberflächenrezeptoren, die über aktivierende Signalmotive oder über Adaptorprotein-bindende transmembran Do-mänen verfügen. In der humanen CEA-Familie kennen wir dagegen zwei Rezeptoren (CEACAM3 und CEACAM4), die über so genannte ITAMs (immunoreceptor tyrosin-based activation motif) verfügen. Vor allem das CEACAM3 verfügt über eine extrazelluläre IgV-ähnliche N-Domäne, die der entsprech-enden Domäne des CEACAM1 sehr ähnlich

Immunologische Grundlagen 51

ist. In der Tat wurde gezeigt, dass Neisserien, die an CEACAM1 binden, auch mit CEACAM3 interagieren, dabei aber entgegen-gesetzte Signale auslösen, was im Fall der CEACAM3-Bindung zur Aufnahme und Zerstörung der Bakterien führt. Da beide Moleküle von Granulozyten exprimiert werden, erfüllen sie formal die Kriterien von „gepaarten Immunrezeptoren“. Ob sich beide Rezeptoren auch zelluläre Liganden teilen ist nicht bekannt. Durch die Fortschritte der unter-schiedlichen Genomprojekte hat man heute die Möglichkeit, die Struktur von Genfamilien in weiteren Spezies zu analysieren. Das Genom des Hundes ist neben dem des Menschen und der Maus nahezu vollständig sequenziert. Wir haben deshalb die CEA-Genfamilie des Hundes, im Hinblick auf das Vorkommen von „gepaarten Immunrezeptoren“, analysiert und nach Hinweisen gesucht, die für eine pathogen-getriebene Evolution dieser Rezeptoren sprechen. Außer 6 Spleißvarianten von CEACAM1 konnten wir Produkte von weiteren 5 Genen identifizieren und klonieren (Abb. 1). Von vier dieser Gene gibt es mindestens eine Spleißvariante die über ein ITAM im zytoplasmatischen Anteil verfügt. Auch das CEACAM24 besaß vermutlich bei seiner Entstehung ein ITAM, das aber durch eine Punktmutation in der Spleißdonorstelle eines Exons, das für die zytoplasmatische Domäne kodiert, verloren ging. Eines dieser Moleküle (CEACAM28) verfügt über eine N-Domäne, die sich von der N-Domäne von CEACAM1 nur in zwei Aminosäuren unterscheidet. Beide Aminosäuren liegen außerhalb, des für die homophile Interaktion von CEACAM1 zuständigen Bereichs. Es kann daher davon ausgegangen werden, dass CEACAM1 und CEACAM28 mit den gleichen Liganden, sowie auf heterotypische Weise, miteinander interagieren. Da sie aufgrund ihrer unterschiedlichen zytoplasmatischen Motive entgegengesetzte Signale transduzieren, handelt es sie bei diesen beiden Molekülen um typische „gepaarte Immunrezeptoren“.

Durch weitergehende Sequenzanalysen konnten wir zeigen, dass die Übereinstimmung der N-Domänen von CEACAM1 und CEACAM28 durch eine kürzlich statt-gefundene Genkonversion, wie sie in Abb. 2 dargestellt ist, hervorgerufen wurde. Die Richtung der Genkonversion, das heißt das Ersetzen des für die ursprünglichen N-Domäne des CEACAM28-kodierenden Genbereichs durch den korrespondierenden Bereich des CEACAM1, gibt einen entscheidenden Hinweis auf den möglichen Selektionsdruck, der zu diesem Ereignis geführt hat.

A2

B

N

SSA1

SS

SS N N N

CEACAM234L

CEACAM241L CEACAM25

1L 1S

A SS

N

CEACAM283L

2L1

A2 SS

N

A1 SS

A

N

SS

2L2

CEACAM30

A2

B

N

SSA1

SS

SSA2

B

N

SSA1

SS

SS A2 S

S

N

A2 SS

N

CEACAM14L 4S

2L 2S

1L 1S

NN

A2

B

N

SSA1

SS

SS N N N

CEACAM234L

CEACAM241L CEACAM25

1L 1S

A SSSS

N

CEACAM283L

2L1

A2 SS

N

A1 SS

A

N

SSSS

2L2

CEACAM30

A2

B

N

SSA1

SS

SSA2

B

N

SSA1

SS

SS A2 S

S

N

A2 SS

N

CEACAM14L 4S

2L 2S

1L 1S

NN

Abb. 1: Domänenorganisation der CEACAM1-verwandten Proteine des Hundes. Die Domänenorganisation wurde basierend auf Genomdatenbanken vorhergesagt und durch RT-PCR, Klonierung und Sequenzierung bestätigt. Die Anzahl der Ig-ähnlichen Domänen und das Vorhandensein einer langen (L) oder kurzen (S) zytoplasmatischen Domäne ist über der grafischen Darstellung der Proteine angegeben. Signalkonsensmotive sind als schwarze (ITIM), weiße (ITSM) und als graue (ITAM) Punkte dargestellt.


CEACAM1 CEACAM28

N

A1

B

A2

N

A1

A2

98%

92%

85%

L L 100%

5‘FR984 L64 Int I810 N360 Int II114

A

B

CEACAM1 CEACAM28

N

A1

B

A2

N

A1

A2

98%

92%

85%

L L 100%

5‘FR984 L64 Int I810 N360 Int II114

A

B

Abb. 2: Von der Genomkonversion betroffene Regionen von CEACAM1 und CEACAM28. Die 2332 bp große Region von CEACAM1, die etwa 1 kb der 5’-flankierenden Region (5’-FR), das Leader-Exon (L), das erste Intron (INT I), das N-Domänenexon (N) und einen Teil des zweiten Intron (INT II) umfasst, weist eine extrem hohe Ähnlichkeit (99%) mit dem entsprechenden Bereich in CEACAM28 auf. Dies deutet auf eine kürzlich stattgefundene Genkonversion hin. Demgegenüber weisen die homologen Bereiche stromauf und stromab nur eine Ähnlichkeit von 80% bzw. 92% auf (A). Den selben Schluss lässt der Vergleich des Leader, der N- und der A-Domänen auf Aminosäureebene zu (B).

Wie bereits angeführt, würde man von einem aktivierenden Rezeptor, der von einem Wirt als Maßnahme gegen eine Pathogenattacke ent-wickelt wurde, fordern, dass sich dieser dem inhibierenden Rezeptor, der vom Pathogen als zelluläre „Eintrittspforte“ verwendet wird, an-gleicht. Dadurch könnte der inhibierende Rezeptor weiter seine physiologische Funktion ausüben. Würde die Genkonversion dazu führen, dass der inhibierende Rezeptor sich dem aktivierenden angleicht, würde der inhi-bierende Rezeptor, zumindest zeitweise, seine natürliche Funktion verlieren. Fasst man also die hier gemachten Beobachtungen zusammen, kann man schließen, dass die dominierende physiologische Funktion von CEACAM1 aus-geübt wird. Und das ursprüngliche CEACAM28, zugunsten einer verbesserten Pathogenabwehr seine Funktion aufgegeben hat.

Hinweise über die Art des Pathogens, das im Hund möglicherweise das CEACAM1 als zellulären Rezeptor verwendet, lieferten die durchgeführten Expressionsanalysen. Wie in Abb. 3 gezeigt, werden beide Rezeptoren von peripheren Blut-T-Zellen koexprimiert.

C28-3

C30-2

GAPDH

C1-4

Tce

lls

Tce

lls(IL

-2)

PBMC

-Tce

llPB

MC-T

cell (

IL-2)

Tce

lls(P

HA)T

cells

(aCD3)

C1-2

C1-1C28-3

C30-2

GAPDHGAPDH

C1-4

Tce

lls

Tce

lls(IL

-2)

PBMC

-Tce

llPB

MC-T

cell (

IL-2)

Tce

lls(P

HA)T

cells

(aCD3)

C1-2

C1-1

Abb. 3: Entgegengesetzte Expression der „gepaarten Immunrezeptoren“ CEACAM1 und CEACAM28 in stimulierten T-Zellen. RNA wurde von aufgereinigten Lymphozytenpopulationen isoliert und mittels RT-PCR analysiert. Die CEACAM1-cDNA (C1*) ist in IL-2-stimulierten T-Zellen erhöht, während die CEACAM28-cDNA (C28*) erniedrigt ist. *Die Zahl nach dem Bindestrich gibt die Anzahl der Ig-Domänen in den gefundenen Spleißvarianten an.

Die natürliche Funktion von T-Zellen ist die Bekämpfung von intrazellulären Pathogenen (z. B. Viren). Dabei erkennen T-Zellen virus-infizierte Zellen entweder, über MHC-I-präsen-tierte, virusspezifischen Peptide mittels des T-Zellrezeptors oder über Interaktionen von T-Zell-eigenen koregulatorischen Oberflächen-molekülen mit vom Virus in der infizierten Zelle induzierten Oberflächenmolekülen. Handelt es sich um ein virusinduziertes Oberflächenprotein, das als Ligand von CEACAM1 fungiert, so würde dies ohne Koexpression von CEACAM28 in der T-Zelle dazu führen, dass über CEACAM1 ein inhibitorisches Signal in die T-Zelle transferiert wird, wenn sie eine virusinfizierte Zelle attackiert. Daraus würde unweigerlich in einer reduzierten Anti-Virus Immunantwort resul-tieren. Wie leicht einzusehen ist, würde die simultane Expression von CEACAM28 das CEACAM1 vermittelte inhibierende Signal aufheben oder sogar ins Gegenteil verwandeln. Wir denken daher, dass wir ein weiteres Immunrezeptorpaar gefunden haben, das Pathogen-induziert ist. Durch Kooperation mit einer englischen sowie einer amerikanischen Arbeitsgruppe versuchen wir nun, das an CEACAM1/CEACAM28-bindende Pathogen zu identifizieren.

R. Kammerer, T. Popp, S. Härtle 1, B.B. Singer 2, W. Zimmermann

Koop.: 1 Institut für Tierphysiologie, Universität München; 2 Institut für Anatomie, Universitätsklinikum Essen.

Immune-escape-Mechanismen 53

Funktionelle Inaktivierung Tumor-infiltrierender natürlicher Killer-zellen beim Nierenzellkarzinom Einführung: Tumorinfiltrierende natürliche Killerzellen (NK-TIL): NK-Zellen sind granu-läre Lymphozyten, die als Teil des angeborenen Immunsystems vor allem bei der Abwehr von Virus-infizierten Zellen eine bedeutende Rolle spielen. NK-Zellen sollten aber auch für die Erkennung von Tumorzellen entscheidend sein, da sie vor allem für die Eliminierung körpereigener Zellen zuständig sind und für ihre Aktivierung keine fremden oder neu exprimierten Antigene brauchen. Dies sind Eigenschaften von Tumorzellen, die es anderen Zellen des Immunsystems meist unmöglich machen, diese Zellen als entartet zu erkennen. Die NK-Zellen befinden sich in der Regel in einem Ruhezustand oder einem inaktivierten Zustand, um gesunde Körperzel-len vor einem Angriff dieser Lymphozyten zu schützen. Die Regulation der Aktivierung oder Inhibierung von NK-Zellen beruht auf einer fein austarierten Balance: Nicht infizierte oder nicht entartete Zellen besitzen vorwiegend Liganden für inhibitorische Rezeptoren (IR) der NK-Zellen und bewirken somit deren Ab-schaltung; infizierte Zellen oder Tumorzellen haben in den meisten Fällen dagegen eine verminderte Anzahl an Liganden für IR, so dass die NK-Zellen nicht ausreichend inhibiert werden. Auf diese Weise kommen Signale über aktivierende Rezeptoren (AR) zum Tragen und führen zu einer Eliminierung der Zielzellen. Liganden für IR sind vor allem Moleküle des sog. Haupthistokompatibilitätskomplexes (major histocompatibility complex, MHC), die von allen kernhaltigen Zellen des Körpers exprimiert werden (Abb. 1).

Akt.Ligand

MHC

+ -

IRAR

Abb. 1: Regulation der Aktivierung oder Inhibierung einer NK-Zelle durch aktivierende Liganden oder MHC-Mole-küle einer Zielzelle. AR: aktivierender Rezeptor, IR: inhibierender Rezeptor.

Somit ist jede Körperzelle mit normaler (aus-reichender) Expression von MHC-Molekülen vor einem Angriff von NK-Zellen geschützt. Tumorzellen zeichnen sich dagegen in den meisten Fällen durch eine Reduktion der MHC-

Moleküle auf der Zelloberfläche aus, um anderen Zellen des Immunsystems (T-Zellen, B-Zellen) zu entkommen, welche die MHC-Moleküle für die Erkennung und als aktivieren-des Signal benutzen. Das Immunsystem tritt diesem T-/BZell-escape-Mechanismus von Tumoren mit den NK-Zellen entgegen: NK-Zellen erkennen diese Reduktion der MHC-Moleküle und die so entarteten Zellen. Bisher ist allerdings nicht geklärt, warum NK-Zellen trotz dieser guten Voraussetzungen in der Regel nicht in der Lage sind, Tumorzellen zu erkennen und zu vernichten.

Im Labor für Tumorimmunologie wird seit längerer Zeit untersucht, warum NK-Zellen das Wachstum des Nierenzellkarzinoms (RCC) trotz alledem nicht verhindern. Wir konnten erstmals anhand einer spezifischen immuno-logischen Färbung von Tumorgewebe zeigen, dass alle Tumoren NK-Zellen enthalten und einige Tumoren sogar von einer sehr großen Zahl an NK-Zellen infiltriert werden. Um diese Zellen näher untersuchen zu können, wurden Lymphozyten schonend aus frisch entnom-menen RCC-Tumorgeweben isoliert und ex vivo einer phänotypischen und funktionellen Analyse unterzogen.

Ergebnisse: Die Untersuchungen zeigten, dass die NK-TIL im RCC-Gewebe in einem inaktiven Zustand vorliegen. Direkt aus dem Gewebe isolierte NK-TIL zeigten nur sehr geringe zytotoxische Aktivität gegenüber Tumorzellen. Erst eine Kurzzeitkultivierung mit Interleukin-2 (IL-2) konnte zu einer deutlichen Eliminierung der Tumorzellen führen.

Nicht alle Tumoren enthielten jedoch NK-Zellpopulationen, die über IL-2 zu einer deut-lichen Lyse aktiviert werden konnten. Es ließen sich zwei verschiedene Tumortypen unter-scheiden: Tumoren mit einem hohen Prozent-satz an NK-Zellen (> 20%, high-NK-TIL), die sich als aktivierbar erwiesen, und Tumoren mit einem niedrigeren Prozentsatz an NK-Zellen (< 20%, low-NK-TIL), die sich nicht durch Kurzzeitstimulation aktivieren ließen (Abb. 2).

Weitere Analysen zeigten überraschende Unterschiede in der CD16-Expression zwischen beiden von uns definierten Tumorgruppen: high-NK-TIL waren haupt-sächlich CD16high und zeigten daher einen für zytotoxische NK-Zellen charakteristischen Phänotyp. Low-NK-TIL waren dagegen vorwiegend CD16neg/dim und zeigten somit den


Phänotyp der geringer zytotoxisch wirkenden NK-Zellen (Tab. 1, Abb. 3).

% s

pezi

fisch

e Ly

se

Abb. 2: Zytotoxische Aktivität von NK-PBMC im Ver-gleich zu high-NK-TIL und low-NK-TIL. * Zytotoxizität gegen die HLA-negative Erythroleukämie-Zelllinie K562 mit einem Effektor-zu-Zielzell-Verhältnis von 20:1 oder 40:1. � NK-Zell-Anreicherung zu 60-95%. � Drei Proben der high-NK-TIL wurden nicht angereichert und enthielten zwischen 35% und 42% NK-Zellen (Schleypen et al. Clin. Canc. Res. 2006).

43.5 ( 24.8 – 68.9 )**12.2 ( 5.9 – 17.9 )14low-NK-TIL

89.8 ( 82.0 – 96.9 )**35.4 ( 22.0 – 62.1 )7high-NK-TIL

59.3 ( 24.8 – 96.9 )22NK-TIL �

89.5 ( 72.4 – 98.7 )12.7 ( 2.0 –26.0 )13NK-PBMC §

% CD16+ (range) ‡% NK (range) †N*

Tab. 1: Expression von CD16 auf NK-TIL. * Zahl der untersuchten Spender. † Prozentsatz CD3-CD56+-NK-Zellen. ‡ Prozentsatz CD16+-Zellen innerhalb der CD3-CD56+-NK-Zellen. § NK-Zellen im peripheren Blut von RCC-Patienten. � Tumor-infiltrierende Lymphozyten wurden direkt aus dem Gewebe isoliert und analysiert. ** Der p-Wert zwischen beiden Gruppen an NK-TIL-Zellen war < 0,0001 (Wilcoxon Test) (Schleypen et al. Clin. Canc. Res. 2006).

Die Bedeutung der CD16-Expression bei NK-vermittelter Eliminierung von Tumorzellen ist noch unklar. Auch für die NK-PBMC wird kontrovers diskutiert, ob die CD16neg/dim-Popu-lation eine eigene funktionelle Subpopulation ist oder, ob es sich um terminal differenzierte NK-Zellen handelt.

Ferner zeigte sich, dass NK-TIL ein zu NK-Zellen der Peripherie unterschiedliches Expres-sionsmuster an inhibitorischen Rezeptoren auf-weisen, die eventuell für die Inaktivierung der NK-Zellen im Tumor verantwortlich sein könn-ten.

Abb. 3: Korrelation zwischen der Häufigkeit von NK-Zellen in TIL und der CD16high-Subpopulation im Ver-gleich zu NK in PBMC (Schleypen et al. Clin. Canc. Res. 2006).

Ein weiterer phänotypischer Unterschied zwi-schen beiden Tumortypen zeigte sich in der Expression der zytotoxischen Effektormoleküle Perforin, Granzym A und Granzym B (Zytoto-xine), die an der Kontaktstelle zwischen NK-Zelle und Zielzelle sezerniert sowie von der Zielzelle aufgenommen werden und den Tod der Zielzelle über die Aktivierung von Caspasen verursachen. Intrazelluläre Fluores-zenz-Färbungen konnten zeigen, dass annähernd alle high-NK-TIL ähnlich wie die NK-PBMC die drei Zytotoxine exprimierten, wogegen sich ein sehr viel geringerer Prozentsatz an low-NK-TIL positiv für diese Effektormoleküle zeigte. Auch diese Beobachtung korrelierte mit dem funktionellen Status der jeweiligen NK-Zellen beider Tumortypen.

Fazit: Obgleich es derzeit unbekannt ist, warum einige RCC-Tumoren mehr NK-TIL aufweisen, könnte die Beobachtung, dass die Anzahl der NK-TIL mit einer charakteristischen Funktion assoziiert ist, zukünftig als prädiktiver Marker dienen. Für einige solide Tumoren korreliert die Präsenz von NK-TIL mit einem besseren Überleben. Zumindest in der Untersuchung unseres kleinen Patientenkollektives konnten interessanter-weise in der Gruppe mit den funktionellen NK-TIL keine Patienten mit Fernmetastasen gefunden werden.

J.S. Schleypen, N. Baur 1, K. Rohrmann 2, R. Kammerer, C.S. Falk 1, E. Nössner 1, D.J. Schendel 1, H. Pohla

Koop.: 1 Institut für Molekulare Immunologie, GSF; 2 Urologische Klinik, Klinikum der Universität München.

Förderung: Strategiefond III der Helmholtz-Gemeinschaft; KKG „Immuntherapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF); Deutsche Krebshilfe, SFB571.


Die Rolle der Chemokine in soliden Tumoren

Einführung: Obwohl häufig eine starke lymphozytäre Infiltration solider Tumoren stattfindet, führt dies nicht zu einer effektiven Kontrolle der Tumorprogression. Es stellt sich deshalb die Frage, ob die Akkumulation von immunkompetenten Zellen im Tumor tat-sächlich, wie meist angenommen, ein Zeichen einer stattfindenden immunologischen Anti-tumorreaktion darstellt oder ob der Infiltration des Tumorgewebes durch immunkompetente Zellen andere Mechanismen zugrunde liegen. Deshalb wollten wir klären, ob die Tumorzellen selbst, entweder in aktiver (Sekretion von Chemoattraktoren) oder passiver (Sekretion von Migrationsinhibitoren) Form an der Leukozytenanreicherung im Tumor beteiligt sind.

Ergebnisse: Wir fanden, dass sich sowohl kolorektale Karzinomzellen als auch Nieren-zellkarzinomzellen aktiv an der Rekrutierung des Immuninfiltrates durch Sekretion von Chemokinen beteiligen. Unter diesen Chemo-kinen befanden sich auch solche, die durch Interaktion mit dem selektiv auf aktivierten T- und NK-Zellen exprimierten Chemokinrezeptor CXCR3 ihre Wirkung entfalten (Abb 1).

Die Sekretion dieser Chemokine wird durch die Stimulation der Tumorzellen mit pro-inflammatorischen Zytokinen noch beträchtlich gesteigert, was funktionell zu einer verstärkten Rekrutierung von aktivierten T-Zellen führt. Daraus muss man folgern, dass sich maligne Zellen verschiedener Tumorentitäten, scheinbar paradoxerweise, aktiv an der immunologischen Antitumorantwort beteiligen. Man sollte aber berücksichtigen, dass eine entzündliche Reaktion im Tumor auch vorteilhaft für den Tumor sein kann, da in entzündeten Geweben die Neoangiogenese verstärkt und Proteasen vermehrt freigesetzt werden, was die Metastasierung der Tumoren erleichtern kann. Auf der anderen Seite kann sich der Tumor vor den negativen Folgen der Immunreaktion durch so genannte Immune-escape-Mechanismen schützen. Am effektivsten sind solche, die durch das von aktivierten Lymphozyten freigesetzte IFNγ angeschaltet werden, da dadurch der Tumor die erhöhte Aktivität des Immunsystems erkennen und zeitgleich neutralisieren kann. In dem wir zeigen konnten, dass Nierenzellkarzinomzellen als Reaktion auf eine Attacke von zytotoxischen Zellen, CEACAM1 exprimieren, gelang es uns solch einen Immune-escape-Mechanismus zu identifizieren. Das von Tumorzellen

A

B

C

T

T

T

A

B

C

T

T

T

Abb. 1: Immunhistologischer Nachweis von CXCL10 (A) und CXCR3 (B, C) in kolorektalen Karzinomen (CRC). Die immunhistologischen Untersuchungen zeigen, dass das Chemokin CXCR3 in einigen CRC konstitutiv von den Tumorzellen (T) exprimiert wird (A). Einige positive, dunkelgefärbte Areale sind mit weißen Pfeilen hervorgehoben. Ebenso konnten in den meisten Tumoren eine große Anzahl von CXCR3-positiven Lymphozyten nachgewiesen werden (B, C). Während sich die infiltrierenden T-Zellen bei Tumor T31 (B) gleichmäßig verteilt innerhalb der Tumorzellnester befinden, sind die infiltrierenden CXCR3-positiven T-Zellen im Tumor T77 (C) vorwiegend im Tumorstroma lokalisiert. Tumor-bereiche mit einer starken Infiltration mit CXCR3-positiven T-Zellen sind durch schwarze Pfeile markiert.

exprimierte CEACAM1 kann über eine homophile Interaktion mit CEACAM1 auf aktivierten T- bzw. NK-Zellen deren zyto-toxischen Aktivität inhibieren. Findet keine akute Immunreaktion mehr statt, kann die


Tumorzelle die CEACAM1-Expression wieder einstellen. Wir sind beim CRC auch der Frage nachgegangen, wie sich das Chemokinmilieu des Primärtumors von dem des korrespon-dierenden Normalgewebes bzw. der Metastasen unterscheidet. Die Analyse von 58 Microarray-Datensätzen (15 Primärtumoren, 14 Metas-tasen, 29 Normalgewebe) ergab zwar ein vergleichbares Chemokinmuster in diesen drei Geweben, allerdings waren auch interessante Unterschiede zu finden. So waren die IFNγ-induzierbaren Chemokine in den Primär-tumoren regelmäßig überexprimiert, während einige auf aktivierte T-Zellen und/oder reife dendritische Zellen chemotaktisch wirkende CC-Chemokine in den malignen Geweben herunterreguliert waren. Weitere Analysen von Microarray-Datensätzen in öffentlichen Daten-banken ergaben, dass unterschiedliche Tumor-entitäten, charakteristische Chemokinmuster aufweisen (Abb. 2).

0 500 1000

Prostata

Blase

Brust

Kolon

Magen

Niere

Leber

Ovar

Pankreas

Lunge

CCL20CXCL8CX3CL1CXCL12CXCL3

1000 2000

Relative Expression

Tum

oren

titä

t

Abb. 2: Vergleich der Chemokinexpression in verschiedenen Tumorentitäten. Dargestellt sind die Mittelwerte und die Standardabweichungen der relativen Expression der Chemokine. Den Daten lagen Expressionsprofile von 175 humanen Tumoren zugrunde, die unter http://source.stanford.edu (carcinoma classifi-cation) zugänglich sind.

Anhand dieser Chemokinmuster ließen sich drei verschiedene Tumorgruppen benennen. Bei dieser Einteilung spielt die Expression eines „Leitchemokins“ die entscheidende Rolle. Wie in Abb. 2 ersichtlich ist, zeichnen sich das kolorektale Karzinom, das Lungenadenokarzinom, das Blasenkarzinom sowie das Magenkarzinom durch die starke Expression von CCL20 aus (CCL20-Gruppe). Demgegenüber exprimieren das Nierenzell-karzinom, das Prostatakarzinom, das Brust-drüsenkarzinom sowie das Ovarialkarzinom große Mengen an CX3CL1 (CX3CL1-Gruppe). Die dritte Gruppe, zu der das Leberkarzinom und das Pankreaskarzinom gehören, ist durch die nahezu gleich starke Expression von CCL20 und CX3CL1 gekennzeichnet.

Ob sich solche typischen Chemokinmuster in der Zusammensetzung des Tumorinfiltrates widerspiegeln, haben wir am Beispiel des Nierenzellkarzinoms untersucht. Dabei ergab sich, dass die Expression der Chemokine CX3CL1 bzw. CXCL12 mit der Infiltration von CD16+- bzw. CD16--NK-Zellen im Nieren-zellkarzinom korreliert. Der für das Chemokin CX3CL1 spezifische Rezeptor CX3CR1 wird von CD16+, nicht jedoch von CD16--NK-Zellen exprimiert. Da die CD16+-NK-Zellen nach IL-2-Stimulation eine stärkere zytotoxische Aktivität aufwiesen als die CD16-

-NK-Zellen, vermuten wir, dass Patienten mit einem hohen CD16+-NK-Zellanteil im Tumor stärker von einer IL-2-basierenden Immun-therapie profitieren, als Patienten mit einem geringen CD16+-NK-Zellanteil. Dies könnte in einer klinischen Anwendung münden, bei der die recht einfach, mittels quantitativer RT-PCR, zu bestimmende Expression dieser Chemokine im Primärtumor als Kriterium für die Anwendung einer häufig nebenwirkungs-reichen IL-2-basierten Immuntherapie verwendet werden könnte.

R. Kammerer, M. Földi 1, A. Hennig, T. Popp, H. Pohla, K.M. Skubitz 2, W. Zimmermann

Koop.: 1 Frauenklinik, Universität Freiburg; 2 Hematology, Oncology and Transplantation, University of Minnesota.



Indolamin-2,3-dioxygenase-Expression in Tumorendothelzellen korreliert bei Nierenzellkarzinompatienten mit einer besseren Prognose

Nur ein begrenzter Anteil von Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom (RCC) pro-fitiert von der sehr kostenintensiven und mit er-heblichen Nebenwirkungen vergesellschafteten Zytokinimmuntherapie. Es wäre daher wün-schenswert, mit Hilfe geeigneter prognostischer Marker aus dem Kollektiv von Patienten die-jenigen herauszufinden, die auf eine solche Immuntherapie ansprechen. Da das RCC zu den wenigen immunogenen Tumoren gehört, deren Wachstum nur bei einem Teil der RCC-Patienten durch unspezifische Immuntherapien mit Zytokinen vermindert werden kann, liegt es nahe, dass Immune-escape-Mechanismen bei dieser Tumorart von Bedeutung sind.

Indolamin-2,3-dioxygenase (IDO), ein Schlüs-selenzym für den Tryptophanabbau, scheint maßgeblich dafür verantwortlich zu sein, dass Schwangere keine Abstoßungsreaktionen gegen den Fötus entwickeln. Der sich ent-wickelnde Embryo besitzt mit der Expression von IDO ein Mittel, um eine Immunsup-pression bei der Mutter zu erwirken und so ge-zielt die zur normalen Entwicklung notwendige Toleranz selbst zu induzieren. Diesen Mecha-nismus macht sich der Tumor zu Nutzen: Die Hemmung von Tumor-infiltrierenden T-Zellen durch lokale Depletierung der essentiellen Aminosäure Tryptophan oder durch toxische Tryptophanabbauprodukte, wie Kynurenin, er-möglicht den normalerweise durch das Immun-system eliminierten Tumoren das weitere Wachstum. Viele menschliche Tumoren expri-mieren IDO, so auch das RCC. Aufgrund der außergewöhnlichen Empfindlichkeit von T-Zellen gegenüber Tryptophanmangel kann die Aktivität dieser Zellen auch durch Expression von IDO in Immunsystem-regulierenden Zel-len, wie dendritischen Zellen, gesteuert werden. In einem Mausmodell konnte gezeigt werden, dass Tumorzellen durch konstitutive IDO-Expression der Kontrolle durch das Immunsystem entkommen können. In einer Reihe aktueller Publikationen konnte tatsächlich gezeigt werden, dass, zumindest für bestimmte Tumoren (Ovarialkarzinom, Kolonkarzinom), eine Korrelation zwischen der IDO-Expression in Tumoren und einem ungünstigen Krankheitsverlauf besteht.

In diesem Projekt haben wir deshalb eine grö-ßere Anzahl von klarzelligen RCC-Geweben (jeweils 60 Primärtumoren und Metastasen) sowie „Normalgewebe“ von 30 Tumor-tragen-

den Nieren auf IDO-Expression mit Hilfe von quantitativer RT-PCR und exemplarisch einige davon mit IDO-spezifischen Antikörpern ver-gleichend untersucht und mit dem Überleben der Patienten korreliert. Auf diese Weise sollte geklärt werden, ob die Expression von IDO im RCC zum Unterlaufen der Tumorbekämpfung durch das Immunsystem führen kann.

Abb. 1: IDO-Expressionsanalyse mittels quantitativer RT-PCR von Nierennormalgeweben, RCC-Primärtumoren und RCC-Metastasen (Einzelauftragung nach Organlokalisation im rechten Teil der Abb.). Die relative IDO-cDNA-Menge wurde anhand des �-Aktin-cDNA-Gehalts normalisiert. Für einen Teil der Patienten ist nur sehr wenig IDO-mRNA im Tumorgewebe nachweisbar (� 10 AU).

Im Vergleich zum Nierennormalgewebe, in dem in der Regel IDO-mRNA nicht nachweis-bar war, enthielten die RCC-Tumoren sehr va-riable in rund 2/3 der Fälle erhöht IDO-mRNA-Mengen. Es zeigte sich kein deutlicher Unter-schied der IDO-Expression in Abhängigkeit von der Organlokalisation der Metastasen. Eine Ausnahme bilden möglicherweise IDO-nega-tive Knochen-, Gehirn- und Brust-Metastasen, die allerdings nur in einer kleinen Zahl unter-sucht wurden (Abb. 1). Bei einer kleinen Sub-gruppe von Patienten konnte sowohl der Pri-märtumor als auch eine davon abstammende Metastase untersucht werden. Interessanter-weise korrelierte die Expression in beiden Ge-weben (R2 = 0,71), was dafür spricht, dass IDO-Expression eine stabile Eigenschaft des Tumors darstellt.

Kaplan-Meier-Analysen ergaben, dass wider Erwarten Patienten mit erhöhtem IDO-mRNA-Gehalt in ihrem Tumor tendenziell länger leben (Primärtumor: p = 0,13; Metastasen: p = 0,15).


IDO

A

CEACAM1

b

C

b

CD34

B

b

Abb. 2: Tumorendothelzellen sind für die Expression von IDO im RCC verantwortlich. Zur Lokalisation von IDO-exprimierenden Zellen in RCC wurden die RCC-Schnitte mit einem IDO-spezifischer monoklonaler Maus-Antikör-per (mAk) (A), einem Endothelzell-spezifischen anti-CD34-mAK (B) oder einen Maus-anti-CEACAM1-mAK (C) immunhistologisch gefärbt. Man beachte die differentielle Färbung der Kapillargefäße (alle sichtbar durch anti-CD34-Markierung) durch den anti-IDO-mAk, der in begrenzten Arealen (links der Bindegewebssepte) kleine (Pfeile) und oft auch große Gefäße (gefüllte Pfeilspitzen) markiert. CEACAM1, das bevorzugt in kleinen unreifen, neu gebildeten, nicht jedoch in großen Tumorgefäßen (offene Pfeilspitzen) exprimiert wird. b: Bindegewebssepte.

Immunhistologische Färbungen ergaben, dass IDO fast ausschließlich in Endothelzellen der Tumorgefäße, vernachlässigbar wenig in infil-trierenden CD45+-Leukozyten detektierbar ist. Die Identität dieser Strukturen konnte durch den etablierten Endothelzellmarker CD34 bzw. Leukozytenmarker CD45 (nicht gezeigt) bestä-tigt werden. Allerdings war meist nur ein klei-ner Teil aller Endothelzellen IDO-positiv. Es gab oft große Tumorareale, in denen alle Gefäßendothelien IDO-negativ waren (Abb. 2). Bei den IDO-positiven Kapillaren dürfte es

sich meist um neu gebildete Blutgefäße handeln, da sie fast immer auch CEACAM1, einen Marker für Neoangiogenese in Tumoren, exprimierten (Abb. 2). Der Mechanismus der möglicherweise auf das RCC beschränkten IDO-Expression in Tumorendothelzellen ist unklar. Möglicherweise ist Interferon- (IFN-), ein TH1-Immunreaktionen-anzeigendes Zytokin, an der Induktion des IDO-Gens beteiligt. Wir konnten nämlich zei-gen, dass in vitro IFN- in der Lage ist, in primären menschlichen mikrovaskulären En-dothelzellen der Haut (HDMEC) IDO-mRNA und IDO-Protein zu induzieren (Abb. 3).

BA

+ IFN�

- IFN�

0

1000

2000

IND

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A-G

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- IFN� + IFN�

Abb. 3: IDO-mRNA und -Protein kann durch IFN- in HDMEC induziert werden. HDMEC wurden für 2,5 Tage mit oder ohne 80 ng/ml IFN- kultiviert. Der IDO-mRNA-Gehalt der Zellen wurde mittels quantitativer RT-PCR bestimmt und mittels ihres �-Aktin-cDNA-Gehalts normalisiert (A). IDO-Protein wurde in sedimentierten HDMEC (Zytospin) immunhistologisch wie in Abb. 2 nachgewiesen (B).

Aufgrund dieser Befunde spekulieren wir, dass IDO in Tumorendothelzellen den Zutritt der essentiellen Aminosäure Tryptophan in den Tumor reduzieren und so, zumindest regional, das Tumorwachstum behindern könnte. Diese Hypothese kann nun an Tiermodellen überprüft werden. Falls sich diese Hypothese verifizieren lässt, soll in Zukunft untersucht werden, ob sich die Expression von IDO in Tumoren-dothelzellen selektiv steigern oder auch in an-deren Tumorentitäten induzieren lässt. Dies könnte zu neuartigen Therapieansätzen in der Onkologie führen.

R. Riesenberg, O. Spring, M. Castro, T. Popp, S. Neckermann, A. Buchner, R. Kammerer, C. Weiler 1, O. Takikawa 4, R.A. Hatz 3, C. Stief 2, W. Zimmermann

Koop.: 1 Institut für Pathologie, 2 Urologische Klink, 3 Chirurgische Klinik, Klinikum der Universität München; 4 National Center for Geriatrics and Gerontology, Gengo, Japan.

Förderung: Förderprogramm Promotionsstudium “Mole-kulare Medizin” der Universität München (02/2004); Deutsche Krebshilfe (106141).

Antigene Zielstrukturen 59

Identifizierung antigener Zielstrukturen auf RCC-26 und primären RCC-Zellen

In den letzten Jahren wurden mehrere neue Technologien wie subtraktive Hybridisierung, Microarray-Analysen, Screening von Expres-sionsbanken mit Antikörpern und Proteom-analysen beschrieben, die einen Vergleich des Expressionsprofils zwischen Tumorgewebe und Normalgewebe erlauben. Mit diesen neuen Technologien können umfangreiche Datensätze gewonnen werden. Davon ausgehend wurden zahlreiche Gene beschrieben, die ein unter-schiedliches Expressionsprofil im Tumorge-webe gegenüber Normalgewebe aufweisen. Mit Hilfe von Computer-Algorithmen können für diese differentiell exprimierten Gene auch Epitope vorhergesagt werden, die an MHC-Moleküle binden können. Mühsam wird es dann, mit Hilfe geeigneter funktioneller Nach-weissysteme die biologische und klinische Relevanz dieser Epitope abzuklären. Dennoch wurden mit diesen neuen Verfahren einige sehr interessante Kandidaten für das Nierenzellkar-zinom gefunden. Antigene mit potentieller Relevanz sind das Her2/neu-Antigen, das Wilms' Tumorsuppressor-Antigen WT1 und insbesondere CA-IX/G250. Sie enthalten jeweils antigene Epitope, die über HLA -A2 präsentierten werden und von T-Zellen erkannt werden können.

RCC-26

Säure-Elution der Peptiderp-HPLC / Sequenzierung

HPLCHPLC

„„in in silicosilico““

Datenbanken

Peptid-Nonamere

NKC-26 Vakzine

MicroarraysMicroarrayscDNA

qRT-PCR

Abb. 1: Strategien zur Identifizierung Tumor-assoziierter Antigene (TAA) beim RCC. Mittels quantitativer real time-RT-PCR wird abschließend die Expression der Genkandidaten in Geweben und etablierten Zelllinien von Tumor (z. B. RCC-26 Vakzine) und Normalniere (z. B. NKC-26) überprüft.

Mittels dieser Datenbankenanalysen sowie eines biochemischen Ansatzes über reverse phase HPLC-Analyse von MHC-eluierten Pep-tiden aus der RCC-Linie RCC-26 konnten mehrere Peptide identifiziert werden, die auf

primärem RCC-Gewebe, auf RCC-26 sowie auf den Vakzinezelllinien RCC-26/CD80/IL-2 und RCC-26/CD80/IL-7, nicht jedoch auf Normalnierengewebe exprimiert werden (Kooperation Dr. Bernhard Frankenberger, Dr. Elfriede Nössner, GSF; Dr. Stefan Stevanovic, Tübingen; Abb. 1-3). Abb. 2 zeigt beispielhaft die Genexpressionsanalyse des Antigens EGFR (epidermal growth factor receptor).

1 21.9

419

105

719

0

200

400

600

800

NKC-I NKC-II NKC-III RCC-I RCC-II RCC-III

Abb. 2: Quantitative Real-time-RT-PCR von EGFR in verschiedenen primären RCC-Geweben und den jeweiligen Normalnierengeweben (NKC) (die Zahlen bedeuten n-fache Überexpression). Unten ist zum Vergleich die elektrophoretische Auftrennung der PCR-Amplifikate im Agarosegel gezeigt.

CA

-IX

ILG

F-B

P3

Cyc

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urvi

vin

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AM

E

RCC26 IL2/B7 - +++ +++ +++ ++ ++++ - +++RCC26 IL7/B7 - ++++ +++ +++ ++ ++++ + +++

ELA

CR

GS

5O

FA

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P 7

VE

GF

VIM

+ - ++ - ++ + - - + ++

Tab. 1: Expressionsanalyse einiger Genkandidaten in den RCC-26–Vakzine-Zelllinien mittels quantitativer Real-time-RT-PCR.

In Tab. 1 sind einige unserer in RCC überexprimierten Antigenkandidaten und ihr Expressionsprofil in den RCC-26-Vakzine-Zelllinien gelistet. Insgesamt haben wir bis jetzt 32 verschiedene Antigene identifizieren können. Für diese haben wir 78 Peptid-Epitope mit HLA-A2-Bindungsmotiv für das Immun-monitoring unserer klinischen Phase-I-Studie ausgewählt und von R. Frank (Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Abteilung für Chemische Biologie, Braunschweig) syntheti-sieren lassen.

H. Pohla, B. Stadlbauer, A. Buchner, B. Frankenberger 1, E. Nössner 1, A. Slusarski 1, S. Stevanovic 2, D.J. Schen-del 1

Koop.: 1 Institut für Molekulare Immunologie, GSF; 2 Institut für Immunologie, Eberhard-Karls-Universität Tü-bingen.

Förderung: KKG „Immuntherapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF).


Identifizierung von Prognosefaktoren und antigenen Zielstrukturen an Laser-mikrodissezierten Nierenzellkarzinom-Metastasen mittels Transkriptomanalysen

Das Nierenzellkarzinom führt in Deutschland zu etwa 12.000 Neuerkrankungen jährlich. Etwa ein Drittel der Patienten haben zum Dia-gnosezeitpunkt bereits Metastasen, ein weiteres Drittel entwickelt sie im weiteren Verlauf. Für das metastasierte Nierenzellkarzinom existieren bei weitgehender Strahlen- und Chemo-resistenz als systemische Therapieoptionen eine kostenintensive und nebenwirkungsreiche unspezifische Immuntherapie auf der Basis von Zytokinen (meist Interleukin-2 und Interferon-alpha) mit Ansprechraten von maximal ca. 30% sowie die neuen Kinaseinhibitoren, die anti-angiogenetisch und antiproliferativ wirken, jedoch meist nur zu einer vorübergehenden Stabilisierung der Erkrankung führen. Abgesehen von der TNMG-Klassifikation gibt es keine tumorbezogenen prognostischen Parameter, so dass eine präzise Abschätzung des Progressionsrisikos und somit ein individuell angepasstes therapeutisches Vor-gehen kaum möglich sind.

Mit bisher üblichen methodischen Ansätzen wie RT-PCR, Western Blot und Immunhisto-chemie gelang es nicht, Zielstrukturen auf den Tumorzellen für eine spezifische Therapie oder neue Prognosefaktoren zu definieren, was nicht zuletzt an der sehr großen Zahl von Kandidatenmolekülen liegt. Seit einigen Jahren ist die Microarray-Technologie verfügbar, die eine simultane Überprüfung sehr vieler, im Ide-alfall aller in Frage kommenden Moleküle ermöglicht. Gerade im Bereich der Nukleinsäu-ren-Diagnostik ist inzwischen ein sehr hoher methodischer Standard erreicht; die aktuell ver-fügbare Generation von Oligonukleotid-Arrays (GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0, Affymetrix) erlaubt die Beurteilung der Expression von ca. 47.000 Sequenzen auf mRNA-Ebene, was annähernd einem genom-weiten Screening entspricht. Die Anwendung dieser Technologie erlaubt erstmals eine effektive, globale Suche nach prognostisch relevanten und als Therapie-Target geeigneten Molekülen in Tumoren. Die Haupt-fragestellungen lauten:

• Gibt es potentielle Zielstrukturen für eine spezifische Immuntherapie?

• Finden sich prognostisch relevante Gen-expressionsmuster?

• Sind (Immun-)Therapieresponder identifi-zierbar?

Zum Nierenzellkarzinom existieren erst wenige publizierte Daten, die meist auf sehr kleinen Serien von untersuchten Gewebeproben beru-hen und mit weniger komplexen Microarrays (cDNA-Arrays oder früheren Versionen von Oligonukleotid-Arrays) erhoben wurden. In der Regel wurde Primärtumorgewebe analysiert, Metastasen nur vereinzelt. Stets wurde die RNA aus „makroskopischen“ Gewebestücken isoliert, so dass die Stromaanteile des Tumors zwangsläufig für einen Teil der gemessenen Genexpression verantwortlich sind und damit einen Bias verursachen. Seit kurzem verfügbare Protokolle zur linearen RNA-Amplifikation erlauben zusammen mit der Technologie der Laser-Mikrodissektion Transkriptom-Analysen an sehr präzise defi-niertem Material, da gezielt vitale Tumorareale berührungsfrei isoliert und der RNA-Extraktion zugeführt werden, nicht aber Bindegewebs-brücken, große Gefäße, Nekrosen oder andere nicht relevante Zonen der Gewebeprobe. Dies minimiert die Verzerrung der Expressionsdaten durch Nicht-Tumorzellen.

Die Gewebeproben werden so rasch wie mög-lich nach Entnahme aus dem Tumor- bzw. Metastasen-Präparat durch den Pathologen in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Von den Proben werden Serienschnitte im Kryostat her-gestellt und das Gewebe mittels Übersichtsfär-bung inspiziert. Schnitte der Dicke 16 µm wer-den auf spezielle Polyethylenfolie-Objektträger aufgezogen, dann fixiert und gefärbt.

Bei der Mikrodissektion (Gerät: P.A.L.M. Mic-roBeam; Prinzip: Abb. 1) werden Tumorzell-areale mitsamt der Trägerfolie durch den fokussierten N2-Laser erst umschnitten und so von der Umgebung abgetrennt. Dann wird das isolierte Areal durch einen einzelnen Laserim-puls in den direkt darüber positionierten Deckel eines speziellen Reaktionsgefäßes katapultiert und bleibt dort haften. Sind alle interessanten Gewebeareale auf diese Weise in den Deckel transferiert, wird das Gewebe lysiert und die RNA extrahiert. Alternativ sind auch weitere Downstream-Analysen möglich, beispielsweise auf Protein-Ebene. In einem Proof-of-principle-Kooperationsprojekt konnte die erfolgreiche Analyse differentiell exprimierter Proteine an mikrodisseziertem Nierentumor-gewebe demonstriert werden (J. Proteome Res. 2005).


Abb. 1: Prinzip der Laser-Mikrodissektion: Die relevanten Gewebeareale auf dem Objektträger werden zunächst mit dem Laser von der Umgebung isoliert und danach (auf der Trägerfolie) berührungsfrei in das Auffanggefäß transfe-riert (Grafik mit freundlicher Genehmigung von P.A.L.M. Microlaser Technologies AG, Bernried).

Die RNA wird nach der Extraktion mittels Kapillarelektrophorese (Agilent 2100 Bio-analyzer mit RNA 6000 Pico LabChip-Kit) auf Integrität überprüft (Abb. 2). Intakte Proben werden mit zwei Zyklen reverser Transkription und linearer In-vitro-Transkription amplifiziert und dann auf das Microarray hybridisiert. Dort ist jedes Transkript durch je 11 Perfect-match- und 11 Mismatch-Areale (Quadrate mit 11 µm Kantenlänge) repräsentiert. Durch Laser-Fluoreszenzmessung dieser Areale erhält man zu jeder Gewebeprobe einen Rohdatensatz für ca. 47.000 Gene (inkl. Varianten; jeweils 22 Messwerte).

Abb. 2: Beispiel für intakte RNA (4 ng/µl) aus einer mikrodissezierten Nierenzellkarzinom-Metastase (Kapillar-elektrophorese). Die ribosomale 18S- und 28S-RNA bildet klare Peaks, keine Degradation; diese Probe ist zur weiteren Analyse geeignet.

Aus den Rohdaten wird nach Normierung der Arrays mit einem aufwändigen Algorithmus für jedes Gen in jeder Gewebeprobe ein

Expressionswert bestimmt. Diese Datensätze werden für alle folgenden Analysen verwendet. Dabei kommen komplexe Verfahren aus derzeit sechs verschiedenen für Expressions-daten spezialisierten Softwarepaketen zum Einsatz.

Zwischen Metastasen in verschiedenen Organen gibt es keine typischen Unterschiede im Expressionsprofil (Abb. 3). Dagegen zeigen Metastasen meist deutliche Ähnlichkeit zum zugehörigen Primärtumor (Analyse von 10 korrespondierenden Probenpaaren).

Abb. 3: Nierenzellkarzinom-Metastasen in verschiedenen Organen (Farbcode) unterscheiden sich nicht im Expressionsprofil. Die 3D-Darstellung der ersten drei principal components zeigt keine Gruppierung der Proben.

Derzeit werden funktionelle Analysen der Expressionsdaten durchgeführt, die erstmals gemeinsame Veränderungen in Signal-transduktions- und Stoffwechselwegen der Tumorzellen in den Metastasen aufzeigen. Dies kann einen Ansatzpunkt darstellen zur Entwicklung neuer, zielgerichteter Therapie-verfahren.

Von 28 Patienten mit klarzelligen Nierenzell-karzinom-Metastasen liegen Follow-up-Daten vor. Mit dem neuartigen Verfahren der semi-supervised principal components analysis (mit leave-one-out-cross validation (LOOCV) und Permutationstest; Bair E and Tibshirani RJ 2004) konnte eine Signatur aus 3 Genen bestimmt werden, die unabhängig von der TNMG-Klassifikation der Patienten eine signifikante Unterscheidung zwischen zwei Prognosegruppen ermöglicht (Abb. 4). Der nächste Schritt ist jetzt die Validierung dieser Gensignatur an weiteren Patienten mittels RT-PCR, um eine zuverlässige prognostische Stratifizierung und damit ein individuell optimales therapeutisches Vorgehen zu ermöglichen.


0 20 40 60 80 100 120

Zeit [Monate]

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Üb

erle

ben

swah

rsch

einl

ichk

eit

low risk, n=14

high risk, n=14 p<0,05

Abb. 4: Eine Signatur aus drei Genen im Metastasen-gewebe detektiert bei 28 Patienten mit klarzelligem Nierenzellkarzinom zwei Gruppen mit signifikant unter-schiedlicher Prognose.

Ein weiterer Ansatz dieses Projekts ist die Identifizierung potentieller Targets für eine

immunologische Therapie zur gezielten Eliminierung der Nierentumor-Metastasen. Dazu werden die Microarray-Daten aufwändig nach verschiedenen Kriterien gefiltert und mit Expressionsdatenbanken abgeglichen. Solche Gene, die als potentielle Therapietargets geeignet erscheinen (z. B. regelmäßige Expression in den Metastasen, keine Expression in normalem Körpergewebe) wer-den in der Folge mit weiteren Methoden (RT-PCR, Immunhistochemie u. a.) evaluiert.

A. Buchner, M. Castro, A. Hennig, G. Assmann 1, W. Zimmermann

Koop.: 1 Institut für Pathologie, Klinikum der Universität München; Institut für Neuropathologie, Universität München; Münchner Leukämie-Labor (MLL) GmbH.

Förderung: Deutsche Krebshilfe (106141); Förder-programm für Forschung und Lehre (FöFoLe) der Universität München (343).


Funktionelle Analyse von CEACAM20, einem potentiellen Zielmolekül für die Tumorimmuntherapie des Prostatakarzinoms

Einführung: Das Prostatakarzinom ist der häufigste Tumor des Mannes. Rund 19% aller in Deutschland bei Männern jährlich neu auftretenden Krebserkrankungen betreffen die Prostata. Die oft schon in frühen Krankheitsstadien ausgestreuten Tumorzellen führen, trotz vollständiger chirurgischer Entfernung des Primärtumors, häufig zu nicht mehr kontrollierbarer Metastasierung und zum Tod. Daher wird intensiv nach neuen Zielstrukturen gesucht, die eine gezielte Hemmung oder Zerstörung von Krebszellen durch therapeutische Antikörper erlauben. Eine gegenwärtig auch für das Prostatakarzinom intensiv untersuchte Zielstruktur stellt ERBB2 dar, das besondere Bedeutung für die Tu-mortherapie bei Brusttumorpatienten erlangt hat.

Vor kurzem haben wir ein neues Mitglied der humanen karzinoembryonalen Genfamilie (CEACAM20) entdeckt, das hauptsächlich in Prostata- und in Prostatakarzinomgewebe, so-wie, in geringerem Maße, in Dünndarm und Hoden exprimiert wird. Analysen des murinen CEACAM20-Gens zeigten eine Über-expression in primären Magenadenokarzi-nomen und Brusttumoren der Maus. Durch RT-PCR-Untersuchungen konnten wir CEACAM20-Transkripte in humanen Prosta-takarzinomgeweben nachweisen. In normaler Prostata wird CEACAM20 wahrscheinlich an der lumenwärts gerichteten Seite des Prostatadrüsenepithels exprimiert, wie immunhistologische Untersuchungen mit durch genetische Immunisierung generierten CEACAM20-Antiseren zeigten (Abb. 1). Andere Mitglieder der CEA-Genfamilie sind bekannt für die Deregulation ihrer Expression in Tumorgeweben und stehen in Verdacht, an der Tumorprogression und Metastasierung beteiligt zu sein. Am bekanntesten ist CEA, das weit verbreitet als Serumtumormarker bei Kolonkarzinomen Verwendung findet. Ein ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif) in der zytoplasmatischen Domäne von CEACAM20 könnte an dem Transformationsprozess der Prostataepithel-zellen durch Aktivierung des �-Catenin-Sig-nalwegs beteiligt sein, wie es z. B. für MMTV-env-transfizierte (mouse mammary tumor virus) Brustepithelzellen, für Epstein-Barr-Virus (EBV) LMP2A-exprimierende (latent membrane protein 2A) Fibroblasten oder generell bei Überexpression von ITAM-tragen-den Proteinen in Epithelzellen beobachtet wird.

Dies würde die Möglichkeit eröffnen, für den Tumor essentielle Wachstumssignale durch in-hibitorische Antikörper unterbinden zu können, wie dies für therapeutisch wirksame Anti-ERBB2-Antikörper (z. B. Trastuzumab/-Herceptin®) beobachtet wird. Unsere Ar-beitshypothese, die in diesem Projekt unter-sucht werden soll, ist in Abb. 2 grafisch dar-gestellt. Zur Abklärung des möglichen klini-schen Nutzens von CEACAM20, ist geplant, immunhistologische Expressionsanalysen an Prostatakarzinomen durchzuführen.

Abb. 1: CEACAM20-Expression in normalem Prostata-gewebe des Menschen. Kryoschnitte von normalem Pros-tatagewebe wurde mit Hilfe von Seren genetisch gegen CEACAM20 immunisierter Mäuse immunhistologisch ge-färbt. Pfeile zeigen die apikale Markierung der Drüsenepithelzellen (A). Keine Färbung wurde mit Präimmunserum beobachtet (B).

Ergebnisse: Eine wichtige Voraussetzung für die CEACAM20-Expressionsanalyse in menschlichem Tumorgeweben sind spezifische Antikörper. Da Anti-CEACAM20-Antikörper kommerziell nicht erhältlich sind, haben wir solche Antikörper durch genetische Immunisie-rung in Zusammenarbeit mit der Firma GENOVAC hergestellt. Die dafür benötigten vollständigen cDNA-Klone wurden von uns über RT-PCR generiert. Zwei monoklonale Antikörper wurden näher charakterisiert. Sie können für FACScan- und Western-Blot-Ana-lysen eingesetzt werden (Abb. 3).


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Abb. 2: Hypothetisches Model der CEACAM20-Funktion in Normal- und Tumorgewebe. Diesem Modell liegen Be-funde anderer Gruppen zugrunde, die zeigten, dass Überex-pression von ITAM-tragenden Proteinen in Epithelzellen zu Wachstumsstimulation und Transformation führen kann. In unserem Modell wird durch einen noch unbekannten CEACAM20-Liganden CEACAM20-Moleküle vernetzt (1). Dadurch kommt es intrazellulär zu Tyro-sinphosphorylierung des ITAM durch src-Kinasen (2), was in der Folge die Bindung von Syk-Kinase über SH2-Domänen erlaubt (3). Gebundenes Syk wiederum aktiviert down-stream weitere mögliche Signalkettenkomponenten, deren Stimulierung zu Wachstum und Transformation führen. Unterbindung von Schritt (1) durch inhibitorische Antikörper könnte einen Therapieansatz darstellen.

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Abb. 3: Charakterisierung der anti-CEACAM20 (C20)-mAk 12D8 und 6G4A5. HeLa-Zellen wurden transient mit dem Vektor oder mit pcDNA3-C20-Spleißvarianten trans-fiziert (Domänenanordnung im oberen Teil der Abb. ge-zeigt) und ihre Lysate im Western Blot analysiert. Die je-weils obere Bande entspricht der erwarteten Größe der Spleißvarianten, bei den unteren Banden könnte es sich um Abbauprodukte oder Glykosylierungsvarianten handeln.

Abb. 4: CEACAM20 ist an Tyrosinresten innerhalb seiner zytoplasmatischen Domäne phosphorylierbar. HeLa-Zellen wurden transient mit pcDNA3 (Vektor) oder pcDNA3-CEACAM20 (CEACAM20) transfiziert und 30 Min. mit oder ohne Phosphataseninhibitor Pervanadat inkubiert. Western-Blot-Analysen mit Anti-p-Tyr-mAk (4G10) oder anti-CEACAM20-mAk (6G4A5; -C20) wurden zum Nachweis von P-Tyr-haltigen Proteinen bzw. CEACAM20 verwendet (Stern: Haupt-P-Tyr-Protein; Pfeile: C20).

Zur Klärung der Funktion von CEACAM20 sollte zunächst untersucht werden, ob das po-tentielle ITAM überhaupt an Tyrosinresten phosphoryliert werden kann. Nach Transfektion mit einem Full-length-CEACAM20-Plasmid bzw. mit dem leeren Vektor konnte in Gegenwart oder in Abwesenheit eines P-Tyr-Phosphatase-inhibitors im Vergleich zur Vektortransfektante ein ca. 90 kDa großes, in der Größe dem CEACAM20 entsprechendes Protein als das dominante Phosphotyrosinprotein identifiziert werden (Abb. 4). Dies spricht für die grund-sätzliche Phosphorylierbarkeit des CEACAM20-ITAM.

Des Weitern sind Fragen nach dem Einfluss von CEACAM20-Überexpression auf das Wachstum von Epithelzellen zu klären. Auch wollen wir die Signalwege aufdecken, die nach Vernetzung von CEACAM20-Molekülen durch Antikörper (ein Ersatz für Liganden-vermittelte Ligation von Rezeptoren) aktiviert werden. Offen ist noch die Häufigkeit und Stärke der Expression von CEACAM20 in Prostatakarzinomen und ihre Bedeutung für den Krankheitsverlauf. Dies soll in Zusammenarbeit mit dem Pathologischen Institut der Universität München an einer größeren Anzahl von Prostatakarzinomproben immunhistologisch untersucht werden. M. Paptistella, A. Eisenried, R. Zebhauser, R. Riesen-berg, T. Popp, K. Ebelt 1, R. Kammerer, W. Zimmer-mann

Koop.: 1 Institut für Molekulare Immunologie, GSF, Mün-chen.

Förderung: Förderprogramm Promotionsstudium “Mole-kulare Medizin” der Universität München (12/2003; 41/2005).

Optimierung von Tumorvakzinen 65

Generierung dendritischer Zellen für die klinische Anwendung

Einführung: Dendritische Zellen (DC) gehö-ren zu den effizientesten Antigen-präsentieren-den Zellen (APC) im Immunsystem und nehmen daher eine Schlüsselrolle bei der Akti-vierung spezifischer Immunantworten ein. Hieraus leitet sich auch das große Interesse ab, DC für die Immuntherapie bei Krebspatienten zu nutzen und so werden derzeit intensiv die optimale Kultivierung und Ex-vivo-Beladung der DC mit Tumorantigenen untersucht. Die Fähigkeit, tumorspezifische T-Zell-Antworten zu induzieren, konnte bereits in mehreren präklinischen Studien nachgewiesen werden.

Für eine optimale T-Zell-Aktivierung ist es wichtig, dass DC ihre Peptidantigene über MHC-Moleküle (Signal 1) präsentieren, ko-stimulatorische Moleküle (Signal 2) exprimie-ren und IL-12p70 produzieren (Signal 3) können. Eine Reifung der DC kann durch inflammatorische Signale induziert werden, wie z. B. durch Tumornekrosefaktor (TNF), IL-1β, oder durch bakterielle Lipopoly-saccharide, Ribomunyl, poly (I:C), Interferone und/oder Prostaglandine, die an die sog. Toll-like-Rezeptoren (TLR) auf den DC binden. IL-12p70-sezernierende DC sind wünschens-wert für eine Vakzineentwicklung, da sie die Polarisation der T-Zell-Entwicklung in Rich-tung T-Helfer 1 (Th1)-Zellen fördern. Th1-Zellen wiederum unterstützen die Entwicklung von CD8+ zytotoxischen T-Zellen (CTL), die für eine erfolgreiche Anti-Tumor-Antwort nötig sind. Ebenfalls unterstützen IL-12p70-sezernierende DC die angeborene Immunität über Induktion der NK-Zell-Proliferation. Basierend auf diesen Überlegungen wurde ein Herstellungsverfahren etabliert, um aus Monozyten (Abb. 1) eine möglichst hohe Anzahl reifer DC zu generieren, die IL-12p70 produzieren können und als APC sowohl für die Beladung mit Peptiden als auch mit RNA geeignet sind, und sich zudem problemlos einfrieren lassen.

Die Vorteile der Verwendung von RNA liegt auf der Hand: Selbst kleinste Tumormengen erlauben die Isolierung und In-vitro-Amplifi-zierung von RNA, die dann für mehrfache Immunisierungen ausreicht. Außerdem können einzelne oder Sätze von bekannten oder noch zu identifizierenden Tumorantigenen in Form ihrer RNA leicht hergestellt werden. Letztend-lich werden jedoch erst klinische Studien zei-gen können, ob eine Vakzinierung mit RNA-tranfizierten DC in der Lage ist, Toleranz zu brechen und ohne evtl. auftauchende Autoim-

munität eine Tumorimmunität im Patienten erzeugen kann (Abb. 1).

� CD80, 86, 83, 40, HLA-DR� DC-SIGN, CCR7� CD14

unreife DC reife DC

TumorantigeneTumorimmunität

Autoimmunität Toleranz

GM-CSFIL-4

Reifungs-Cocktail

Elektroporation

Monozyten

Leukapherese

Abb. 1: Strategie der DC-basierten Vakzinierung.

Präklinische Studien konnten bereits zeigen, dass DC, beladen mit Tumor-RNA aus RCC-Geweben, sehr effektiv in der Lage sind, Tumor-spezifische T-Zellen zu induzieren (Gilboa et al. 2004). Eine zweite präklinische Studie konnte diese Beobachtung bestätigen und zeigen, dass sowohl die Gesamt-Tumor-RNA als auch die amplifizierte Tumor-mRNA aus RCC-26-Tumorzellen zur Stimulation von Tumor-spezifischen CTL eingesetzt werden kann (Geiger et al. 2005).

Material und Methoden: Für die Gewinnung von Monozyten als Progenitoren wurde das ge-schlossene System einer Elutriation verwendet (Abb. 2; ELUTRA, Gambro BCT, USA), bei der die Zellen über Gegenstrom-Zentrifugation mittels Festwinkelrotor getrennt werden (2400 Umdrehungen/min.). Angereicherte Monozyten befinden sich dann in Fraktion 5 und Lympho-zyten in der Fraktion 3.

Abb. 2: ELUTRA, Gambro BCT (Lakewood, CO, USA). Geschlossenes System zur Anreicherung verschiedener Leukozyten-Populationen aus peripherem Blut.


Anschließend wurden die Monozyten mit GM-CSF (Leukine®, Berlex, USA; 100 ng/ml) und rekombinantem IL-4 (R&D Systems; 20 ng/ml) für sechs Tage kultiviert, um zunächst unreife DC zu generieren, die dann mit verschiedenen Reifungscocktails für wei-tere 24 Stunden inkubiert wurden (Tab. 1).

TNF-αααα, IL-1ββββ,IFN-γγγγ



TNF-αααα, IL-1ββββ,IFN-αααα, IFN-γγγγ

TNF-αααα, IL-1ββββ, IL-6

InflammatorischeZytokine,Interferone

+

+

+

-

+

PGE2-Zugabe

kein TLR-Ligand

-JonuleitDC1

TLR3poly (I:C)KalinskiDC2

TLR7/8TLR3

R848,poly (I:C)

Cocktail 5DC5

TLR7/8R848Cocktail 4DC4

TLR7/8,reduziertes IFN-γγγγund PGE2

R848Cocktail 3DC3

AnmerkungTLR-LigandCocktailDC

Population

Tab. 1: Reifungscocktails für die DC-Generierung. Konzentrationen: TNF-α (10 ng/ml), IL-1β (10 ng/ml), Resiquimod R848 (1 µg/ml), poly (I:C) (20 ng/ml) sowie zusätzlich bei Jonuleit et al. 1997: IL-6 (15 ng/ml), PGE2 (1000 ng/ml); Kalinski (Mailliard et al. 2004): IFN-α (3000 IU/ml), IFN-γ (1000 IU/ml); Cocktail 3: IFN-γ (1000 IU/ml), PGE2 (100 ng/ml); Cocktail 4 und 5: IFN-γ (5000 IU/ml), PGE2 (250 ng/ml).

Die DC wurden dann entweder zuvor ein-gefroren oder direkt phänotypisch analysiert. Für die funktionellen Experimente wurden die reifen DC entweder mit Peptiden beladen oder per Elektroporation mit RNA transfiziert.

Ergebnisse der In-vitro-Studien: Die durch-flusszytometrischen Analysen zeigten, dass alle DC-Präparationen den Phänotyp reifer DC aufwiesen: > 80% CD83, CD86, CD80, HLA-DR, CD40, > 60% CD209 (DC-SIGN), > 60% CD197 (CCR7) und < 2% CD14. Dieser blieb auch nach dem Einfrieren und nach dem Auswaschen der Zytokine für weitere 48 Std. stabil. Die Anzahl vitaler DC war mit dem DC2 Cocktail (Kalinski) jedoch etwas schlechter durch die starke Plastikadhärenz dieser DC. Die Expression des Chemokin-Rezeptors CCR7 weist auf die Homing-Kapazität der DC in die Lymphknoten hin, ein wesentliches weiteres Merkmal reifer DC. Abb. 3 zeigt jedoch, dass nicht alle DC-Präparationen gleichermaßen biologisch aktives IL-12p70 sezernieren, wobei sogar die DC im Jonuleit-Cocktail (DC1) nicht in der Lage sind, IL-12p70 zu produzieren. IL-10 ist als Gegen-spieler von IL-12p70 anzusehen und sollte in möglichst geringer Menge produziert werden. In einem weiteren Experiment wurde die allostimulatorische Kapazität der DC-Präparationen in gemischten Lymphozyten-Reaktionen (MLR) überprüft (Abb. 4). Alle DC

sind in der Lage, eine starke Alloantwort zu induzieren, wobei sie bei DC2 (Kalinski) etwas geringer ausfällt.

Abb. 3: ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) als funktioneller Assay zur Quantifizierung von IL-12p70 (schwarze Balken) und IL-10 (weiße Balken) im Überstand der kultivierten DC nach 24-std. Ausreifung.

Abb. 4: Analyse der allostimulatorischen Kapazität der unterschiedlichen DC-Präparationen anhand der Prolifera-tion von T-Zellen in einer gemischten Lymphozyten-Reaktion (MLR), gemessen nach sechs Tagen über radio-aktiven 3H-Thymidin-Einbau. Die Abbildung zeigt das Resultat aus drei unabhängigen Experimenten.

Anzahl IFN-γγγγ-produzierender T-Zellen pro well Abb. 5: IFN-γ-ELISPOT zur Analyse der Immunantwort autologer T-Zellen nach Stimulation mit Peptid-beladenen DC. 40.000 T-Zellen, in vitro mit den DC vorstimuliert, wurden jeweils in Triplikaten mit 20.000 autologen Mono-zyten und CEF-Peptiden im ELISPOT restimuliert. Folgende CEF-Peptide mit HLA-A2-Bindungsmotiv wurden verwendet: CMVpp65495-503 (NLVPMVATV), EBV-BMLF1280-288 (GLCTLVAML), EBV-LMP-2426-434

(CLGGLLTMV), influenza M1 protein58-66 (GILGFVFTL), and influenza RNA polymerase PA46-54 (FMYSDFHFI) von PANATecs GmbH, Tübingen.

Dass alle DC auch gleichermaßen in der Lage sind, Peptide autologen T-Zellen zu präsen-tieren, wurde anhand eines IFN-γ-ELISPOT analysiert (Abb. 5). Dazu wurden die T-Zellen


aus Fraktion 3 (54,8% CD3+) zunächst für sieben Tage mit reifen Peptid-beladenen DC stimuliert und anschließend im ELISPOT erneut restimuliert. Aufgrund der schlechteren Ernteeigenschaften reichten die DC2 für dieses Experiment nicht mehr aus.

Ferner wurde die Proteinexpression der unterschiedlichen DC-Präparationen nach Transfer von RNA per Elektroporation getestet. Als Modell diente EGFP-RNA (enhanced green fluorescent protein-RNA). Die Expres-sion wurde mittels eines EGFP-spezifischen Antikörpers am Durchflusszytometer bestimmt (Abb. 6).

Abb. 6: EGFP-Expression in DC nach Transfektion in vitro transkribierter RNA. Die RNA wurde per Elektro-poration in die reifen DC transfiziert und für die Immun-fluoreszenz 24 Std. später geerntet. Angegeben sind jeweils die Prozentsätze EGFP-positiver DC und die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI).

Die Gegenwart von poly(I:C) scheint die Proteinexpression nach Transfektion der exo-genen RNA zu blockieren, vermutlich eine Art Schutzmechanismus durch TLR3 oder andere RNA-bindende Rezeptoren, um Zellen vor Fremd-RNA zu schützen. Damit scheinen DC2 (Kalinski) und DC5 für RNA-beladene DC nicht so geeignet zu sein. Cocktail 3 und 4 sind sowohl für RNA- als auch Peptid-beladene DC die geeigneten Reifungscocktails.

Fazit: Mit Hilfe der Elutriation und des neuen Reifungscocktails ist es möglich, DC zu gene-rieren, die sich insbesondere unter GMP-konformen Bedingungen leicht in großer Menge ernten lassen. Ferner zeigen sie sich

auch nach dem Einfrieren sehr stabil, produ-zieren hohe Mengen an IL-12p70 und weisen gute stimulatorische Kapazität auf. RNA kann effizient per Elektroporation in die reifen DC eingeschleust werden, wobei sich insbesondere DC eignen, die im Reifungscocktail TLR7/8-Liganden enthielten. Die Zugabe von TLR3-Liganden eignet sich dagegen anscheinend eher für DC, die beispielsweise mit Peptiden beladen werden.

Zukünftige Studien müssen nun klären, wie effizient die Kapazität derartiger mit einem Pool RCC-spezifischer Tumorantigen-RNA transfizierter DC ist, um im Patienten existierende Central-memory-T-Zellen zu reaktivieren oder de novo CD4+- bzw. CD8+ T-Zellen zu stimulieren. Dieses wird gegenwärtig an unserem RCC-26-Modell-system getestet und soll dann zur Vorbereitung einer klinischen Studie führen. Abb. 7 zeigt zusammenfassend unsere geplanten therapeu-tischen Strategien für das Nierenzellkarzinom auf.

RCC-26

RCCRCC--2626--basedbasedVaccineVaccine

Vaccine

CD80CD80

ILIL--2/IL2/IL--77

geneticengineering

1

generic totaltumor RNA

2

gene

ric p

eptid

e po

ols

4

TTT

T cells (large scope)

Adoptive Cell TherapyAdoptive Cell Therapy

TCR transgenicT cells

5

selectedselected TAAsTAAs

gene

ric R

NA

poo

ls

3

DC DC VaccineVaccine

DC

Abb. 7: Therapeutische Optionen für das Nierenzell-karzinom

H. Pohla, B. Stadlbauer, A. Zobywalski 1, M. Javorovic 1, B. Frankenberger 1, C. Geiger 1, E. Kremmer 1, I. Bi-galke 1, 2, D.J. Schendel 1

Published in: Generation of clinical grade dendritic cells with capacity to produce biologically active IL-12. Journal of Translational Medicine, 5:18, 70 (2007)

Koop.: 1 Institut für Molekulare Immunologie, GSF; 2 GMP-Labor der GSF.

Förderung: SFB 455 (Projekte C1 und Z1; D.J. Schendel), KKG „Immuntherapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF).


Konstruktion und Charakterisierung von T-Zell-Rezeptor-Gen-modifizierten T-Zellen für den adoptiven Transfer

Einführung: Grundlegende Arbeiten von H.-J. Kolb (Medizinische Klinik III, Klinikum der Universität) hatten gezeigt, dass eine Infusion von Spender-Lymphozyten nach Knochenmarktransplantation die Eliminierung von Leukämiezellen herbeiführen kann und auf einer T-Zell-vermittelten Immunität basiert. Dies bedeutet, dass das Immunsystem grundsätzlich dazu in der Lage ist, Tumoren zu heilen. Allerdings lässt sich der Schwierigkeitsgrad, klinische Erfolge bei möglichst geringen Nebenwirkungen mit Hilfe der adoptiven T-Zell-Therapie zu erzielen, wie folgt reihen:

Virus-assoziierte Erkrankungen � Virus-asso-ziierte hämatopoetische Tumoren � hämato-poetische Tumoren ohne bekannte virale Be-teiligung � solide Tumoren.

Solide Tumoren sind somit das schwierigste Target, machen aber 80-90% aller Krebser-krankungen aus (Karzinome epithelialen Ur-sprungs) und sind sehr oft nicht kurabel. Selbst in vergleichbar einfachen Mausmodellen kön-nen adoptiv transferierte spezifische T-Zellen Tumoren, die länger als ca. 14 Tage zu soliden Tumoren wachsen konnten, in der Regel nicht mehr abstoßen. Die Ursachen sind nicht völlig geklärt. Einige Befunde zeigen, dass T-Zellen solides Tumorgewebe nicht effizient infiltrieren können. Eine andere Möglichkeit ist, dass das Target-Antigen nicht ausreichend stark ausgeprägt wird und daher nicht kreuz-präsentiert werden kann. Es gibt gute Hinweise, dass Vorbehandlung durch beispiels-weise Chemotherapie oder Entzündungs-mediatoren das Tumorgewebe wieder zugänglicher für T-Zellen machen. Die genauen Wirkmechanismen solcher kombinierter Therapien, vor allem Verteilung, Migration oder Überleben transferierter T-Zellen, sind noch unzureichend verstanden.

Die Komplexität des adoptiven T-Zell-Transfers erfordert die interdisziplinäre Zu-sammenarbeit zwischen Grundlagen- und klinischen Immunologen, Molekularbiologen, Virologen und klinisch tätigen Wissen-schaftlern. Langfristig wird sich der Erfolg des adoptiven T-Zell-Transfers an klinischen Er-gebnissen messen lassen müssen. Sowohl die für die klinische Anwendung notwendige Tech-nologieentwicklung als auch kleinere klinische Pilotstudien selber sind häufig nicht sonderlich publikationsträchtig, aber essentiell für eine Verbesserung klinischer Forschung. Aus

diesem Grund wurde ein neuer transregionaler Sonderforschungsbereich zwischen München (stellvertretende Sprecherin: D.J. Schendel) und Berlin (Sprecher: T. Blankenstein) mit dem Thema „Grundlagen und Anwendung adoptiver T-Zell-Therapie“ etabliert (SFB-TR 36/1).

Selbst wenn es hoch affine T-Zellen gegen Tumorantigene gibt, muss man nach heutigem Kenntnisstand davon ausgehen, dass es sich hierbei um individual-spezifische, d. h. soma-tisch mutierte, Antigene handelt. Dadurch ent-ziehen sie sich praktisch einem therapeutischen Ansatz. Was bleibt, sind sog. Tumor-assoziierte Antigene (TAA), d. h. Selbst-Antigene, gegen die Toleranzmechanismen, etwa die klonale Deletion hoch affiner T-Zellen, nicht ausgeschlossen werden können. Um hoch affine T-Zellen gegen Selbst-Anti-gene herzustellen, muss man das Problem der klonalen Deletion umgehen. Die T-Zellen müssen aus einem Antigen-, bzw. MHC/Peptid-Komplex-freien Milieu generiert werden. Die Antigenspezifität der T-Zellen wird durch die beiden Ketten des T-Zell-Rezeptors (TCR) vermittelt. Da recht effektive Methoden und Vektoren etabliert sind, quantitativ Gene in primäre T-Zellen einzuschleusen und auszuprägen, nimmt der TCR-Gentransfer daher viel Raum in diesem SFB ein (Abb. 1). Dies ist zum einen sinnvoll, um sich hoch affine Antigen-spezifische Patienten-T-Zellen gegen Selbst-Antigene aus Tumoren herzustellen. Weiterhin könnte der TCR-Gentransfer den Zeitablauf zur Her-stellung spezifischer, auch gegen virale Anti-gene gerichtete, T-Zellen so verkürzen, dass adoptive T-Zell-Therapie praktikabler wird.

Adoptiver T-Zell-Transfer

Patient

T-Zell-Isolierung

Ex vivoTCR

Gentransfer

Abb. 1: Adoptiver T-Zell-Transfer: Redirigierung der T-Zell-Spezifität über einen Ex-vivo-TCR-Gentransfer.

Projekt Z1: Verschiedene Teilprojekte des SFB-TR 36/1 beinhalten die Generierung von Antigen-spezifischen T-Zellen durch TCR-Gentransfer, deren Charakterisierung und den adoptiven Transfer TCR-modifizierter T-Zellen. Im Rahmen des Z1-Projektes wird unter der Leitung von W. Uckert (Berlin), H. Pohla (LTI, Universität München) und B. Gänsbacher (TU München) ein TCR-Labor


als core facility mit Standorten in Berlin und München etabliert (Abb. 2). Die Konstruktion von TCR-modifizierten T-Zellen und deren Charakterisierung wird als Kooperations-leistung für andere Gruppen durchgeführt bzw. als Technologie weitergegeben. Retrovirus-Vektoren für den TCR-Gentransfer werden optimiert und neuartige Verpackungszellen für die Produktion von TCR-Retroviren sowie Indikatorzelllinien zum Nachweis der TCR-Funktion konstruiert. Methoden werden etabliert, um aus Biopsiematerial und Blut von Studienpatienten vitale Antigen-spezifische T-Zellen isolieren und diese phänotypisch und funktionell charakterisieren zu können. Diese Methoden dienen neben der Detektion Antigen-spezifischer T-Zellen auch der Generierung von T-Zellen für den adoptiven Transfer.

Klonierung derTCR Gene

T-Zell-Klonierung

Generierung derTCR-Retroviren

Transduktionder PBL

LTR LTRTCR

TCR Identifizierung,RNA Isolierung → cDNA(RT-PCR, RACE-PCR)

Erste funktionelleCharakterisierung

Anreicherung,Expansion

Z1Core facility

Berlin/München

Koop.PartnerKoop.

Partner

Koop.Partner

Koop.Partner

Abb. 2: Schema zur Konstruktion und Charakterisierung TCR-Gen-modifizierter T-Zellen für den adoptiven Transfer im Rahmen des Z1-Projektes.

Die Vorteile der Einrichtung einer derartigen Serviceeinheit liegen auf der Hand: die Ver-wendung von Standardprotokollen, die Ver-gleichbarkeit der Resultate, die gleich bleiben-de Qualität der Produkte sowie Zeit- und Geld-ersparnis. Außerdem dient sie als Basis für die Produktion der GMP-Reagenzien (Abb. 3).

ExperimentelleForschung

KlinischeAnwendung

GMP-Labor

Selektion der TCR für die klinische Anwendung

Design des Protokolls

Dokumentation der Reagenzien

Adaption des experimentellen Ansatzes

Z1Core facility

Berlin/München

Abb. 3: Die Z1-core-facility als Basis für die Produktion der GMP-Reagenzien für den adoptiven Transfer TCR-Gen-modifizierter T-Zellen.

Proof of principle: In einer Zusammenarbeit der Arbeitsgruppen E. Nössner, D.J. Schendel,

W. Uckert und T. Blankenstein ist eine effektive und reproduzierbare TCR-Genexpres-sion in primären T-Zellen etabliert worden. Abb. 4 zeigt die Expression des RCC-26-spezifischen TCR nach retroviralem Transfer in 48% der humanen PBL. Die transduzierten Zellen wiesen gleiche Spezifität und Sensitivi-tät wie die ursprünglichen TIL-26-Zellen auf (Abb. 5).

Vββββ22

coun

ts

100 101 102 103 1040

200

48 %

Abb. 4: Expression des RCC-26-spezifischen Vβ22 TCR auf primären Blutlymphozyten gezeigt anhand einer durchflusszytometrischen Analyse mit einem Vβ22-spezi-fischen monoklonalen Antikörper (Engels et al. 2005, Hum. Gene Ther.).

% s

pezi

fisch

e Ly

se

Abb. 5: Nachweis der zytotoxischen Aktivität humaner PBL nach retroviralem Transfer des RCC-26-spezifischen TCR von TIL-26 (Engels et al. 2005, Hum. Gene Ther.). Als Kontrollen dienten die Normalnieren-Zelllinie NKC-26, die lymphoblastoide B-Zelllinie LCL-26, die Erythroleukämielinie K-562 sowie eine weitere RCC-Linie RCC-53, die alle nicht erkannt wurden.

Fazit: Der adoptive T-Zelltransfer, kombiniert mit der Generierung neuer Antigenspezifität, bietet die Möglichkeit, hoch affine T-Zellen gegen praktisch jedes Zielantigen zu generie-ren. Generell ist adoptive T-Zell-Therapie bei Krebs die am wenigsten untersuchte Form der Immuntherapie; bietet nach gegenwärtigem Kenntnisstand aber das größte Potenzial, u. a. da sie mit anderen Therapieformen wie Chemotherapie kombiniert werden kann.

H. Pohla, H. Herbig, B. Stadlbauer, M. Anton 1, B. Gänsbacher 1, B. Frankenberger 2, E. Nössner 2, B. Engels 3, W. Uckert 4, D.J. Schendel 2, T. Blankenstein 4

Koop.: 1 Institut für Experimentelle Onkologie und Therapieforschung, TU München; 2 Institut für Molekulare Immunologie, GSF; 3 Institut für Biologie, Humboldt-Universität Berlin; 4 Institut für Immunologie, Charité-Berlin und Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin, Berlin-Buch.

Förderung: SFB-TR 36/1.


Die Rolle der CEACAM-Moleküle bei der DC-T-Zell-Interaktion

Einführung: Das carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1) ist ein hochglykosyliertes Transmembran-protein der Karzinoembryonalen Antigen-familie, die ihrerseits zur Immunglobulin-superfamilie gezählt wird. CEACAM1 wird von unterschiedlichen Zellen wie z. B. Endothel-, Epithelzellen und Zellen des Immunsystems exprimiert. Neben neutrophilen Granulozyten exprimieren humanen T-, NK- und B-Zellen sowie T- und B-Zellen der Maus, der Ratte und des Rindes CEACAM1. CEACAM1 vermittelt homophile Zell-Zell-Adhäsion, und leitet dabei mittels im zytoplasmatischen Teil befindlichen ITM (im-munoreceptor tyrosin-based motif) Signale in das Zellinnere. Diese Signale sind unter anderem an der Regulation der T-Zell-aktivierung beteiligt. In vivo wird die T-Zellaktivierung durch Antigen präsentie-rende Zellen (APC) gesteuert, die den naiven T-Zellen zusätzlich zur Präsentation von Anti-genen entsprechende kostimulatorische, aber auch koinhibitorische Signale vermitteln. Die für die T-Zellaktivierung wichtigsten APC sind die dendritischen Zellen (DC). Kürzlich fanden wir, dass CEACAM1 von murinen DC expri-miert wird und Signale zur Reifung der DC vermittelt. Moleküle mit einem solchen Poten-tial sind interessante Zielstrukturen, um die Effektivität von DC-basierten Tumorimmun-therapien zu verbessern. Allerdings ist bis heute nichts über die Expression von CEACAMs in humanen DC bekannt.

Ergebnisse: Unsere Untersuchungen zeigen, dass humane DC in erster Linie nach Stimulation mit INFγ CEACAM1 expri-mierten. In vivo wird INFγ im Zuge der von DC vermittelten T-Zellaktivierung freigesetzt, so dass während der T-Zell-DC-Interaktion CEACAM1 auf der Oberfläche beider Zelltypen erscheint und über homophile Inter-aktion das Verhalten beider Zellen regulieren kann. Die für murine DC beschriebene Vermittlung von Reifungssignalen, konnten wir für humane DC bisher nicht bestätigen. Der Grund für diese speziesspezifischen Unter-schiede könnte in der unterschiedlichen Signaltransduktion von CEACAM1 in den ver-schiedenen Spezies liegen. In der Tat kennt man zwei verschiedene Spleißvarianten von CEACAM1, die sich dramatisch in ihrem zy-toplasmatischen Teil unterscheiden. Die CEACAM1-Variante mit der längeren zytoplasmatischen Domäne enthält zwei ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibition

motif), die bei der kurzen zytoplasmatischen Variante fehlen. Wie eigene Untersuchungen zeigten, unterscheidet sich interessanterweise, das Verhältnis der exprimierten Spleiß-varianten zwischen murinen und humanen DC stark. Während in murinen DC etwa die Hälfte des exprimierten CEACAM1 den kurzen zytoplasmatischen Teil hat, kommt diese Spleißvariante in humanen DC praktisch nicht vor (Abb. 1).

Abb. 1: Expression von CEACAM1-Spleißvarianten in DC von Maus und Mensch. A: Die Gesamt-RNA von reifen (für 6 Tage kultivierte (d6)) und unreifen (für 8 Tage kultivierte (d8)) murinen DC wurde mit der RT-PCR unter Verwendung von CEACAM1-spezifischen Primern analysiert. Links ist die Analyse der zwei zyto-plasmatischen Isoformen und rechts die Analyse der Isoformen, die sich im extrazellulären Bereich unter-scheiden, gezeigt. B: Zeitlicher Verlauf der Expression von unterschiedlichen CEACAM1-Spleißvarianten unter INFγ-Stimulation.

Da sich die CEA-Genfamilie in Maus und Mensch stark unterscheidet (siehe auch http://cea.klinikum.uni-muenchen.de) besteht die Möglichkeit, dass die oben erwähnten funktionellen Unterschiede durch die unter-schiedliche Expression von weiteren CEA-Familienmitgliedern hervorgerufen wer-den. Tatsächlich konnten wir zeigen, dass murine DC außer CEACAM1 auch CEACAM10, CEACAM15 (reife DC) und CEACAM19 (unreife DC) exprimieren (Abb. 2A). In humanen DC konnten wir neben CEACAM1 auch zwei Spleißvarianten von CEACAM19 nachweisen. CEACAM19-TM verfügt über eine Transmembrandomäne und einen zytoplasmatischen Teil, der ein ITAM-ähnliches Sequenzmotiv enthält. Die CEACAM19-S-Spleißvariante ist ein sezer-


niertes Molekül (Abb. 2B). In der Maus gibt es nur die transmembran verankerte Isoform.

Mon

ozyte

nun

reife

DC

reife

DC

CEACAM19-S

CEACAM19-TM

ß-Aktin

unreif

CEACAM1a

CEACAM2

CEACAM9

CEACAM10

CEACAM12

CEACAM15

CEACAM18

CEACAM19

CEACAM20

�-Aktin

285

495

407

396

259

394

482

388

497

569

reifDC der MausA

B

Mon

ozyte

nun

reife

DC

reife

DC

CEACAM19-S

CEACAM19-TM

ß-Aktin

unreif

CEACAM1a

CEACAM2

CEACAM9

CEACAM10

CEACAM12

CEACAM15

CEACAM18

CEACAM19

CEACAM20

�-Aktin

285

495

407

396

259

394

482

388

497

569

reifDC der MausA

B

Abb. 2: Expression von CEACAM in DC von Maus und Mensch. A: Die Gesamt-RNA von unreifen und reifen murinen DC wurde mit RT-PCR unter Verwendung von Gen-spezifischen Primern analysiert. B: Expression von unterschiedlichen CEACAM19-Spleißvarianten in humanen DC.

Für die DC-T-Zell-Interaktion könnten mögliche molekulare Interaktionen, mit von T-Zellen exprimierten CEACAMs, von Bedeutung sein. Bisher wurde in T-Zellen nur die Expression von CEACAM1-Isoformen gezeigt. Inwieweit CEACAM1 in der Maus oder im Menschen mit CEACAM10 oder CEACAM19 heterophil interagieren kann, ist nicht bekannt. Die beschriebene Interaktion von CEACAM1 und CEACAM10 in der Ratte, lässt eine solche Interaktion als wahrscheinlich erscheinen. Würde dies zutreffen, könnten folgende, in Abb. 3 schematisch dargestellte, speziesspezifischen Signale für die unterschiedliche Regulation der DC-T-Zell-Interaktion in Maus und Mensch verantwortlich sein. Zum Beispiel exprimieren murine DC einen großen Teil des CEACAM1 mit der kurzen zytoplasmatischen Domäne. Diese Isoform induziert Differenzierung in epithelialen Zellen und könnte daher auch für die Reifung der murinen DC verantwortlich sein. Die nahezu vollständige Abwesenheit dieser kurzen CEACAM1-Isoform könnte der

Grund dafür sein, dass CEACAM1-vermittelte Signale in humanen DC keine Reifung auslösen.

CEACAM1

CEACAM19 TM

ITIM ITSM

ITAM

MausTDC

Mensch

CEACAM10

Short form CEACAM19 S

DC

CEACAM1

CEACAM19 TM

ITIM ITSM

ITAM

MausTDC

Mensch

CEACAM10

Short form CEACAM19 S

DC

Abb. 3: Schematische Darstellung der möglichen spezies-spezifischen CEACAM-CEACAM-Interaktionen und der dadurch transduzierten Signale während der DC-vermittelten T-Zell-Aktivierung. Die Zellmembranen der T-Zellen (T) sind in der Mitte angeordnet, die der dentritischen Zellen (DC) sind links (Maus) und rechts (Mensch), dargestellt. ITIM: immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif, ITSM: immunoreceptor tyrosine-based switch motif, ITAM: immunoreceptor tyrosine-based activation motif.

Demgegenüber scheint die Bilanz von inhibierenden und aktivierenden CEACAM- vermittelten Signalen in Mensch und Maus vergleichbar zu sein, wenn auch die Regulation dieses Verhältnisses auf unterschiedliche Weise realisiert ist. In beiden Spezies dominieren CEACAMs, die aktivierende Signale übermitteln, auf unreifen DC, während auf reifen DC CEACAMs dominieren, die inhibierende Signale vermitteln können. Während der DC-Reifung wird dies in der Maus durch die Herunterregulation des ITAM-tragenden CEACAM19, im Menschen durch die Hochregulation des ITIM-haltigen CEACAM1 realisiert. Schließlich können die löslichen CEACAMs die Feinregulation der CEACAM-Interaktionen während der DC-T-Zell-Kommunikation übernehmen. Das Verständnis der Rolle der CEACAMs bei der DC vermittelten T-Zellaktivierung könnte neue therapeutische Möglichkeiten eröffnen, Immunreaktionen gezielt zu beeinflussen.

R. Kammerer, B. Sievers, A. Hennig, T. Popp, B.B. Singer 1, W. Zimmermann

Koop.: 1 Institut für Anatomie, Universitätsklinikum Essen.

Förderung: KKG „Immuntherapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF).


Induktion von Anti-Tumor-Immunantworten durch Photodynamische Therapie

Einführung: Die Photodynamische Therapie (PDT) ist eine neuartige Modalität zur Be-handlung von Krebs. Dabei werden Photo-sensibilisatoren oder metabolische Vorstufen, wie 5-Aminolävulinsäure (5-ALA), ver-abreicht, die bevorzugt in Tumorzellen akkumulieren oder metabolisiert werden. Be-strahlung des Tumors mit Licht zerstört den Tumor hauptsächlich durch die Bildung von hochreaktivem Singulett-Sauerstoff und freien Radikalen, deren Entstehung durch den Photosensibilisator vermittelt wird. Es konnte gezeigt werden, dass PDT in Mäusen systemische Immunreaktionen auslösen kann, von denen man annimmt, dass sie für das vollständige Verschwinden von Tumoren in Mausmodellen verantwortlich sind. Weiterhin erwiesen sich Extrakte aus PDT-behandelten Tumorzellen als wirksamer zur immunthera-peutischen Behandlung von Maustumoren als Lysate durch UV- oder Gammastrahlung ab-getöteter Tumorzellen. Gelegentlich bei Gli-ompatienten nach PDT beobachtete vollstän-dige Tumorregressionen, legen nahe, dass auch beim Menschen durch PDT systemische Anti-Tumorimmunreaktionen ausgelöst werden. Wir haben uns nun zum Ziel gesetzt, die PDT im Sinne einer maximal wirksamen Anti-Tumor-Immunantwort zu optimieren.

Ziele und Vorgehen: Für die Anwendung der PDT mit Anti-Tumorimmunantwort im Maus-model und im Patienten müssen drei Effekte optimiert werden: i) direkte Tumorzerstörung durch PDT, ii) die Stimulation der Immun-antwort durch PDT und iii) die differentielle Akkumulation des Photosensibilisators im Tumor im Vergleich zum zu schonenden Normalgewebe.

Etablierung des Tiermodells: Das beste zugängliche spontane autochthone Prostata-karzinom-Mausmodell stellt das C57BL/6-TRAMP-Modell (transgenic adenocarcinoma mouse prostate) dar. Die Mäuse enthalten ein Transgen bestehend aus dem Ratten-Probasin-promotor und dem SV40-T-Antigen-Gen und entwickeln im Alter von 10 Wochen pathologische Epithelveränderungen in der Prostata und 2 Wochen später sind die ersten Metastasen vor allem in den aortanahen Lymphknoten und in der Lunge feststellbar. Im Alter von 28 Wochen zeigen 100% der Männchen ausgeprägte Metastasierung. Von TRAMP-Prostata-Adenokarzinomen wurden Zelllinien etabliert (C1 und C2), die subkutan in syngenen C57BL/6-Mäusen transplantiert

werden können. Immuntherapeutische Studien zeigten, dass gegen das SV40-T-Antigen in diesem Modell eine periphere Toleranz besteht, die grundsätzlich (z. B. mit peptidbeladenen DC) gebrochen werden kann. Zu Beginn dieses Projektes wurde die subkutane Tumorbildung der C1- und C2-Zelllinien bestimmt. Dabei hat es sich gezeigt, dass unter den von uns gewählten Versuchsbedingungen die Trans-plantation von 3 x 106 Tumorzellen für ein sicheres reproduzierbares Angehen beider Tumorzelllinien notwendig war (Abb. 1). Die subkutan wachsenden Tumoren reicherten den Photosensibilisator Protoporphyrin IX (PPIX) nach i.p.-Injektion von 500 mg/kg 5-ALA, innerhalb von 3 h hoch selektiv an, so dass selbst sehr kleine Tumoren eindeutig von dem umgebenden Normalgewebe abgrenzbar waren.

Abb. 1: Reproduzierbares Wachstum von subkutan transplantierten C1-Zellen in männlichen immun-kompetenten Wildtyp-C57BL/6-Mäusen. A: Wachs-tunmsgeschwindigkeit der Tumoren nach subkutaner inokulation von 1 x 106 und 3 x 106 C1 Prostatakarzinom-zellen in verschiedenen Mäusen. B: Subkutan gewachsener C1-Tumor (mit weißer Linie eingekreist).

Empfindlichkeit der C1-Zellen gegenüber PDT: Im weiteren Verlauf der Untersuchungen haben wir das PPIX-Anreicherungsverhalten der C1- und C2-Zellen bestimmt. Dabei konnten wir zeigen, dass eine homogene An-reicherung in der Zellpopulation stattfindet


(Abb. 2). Das Maximum der 5-ALA-Anreicherung wird bei einer Konzentration von 50 µg 5-ALA pro ml Kulturmedium erreicht. Um die Vitalität der PDT-behandelten Tumorzellen, sowie deren transkriptionelle Reaktionsfähigkeit aufrecht zu erhalten, sind wir, abweichend vom üblichen Vorgehen, dazu übergegangen die 5-ALA-Inkubation in Anwesenheit von 5% fötalem Kälberserum durchzuführen. Unter den oben angeführten Beladungsbedingungen konnten wir die LD50 für die C1- und C2-Zellen bei einer Lichtdosis von 2 J/cm2 bestimmen (Abb. 2).

AC1 C2

B

C

Übe

rlebe

n [%

]R

eativ

eFl

uore

szen

zint

ensi

tät

0 10 200

10

20

30

40

50C1C2

C1 5-ALAC2 5-ALA

Zeit [h]

0 1 2 3 4 5 60

20

40

60

80

100

120 C1 C2

Lichtdosis [J/cm2]

AC1 C2

B

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Zeit [h]

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20

40

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80

100

120 C1 C2

Lichtdosis [J/cm2] Abb. 2: Anreicherung von PPIX in C1- und C2-Zellen und deren Empfindlichkeit gegenüber PDT. A: C1- und C2-Zellen wurden für 4 h mit 100 µg/ml 5-ALA inkubiert und das angereicherte PPIX mittels Durchflusszytometrie bestimmt. B: C1- und C2-Zellen wurden mit 50 µg/ml inkubiert und der Gehalt an PPIX in den Zellen zu den angegebenen Zeitpunkten bestimmt. C: C1- und C2-Zellen wurden mit 5 µg/ml 5-ALA für 4 h inkubiert und mit unterschiedlichen Lichtdosen bestrahlt. Nach 4 h wurde die Vitalität der Zellen mit dem MTT-Test bestimmt.

Reaktion der C1-Zellen auf eine subletale PDT: Zellen reagieren auf Noxen, wie zum Beispiel auf Schädigungen durch PDT-generierte reaktive Sauerstoffspezies, mit der Induktion von Stressproteinen und pro-inflammatorischen Faktoren. Diese können im Falle von Tumorzellen einen stimulierenden Einfluss auf die Induktion einer Anti-Tumorimmunantwort beim Vorliegen ge-eigneter Gefahrensignale (danger signals) haben. Hitzeschockproteine (HSP) stellen eine wichtige Gruppe von Stressproteinen dar, die eine effektive Anti-Tumorimmunantwort unterstützen können. Einige dieser Proteine (z. B. HSP90) werden, komplexiert mit Tumorpeptiden, bereits in klinischen Studien getestet. Wir haben deshalb C1-Zellen einer PPIX-vermittelten PDT unterzogen und die Expression verschiedener Hitzeschockproteine auf Proteinebene mittels Western Blot untersucht. Wie in Abb. 3 gezeigt, reagieren die C1-Zellen auf Hitzestress mit der Hochregulation verschiedener HSP, und tatsächlich war auch in PDT behandelten C1-Zellen eine Hochregulation von HSP70 nachzuweisen. Obwohl die Hochregulation bei weitem nicht so ausgeprägt war wie nach Hitzebehandlung, zeigen diese Experimente deutlich, dass Tumorzellen im Zuge einer PDT so genannte danger signals aussenden, die bekanntermaßen die Immunantwort unter-stützen.

Abb. 3: Induktion von Hitzeschockproteinen. A: C1-Zellen wurden mit 5-ALA beladen und mit 2 J/cm2 bestrahlt. Die überlebenden Zellen wurden nach den angegebenen Zeitpunkten geerntet und die Expression der HSP mittels Western Blot bestimmt. B: Der Hitzeschock wurde in einem Wasserbad bei 45°C für 22 min. durchgeführt.

R. Kammerer, P. Palluch, W. Beyer, R. Baumgartner, M. Heide, H. Pohla, H. Stepp, W. Zimmermann

Förderung: Deutsche Krebshilfe (107320).


Erfolgreiche Immuntherapie des Magenkarzinoms in einem spontanen autochthonen Mausmodell

Einführung: Auf der Basis zweier transgener Mausmodelle haben wir in den letzten Jahren ein In-vivo-Tumormodell aufgebaut, das für die Überprüfung und Optimierung von Tumor-immuntherapien hervorragend geeignet ist. Im ersten transgenen Mausmodell wird ein humanes Tumorantigen (CEA) exprimiert (CEA-tg-Mäuse). Das CEA wird in diesen Mäusen als Selbstantigen akzeptiert, so dass, wie im Menschen, keine immunologische Reaktion gegen dieses Antigen induziert wird. Im zweiten transgenen Modell wird das T-An-tigen, ein Onkogen des SV40-Virus, unter der Kontrolle des CEA-Promotors exprimiert (424CEA-Tag-tg-Mäuse). Dies führt in 100% der Tiere in einem Alter von 90-110 Tagen zu einer spontanen Tumorentwicklung im Pylorusbereich des Magens (Abb. 1).

Abb. 1: Vergleich des Magens einer 424CEA-TAg-tg-Maus (links) und einer Wildtyp-C57BL/6-Maus (rechts). Die einzelnen Bereiche des Magens sind in der Mitte der Abbildung angegeben und markieren die entsprechenden Regionen beider Mägen. Die Mägen wurden entlang der kleinen Kurvatur geöffnet.

Kreuzt man diese beiden Tierstämme, so erhält man Mäuse, die, wie oben beschrieben, Magen-karzinome entwickeln und das humane Tumorantigen im Tumor und im Normal-gewebe exprimieren (CEA424-TAg/CEA-tg). Aus diesen spontan entstandenen Tumoren beider transgener Mausstämme haben wir mehrere Tumorzelllinien etabliert und charakterisiert. Die Tumorzelllinien können, trotz der Expression der erwähnten Antigene, in immunkompetente Wildtyp-C57BL/6-Mäuse subkutan transplantiert werden, ohne eine Abstoßungsreaktion auszulösen. Durch die Kombination der verschiedenen Mausstämme und den daraus etablierten Zelllinien können wir die Wirksamkeit von Tumorimmun-therapien in Modellen mit aufsteigendem Schwierigkeitsgrad, bis hin zu einem spontan entstehenden Tumor, überprüfen. In Abb. 2 sind die Komponenten und ihre Kombinations-möglichkeiten schematisch zusammengefasst.

C57BL/6J CEA424-TAg

transplantierbar

C57BL/6J

Etablierte Zelllinien(CEA424-TAg/CEA-tg)

mGC11++mGC2++ mGC4++

CEA424-TAg transgene Mäuse (H-2b)

Spontaner Magentumor

CEA424-TAg/CEA transgeneMäuse (H-2b)

Etablierte Zelllinien(CEA424-TAg-tg)

424GC+-mGC3+-mGC5+-mGC8+-

transplantierbar

CEA424-Tag-tgCEA-tg

(CEA424-TAg/CEA)-tg

Einzelnes TSA

ZweiTSA

Einzelnes TAA

TSA TAA

TSA TAA

TAA TAA

Abb. 2: Schematische Darstellung der unterschiedlichen Tumormodelle zur systematischen Optimierung von Tumorimmuntherapien.

Ergebnisse: Um grundsätzlich die Frage zu beantworten, ob die Progression des spontan entstehenden Magentumors in den transgenen Mäusen durch eine Tumorimmuntherapie beeinflusst werden kann, haben wir einen adoptiven Transfer von Milzzellen aus nicht immunisierten (naive, T-Ag-spezifische T-Zellen) und gegen SV40-T-Ag-immuni-sierten (geprimte, T-Ag-spezifische T-Zellen) C57BL/6-Mäusen auf CEA424-Mäuse durch-geführt. Bei diesem Vorgehen wird die zentrale Toleranz gegenüber dem T-Ag, die in den transgenen Mäusen besteht, umgangen. Wie in Abb. 3 gezeigt ist, haben die CEA424-Mäuse, die einmal Milzzellen von immunisierten C57BL/6-Mäusen bekamen („Adoptiver Transfer 1“) eine signifikant längere Über-lebenszeit als Mäuse, die Milzzellen von nicht immunisierten Tieren („Kontrolle“) bekamen oder bei denen kein adoptiver Transfer durch-geführt wurde. Die Überlebenszeit konnte noch einmal deutlich erhöht werden wenn eine Wiederholung des adoptiven Transfers durch-geführt wurde („Adoptiver Transfer 2“) (Abb. 3). Wurden Milzzellen von nicht immun-isierten C57BL/6-Mäusen transferiert und die transgenen Rezipienten danach gegen das SV40-T-Ag immunisiert, so konnten wir keine Lebensverlängerung erzielen. Analysen der Milzzellen dieser Tiere zeigten jedoch, dass eine begrenzte Anzahl von T-Ag-spezifischen T-Zellen durch diese Behandlung erzeugt wurde. Die Frequenz der antigenspezifischen T-Zellen konnte jedoch durch wiederholtes Immunisieren nicht erhöht werden. Diese Befunde sprechen für eine zusätzlich vor-handene, periphere Toleranz gegenüber dem

Tiermodelle 75

T-Ag in diesen Tieren, die eine T-Ag-spezifische Immunantwort limitiert. Solche Toleranzphänomene sind auch beim Menschen häufig der Grund für das Scheitern von aktiven Tumorimmuntherapien.

Überleben

Kontro

lle

Adopti

ver T

ransfe

r 1

Adopti

ver T

ransfe

r 2

100

120

140

160

Behandlung

Zeit

Abb. 3: Überleben von 424CEA-Tag-tg-Mäusen. 108 Milzzellen von naiven (Kontrolle) oder T-Ag-immunen C57BL/6-Mäusen (Adoptiver Transfer 1) wurden i.p. in CEA424T-Ag-transgenen Mäuse transferiert. Mäuse bei denen der adoptive Transfer mit Milzzellen von immunisierten Mäusen wiederholt wurde sind mit „Adoptiver Transfer 2“ bezeichnet. Die Mäuse, die einen zweifachen Milzzelltransfer bekamen, wurden im Alter von etwa 150 Tagen getötet, ohne dass Krankheitsanzeichen zu erkennen waren.

In den letzten Jahren wurden große Fortschritte bei der Entwicklung von so genannten „Designer-T-Zellen“ gemacht. Dabei handelt es sich um T-Zellen, die gentechnisch so verändert wurden, dass sie über künstlich modifizierte T-Zellrezeptoren bestimmte Tumorantigene erkennen. Durch diese neuen Möglichkeiten kommt der adoptiven Immun-therapie wieder eine erhöhte Bedeutung zu. Im Mausmodell kann man solche „Designer-T-Zellen“ sehr leicht simulieren, indem man antigenspezifische T-Zellen im nichttransgenen Elternstamm der transgenen Tiere durch konventionelle Immunisierung herstellt. Diese tumorantigen-spezifischen T-Zellen können nun adoptiv in die transgenen, tumortragenden Mäuse transferiert und deren therapeutische Wirkung bestimmt werden.

Das längere Überleben der transgenen Mäuse , nach dem adoptiven Transfer von T-Ag-spez-ifischen T-Zellen zeigt, dass diese Form der Immuntherapie in der Lage ist, die Progression des Magenkarzinoms zu verzögern. Da sich T-Ag-spezifische T-Zellen aus der Magenwand

dieser Mäuse isolieren ließen, scheint die spezifische Tumorzelllyse durch T-Ag-spezifische CTL für diesen therapeutischen Effekt verantwortlich zu sein. Tatsächlich zeigen immunhistologische Untersuchungen eine vermehrte Präsenz von lymphozytären Zellen in den submukosalen Tumorarealen der behandelten Mäuse. Entsprechend ist die submukosale Tumorausbreitung in den behandelten Mäusen deutlich kleiner als in den unbehandelten Mäusen (Abb. 4).

Abb. 4: Ausbreitung des spontan entstandenen Magenkarzinoms in der Mukosa und Submukosa des Magens von unbehandelten Mäusen (A) und durch adoptiven T-Zell-Transfer behandelter Mäuse (B). Der Verlauf die Lamina muscularis mucosae, welche die Mukosa von der Submukosa trennt, ist durch Pfeile markiert. Die Stärke der submukosalen Tumormasse ist durch die senkrechten Linien verdeutlicht.

Überraschenderweise unterschieden sich die mukosalen Tumorareale der behandelten Mäuse histologisch kaum von denen der unbe-handelten Mäuse. Es konnte auch keine ver-stärkte lymphozytäre Infiltration in diesem Bereich festgestellt werden. Einen vergleichbareren Befund erhält man nach wiederholtem adoptiven T-Zell-Transfer. Obwohl die Stärke der submukosalen lymphozytären Infiltration wesentlich erhöht und die submukosale Ausbreitung des Tumors deutlich verringert war, konnte keine auffällige Antitumor-Immunreaktion in der Drüsen-magenmukosa beobachtet werden. Dies spricht dafür, dass die Effektivität einer adoptiven Immuntherapie, auch mit antigenspezifischen T-Zellen, regional sehr unterschiedlich sein kann. Dies hat für die therapeutische Intention, der Behandlung von Metastasen oder einer minimal residual disease, enorme Bedeutung.

R. Kammerer, N.K. van den Engel 1, B. Sievers, J. Nöckel, H. Winter 1, I. Drexler 2, 3, W. Zimmermann

Koop: 1 Chirurgische Klinik, Klinikum der Universität München; 2 Institut für Molekulare Virologie, GSF; 3 Institut für Virologie, TU München.



Allogene genetisch modifizierte Tumorzellvakzine (RCC-26/CD80/IL-2) zur Therapie von Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom (klinische Phase-I-Studie)

Studienaufbau und klinische Daten: Das Nierenzellkarzinom führt in Deutschland zu etwa 12.000 Neuerkrankungen im Jahr. Etwa jeder dritte Patient hat zum Zeitpunkt der Diagnosestellung bereits Metastasen, ein weite-res Drittel der Patienten entwickelt Metastasen im weiteren Verlauf. Während der Primärtumor in der Regel operativ entfernbar ist, stellt die Behandlung der metastasierten Erkrankung we-gen der Resistenz gegenüber Strahlen- und Chemotherapie ein großes Problem dar. Zytokin-basierte Therapieformen und anti-angiogenetische Wirkstoffe wie die neuen Kinase-Inhibitoren führen bei einem Teil der Patienten zu begrenzten Erfolgen (meist nur eine vorübergehende Stabilisierung) bei oft er-heblichen Nebenwirkungen.

Das Ziel unserer Vakzinetherapie-Studie mit genetisch modifizierten Tumorzellen ist die Entwicklung einer spezifischen Therapie gegen das metastasierte Nierenzellkarzinom. Dabei wurde aus Tumormaterial eines HLA-A*0201- positiven Patienten eine Zelllinie etabliert (RCC-26), die durch genetische Modifikation (Transfektion mit Expressionskonstrukten für Interleukin-2 (IL-2) und CD80 (B7.1)) eine gegenüber der Ursprungszelle erhöhte Immunogenität aufweist und T-Zellen zu Proli-feration und Tumor-spezifischer Zytotoxizität aktivieren kann (Abb. 1). Dieses wurde in zahl-reichen In-vitro-Untersuchungen nachgewie-sen.

Es wurde eine klinische Phase-I-Studie initiiert, um die allogene RCC-26/CD80/IL-2-Tumor-zellvakzine an einem Patientenkollektiv mit metastasiertem Nierenzellkarzinom bezüglich folgender Zielvariablen zu testen:

• Sicherheit / Toxizität der Vakzine

• Aktivierung spezifischer Immunreaktionen

• Klinisches Ansprechen

Im Vordergrund stand dabei die klinische Überwachung der Patienten mit umfangreichen Laborkontrollen, insbesondere auch von Para-metern, die die Induktion potentieller Autoim-munreaktionen anzeigen (antinukleäre Antikör-per, Rheumafaktor, Komplementfaktoren u. a.). Die Aktivierung spezifischer antitumoraler Immunreaktionen wird derzeit mit einer Reihe aufwändiger Methoden an Blutproben und Hautbiopsien der Patienten überprüft (Immun-monitoring, siehe unten). Die Beurteilung des

klinischen Ansprechens der Tumorerkrankung erfolgte durch engmaschiges Restaging der Pa-tienten mit Computertomographie und Skelett-szintigraphie.

Für den Einschluss von Patienten in die Vakzi-nestudie galten folgende Kriterien:

• metastasiertes Nierenzellkarzinom

• mindestens eine messbare Markerläsion

• keine systemische Therapie 3 Monate zuvor

• guter Allgemeinzustand

• keine Autoimmunerkrankung

• keine immunmodulatorische Therapie (Kortikoide etc.)

• HLA-A*0201-Subtyp

Abb. 1: (a) Die ursprüngliche Tumorzelle RCC-26 präsen-tiert zwar Tumorantigen, dies allein führt aber bei den zytotoxischen T-Zellen nicht zur Aktivierung. (b) Erst die genmodifizierte Vakzinezelle bewirkt durch das kostimu-latorische Signal (CD80) und die IL-2-Produktion die Proliferation und antitumorale Aktivierung der T-Zellen.

Damit die Vakzine zu einer effektiven Antigen-präsentation im Immunsystem des Patienten führen kann, sollte dieser zumindest ebenfalls den HLA-A*0201-Subtyp aufweisen. Dieses wurde an einer Blutprobe zunächst serologisch und nach Isolierung der genomischen DNA mittels PCR und Sequenzierung getestet. Der Subtyp HLA-A*0201 findet sich in Mittel-europa bei etwa der Hälfte aller Menschen.

Klinische Studien 77

Das Zeitschema für die Vakzinestudie (Abb. 2) zeigt die intradermale Applikation der Vakzine in drei ansteigenden Konzentrationsstufen so-wie die dreimalige Entnahme einer Hautbiopsie aus einer Applikationsstelle, um eine histo-pathologische Beurteilung des lokalen Zellin-filtrats 48 Stunden nach Applikation sowie funktionelle Untersuchungen an den infiltrie-renden Lymphozyten in der Zellkultur vorneh-men zu können. Bei drei Patienten wurde das Protokoll modifiziert, indem die vier Gaben der niedrigsten Dosisstufe gestrichen wurden, so dass von Anfang an 1 x 107 Vakzinezellen gegeben wurden.

Abb. 2: Zeitschema für die intradermale Applikation der Tumorzellvakzine in drei ansteigenden Dosisstufen. In Studienwoche 6, 14 und 22 wird jeweils eine Hautbiopsie aus einer Injektionsstelle (48 Stunden nach Vakzinegabe) entnommen.

Nr. Alter, m/w Stadium** Vakzine Survival

1 39, m T2N0M0G2 4 / 1 / - 31

2 66, m T2N0M1G3 4 / 4 / 2 79

3 68, w T3bN0M1G2 4 / 4 / 2 68

4 61, m T3bN0M1G2 4 / 4 / 2 76

5* 61, m T3bNxM1G2 - / 4 / - 18

6* 63, m T2N0M0G2 - / 4 / 2 84

7* 68, w T1N0M1G2 - / 4 / 2 79

8 65, w T2NxM0G1 4 / 4 / 2 55

9 49, m T3bNxM1G2 4 / 4 / - 17

10 48, w T1bN2M1G3 4 / - / - 8

11 53, m T1bN0M0G2 4 / 4 / 2 30 (lebt)

12 61, m T3aN0M1G3 4 / 4 / 2 36 (lebt)

13 58, m T2NxM1G2 4 / 4 / 2 29 (lebt)

Tab. 1: Übersicht über die Patienten der Vakzinestudie (Stand 3/07). In der Spalte „Vakzine“ ist die Zahl der Applikationen pro Dosis-Stufe angegeben (2,5 / 10 / 40 x 106 Zellen). In der Spalte „Survival“ ist die Überlebenszeit in Wochen angegeben. * bei drei Patienten entfiel die niedrigste Dosis. ** Bei Stadium N0M0 und NxM0 traten die Metastasen zu einem späteren Zeitpunkt auf.

Insgesamt wurden 135 Patienten für die Studie HLA-typisiert, von denen 69 Patienten A*0201-positiv waren. Viele der Patienten waren jedoch zu progredient oder wurden von Klinikseite in Industrie-gesponserte Studien eingeschlossen. Bis März 2007 konnten jedoch

15 Patienten in die Studie eingeschlossen werden. Von diesen sind 13 Patienten auswertbar, da sie alle die komplette Anzahl an Vakzine-Applikationen erhalten haben oder gemäß dem Studienprotokoll bis zur Progression vakziniert worden sind (Tab. 1).

Ernsthafte systemische Nebenwirkungen traten bei keinem Patienten auf, ebenso gab es keinen Hinweis für die Induktion von klinisch rele-vanten Autoimmunphänomenen. Typisch war eine lokale Hautreaktion an den Injektions-stellen innerhalb von 48 Stunden (Rötung, Induration, leichter Juckreiz) im Sinne einer Typ-IV-Immunreaktion, die spontan wieder ab-geklungen und nicht behandlungsbedürftig war.

Bei einem Teil der Patienten fanden sich vorübergehende Erhöhungen von Amylase und Lipase (Abb. 3) sowie leichte Verschiebungen im Differentialblutbild (Anstieg der neutro-philen und eosinophilen Granulozyten, Abfall der Lymphozyten), aber kein Hinweis auf klinisch relevante Autoimmunphänomene wie etwa Thyreoiditis oder Pankreatitis.

Abb. 3: Beispiel für den Verlauf von Amylase und Lipase bei einem Patienten im Verlauf der zehn Vakzinierungen (Pfeile mit Angabe der Studienwoche am oberen Bildrand). Beide Werte stiegen während der vier rasch aufeinander folgenden Vakzinegaben der mittleren Dosis an und normalisierten sich während der längeren Therapiepausen wieder (Einheiten: U/l).

Das mediane Zeitintervall bis zur Progression war 28 Monate, das mediane Überleben der Patienten betrug 68 Monate, drei Patienten sind noch unter Beobachtung (Stand 3/07, Abb. 4). Remissionen wurden nicht beobachtet. Es besteht eine Assoziation zwischen dem Auftreten einer deutlichen lokalen Haut-reaktion an der Vakzine-Applikationsstelle und einem längeren Überleben. Dies kann als Hinweis auf einen immunologischen Effekt der Vakzine gewertet werden.

Derzeit laufen die umfangreichen Analysen zum Immunmonitoring sowie zur histopatho-logischen und funktionellen Untersuchung der Hautbiopsien. Einige der Ergebnisse sind im Folgenden dargestellt.


Abb. 4: Kaplan-Meier-Kurven für 13 Patienten. (A) Zeit bis zur Progression, (B) Gesamtüberleben.

Immunmonitoring: Für das Immunmonitoring wurden jeweils vor der ersten Vakzinierung und 48 Std. nach der 4., 8., und 10. Vakzinierung, d. h. zum Zeitpunkt der Hautbiopsien, und zum Follow-up-Termin drei Monate später, Blutproben abgenommen. Bei fünf Patienten wurde zusätzlich 14 Tage nach der letzten Vakzinierung eine weitere Blut-probe abgenommen. Aus diesen heparinisierten Blutproben wurden PBMC isoliert und kryokonserviert. Ferner wurden jeweils vor der ersten Vakzinierung und vor und 48 Std. nach der 4., 8., und 10. Vakzinierung sowie vor und 24 Std. nach jeder Dosiserhöhung (5. und 9. Vakzinierung) zusätzliches Blut für die Serumgewinnung abgenommen. Auch das Serum wurde aliquotiert und kryokonserviert, und dient derzeit einer umfangreichen Multiplex-Zytokin-Bestimmung (IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, TNF-α, IFN-γ, GM-CSF etc.). Die mit Skalpell heraus-geschnittenen und maximal erbsengroßen Hautbiopsien wurden aufgeteilt und für die Immunhistologie sowie für die direkte RNA-Isolierung zum TCR-Tracking zunächst ebenfalls eingefroren. Außerdem wurden kleine Stückchen direkt in T-Zell-Kulturmedium aufgenommen, um auswandernde Lympho-zyten phänotypisch und funktionell charakterisieren zu können. Allerdings mussten die Zellen meistens 10-18 Tage mit

50 U IL-2/ml in Kultur gehalten werden, da ansonsten die Zellzahl ex vivo nicht ausgereicht hätte, um eine durchflusszytome-trische Analyse ihrer Zelloberflächenmarker und ihres Zytokin- bzw. Chemokin-Expressionsprofils durchführen zu können. In den meisten Fällen dominierten CD4+-T-Zellen vom Effector-memory-Typ in der Kultur. Die Zytokinprofile nach In-vitro-Stimulation mit den Tumorzellen wiesen bei einigen Patienten eine erhöhte Sekretion von IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 und GM-CSF auf. Die Sezernierung von TNFα und G-CSF nahm dagegen eher ab. IL-1β, IL-7, IL-12 und IL-17 waren meistens nicht detektierbar, IL-2 und IFN-γ ließen sich aus methodischen Gründen (lt. Firma: Serumgehalt im Medium) quan-titativ nicht reproduzierbar bestimmen. Gut ließen sich jedoch mittels des Cytometric Bead Arrays bei den Patienten die Chemokine IP-10 (CXCL10), MIG (CXCL9) und RANTES (CCL5) am Durchflusszytometer quantifizie-ren. Abb. 5 zeigt die verstärkte Sekretion von RANTES nach wiederholter Impfung am Beispiel von Patient 2.

Abb. 5: RANTES-Produktion der Haut-infiltrierenden Lymphozyten von Patient 2. Die Biopsieentnahmen erfolgten jeweils 48 Std. nach 4., 8. und 10. Vakzinegabe. in vitro in der Kultur auswandernde T-Zellen wurden erneut mit der RCC-26/CD80/IL-2 Vakzine stimuliert. Die Chemokine wurden mittels des Cytometric Bead Arrays am FACSCalibur im Kulturüberstand bestimmt (Angabe in pg/ml aus 50 µl Kulturüberstand; 500.000 T-Zellen stimu-liert mit 50.000 Tumorzellen in 1,5 ml Medium).

RANTES ist ein Chemokin, das u. a. chemo-taktisch auf T-Zellen und Eosinophile wirkt, und eine aktive Rolle bei der Rekrutierung von Leukozyten in inflammatorisches Gewebe spielt. Es unterstützt insbesondere die Migra-tion von Monozyten und CD4+-T-Zellen. Außer RANTES werden ebenfalls die Chemokine IP-10 und MIG nach Stimulation verstärkt sezerniert. Die Expression dieser Chemokine wird insbesondere über IFN-γ induziert und sie wirken ebenfalls


chemotaktisch auf aktivierte T-Zellen. Betrachtet man jedoch die einzelnen Vakzinierungszeitpunkte, stellt sich dieser Ver-lauf durchaus unterschiedlich bei den einzelnen Patienten dar. Eine Korrelation zum klinischen Befund lässt sich derzeit noch nicht klar ableiten, da noch nicht alle Patientenproben analysiert worden sind.

TCR-Tracking: Speziell für unsere RCC-26- Vakzinestudie hat die quantitative Analyse des TCR über die Real-time-RT-PCR mittels des LightCycler� große Bedeutung. Mit der Bestimmung der TCR-Sequenz eines autologen RCC-reaktiven TIL-26-Klones, erhielten wir einen außerordentlich nützlichen Surrogat-marker, um die Entwicklung von Tumor-assoziierten Immunantworten nicht nur in autologen und allogenen Kulturen sondern auch während der Vakzinierungen verfolgen zu können (Abb. 6).

TIL-26„GG“

CDR3AV20 GGSARQL AJ22

TIL-26„LSG“

CDR3AV20 LSGSARQL AJ22

AV20.3 – AJ22.3 AV20 – AJ22.5

Molekularer Marker zur Molekularer Marker zur ÜÜberprberprüüfung der Reaktivierung/Expansion fung der Reaktivierung/Expansion TumorTumor--assoziierterassoziierter GedGedäächtnischtnis--TT--ZellenZellen

- Keine Kreuzreaktivität der Primer- Bestätigung durch Sequenzierung- Standardkurven (real-time RT-PCR)

Dominante in situTIL26 T-Zellklone

Abb. 6: TCR-Tracking. Die für TIL-26 charakteristische TCR-Sequenzen in der CDR3-Region des TCR können als molekulare Marker für die Quantifizierung Tumor-reaktiver T-Zellen in den Patienten dienen. Die CDR3-Region (complementary determining region-3) des TCR interagiert mit dem Peptidantigen und weist demnach auch die höchste Sequenzvariabilität auf.

Das TCR-Tracking ist gegenwärtig in Arbeit. Abb. 6 zeigt die Expression des TIL-26-spezifischen TCR (AV20.3-AJ22.3 mit der „GG“-Sequenz in der CDR3-Region) in der Hautbiopsie von Patient 6 nach der 4. Vakzi-nierung.

Abb. 7: Expression des TIL-26-spezifischen AV20.3-AJ22.3 TCR mit der „GG“-Sequenz in der CDR3-Region. Die Gelanalyse der PCR-Amplifikate aus den Hautbiopsien zeigt im Vergleich zu Patient 1 in der Hautbiopsie von Patient 6 die spezifische Bande.

Die PBMC der Patienten dienen folgenden Immunmonitoring-Analysen:

• ELISPOT: IFN-γ, Perforin

• MHC/Peptid-Multimer-Färbungen

• Mehrfarben-Durchflusszytometrie am LSRII-Gerät: T-Zell-Subpopulationen, NK-Zellen, regulatorische Zellen

• TCR-Tracking

• In-vitro-Stimulationen (IVS)

Ergebnisse der 4-wöchigen IVS-Kulturen mit Zellen vor der ersten und nach der zehnten Vakzinegabe zeigen, dass die T-Zellen aus den Patienten mit der längeren Überlebensrate eine schnellere Proliferationsrate insbesondere gegenüber der Vakzine-Zelllinie aufweisen, was bedeuten könnte, dass hier bereits ein größerer Anteil an Effektor-Gedächtnis-T-Zellen vorliegt. Eine Analyse der Oberflächenmarker, des Zytokinprofils sowie der TCR-Expression wird auch hier derzeit durchgeführt.

Um Inter-Assay-Variabilitäten zu vermeiden, werden die sehr sensitiven aber auch empfindlichen ELISPOT-Assays erst durchge-führt, wenn die Proben aller Patienten vor-liegen. Aus Vorarbeiten wissen wir, dass die Verwendung eingefrorener PBMC kein Pro-blem für ELISPOT-Analysen darstellt. Zwischenzeitlich konnten wir in Kooperation mit der GSF (D.J. Schendel, B. Frankenberger, E. Nössner), H.G. Rammensee und S. Stevano-vic (Tübingen), sowie D. Hunt (USA) 34 interessante Antigenkandidaten identifizieren, die als Surrogatmarker für das Immun-monitoring von Bedeutung sind. Für diese 34 Antigene wurden 78 Peptide mit HLA-A*0201-Bindungsmotiv bestimmt, die uns von R. Frank (Helmholtz-Zentrum für Infektions-forschung, Braunschweig) synthetisiert worden sind. Die Peptidepitope, die sich in den ELISPOT-Analysen als erfolgreich erweisen, werden dann für die Multimer-Herstellung verwendet (Kooperation: D. Busch, TU München).

Von Patient 5 stand nach einer notwendigen tumororthopädischen Operation Material einer Knochenmetastase zur Verfügung. Dieses Ge-webe wurde mittels quantitativer PCR analy-siert und zeichnete sich insbesondere durch Überexpression der Gene für G250, Survivin, PRAME, EGFR und Vimentin aus (Tab. 2). Diese Antigene sind ebenfalls als geeignete Monitoringmarker für die Patienten ausgewählt worden.


1,371,440,44754,831CAIX(=G250)

0,840,650,0394,351PRAME

4,0311,477,5212,641Vimentin

0,661,360,661,111ELAC

1314,231,710,351,221NY-ESO-1

26,7285,0417,0314,831EGFR

0,421,600,221,601Adipophilin

6,72155,4258,89114,561Survivin

RCC26/CD80/IL7RCC26/CD80/IL2RCC26#5NN

Tab. 2: Expressionsanalyse einiger Genkandidaten mittels quantitativer Real-time-RT-PCR Normalisiert wurde auf primäres Normalnierengewebe (NN). Verglichen wurden die RCC-26-Zelllinien und Material aus der Knochen-metastase des Patienten 5. (Die Zahlen bedeuten n-fache Überexpression).

Zusammenfassung: Grundsätzlich handelt es sich bei RCC-26/CD80/IL-2 um eine sehr sichere Genvakzine. Es gab bisher keine ernsthaften systemischen oder lokalen Neben-wirkungen und keinen Anhalt für die Induktion einer Autoimmunität. Die bisher vorliegenden Daten deuten auf einen immunologischen Effekt mit Beeinflussung des Krankheits-verlaufs bei einem Teil der Patienten hin.

A. Buchner 1, H. Pohla, B. Stadlbauer, B. Konkol, H. Herbig, R. Oberneder 2, A. Baur 3, A. Hofstetter, C. Stief 1, T. Blankenstein 4, D.J. Schendel 5.

Koop.: 1 Urologische Klinik, Klinikum der Universität München; 2 Urologische Klinik, München-Planegg; 3 Institut für Klinische Radiologie, Klinikum der Universität München; 4 Institut für Immunologie, Charité Berlin und Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin, Berlin-Buch; 5 Institut für Molekulare Immunologie, GSF.

Förderung: BMBF DLR 01 GE 9624/1; KKG „Immun-therapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF).


Einsatz einer Zytokin-Gentherapie beim hormonrefraktären Prostatakarzinom (klinische Phase-I-Studie)

Einführung: Das Prostatakarzinom (CaP) ist unter den urologischen Tumoren die häufigste Todesursache und ab dem 80. Lebensjahr auch die häufigste tumorbedingte Todesursache beim Mann. Die Therapie der Wahl bei einem lokal begrenzten CaP ist die radikale Prostatektomie. In Abhängigkeit vom Tumorstadium wird adjuvant auch die Radiotherapie angewandt. Eine weitere Therapieoption ist die Hormontherapie, die entweder als neoadjuvante Therapie vor Strahlentherapie beim lokal fortgeschrittenen CaP oder als adjuvante Therapie nach kurativer Ersttherapie eingesetzt wird. Grundsätzlich von Bedeutung ist die Androgenblockade beim metastasierten CaP. Fast immer entwickelt sich aus einem primär Androgen-abhängig wachsenden Tumor ein Hormon-unabhängiges (hormonrefraktäres) Karzinom (HRPC). Hier sind die Therapieoptionen limitiert und der Patient kann zumeist nur noch palliativ behandelt werden (zytotoxische Chemo-therapie, Gabe von Bisphosphonaten bei Knochenmetastasen). Als alternative experi-mentelle Therapieoptionen beim HRPC gelten die Gentherapie, der Einsatz von Inhibitoren bestimmter Wachstumsfaktoren und der Angio-genese sowie monoklonale Antikörper (Abb. 1).

Diagnose: Hormonrefraktäres CaP (HRPC); Stadium IV Medianes Überleben: 8.8 – 22.8 Monate (Halabi, 2003)Keine effektive Therapie mehr verfügbar (palliative Behandlung)

*

PS

A A

nstie

g

Zeit

Standard-Therapie I(Operation,Bestrahlung)

Standard-Therapie II(androgeneAblation)

ExperimentelleTherapy(Gentherapie)

�

D: CaP D: met. CaP

*

Abb. 1: Charakteristischer Verlauf des PSA-Wertes in Abhängigkeit von Diagnose und Therapie beim Prostata-karzinom.

Durchführung der Gentherapiestudie: Am Klinikum der Technischen Universität Mün-chen (Prof. B. Gänsbacher, Institut für Experi-mentelle Onkologie und Therapieforschung, Prof. R. Hartung, Urologische Klinik) wurde eine klinische Phase-I/II-Studie mit einer gene-tisch modifizierten Tumorzellvakzine durch-geführt, für die im Labor für Tumor-immunologie sowohl die HLA-Typisierung als auch das Immunmonitoring durchgeführt wurde. Produziert wurde diese Vakzine am Sloan-Kettering Cancer Center, New York. Die allogene HLA-A*0201-positive Prostata-karzinomzelllinie LNCaP wurde durch retro-viralen Gentransfer mit den cDNAs für die

Zytokine IL-2 und IFN-γ transfiziert. IL-2 soll die Aktivierung und Proliferation von T-Lymphozyten und NK-Zellen fördern, IFN-γ soll u. a. zu einer gesteigerten Expression von MHC-Molekülen auf der Zelloberfläche der Tumorzellen und damit auch zu einer gestei-gerten Präsentation Tumor-assoziierter Peptid-fragmente führen. Die Zellen wurden vor In-jektion mit 150 Gy bestrahlt, um ein Tumor-wachstum im Körper der Patienten zu verhin-dern. Anschließend wurden die Zellen dann in einem Dosis-Eskalationsversuch den Patienten intradermal an den Tagen 1, 15, 29 und 92 injiziert und dann alle weiteren 90 Tage bis Tumorprogression erkennbar war. Phase I der klinischen Studie mit 6 Patienten und Phase II mit 24 Patienten und einem Follow up von mindestens sechs Monaten bei vier Vakzinierungen sind beendet und befinden sich in der Auswertung. PSA-Bestimmung, Com-putertomographie und Knochenszintigraphie dienten dem klinischen Monitoring. Primäres Ziel war die Verlängerung der PSA-Ver-dopplungszeit. Sekundärer Endpunkt der Studie war die longitudinale Evaluierung der Immunantwort.

Ergebnisse: Abb. 2 zeigt die bei den Patienten typischen PSA-Konzentrationsverläufe unter Therapie.

Abb. 2: Typische Verläufe der PSA-Konzentrationen im Serum der Patienten zum Zeitpunkt der einzelnen Vakzinierungen (durch Pfeil gekennzeichnet) am Beispiel der Patienten 105 („Non-Responder“), 108 (transiente Stabilisierung) und 125 („Responder“) aus der klinischen Phase-I-Studie.


Insgesamt 4/30 Patienten (aus Phase I und II) mussten wegen zu starkem Krankheitsprogress nach drei Injektionen aus der Studie genommen werden. Von den restlichen zu bewertenden Patienten zeigten 10 Patienten einen weiteren Anstieg des PSA-Wertes, 13 eine transiente Stabilisierung über einen Zeitraum von min-destens sechs Wochen und drei Patienten zeig-ten eine 50%ige Reduktion der PSA-Konzen-tration, wobei ein Patient seit über drei Jahren stabil ist.

Insgesamt zeigte sich, dass es sich um eine sehr sichere Vakzine mit einem geringen Neben-wirkungsspektrum (< WHO 2-3) handelt. Zu keiner Zeit - auch nach Dosiserhöhung von 7,5 auf 15 Mio. Zellen - wurden stärkere lokale oder sogar systemische Nebenwirkungen beo-bachtet.

Immunmonitoring: Für ELISPOT-Analysen und MHC/Peptid-Tetramer-Bindungsstudien wurden insgesamt 40 verschiedene Peptide, einschließlich einiger bereits beschriebener HLA-A2-restringierter T-Zell-Epitope syntheti-siert. In Abhängigkeit der Verfügbarkeit an Patientenmaterial wurden insbesondere die Epitope folgender Antigene getestet: PSA, PSMA (Prostata-spezifisches Membrananti-gen), PAP (prostatic acid phosphatase), PSCA (prostate stem cell antigen), STEAP (six-transmembrane epithelial antigen of the prostate), PSGR (prostate-specific G protein-coupled receptor), PCTA (prostate carcinoma tumor antigen), PRAME (preferentially expressed in melanoma), Survivin und EpCAM (epithelial cell adhesion molecule). Abb. 3 zeigt die Reaktivität peripherer T-Zellen des Patienten 113 gegenüber PSGR-1 im IFNγ-ELISPOT.

A B

Tag 0 (vor Vakzinierung) Tag 22 (nach 2. Vakz.) Tag 512 (nach 9. Vakz.)

C

D E F

Abb. 3: IFNγ-ELISPOT zur Analyse der Immunantwort gegenüber PSGR-1 (ILLVMGVDV) am Beispiel des Patienten 113. Dem Patienten wurden vor und jeweils acht Tage nach den einzelnen Vakzinierungen Blutproben entnommen, die PBMC isoliert und eingefroren. Am Tag der ELISPOT-Analyse wurden die Zellen aufgetaut und 100.000 Zellen pro well direkt mit 5 µg/ml Peptid für 24 Std. inkubiert.

Patient 113 bekam protokollgemäß insgesamt 14 Impfungen und musste dann erst wegen eines PSA-Progresses an Tag 1020 aus der Studie genommen werden. Sein PSA-Verlauf zeichnete sich erst nach einer langen Verzögerung durch einen > 50%igen Abfall des Wertes und einer sehr langen Stabilisierungsphase aus. Wie in Abb. 4 ersichtlich reagiert dieser Patient auch im ELISPOT erst sehr spät.

010

20

30

40

5060

70

80

PSA-1

23

PSM

A-P

2

PSC

A-P

4

Ep-

2H

PSG

R-1

STEAP-3

PR

AM

E-P

4

pre vaccinat ion

d8 (1st)d22 (2nd)

d36 (3rd)

d57d99 (4th)

d183

d274d365

d512 (9th)

d602

d692d783

d870

d968d1127

d1332

d1338d1367

d1532

Anz

ahl I

FN

-γpr

oduz

iere

nder

T-Z

elle

n pr

o w

ell

Abb. 4: IFN-γ-ELISPOT zur Analyse der Immunantworten am Beispiel des Patienten 113. Dem Patienten wurden vor und jeweils acht Tage nach den einzelnen Vakzinegaben Blutproben entnommen, die PBMC isoliert und eingefroren. Am Tag der ELISPOT-Analyse wurden die Zellen aufgetaut und in Triplikaten von 100.000 Zellen pro well direkt mit 5 µg/ml Peptid für 24 Std. inkubiert. PSA123 (FLTPKKLQCVDLHVISNDVCAQV), PSMA-P2 (ALFDIESKV), PSCA-P4 (ALQPGTALL), Ep-2H (ILYENNVIV), PSGR-1 (ILLVMGVDV), STEAP-3 (LLLGTIHAL), PRAME-P4 (SLLQHLIGL). Die Hintergrundreaktivität der PBMC ohne Peptid ist hier bereits abgezogen.

Patienten, die z. B. wie Patient 113 als Responder gelten, wiesen außerdem in ihren Hautbiopsien zumeist eine starke Infiltration von T-Lymphozyten im Verhältnis 3:1 (CD4+:CD8+-T-Zellen) und eine Ansammlung von eosinophilen und neutrophilen Granulozy-ten sowie von Makrophagen auf. Von einigen Patienten konnten aus den Hautbiopsien T-Lymphozyten gewonnen und sowohl ihr Zytokinexpressionsmuster als auch ihr T-Zellrezeptor-Repertoire charakterisiert wer-den. In Abb. 5 ist beispielhaft die Hautreaktion bei Patient 113 zu sehen sowie die Hämatoxylin-Eosin-Färbung eines Paraffin-schnittes des entsprechenden Hautarreales. Die injizierten Vakzinezellen konnten in keinem der Patienten mehr nachgewiesen werden, was auf die sofortige Reaktion des Immunsystems hindeutet. Bei Patient 113 wiesen die Haut-


infiltrierenden T-Zellen zudem ein stark einge-schränktes Repertoire an T-Zell-Rezeptoren (TCR) auf. Hier wurden ebenfalls umfang-reiche Sequenzanalysen durchgeführt, um ähn-lich wie bei der RCC-Studie, TCR als Surro-gatmarker für das Monitoring einsetzen zu können.

A

B

Abb. 5: Hautreaktion von Patient 113 nach mehrfacher Vakzinierung. (A) zeigt die Hautrötung und (B) die immunhistologische Färbung des leukozytären Infiltrates (Hämatoxylin-Eosin; 400fache Vergrößerung).

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

IFNg TNFa IL-10 IL-5 IL-4 IL-2

24h48h

pg/m

l

Abb. 6: Zytokinprofil der T-Zellen aus der Hautbiopsie von Patient 113. Die Biopsie-Entnahme erfolgte 48 Std. nach intradermaler Vakzinegabe. In vitro in der Kultur auswandernde T-Zellen wurden erneut mit der Vakzine stimuliert und die Zytokine im Kulturüberstand mittels eines cytometric bead array am Durchflusszytometer quantifiziert.

In Abb. 6 ist das Zytokinexpressionsmuster der Haut-infiltrierenden Zellen ebenfalls von Patient 113 dargestellt. Hier wurden die aus den kleinen Hautstückchen auswandernden Zellen erneut mit der Vakzine stimuliert und jeweils nach 24 bzw. 48 Std. der Zellkultur-überstand mittels eines Cytometric bead arrays analysiert. Der hohe Anteil an IL-5-

produzierenden Zellen steht dabei in Übereinstimmung mit der höheren Ratio an CD4+-T-Zellen und der Infiltration an Eosino-philen.

Zusammenfassung: Sowohl die klinische Phase-I- als auch die Phase-II-Studie wurde erfolgreich abgeschlossen. Alle Daten werden derzeit ausgewertet und zur Publikation vorbereitet. Grundsätzlich handelt es sich bei LNCaP/IL-2/IFNγ ebenfalls um eine sehr sichere, nebenwirkungsarme Vakzine. Über 50% der Patienten reagierten zumindest mit einer transienten Stabilisierung ihrer PSA-Werte. Damit ist das primäre Ziel, die Verlängerung der Zeit bis zur PSA-Verdopplung, erreicht. Einige Patienten zeigten charakteristische Hautinfiltrate und im Blut ließen sich sowohl im ELISPOT als auch mittels Tetramer-Bindungsstudien (hier nicht gezeigt) T-Zellen mit Spezifität für einige be-kannte Prostata-spezifische Antigene nachwei-sen. Fasst man die ELISPOT-Daten aller Patienten zusammen, so scheinen die immunogensten Peptide PSGR-1, STEAP, PSA und PRAME sowie PSCA, PSMA und EpCAM zu sein. Ferner zeigen die Patienten mit der höchsten Frequenz an Peptid-reaktiven T-Zellen die niedrigsten PSA-Werte, was evtl. auf eine niedrigere Tumorlast hindeuten würde. Jedoch eine Korrelation zwischen PSA-Verlauf und Immunantwort ist derzeit nicht erkennbar, da noch nicht alle Patienten ausgewertet sind. Zum Teil lässt sich bei den „PSA-Respondern“ eher eine inverse Korrelation beobachten, da sie häufig eine niedrigere Frequenz an Peptid-reaktiven T-Zellen zum Zeitpunkt des Abfalls bzw. der Stabilisierung des PSA-Wertes aufweisen. Dies würde wiederum die Hypothese stützen, dass die T-Zellen während der klinischen Antwort aus der Peripherie verschwinden.

H. Pohla, B. Stadlbauer, B. Konkol, H. Herbig, M. Osthoff, D.J. Schendel 1

Koop.: Institut für Experimentelle Onkologie und Therapieforschung, Institut für Pathologie und Urologische Klinik, Klinikum rechts der Isar (TU München); 1 Institut für Molekulare Immunologie, GSF.

Förderung: BMBF DLR 01 GE 9625/4; KKG „Immun-therapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF).


Einsatz einer Multipeptidvakzine zur Behandlung des metastasierten Nierenzellkarzinoms (klinische Phase-I-Studie)

Einführung: IMA901 ist eine therapeutische Tumorvakzine, basierend auf mehreren Tumor-assoziierten Peptiden, die auf primärem RCC-Gewebe überexprimiert sind. Sie besteht aus neun HLA-Klasse-I-bindenden Peptiden und einem HLA-Klasse-II-bindenden Peptid und ist in der Lage, CD8+-CTL- und CD4+-Th-Zellen zu aktivieren.

Entwickelt wurde diese Vakzine von der Firma immatics biotechnologies GmbH, die im Jahr 2000 als Spin-off-Unternehmen der Universität Tübingen gegründet wurde. Die Firma beschäftigt sich mit der Identifizierung und Validierung neuer Immuntherapeutika zur Krebsbehandlung. Aufgrund ihrer Expertise und ihrer Technologieplattformen aus den Bereichen Genomics, Peptidomics, Bioinfor-matik und Immunologie hat immatics zahlreiche Antigene („TUMAPs“, Tumor-assoziierte Peptide) für verschiedene Tumor-entitäten identifiziert und patentiert. Nach einigen viel versprechenden Pilotversuchen war eine erste multizentrische klinische Phase-I-Studie zur Behandlung von Patienten mit fortgeschrittenem RCC durchgeführt worden. Hauptziel dieser offenen, nicht-kontrollierten, einarmigen Studie war die Untersuchung der Verträglichkeit und Sicher-heit dieser Vakzine zusammen mit dem intradermal injizierten rekombinanten humanen (rhu) GM-CSF als Adjuvants. Ferner sollte die Immunogenität bezüglich einer T-Zell-Antwort, das systemische pharmakokinetische Profil des rhu GM-CSF sowie der Tumorstatus mittels bildgebender Verfahren nach RECIST-Kriterien analysiert werden.

Durchführung der Studie: In die Studie wurden insgesamt 28 Patienten eingeschlossen. Vier urologische Universitätskliniken aus Deutschland (Universität München, Tübingen, Heidelberg, Mainz), eine aus Genf und zwei aus London waren beteiligt. Die Patienten mussten HLA-A*02-positiv sein und ein histologisch gesichertes RCC der Stadien III oder IV aufweisen. Sie bekamen acht Impfungen (4,5 mg IMA901, 75 µg rhu GM-CSF) an den Tagen 1, 2, 3, 8, 15, 22, 36, und 64 intradermal injiziert (Abb. 1).

1IMA901 Phase 1 Immunomonitoring

StudyTreatment and Blood Samples

VACCINATIONGM- CSF _____________

IMA901 ________________

WEEKDAY 85-92

-up Period

VISIT 1.2.3 4 5 6 7 8

1 2 3 4 6 101–2 131.2.3. 8 15 22 36 64–3–14

Screening Vaccination (Treatment) Period

Scr FU

T - CELLSAMPLE

FUV1 V4 V5 V6 V7 V8S2

Abb. 1: Therapieschema zur IMA901-Studie (mit freundlicher Genehmigung von immatics biotechnologies GmbH).

Wir haben für diese Studie 76 Patienten HLA-typisiert und 15 Patienten konnten alleine in München eingeschlossen werden. Dement-sprechend wurden in unserer Arbeitsgruppe auch die meisten erfolgreichen PBMC-Auf-arbeitungen (n = 111) durchgeführt.

Erste Ergebnisse: IMA901 ist eine sehr sichere, gut verträgliche und immunogene Multipeptidvakzine. Das klinische und immu-nologische Monitoring befindet sich derzeit in der Auswertung der Tübinger Firma. Eine erste Analyse zeigt, dass bei 74% der Patienten T-Zell-Antworten zumindest gegen eines der TUMAP detektiert werden konnten und 30% der Patienten zeigten Antworten auf mehrere Peptide. Mehrheitlich gab es auch in dieser Gruppe einen klinischen Benefit für die Patienten zu verzeichnen.

Aufgrund des Erfolges ist für Mai 2007 eine multizentrische klinische Phase-II-Studie mit 200 Patienten geplant, an der erneut unsere Arbeitsgruppe und die Urologische Klinik des Klinikums der Universität München beteiligt sein wird.

H. Pohla, H. Herbig, B. Stadlbauer, B. Roser 1, M. Staehler 1, C. Stief 1

Koop.: 1 Urologische Klinik, Klinikum der Universität München; ICON Clinical Research, Langen (für die Logistik).

Federführend: immatics biotechnologies GmbH: H. Singh, S. Walter, T. Weinschenk, A. Mayer, S. Stevanovic, H.G. Rammensee, J. Frisch.

Förderung: immatics biotechnologies GmbH; KKG „Immuntherapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF).


Erste Pilotstudie zur Therapie von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (The Munich NSCLC Vaccine Study Group)

Einführung: Trotz weit reichender Bemühun-gen in der Weiterentwicklung von Diagnose und Therapie weist weltweit keine andere Krebsart so starke Zuwachsraten auf wie das Bronchialkarzinom. Die Fünfjahresüberlebens-rate stieg dabei in den letzten 25 Jahren nur geringfügig an und liegt derzeit bei ca. 13%. Innovative, nebenwirkungsarme Therapiefor-men werden dringend benötigt. Insbesondere die therapeutische Vakzinierung erscheint at-traktiv durch die hohe Spezifität bei relativ nie-drigem Nebenwirkungsspektrum. Für die aktiv-spezifische Immuntherapie durch Vakzinierung mit bestrahlten, autologen Tumorzellen, die nach genetischer Manipulation GM-CSF (Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulie-render Faktor) produzieren, konnte der klini-sche Nachweis der Durchführbarkeit und An-wendungssicherheit bereits erbracht werden, ein überzeugender klinischer Erfolg blieb allerdings bislang aus. Grundsätzlich zeichnet sich jedoch ab, dass immuntherapeutische Strategien ihren Platz vor allem im Rahmen multimodaler Behandlungskonzepte im Sinne einer adjuvanten Therapie finden werden.

In präklinischen Versuchen konnte gezeigt werden, dass CD4+- und CD8+-T-Lymphozyten, die sich normalerweise nicht oder sehr langsam vermehren, rasch proliferieren, wenn sie in eine lymphopenische Umgebung übertragen werden (sog. “lymph-openia/homeostasis-driven proliferation”). Durch diese Strategie konnte die Frequenz zirkulierender Tumor-spezifischer T-Lympho-zyten deutlich gesteigert werden. Eine einfache Erklärung für diese Beobachtung könnte sein, dass für die Proliferation Tumor-spezifischer T-Lymphozyten nach Lymphodepletion mehr Raum zur Verfügung steht (“space theory”). Möglicherweise wird durch die zur Lymphopenie eingesetzten Chemotherapeutika auch die Anzahl der CD4+CD25+-regulatorischen T-Zellen (Treg) reduziert. Unter physiologischen Bedingungen kontrollie-ren diese Treg eine Immunantwort und ver-hindern eine überschießende immunologische Reaktion. Ebenfalls diskutiert wird die Be-teiligung eines reaktiven Anstiegs bestimmter Zytokine in sero nach Lymphodepletion. Auch wenn die zugrunde liegenden Mechanismen derzeit noch weitgehend unklar sind, in der klinischen Erstanwendung erreichten Rosen-berg et al. bei Patienten mit metastasiertem, malignem Melanom mit diesem Konzept, allerdings in Kombination mit adoptivem

Transfer von TIL, eine beeindruckende Responserate von 45% (Dudley et al. 2002). Kürzlich wurde unter Leitung der Chirur-gischen Klinik (Klinikum der Universität München) eine klinische Pilot-Phase-I-Studie begonnen, in der Patienten mit nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom (NSCLC) nach chirurgischer Resektion mit bestrahlten, autologen Tumorzellen vakziniert werden (Abb. 1). Am Ort der Vakzinierung wird per Minipumpe eine kontinuierliche Infusion von GM-CSF appliziert. Eine genetische Manipula-tion der Tumorzellen entfällt also. Zusätzlich erhalten die Patienten vor Vakzinierung und nach Lymphopenie-Induktion durch Gabe von Cyclophosphamid/Fludarabine eine Reinfusion autologer Leukozyten (Leukaphereseprodukt). Zur Durchführung der Studie und dem wissenschaftlichen Begleitprogramm wurde die Munich NSCLC Vaccine Study Group gegründet.

Abb. 1: Schematische Darstellung des Studienablaufs: nach T-Zell-Apharese zum späteren adoptiven Transfer sowie zum Immunmonitoring erfolgt die Herstellung der Vakzine aus autologen Tumorzellen. Nach Lymphopenie-Induktion mit Hilfe einer niedrig dosierten Chemotherapie (CTX) für drei Tage und Rekonstitution mit den autologen T-Zellen werden die Patienten intradermal geimpft unter gleichzeitiger GM-CSF Infusion per Minipumpe.

Durchführung der Studie: Aufgenommen werden Patienten mit histologisch gesichertem NSCLC der Stadien IIb und IIIa. Studienarm A erhält nur die Vakzinierung mit lokaler, kontinuierlicher Infusion von GM-CSF. Studienarm B erhält vor Vakzinierung zusätz-lich eine dreitägige Behandlung mit niedrig-dosiertem Cyclophosphamid und Fludarabine zur Lymphopenie-Induktion sowie eine Reinfu-sion autologer Leukozyten. Nach Abnahme der zwei Leukapheresen für das Immunmonitoring und für die Reinfusion autologer PBMC unterziehen sich die Patienten dem standardi-sierten, operativen Eingriff. Aus dem resezier-ten Präparat werden autologe Tumorzellen


isoliert, bestrahlt und kryokonserviert. An Tag 1 nach Rekonstitution der Lymphozyten wird die Vakzine unmittelbar vor Beginn der subkutanen Infusion von GM-CSF intradermal appliziert (alle 2 Wochen, gesamt max. 5 Vakzinierungen, Abb. 2).

Abb. 2: Therapieplan IML = Immunmonitoring-Leukapherese OP = operative Tumorentfernung � = Lymphopenie-Induktion (Tag 1-3)

In Abhängigkeit von der verfügbaren Tumor-zellzahl wird für jeden Patienten die Dosierung der Vakzine individuell bestimmt und beträgt 5x106 bis 50x106 Zellen pro Impfung. Unmittelbar nach intradermaler Vakzinierung wird der Katheter einer Minipumpe in die Mitte der Impfstelle platziert und GM-CSF (50 µg/24 Std.) über 6 Tage subkutan infundiert (Abb. 3). Hierdurch sollen Antigen-präsentierende Zellen wie z. B. DC an die Impfstelle “gelockt” werden. Diese Zellen nehmen die Bestandteile der Tumorzellen auf und können so die relevanten Tumorantigene dem körpereigenen Immunsystem präsentieren. Ziel ist die Induktion einer systemischen, Tumor-spezifischen Immunantwort und damit die generalisierte Bekämpfung einer potentiell vorliegenden Mikrometasierung (“minimal residual disease”).

Abb. 3: Intradermale Applikation der autologen Tumor-vakzine (oben) sowie die kontinuierliche Infusion von GM-CSF an der Impfstelle per Minipumpe (unten)

Im Anschluss an die Vakzinierungen wird erneut eine Leukapherese für das Immun-

monitoring durchgeführt. Außerdem wird die immunologische Antwort vor und nach der vierten Impfung anhand einer DTH–Testung (delayed type hypersensitivity) durch Injektion von 1x106 autologen, bestrahlten Tumorzellen in die Haut des Oberarms geprüft.

Ergebnis: Bislang wurde bei 3 von 3 Patienten erfolgreich ein Impfstoff hergestellt und zwei Patienten haben das Protokoll aus insgesamt 5 Impfungen ohne wesentliche Neben-wirkungen abgeschlossen und befinden sich derzeit im Follow up. Klinisch traten lediglich Grad 1/2-Reaktionen an der Impfstelle (Rötung, Induration, Juckreiz) auf. Auch die bisher beobachteten systemischen Nebenwirkungen waren nur gering ausgeprägt (Muskel-, Gelenkschmerzen, Abgeschlagen-heit, erhöhte Temperatur). Damit zeigt sich dieses Therapieprotokoll bisher als sehr sicher und gut verträglich.

In allen Patienten konnte durch die 3-tägige Chemotherapie eine ausgeprägte Lymphopenie induziert werden. FACS-Analysen zeigten, dass sowohl unterschiedliche T-Zell-Subpopulationen (CD4, CD8, CD4CD25) als auch NK-Zellen, Granulozyten und B-Zellen signifikant reduziert werden konnten. Nach Rekonstitution nahmen neutrophile Zellen am schnellsten wieder zu, die anderen Zellpopulationen zum Teil etwas langsamer. Erste immunhistologische Analysen zeigten an der Injektionsstelle eine vermehrte Infiltration von Makrophagen, Eosinophilen, Neutrophilen und Lymphozyten. Im Vergleich zu Biopsien an Kontrollhaut der Patienten ließen sich insbesondere CD1a+-dendritische Zellen und vermehrt CD4+-T-Lymphozyten detektieren. ELISPOT-Analysen zum Immunmonitoring befinden sich derzeit in der Auswertung.

H. Pohla, B. Stadlbauer, D.J. Schendel 1

Koop.: 1 Institut für Molekulare Immunologie, GSF; 2 Chirurgische Klinik, 3 Medizinische Klinik III, 4 Klinik für Anästhesiologie, Abteilung für Transfusionsmedizin und Hämostaseologie, Klinikum der Universität München; 5 Robert W. Franz Cancer Research Center, Earle A. Chiles Research Institute, Portland, Oregon, USA.

Federführend: D. Rüttinger 2, H. Winter 2, N.K. van den Engel 2, M. Schlemmer 3, S. Grützner 4, B. Wagner 4, K.W. Jauch 2, R.A. Hatz 2, B.A. Fox 5

Alle genannten Autoren repräsentieren die Munich NSCLC Vaccine Study Group.

Smiths Medical (Kirchseeon) stellt die Minipumpen zur Verfügung.

Förderung: Chiles Foundation, Portland, Oregon, USA; „Programm zur Förderung von Forschung und Lehre“ der Universität München (FöFoLe an D. Rüttinger).

Immunmonitoring 87

Das Immunmonitoring – Techniken zur Evaluierung immuntherapeu-tischer Behandlungskonzepte

Einführung: Für eine erfolgreiche Umsetzung klinischer Studienprotokolle müssen erstens Laboreinrichtungen verfügbar sein, um Zelltherapeutika unter Bedingungen vor-zubereiten, die einen Transfer zurück in die Patienten gestatten (sog. good manufacturing practice (GMP)-Einrichtungen). Alle Arzneimittel, die am Patienten eingesetzt werden, unterliegen strengen gesetzlichen Auflagen. Eine dafür notwendige Reinraum-anlage wird derzeit von der GSF vorbereitet. Zweitens müssen auch Strategien zur Über-prüfung des Immunstatus’ der behandelten Patienten entwickelt, standardisiert und vali-diert werden. Von besonderer Bedeutung ist dieses Immunmonitoring immer dann, wenn Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung in klinische Phase-I/II-Studien aufgenommen werden. Bei diesen Patienten wird ein klinisches Ansprechen auf die jeweilige Therapie nur selten erwartet und somit sind hochsensitive und standardisierte Immun-monitoring-Technologien von ganz entschei-dender Bedeutung für die Evaluierung der therapeutischen Effekte auf das Immunsystem.

Die Immunmonitoring-Plattform: Die GSF und die beiden Münchener Universitäten arbeiten auf dem Gebiet der Immuntherapie maligner und infektiöser Erkrankungen in vielfältigen Kooperationen sowie im Rahmen mehrerer Klinischer Kooperationsgruppen (KKG) zusammen, darunter auch unsere KKG „Immuntherapie bei urologischen Tumoren“ und die KKG „Antigen-spezifische Immun-therapie“ (Leiter: D.H. Busch). Mit Hilfe eines im Helmholtz-Programm „Infektion und Immunität“ bewilligten Überzeichnungs-projekts wurde von den zwei GSF-Instituten (Molekulare Immunologie und Molekulare Virologie) im Jahr 2004 eine Plattform „Immunmonitoring“ gegründet, mit dem Ziel der Entwicklung und Standardisierung verschiedenster State-of-the-Art-Verfahren zur Überwachung der Immunantwort von Patienten in laufenden klinischen Studien. Basierend auf der langjährigen, engen Kooperation zwischen meiner Arbeitsgruppe im LTI und D.J. Schendel (GSF) wurden im Rahmen des BMBF-Forschungsverbundes „Somatische Gentherapie bei Nierenzell- und Prostata-karzinom“ drei klinische Phase-I/II-Studien mit allogenen genetisch-modifzierten Tumor-Zelllinien gemeinsam etabliert und durchgeführt. Für diese Studien wurden am LTI mehrere Immunmonitoring-Verfahren

entwickelt und ein Prüflabor für Lymphozytenstimulierung unter GMP-Bedingungen aufgebaut. Durch diese Kerneinheit von qualifizierten Wissen-schaftlern und technischem Personal, die vielfältige Immunmonitoring-Technologien standardisieren und validieren, wird sicher-gestellt, dass den klinischen Partnern die neuesten Werkzeuge zur Untersuchung der Wirkung ihrer experimentellen Therapien zur Verfügung stehen, ohne die Notwendigkeit viele komplizierte Technologien selber etablieren zu müssen. Darüber hinaus kann eine solche Kerneinheit immer auf dem neuesten Stand der Technik in diesem Gebiet sein, und gleichzeitig die laufenden Studien durch validierte Tests unterstützen und beratend zur Seite stehen. Die Mitglieder dieser Plattform interagieren ebenfalls mit der GMP-Arbeitsgruppe der GSF um Methoden der Qualitätssicherung für klinisches Prüfmaterial zu etablieren. Neben der Betreuung klinischer Studien ist die Grundlagenforschung ein weiteres Ziel, um die molekularen und zellulären Regulationen der Immunantworten besser verstehen zu können. Durch die Kombination der genannten Ziele wird es in Zukunft möglich sein, immer effizientere Therapieverfahren für die Klinik zu entwickeln.

Die Immunmonitoring-Technologien: Meist reicht ein einzelnes diagnostisches Verfahren nicht aus, um die vielschichtigen Folgen verschiedenster therapeutischer Maßnahmen auf das Immunsystem zu erfassen. Dies ist insbesondere der Fall, wenn es sich um individualisierte Therapieschemata handelt und/oder z. B. eine Tumorerkrankung weit fortgeschritten ist. Folgende Technologien wurden dafür am LTI etabliert:

• ELISPOT-Analysen (enzyme linked immunosorbent spot) zur Quantifizierung Antigen-spezifischer T-Zell-Antworten anhand von Zytokin- bzw. Granzym- oder Perforin-Produktion

• Cytometric bead array (CBA FlexSet, BD Biosciences) bzw. BioPlex-Assay (Bio-Rad, Luminex-Technologie) für die gleichzeitige Quantifizierung von über 20 verschiedenen Zytokinen und Chemokinen aus Serum oder Zellkulturüberständen sowie die Quantifizierung von Zell-signalling-Molekülen (Phosphoproteinen)


• Zytokin-Sekretions- bzw. capture-Assay (MACS®-Miltenyi-Technologie), der eine Anreicherung z. B. Tumor-spezifischer CD4+- und CD8+-T-Zellen auch ohne Kenntnis des Antigens erlaubt

• Multiparameter-Immunfluoreszenz am LSRII-Gerät (BD Biosciences) der GSF, für eine kombinierte phänotypische und funktionelle Analyse verschiedener T-Zell-Subpopulationen

• MHC/Peptid-Tetramer- bzw. Multimer-Bindungsanalysen, vorausgesetzt, dass immunogene, MHC-restringierte Antigene bekannt sind

• Quantitative T-Zell-Rezeptor-Analysen (TCR) mittels Real-time-RT-PCR, wie es z. B. für die RCC-26-Vakzinestudie möglich ist, da hier bereits Tumor-spezifische TCR-Sequenzen bekannt sind.

Um das zytotoxische Potential von T-Zellen zu charakterisieren, wurden zum einen ELISPOT-Assays für Granzym B und Perforin etabliert, zum anderen der Nachweis der sog. CD107a/b-Mobilisierung eingesetzt. Hierbei handelt es sich um vesikuläre Membranproteine, die während der Degranulierung transient an die Zelloberfläche kommen und dann über Bindung an einen Fluoreszenz-markierten monoklonalen Antikörper sichtbar gemacht werden. In Kombination mit einer Multimerfärbung, intrazellulärer Zytokin-bestimmung sowie einer Oberflächenmarker-analyse lassen sich am Durchflusszytometer sowohl der Phänotyp als auch die Spezifität und der funktionelle Status Antigen-spezifischer T-Zellen gleichzeitig überprüfen. Eine derartige Mehrfarbenanalyse testen wir derzeit am LSRII-Gerät (BD Biosciences) der GSF.

Als Material für die Etablierung und Vali-dierung der Immunmonitoring-Technologien standen uns Blut- und Hautbiopsieproben der Patienten unserer klinischen Studien zur Verfügung. Um unter Therapie beispielsweise das Zytokinprofil der Zellen aus Biopsiematerial zu analysieren, wurde u. a. der Cytometric Bead Array eingesetzt. Abb. 1 zeigt das Zytokinprofil von T-Zellen aus der Haut-biopsie eines Patienten unserer Prostata-karzinomstudie nach mehrfacher Impfung.

IL-2IL-4IL-5IL-10TNF-ααααIFN-γγγγ



C

A

B

Abb. 1: Zytokinprofil der T-Zellen aus der Hautbiopsie eines Patienten der Prostatakarzinomstudie nach wiederholter Impfung. Die T-Zellen wurden in vitro mit der LNCaP/IL-2/IFN-γ Vakzine stimuliert und die Zytokine nach 48 Std. aus dem Überstand anhand eines CBA-Assays am Durchflusszytometer bestimmt. Das Fluoreszenzsignal FL2 ist proportional zur Zytokin-konzentration. Dargestellt ist der Überstand der kultivierten T-Zellen ohne Vakzine (A), stimuliert mit Vakzine (B) und der Vakzine allein zur Kontrolle (C).

Das Cancer Vaccine Consortium: Um auch auf internationaler Ebene die Immun-monitoring-Technologien evaluieren zu können, ist die Beteiligung am Cancer Vaccine Consortium des Sabin Vaccine Institutes, USA, vorteilhaft. Das Cancer Vaccine Consortium wurde 2002 mit dem Ziel gegründet, Immunmonitoring-Assays und klinische Studien zu standardisieren und zu validieren, Kombinationstherapien zu identifizieren, Informationsplattformen und internationale Workshops zu bilden, um die Entwicklung von Vakzinen für Krebserkrankungen zu forcieren und auch um internationale Firmen für die Weiterentwicklung von Krebsimpfstoffen zu interessieren. Letzteres ist besonders wichtig um die Translation von experimenteller prä-klinischer Forschung in die Klinik zu er-leichtern.

Im Jahr 2006 wurde ein internationales ELISPOT Proficiency Panel (EPP) durch-geführt, an dem auch die Immunmonitoring-Gruppe des LTI (H. Pohla, B. Stadlbauer,

Immunmonitoring 89

H. Herbig) beteiligt war. Hierfür wurden an 29 verschiedene Labore (USA, Kanada, Belgien, Frankreich, England, Schweiz, Deutschland) 4 tiefgefrorene PBMC-Proben gesunder Spender mit unterschiedlicher Reaktivität gegenüber Mischungen von Peptiden spezifisch für Cytomegalie-Virus (CMV) alleine bzw. gegenüber CMV, Epstein-Barr-Virus und Influenza-Virus (CEF) verschickt. Platten-belegung und Zellzahl waren vorgeschrieben, die Reaktivität der Spender und die Antigene waren unbekannt. Jedes Labor konnte auch seine eigene ELISPOT-Methode und seine eigenen Reagenzien verwenden, um die Robustheit des Assay-Systems zu testen. Abb. 2 zeigt die Plattenbelegung und das Ergebnis eines Experimentes.

no responder high responder

low responder medium responder

Mediaonly

Mediaonly

CMV

CMV

CEF

CEF

no peptide

no peptide

Abb. 2: IFN-γ ELISPOT des Proficiency Panels. PBMC von vier Spendern mit unterschiedlicher Reaktivität gegenüber CMV- (Cytomegalie-Virus) bzw. CEF- spezifischen (Cytomegalie-Virus, Epstein-Barr-Virus, Influenza-Virus) Peptidantigenen wurden entsprechend der Plattenbelegung in jeweils sechs Replikaten mit 200.000 Zellen pro well der Mikrotiterplatte aufgetragen und mit den Antigenen über Nacht inkubiert.

Abb. 3 zeigt als Beispiel ein well der Mikrotiterplatten von allen beteiligten 29 Laboren. Hier zeigen sich deutliche Unter-schiede zwischen den einzelnen Laboren. Ursachen dafür können sein: verwendetes Serum im Medium, fehlerhafte Zählung, unterschiedliche Antikörper und Kit-Systeme. Trotzdem haben alle Labore zumindest die richtige Zuordnung der no, low, medium und high responder getroffen.

In Abb. 4 sind Box-plot-Analysen beispielhaft für Spender 1 (no responder) und für Spender 2 (high responder) gegenüber den CEF-Peptiden dargestellt.

Alle Ergebnisse des EPP werden derzeit validiert (S. Janetzki, ZellNet Consulting Inc., USA) und zur Publikation vorbereitet.

Um weiter zeigen zu können, wie wichtig derartige Evaluierungen der Immunmonitoring-

Technologien sind, haben wir den Einfluss von Serum im Medium getestet. Das Ergebnis ist sehr eindrucksvoll in Abb. 5 zu sehen.

Abb. 3: IFN-γ-ELISPOT des Proficiency Panels. Gezeigt ist jeweils well F3 (low responder) für alle beteiligten 29 Labore.

Overall Results – Donor 1 (no responder), CEF50

40

30

20

10

0� Lab No.�

Overall Results – Donor 2 (high responder), CEF1000

800

600

400

200

0� Lab No.�

Abb. 4: Box-Plots aller IFN-γ-ELISPOTs des Proficiency Panels am Beispiel Spender 1 (no responder, oben) und Spender 2 (high responder, unten) gegenüber den CEF-Peptiden. Dargestellt ist die Anzahl IFN-γ-produzierender PBMC für die einzelnen Labore.


0.0

20.0

40.0

60.0

80.0

ohnePeptid

CEF ohnePeptid

CEF ohnePeptid

CEF

RPMI IIIAB Serum

RPMI IIIHS Serum

Mediumserumfrei

Anz

ahl I

FNγ-

seze

rnie

rend

erT-

Zelle

n

Abb. 5: Einfluss von Serum im Kulturmedium für die ELISPOT-Analysen. Gezeigt ist die Anzahl IFN-γ- produzierender Zellen pro eingesetzte 50.000 Zellen eines gesunden Spenders nach Stimulation mit CEF-Peptiden.

Fazit: Im Rahmen des ImmunoAssay Proficiency Panel Program sind 2007 zu-sätzliche Analysen für MHC/Peptid-Tetramer-Bindung (Leitung: P. Romero, Lausanne und C.M. Britten, Leiden), intrazelluläre Zytokin-messung (ICS; Leitung: H. Maecker, BD Biosciences, USA) und Proliferationsmessung anhand der Markierung der Zellen mit CFSE (Carboxylfluorescin-Succinimidyl-Ester; Leit-ung: J. Boyer, Pennsylvania, USA) geplant, an denen wir ebenfalls beteiligt sein werden. Ein ähnliches Ziel verfolgt auch die Monitoring Working Group des CIMT (Association for Cancer Immunotherapy) unter Leitung von C.M. Britten, C. Gouttefangeas, Tübingen, und S.H. van der Burg, Leiden.

Neben der Standardisierung der Immun-monitoring-Methoden und der Erstellung von Standard Operating Procedures (SOP) wird auch eine für die Auswertung klinischer Studien benötigt. Die Komplexität der klini-schen Resultate und der Immunmonitoring-Daten bei Patienten unter Immuntherapie benötigt dringend spezialisierte Analyse-methoden wie z. B. die Anwendung artifizieller neuronaler Netzwerke. Ein Computer-programm, das im LTI zur Verfügung steht, ist STATISTICA Neural Networks 7 (StatSoft, Tulsa, OK, USA). Hier ist die enge Kooperation mit A. Buchner (Urologische Klinik) von großer Bedeutung.

H. Pohla, B. Stadlbauer, H. Herbig, M. Odendahl 1, D.H. Busch 1, A. Cosma 2, K. Ebelt 3, D.J. Schendel 3

Koop.: 1 Institut für Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, TU München; 2 Institut für Molekulare Virologie, GSF; 3 Institut für Molekulare Immunologie, GSF.

Förderung: BMBF DLR 01 GE 9624/1; BMBF DLR 01 GE 9625/4; KKG „Immuntherapien bei urologischen Tumoren“ (GSF/BMBF); KKG „Immunmonitoring“.

Antikörperplattform 91

Herstellung von Antikörpern durch genetische Immunisierung

Einführung: In Zusammenarbeit mit der auf Antikörperproduktion spezialisierten Firma Genovac GmbH, Freiburg, die vom Leiter des LTI mitgegründet wurde, konnten wir die Methode der genetischen Immunisierung zur Antikörperherstellung im LTI etablieren. Die Herstellung von monoklonalen und polyklona-len Antikörpern durch genetische Immunisie-rung beruht auf dem ballistischen Transfer von Expressionsplasmiden (Immunisierungsvekto-ren) mittels gene gun in die Haut von Ver-suchstieren. Das kodierte Protein wird dort exprimiert und führt zur Erkennung durch B-Zellen. Herkömmliche Technologien erlau-ben dann die Herstellung von monoklonale Antikörper produzierenden Hybridomen aus den so immunisierten Tieren (Abb. 1). Die vielfältig erprobte Methode hat den Vorteil, dass man bei der Antikörperherstellung das Protein weder rekombinant herstellen noch reinigen muss. Es wird nur die entsprechende cDNA benötigt, die häufig über Ressourcen-zentren bezogen werden kann. Die erhaltenen Antikörper besitzen in der Regel eine hohe Affinität und erkennen native Proteine. Die Methode ist besonders nützlich für die Herstellung von Antikörpern gegen oft durch Glykosylierung modifizierte, sezernierte und transmembran gebundene Proteine, die eine wichtige Gruppe der Therapie- und Diagnose-relevanten Zielstrukturen darstellen. Außerdem gelingt damit die gezielte Herstellung von Antikörpern gegen definierte Proteindomänen (wichtig u.a. für Funktionsbeeinflussung des Zielproteins und für die Herstellung von nicht um die Bindung an das Antigen konkurrieren-den Antikörperpaaren).

Im Rahmen zweier Dissertationsarbeiten wurde die parallele Produktion von Antikörpern durch Immunisierung mit mehreren Expressionsplas-miden als gut durchführbar gezeigt (Necker-mann, 2006; Meyle, eingereicht). Durch Auto-matisierung des Hybridom-Screeningverfah-rens mittels Robotik könnte die Zahl der pro Zeiteinheit hergestellten Antikörper gesteigert werden.

Antikörpergenerierungsprojekte: Nach der Implementierung und Optimierung der Methode der Antikörperherstellung durch genetische Immunisierung haben wir die ersten Projekte zur Herstellung von Antikörpern durchgeführt. Gegen folgende, für die For-schung am LTI relevanten Antigene wurden monoklonale und polyklonale Antikörper her-gestellt (siehe auch die entsprechenden in die-sem Bericht aufgeführten Projekte):

Abb. 1: Schematische Darstellung der genetischen Immu-nisierung mittels gene gun. Die cDNA des interessierenden Proteins wird in einen Immunisierungsvektor kloniert. Dieser erlaubt die transiente Expression des Proteins an der Zelloberfläche nach ballistischem Transfer des auf Goldstaub aufgebrachten Immunisierungsplasmids in die Haut des Versuchstiers. Das dort gebildete Protein stimu-liert antigenspezifische B-Zellen, die mit Hilfe gängiger Hybridomtechologie immortalisiert werden können. Die Identifizierung der die gewünschten Antikörper produzie-renden Hybridome erfolgt durch einen so genannten zell-basierten ELISA (CELISA) mittels Zellen, die nach Trans-fektion mit dem Immunisierungskonstrukt das interessie-rende Protein exprimieren.

• Bovines CEACAM1

• murines CEACAM16

• humanes CEACAM20

• humanes IDO.

Die innovative Methode der Antikörperher-stellung durch genetische Immunisierung hat breite Anwendungsmöglichkeiten und große Vorteile, wenn die native Konformation des Antigens durch die Antikörper erkannt werden soll oder wenn das Antigen nur schwer herzu-stellen ist. Daher bieten wir anderen Arbeits-gruppen des Klinikums an in Kooperation Antikörper zu produzieren. Ein solches Projekt wird im folgenden vorgestellt:

Der Transkriptionsfaktor ITF2B: Die Arbeitsgruppe um Frank Kolligs und Andreas Herbst konnte in Untersuchungen an Patienten mit kolorektalen Karzinomen zeigen, dass die Expression des Transkriptionsfaktors ITF2B im Tumorgewebe im Vergleich zum Normalge-webe verringert ist. Der Verlust der ITF2B-Expression in Kolonkarzinomen ist u.a. auf den Verlust eines ITF2-Allels zurückzuführen. Zu den Zielgenen von ITF2B gehört auch der Zellzyklusinhibitor p21Cip1.

Zur Untersuchung der (fehlenden) Induktion des Zellzyklusinhibitors p21Cip1 wurden zwei Kolonkarzinomzelllinien, DLD-1 und SW480, die kein endogenes ITF2B exprimieren, stabil mit einem Doxycyclin-induzierbaren Expressi-


onskonstrukt für ITF2B transfiziert. Die Doxy-cyclin-induzierte Synthese des Transkriptions-faktors ITF2B führt zu einem Arrest des Zell-zyklus in der G1-Phase. Der Arrest des Zell-zyklus korreliert zeitlich mit der Induktion der ITF2B-Expression und mit dem im Vergleich zur ITF2B-Expression zeitlich verzögerten Auftreten der p21Cip1-Expression, nachgewie-sen durch Immunoblots. Das Fehlen der ITF2B-Expression bietet den betroffenen Kolonkarzinomzellen also einen Selektions-vorteil, da in diesen Zellen der Transkriptions-faktor ITF2B keinen p21Cip1-vermittelten Zellzyklusarrest induzieren kann und sie somit ungehindert proliferieren können.

Vor diesem Hintergrund erschien der Einsatz eines bisher fehlenden Antikörpers zur Lokali-sierung von ITF2B in Tumor- und Normalge-weben von Patienten als äußerst wünschens-wert. Mittels genetischer Immunisierung von Mäusen konnten monoklonale Antikörper durch intradermale Applikation von Goldparti-keln mit adsorbiertem ITF2B-Expressionspla-mid und nachfolgender Fusion der Lymphozy-ten mit Myelomzellen gewonnen werden. Anti-körper des besten Subklons (Ri3B9) wurden aufgereinigt und stehen nun in ausreichender Menge für experimentelle Anwendungen zur Verfügung. Die beiden Anwendungsbeispiele belegen, dass durch genetische Immunisierung gewonnene Antikörper, prinzipiell sowohl nati-ves Protein, wie in den Zytospinpräparaten vorliegend (Abb. 2), als auch denaturiertes Protein, vermutlich im Immunoblot vorliegend (Abb. 3), erkennen können.

Abb. 2: Immunzytochemischer Nachweis von ITF2B (braun) mit mAk Ri3B9 nach Doxycyclin-induzierter IFB2B-Expression in DLD1-Zellen (Zytospinpräparat).

Abb. 3: Western Blot von Doxycyclin-aktivierten und nicht aktivierten DLD1-Zellen mit mAk Ri3B9.

R. Riesenberg, A. Herbst 1, F. Kolligs 1 A. Eisenried, A. Hennig, R. Krupar, R. Kammerer, S. Neckermann, S. Meyle, W. Zimmermann

Koop.: 1 Medizinische Klinik II, Klinikum der Universität München.

Förderung: Förderprogramm Promotionsstudium “Mole-kulare Medizin” der Universität München (12/2003; 40/2005); Deutsche Krebshilfe (106141).


Mitarbeiter (LTI)

Wissenschaftlicher Leiter LTI

Prof. Dr. rer. nat. Wolfgang Zimmermann

Sekretariat

Kornelia Eberle

Arbeitsgruppenleiter

Dr. med. Alexander Buchner Dr. med. vet. Robert Kammerer Dr. rer. nat. Heike Pohla Dr. rer. nat. Rainer Riesenberg

Postdoktoranden

Dr. med. Kathleen Ebelt

Doktoranden (Dr. rer. nat.)

Dipl. Biol. Sandra Neckermann Dipl. Biol. Birte Sievers

Doktoranden (Dr. med.)

Martin Eder Andreas Eisenried Rosemarie Krupar Stefanie Meyle Jessica Nöckel Michael Osthoff Michaela Paptistella Oliver Spring Roland Zebhauser

Technische Assistenten

Anja Hennig Heidi Herbig Birgit Konkol Patrick Palluch Tanja Popp Birgit Stadlbauer

Praktikanten

Mihael Jahovac Katharina Knöpfle Peggy Lang


Kooperationen (LTI)

KKG-Kooperationen Klinische Kooperationsgruppe (KKG) Im-muntherapie urologischer Tumoren

Leitung

Dr. rer. nat. Heike Pohla

Kooperationspartner

Urologische Klinik und Poliklinik, Klinikum der Universität München

Prof. Dr. med. Christian Stief

Institut für Molekulare Immunologie der GSF, München

Prof. Dr. Dolores J. Schendel

Wissenschaftliche Einrichtungen in München Abteilung für Klinische Pharmakologie, Klinikum der Universität München

Prof. Stefan Endres PD Dr. Gunther Hartmann Dr. Dr. Carole Bourquin Dr. Martin Schneider Philipp Schneider

Abteilung Hämatologie-Onkologie, III. Medi-zinische Klinik, Klinikum rechts der Isar, TU München

PD Dr. Helga Bernhard

Chirurgische Klinik und Poliklinik, Klinikum der Universität München

PD Dr. Rudolf A. Hatz Dr. Hauke Winter Dr. Natasja K. van den Engel Dr. Dominik Rüttinger

Genzentrum der Universität München

Prof. Dr. Eckhard Wolf Dr. Marlon Schneider Dr. Georg J. Arnold Dr. Thomas Fröhlich

Institut für Biometrie und Epidemiologie

Prof. Dr. Karl Überla Dr. Alexander Crispin

Institut für Chirurgische Forschung, Klinikum der Universität München

Prof. Dr. Georg Enders

Institut für Experimentelle Onkologie und The-rapieforschung, TU München

Prof. Dr. Bernd Gänsbacher Dr. Thomas Brill Dr. Martina Anton

Institut für Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene, TU München

Prof. Dr. Dirk Busch Dr. Marcus Odendahl

Institut für Molekulare Immunologie der GSF, München

Prof. Dr. Dolores J. Schendel PD Dr. Christine S. Falk Dr. Bernhard Frankenberger PD Dr. Elfriede Nößner Dr. Miran Javorovic Dr. Anke Zobywalski Dr. Kathleen Ebelt

Institut für Pathologie, TU München

Prof. Dr. Falk Fend

Institut für Pathologie, Universität München

Prof. Dr. Thomas Kirchner Dr. Christoph Weiler Dr. Gerald Assmann

Institut für Tierphysiologie, Universität München

Prof. Dr. Bernd Kaspers Dr. Stefan Härtle

Labor für Funktionelle Genomik & Transplan-tationsbiologie, Kinderklinik der TU München

Dr. Günther Richter

Medizinische Klinik II, Klinikum der Universität München

PD Dr. Frank Kolligs Dr. Andreas Herbst

MLL Münchener Leukämie Labor GmbH

Prof. Torsten Haferlach Sonja Rauhut

Urologische Klinik, Klinikum rechts der Isar, TU München

Prof. Dr. Rudolf Hartung PD Dr. Roger Paul Dr. Heiner van Randenborgh Dr. Hubert Kübler


Urologische Klinik München-Planegg

Dr. Ralph Oberneder

Urologische Klinik und Poliklinik, Klinikum der Universität München

Dr. Michael Staehler

Nationale wissenschaftliche Ein-richtungen

Deutsches Rheumaforschungszentrum, Berlin

Prof. Dr. Andreas Radbruch Dr. Andreas Thiel

Hämatologie, Onkologie und Tumorimmu-nologie, Charité Berlin, Campus Berlin-Buch

Prof. Dr. Antonio Pezzutto Dr. Jörg Westermann

Helmholtz-Zentrum für Infektionsforschung, Abteilung für Chemische Biologie, Braun-schweig

Dr. Ronald Frank

Institut für Immunologie, Charité Berlin, Campus Benjamin-Franklin

Prof. Dr. Thomas Blankenstein Prof. Dr. Wolfgang Uckert Dr. Gerald Willimsky

Institut für Molekularbiologie und Biochemie, Charité, Berlin

PD Dr. Lothar Lucka Dr. Bernhard B. Singer

Klinikum Traunstein

Dr. Thomas Hofmann

Medizinische Klinik III, Hämatologie und Onkologie, Johannes-Gutenberg-Universität Mainz

Prof. Dr. Thomas Wölfel

Zellkulturlabor für Klinische Prüfung (ZKP), MDC Berlin-Buch

Dr. Joachim Kopp Engelbert Wehnes

Zentrum für Infektionsforschung, Universität Würzburg

Prof. Dr. Christof R. Hauck

Internationale wissenschaftliche Einrichtungen

Cancer Vaccine Consortium of the Albert B. Sabine Vaccine Institute, Washington DC, USA

Dr. Charu Malik

Department of Cell & Molecular Biology, Karolinska Institute, Stockholm, Sweden

Prof. Dr. Björn Öbrink

Department of Clinical Oncology, Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands

Prof. Dr. Peter J. Schrier

Department of Microbiology, University of Colorado Health Sciences Center, USA

Prof. Dr. Kathryn V. Holmes

Department of Oncology-Pathology, Karolin-ska Institute, Stockholm, Sweden

Prof. Dr. Pavel Pisa

Department of Pathology & Microbiology, School of Medical Sciences, University of Bristol, Bristol, UK

Dr. Darryl J. Hill Prof. Dr. Mumtaz Virji

Department of Pathophysiology, Medical University of Vienna, Österreich

Prof. Dr. Erika Jensen-Jarolim Dr. Kira H. Brämswig

Developmental Genetics Laboratory, Depart-ment of Biochemistry, Biosciences Institute, University College Cork, Cork, Ireland

Dr. Tom Moore Dr. Andrew S. McLellan

Elispot Consulting for the CVC and Chair of Assay Working Group/CVC, ZellNet Con-sulting Inc., USA

Dr. Sylvia Janetzki

Hematology, Oncology, and Transplantation, University of Minnesota Medical School, Minneapolis, USA

Prof. Dr. Keith M. Skubitz

Institute for Animal Health, Compton, New-bury, UK

Dr. Jayne Hope


The Lautenberg Center for General and Tumor Immunology, The Hebrew University, Hadassah Medical School, Jerusalem, Israel

Prof. Dr. Ofer Mandelboim Dr. Gal Markel

Ludwig Institute for Cancer Research, Division of Clinical Onco-Immunology, Lausanne, Schweiz

Prof. Dr. Pedro Romero

National Center for Geriatrics and Gerontol-ogy, Laboratory of Radiation Safety, Gengo, Japan

Dr. Osamu Takikawa

Neuroimmunology Branch, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institute of Health, Bethesda, USA

Prof. Dr. Steven Jacobson

Norwegian School of Veterinary Science, Oslo, Norway

Dr. Anne Dorset

Robert W. Franz Cancer Research Center, Earle A Chiles Research Institute, Providence Portland Medical Center, Portland, USA

Prof. Dr. Bernard A. Fox Dr. Hong-Ming Hu

University of Leiden, The Netherlands

Dr. Cedric Britten

Industriepartner BT Pharma, Labège Innopole Cedex France

GENOVAC GmbH, Freiburg

immatics biotechnologies GmbH, Tübingen

P.A.L.M. Microlaser Technologies AG, Bern-ried

Trion Research, Martinsried

Vaccine Project Management GmbH, Hanno-ver

Wilex AG, München


Promotionen (LTI)

Martin Eder (Dr. med.), Expressionsanalyse von Zielantigenen für die Immuntherapie von Nierenzellkarzinomen (in Arbeit)

Andreas Eisenried (Dr. med.), CEACAM20, ein Zielmolekül für Tumordiagnose und Tumorimmuntherapie des Prostatakarzinoms? (in Arbeit)

Rosemarie Krupar (Dr. med.), Funktionelle Analyse des Innenohr-spezifischen CEA-Familienmitglieds CEACAM16 (in Arbeit)

Stefanie Meyle (Dr. med.), Verbesserung der Antikörperproduktion durch multiple geneti-sche Immunisierung (in Arbeit)

Sandra Neckermann (Dr. rer. nat.), Optimie-rung der genetischen Immunisierung zur Her-stellung von funktionsbeeinflussenden Anti-körpern gegen Multitransmembranproteine am Beispiel von Chemokinrezeptoren (2006)

Jessica Nöckel (Dr. med.), Charakterisierung eines neuen murinen In-vivo-Modells für die Evaluierung von Tumorimmuntherapien des Magenkarzinoms (in Arbeit)

Michael Osthoff (Dr. med.), Analyse der T-Zellantwort bei Patienten mit hormonrefrak-tärem Prostatakarzinom vor und nach allogener Tumorzellvakzinierung (in Arbeit)

Michaela Paptistella (Dr. med.), Analyse der Signaltransduktion von CEACAM20, einem potentiellen Zielmolekül für die Immuntherapie von Prostatakarzinompatienten (in Arbeit)

Karl Rohrmann (Dr. med.), In-vitro-Analyse der T-Zellantwort von Patienten mit metastasierendem Nierenzellkarzinom unter Behandlung mit Interleukin-2, Interferon- und 5-Fluorouracil (2006)

Birte Sievers (Dr. rer. nat.), Einfluss von CEACAM1-vermittelten Signalen auf die Kreuz-Präsentation von Tumorantigen durch murine dendritische Zellen (in Arbeit)

Oliver Spring (Dr. med.), Beeinflusst die Expression von Indolamin-2,3-dioxygenase (INDO) im Nierenzellkarzinom das Anspre-chen von Patienten auf eine Zytokinimmunthe-rapie? (in Arbeit)

Roland Zebhauser (Dr. med.), Charakterisie-rung eines Mausmodells zur Evaluierung neuer Mitglieder der CEA-Familie als Zielstrukturen für Tumortherapie (2006)


Publikationen (LTI)

2005

B. Frankenberger, S. Regn, C. Geiger, E. Noessner, C.S. Falk, H. Pohla, M. Javo-rovic, T. Silberzahn, S. Wilde, A. Buchner, M. Siebels, R. Oberneder, G. Willimsky, A. Pezzutto, T. Blankenstein, D.J. Schendel: Cell-based vaccines for renal cell carcinoma: genetically-engineered tumor cells and mono-cyte-derived dendritic cells. World J Urol. 23, 166-74 (2005)

B. Frankenberger*, H. Pohla*, E. Noessner, G. Willimsky, B. Papier, A. Pezzutto, K. Kopp, R. Oberneder, T. Blankenstein, D.J. Schendel: Influence of CD80, IL-2 and IL-7 expression in human renal cell carcinoma on the expansion, function and survival of tumor-specific cytotoxic T lymphocytes. Clin. Cancer Res. 11, 1733-1742 (2005) (*equally contributed)

B. Frankenberger, S. Regn, C. Geiger, E. Noessner, C.S. Falk, H. Pohla, M. Javo-rovic, T. Silberzahn, S. Wilde, A. Buchner, M. Siebels, R. Oberneder, G. Willimsky, A. Pezzutto, T. Blankenstein, D.J. Schendel: Cell-based vaccines for renal cell carcinoma: Genetically-engineered tumor cells and monocyte-derived dendritic cells. World J. Urol. 23, 166-174 (2005)

M. Javorovic, H. Pohla, B. Frankenberger, T. Wölfel, D.J. Schendel: RNA Transfer by electroporation into mature dendritic cells leading to reactivation of effector-memory cytotoxic T lymphocytes: A quantitative analy-sis. Mol. Ther. 12, 734-743 (2005)

A.S. McLellan, B. Fischer, G. Dveksler, T. Hori, F. Wynne, M. Ball, K. Okumura, T. Moore, W. Zimmermann: Structure and evolution of the mouse pregnancy-specific glycoprotein (Psg) gene locus. BMC Genomics 6, 4 (2005)

A.S. McLellan, W. Zimmermann, T. Moore: Conservation of pregnancy-specific glycopro-tein (PSG) N-domains following independent expansions of the gene families in the mouse and human. BMC Evol. Biol. 5, 39 (2005)

S. Poznanovi�, W. Wozny, G. Schwall, C. Sastri, C. Hunzinger, W. Stegman, A. Schrattenholz, A. Buchner, R. Gangnus, R. Burgemeister, M. Cahill: Differential radioactive proteomic analysis of microdissected renal cell carcinoma tissue by 54 cm isoelectric focusing in serial immobilized pH gradient gels. J. Proteome Res. 4, 2117-25 (2005)

O. Schmetzer, G. Moldenhauer, R. Riesen-berg, J.R. Pires, P. Schlag, A. Pezzutto: Quality of recombinant protein determines the amount of autoreactivity detected against the tumor-associated Epithelial Cell Adhesion Molecule antigen: low frequency of antibodies against the natural protein. J. Immunol. 174, 942-952 (2005)

B.B. Singer, E. Klaile, I. Scheffrahn, M.M. Müller, R. Kammerer, W. Reutter, B. Öbrink, L. Lucka: CEACAM1 (CD66a) mediates delay of spontaneous and Fas ligand-induced apoptosis in granulocytes. Eur. J. Immunol. 35, 1949-1959 (2005)

R. Zebhauser, R. Kammerer, A. Eisenried, A.S. McLellan, T. Moore, W. Zimmermann: Identification of a novel group of evolutionary conserved members within the rapidly diverging murine Cea family. Genomics 86, 566-580 (2005)

W. Zimmermann: Ceacam10. AfCS-Nature Molecule Pages (doi:10.1038/mp.a003606.01) (2005)


2006

A. Buchner*, R. Riesenberg*, I. Kotter, A. Hofstetter, C. Stief, R. Oberneder: Frequency and prognostic relevance of disseminated tumour cells in bone marrow of patients with metastatic renal cell carcinoma. Cancer 106, 1514-20 (2006) (*equally contributed)

J. Nöckel, N.K. van den Engel, H. Winter, R.A. Hatz, W. Zimmermann, R. Kammerer: Characterization of gastric adenocarcinoma cell lines established from CEA424/SV40 T antigen-transgenic mice with or without a human CEA transgene. BMC Cancer 6, 57 (2006)

D. Rüttinger, H. Winter, N.K. van den Engel, R.A. Hatz, M. Schlemmer, H. Pohla, S. Grutzner, D.J. Schendel, B.A. Fox, K.W. Jauch: Immunotherapy of lung cancer: an update. Onkologie 29, 33-38 (2006)

J.S. Schleypen, N. Baur, R. Kammerer, P.J. Nelson, K. Rohrmann, E.F. Gröne, M. Hohenfellner, A. Haferkamp, H. Pohla, D.J. Schendel, C.S. Falk, E. Noessner: Cytotoxic markers and frequency predict functional capacity of natural killer cells infiltrating renal cell carcinoma. Clin. Cancer Res. 12, 718-725 (2006)

K.M. Skubitz, W. Zimmermann, R. Kam-merer, S. Pambuccian, A.P.N. Skubitz: Differential gene expression identifies subgroups off renal cell cancer. J. Lab. Cin. Med. 147, 250-67 (2006)

F. Wynne, M. Ball, A.S. McLellan, P. Dock-ery, W. Zimmermann, T. Moore: Mouse pregnancy-specific glycoproteins exhibit tissue-specific expression and association with maternal vasculature. Reproduction 131, 721-32 (2006)


Drittmittelförderungen (LTI)

Projekttitel / Förderer / Laufzeit

Analyse und Beeinflussung des Verhaltens humaner Lymphozyten in der Mikroumgebung kolorektaler Karzinome (70-2561-Ka 2). Deut-sche Krebshilfe, 01.12.02 - 30.11.04, verlän-gert bis 31.05.05

Dendritische-Zell-basierte Vakzine und im-munstimulatorische Oligonukleotide zur The-rapie spontaner Magenkarzinome im SV40 T-Antigen-transgenen Mausmodell (10-2214-En 3). Deutsche Krebshilfe, 02.04.04 - 01.04.06 (Mitantragstellung)

Identifizierung und Evaluierung von Ziel-strukturen für die Antikörper- und Zell-ver-mittelte Immuntherapie des Nierenzellkarzi-noms (106141). Deutsche Krebshilfe, 19.10.04 - 30.04.07

Untersuchung der synergistischen Wirkung von 5-Aminolävulinsäure-basierter photodynami-scher Therapie und Immuntherapie beim Gli-oblastom und Prostatakarzinom (107320). Deutsche Krebshilfe 18.05.06 - 17.05.08

Core facility for the construction and charac-terization of T cell receptor gene-modified T lymphocytes (SFB-TR 36Z1). SFB-TR “Principles and applications of adoptive T cell therapy” 01.07.06 - 30.06.10

Klinische Kooperationsgruppe: Immuntherapie bei urologischen Tumoren (FE 71791). GSF/BMBF, 01.09.01 - 31.08.06

Phase I Trial: IL-2/B7.1 modifizierte allogene Tumorzellen als Vakzine für Patienten mit metastasiertem Nierenzellkarzinom (DLR 01 GE 9624/1). BMBF, 01.04.04 - 31.12.06

Identifikation potentieller Zielstrukturen für eine spezifische Immuntherapie und prognos-

tisch relevanter Faktoren beim metastasierten Nierenzellkarzinom mittels Laser-Mikrodis-sektion und Oligonukleotid-Microarrays (Reg.-Nr. 343). FöFoLe der Universität München, 14.04.04 - 13.10.05

CEACAM20, ein potentielles prostataspezi-fisch exprimiertes Zielmolekül für Tumordiag-nose und Tumorimmuntherapie (Reg.-Nr. 12/2003). Promotionsstudium “Molekulare Medizin” der Universität München, 01.02.04 -31.07.05

Beeinflusst die Expression von Indolamin-2,3-dioxygenase (INDO) im Nierenzellkarzinom das Ansprechen von Patienten auf eine Zytoki-nimmuntherapie? (Reg.-Nr. 2/2004). Promoti-onsstudium “Molekulare Medizin” der Universität München, 01.02.05 - 31.07.06

Expressionsanalyse von Zielantigenen für die Immuntherapie von Nierenzellkarzinomen (Reg.-Nr. 3/2004). Promotionsstudium “Molekulare Medizin” der Universität München, 01.02.05 - 31.07.06

Untersuchung der Funktion von CEACAM16 im Innenohr (Reg.-Nr. 40/2005). Promotions-studium “Molekulare Medizin” der Universität München, 01.02.06 - 31.07.07

Untersuchung der therapeutischen und prog-nostischen Möglichkeiten von CEACAM20 für das Prostatakarzinom (Reg.-Nr. 41/2005). Promotionsstudium “Molekulare Medizin” der Universität München, 01.02.06 - 31.07.07

Entwicklung und Validierung einer neuartigen Tumor-Prognostik anhand der CEACAM-Familie: Multianalyt-Sandwich-Pair-ELISA. BioChancePLUS BMBF, bewilligt für 3 Jahre (Subkontraktnehmer)


Veranstaltungen, Ausbildung, Lehre (LTI)

Seminarreihe des Labors für Tumorim-munologie und der KKG „Immuntherapie urologischer Tumoren“ (GSF - Universität München)

Regression and escape of melanoma after an antigen-driven expansion and persistence of gp100-specific TCR-transgenic CD8+ T cells in lympho-depleted mice. Dr. Hong-Ming Hu, E.A. Chiles Research Institute and Franz W. Cancer Center, Providence Health Center, Portland, OR, USA (24. Januar 2005)

The adenylate cyclase from Bordetella pertus-sis: a promising vector for immunotherapy. Dr. Xavier Préville, Head Immunothera-peutics, BT Pharma, Prologue-Biotech, Paris, France (14. Februar 2005)

Trifunktionelle Antikörper in der Tumorthera-pie. Dr. Peter Ruf, Dr. Michael Jäger, Trion Research, Martinsried (9. Mai 2005)

Anti-angiogenetischer und anti-vaskulärer Effekt von m-TOR-Inhibitoren bei soliden Tumoren: Vorstellung verschiedener präklini-scher Tiermodelle. PD Dr. Christiane Bruns, Chirurgische Klinik und Poliklinik, Klinikum der Universität München (23. Mai 2005)

Mimotopes for epitope-specific tumor immu-notherapy. Prof. Dr. med. Erika Jensen-Jarolim, Center of Physiology and Patho-physiology, Medical University of Vienna, Vienna, Österreich (27. Juni 2005)

Immunoglobulin gene conversion or hyper-mutation: that’s the question. Prof. Dr. Jean-Marie Buerstedde, Institut für Molekulare Radiobiologie, GSF, Neuherberg (4. Juli 2005)

Identification of novel human T cell epitopes in HLA-B27-transgenic mice and man associated with spondyloarthropathy. Dr. rer. nat. Wolfgang Kuon, Medizinische Poliklinik Innenstadt, Klinikum der Universität München, (11. Juli 2005)

Strategien multimodaler molekularer Bildge-bung: Anwendungen beim Zell-Trafficking. Dr. Frank Berger, Institut für klinische Radiologie, Universität München (17. Oktober 2005)

The CD8+ and CD4+ T cell response in a patient with RCC following vaccination with GM-CSF gene transduced autologous tumor cells. Dr. Josef Mautner, Kinderklinik der Technischen Universität München (28. November 2005)

Immunogenicity of MVA-based Her2/neu vaccines in a murine model of breast cancer. Dr. med. Ingo Drexler, Institut für Virologie, Technische Universität München (12. Dezember 2005)

„Cell-on-a-chip“-Assays in Forschung und Medizin. Dr. Martin Brischwein, Heinz Nix-dorf-Lehrstuhl für Medizinische Elektronik der Technischen Universität München (8. Mai 2006)

Humane endogene Retroviren (HERV), Troja-nische Pferde im menschlichen Genom. PD Dr. Christine Leib-Mösch, Institut für Molekulare Virologie der GSF, Neuherberg (29. Mai 2006)

Identifikation von Wnt-Zielgenen im Kolonkar-zinom. PD. Dr. med. Frank Kolligs, Medizi-nische Klinik II, Klinikum der Universität München (26. Juni 2006)

Bedeutung von beta-Catenin für die Regulation von Invasion, Differenzierung und stemness in der Progression humaner, kolorektaler Karzi-nome. PD Dr. Andreas Jung, Pathologisches Institut, Universitat München (27. November 2006)

Role of the non-receptor tyrosine kinase Syk for the control of the acute inflammatory response. Prof. Dr. Barbara Walzog, Institut für Phy-siologie, Universität München (18. Dezember 2006)


Praktikum

„Molekularbiologische Methoden in der Immu-nologie und Tumorimmunologie“ 16. – 20.01.06 17. – 21.07.06 Zimmermann, Buchner, Kammerer, Pohla, Riesenberg

In diesem Praktikum werden in Kleingruppen eigenständig molekularbiologische Methoden kennengelernt, die aktuell in der immunologi-schen und tumorimmunologischen Forschung eingesetzt werden:

HLA-Typisierung durch Durchflusszytometrie

Nachweis von Tumorantigenen durch Immun-histologie

Nachweis von tumorspezifischen murinen CTL durch Durchflusszytometrie

Validierung von Tumorantigenen

Nachweis von humanen peptidspezifischen CTL durch IFN�-Elispot

Praktikum

„Grundlagen der Immunologie“

sowie Vorlesung für Biologie-Studenten und Seminar über aktuelle Probleme der Tumor-immunologie (zusammen mit dem Institut für Immunologie der Universität München).

Sommersemester 2005 Wintersemester 2005/2006 Sommersemester 2006 Wintersemester 2006/2007

Dr. Heike Pohla

LTI-Doktoranden-Seminar

In diesem Seminar sind die medizinischen und naturwissenschaftlichen Doktoranden aufgefor-dert, in Form von Kurzvorträgen den aktuellen Stand ihrer wissenschaftlichen Tätigkeit zu präsentieren und zu diskutieren. Das Seminar bildet ein Forum, um übergeordnete Fragestel-lungen zu erörtern und in den Forschungsrah-men des LTIs einzupassen, sowie den Stellen-wert der eigenen wissenschaftlichen Aktivitä-ten einzuordnen. Do., 8.30 – 10.00 Uhr

LIFE – Laser- und Immunologie-Forschungseinrichtungen Ludwig-Maximilians-Universität München

Marchioninistraße 23 81377 München

Telefon (089) 7095-4865 Telefax (089) 7095-4864

http://life.med.uni-muenchen.de

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LIFE - klinikum.uni-muenchen.de · Laser- und Immunologie-Forschungseinrichtungen mit den Lasereingriffen an Zellstrukturen auftun und das so genannte Laserröntgen wird hierfür