Limites de aplicabilidade da determinação do ácido Δ-aminolevulínico urinário como teste screening na avaliação da intoxicação profissional pelo chumbo

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Cad. Sade Pblica, Rio de Janeiro, 16(1):225-230, jan-mar, 2000

ARTIGO ARTICLE

Limites de aplicabilidade da determinao do cido -aminolevulnico urinrio como teste screening na avaliao daintoxicao profissional pelo chumbo

Applicability limits of urinary -aminolevulinic acid as a screening test to evaluate professionalintoxication by lead

1 Centro de Estudos da Sadedo Trabalhador e EcologiaHumana, Escola Nacional de Sade Pblica,Fundao Oswaldo Cruz.Rua Leopoldo Bulhes 1480,Manguinhos, Rio de Janeiro,RJ, 21045-900, Brasil.

Cristiane Caldeira 1

Rita de Cassia Oliveira da Costa Mattos 1

Armando Meyer 1

Josino Costa Moreira 1

Abstract The relationship between concentrations of ALA-U and Pb-S for two groups of work-ers is reported. The first group consisted of workers from a telephone company, and the second,of workers from battery factories with average Pb-S equivalent to 17,3 g/dl (6,2-39,4) and 61,5g/dl (41,1-91,0), respectively. The aim of this study was to evaluate the utilization of ALA-Ulevels as a screening test for different levels of lead in blood by means of High Performance Liq-uid Chromatography (HPLC) and of spectrophotometry. A significant correlation was found be-tween measured ALA and levels of blood lead (R = 0,739 first group; R = 0,902 second group;p < 0,001). The validity of ALA-U test to evaluate different levels of lead in blood was also stud-ied. By using ALA levels of 3 mg/g creatinine as a threshold to detect levels of lead in blood equalto or higher than 20 g/dl, the test results, for the workers in the first group, showed sensitivity of92% and specificity of 90%. In both groups, the false positives as well as the false negatives werelower than 10%, which was enough to validate the test.Key words Lead Poisoning; Aminolevulinic Acid; Occupational Exposure; Occupational Health

Resumo A aplicabilidade da determinao da concentrao do cido -aminolevulnico uri-nrio (ALA-U) no controle da sade de trabalhadores expostos ocupacionalmente ao chumbo foirealizada em dois grupos de trabalhadores. Os valores mdios de Pb-S para os dois grupos foram17,3 g/dl (6,2-39,4) e 61,5 g/dl (41,1-91,0), respectivamente. As concentraes de ALA-U foramdeterminadas por HPLC e por espectrofotometria. Uma correlao significativa (p

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Introduo

O chumbo um elemento especialmente im-portante em sade ocupacional, devido a suaampla utilizao em processos industriais esua toxicidade aguda e crnica. Por ser alta-mente resistente a corroso atmosfrica e ao de cidos, especialmente o sulfrico, estemetal muito utilizado em construes, na fa-bricao de baterias chumbo-cidas, na fabri-cao de produtos qumicos, tubos, conexes ecomo envoltrio de cabos telefnicos e outros.Desta forma, casos de intoxicao ocupacionalcausados pelo chumbo so bastante comuns,sendo denominados intoxicao profissionalpelo chumbo (IPCH). Apesar da carncia dedados brasileiros sistematizados, alguns estu-dos isolados tm demonstrado uma alta preva-lncia destes casos em nosso pas. A intoxica-o profissional pelo chumbo, por ser uma do-ena grave, incapacitante e de grande incidn-cia ocupacional, considerada um problemade sade pblica, sendo passvel de prevenoatravs da adoo de processos de higiene in-dustrial e equipamentos de proteo coletiva(ATSDR, 1990).

A toxicidade do chumbo se manifesta prin-cipalmente em quatro sistemas: gastrointesti-nal, renal, nervoso e hematopoitico, sendo es-te ltimo de grande importncia no monitora-mento biolgico exposio a este metal. Oprincipal efeito do chumbo neste sistema areduo dos nveis do grupo prosttico heme,causado pela inibio de algumas enzimas uti-lizadas na sntese da hemoglobina, devido a li-gao do metal enzima cido -aminolevul-nico desidratase (ALA-D), causando o acmulodo cido delta aminolevulnico (ALA) no san-gue e na urina (Alessio & Fo, 1983; ATSDR,1990; Landrigan, 1989; Paolielo et al., 1993).Deste modo, a determinao da concentraodo cido -aminolevulnico urinrio (ALA-U)tem sido proposta para o monitoramento daexposio ocupacional ao chumbo, paralela-mente aos nveis do metal no sangue (Pb-S).

Alguns autores tem sugerido a utilizao doALA-U como teste screening para se estudar aintoxicao humana pelo chumbo, por ser ummtodo no-invasivo, causando o mnimo dedesconforto, e por utilizar uma matriz biolgi-ca de fcil coleta e anlise. A utilizao de m-todos mais sensveis para a determinao des-te metablito em fluidos biolgicos tem possi-bilitado a deteco cada vez mais precoce doscasos de intoxicao pelo chumbo onde aindano so observados sinais e/ou sintomas da in-toxicao. A utilizao da Cromatografia Lqui-da de Alta Performance (HPLC) como mtodo

analtico, ao invs do mtodo espectrofotom-trico, comumente utilizado no Brasil, represen-ta um sensvel avano nesta determinao, porincorporar uma etapa prvia de separao cro-matogrfica e, assim, diminuir a interfernciacausada por outros compostos como aminoa-cetonas, presentes na urina (Hennekens & Bu-ring, 1987; Simmonds et al., 1995; Tabuchi etal., 1989).

Estudos realizados com algumas atividadesprofissionais e em ambientes de trabalho noBrasil tm demonstrado valores elevados dechumbo no ar-ambiente de locais onde se uti-liza este metal (acima de 0,1 mg/m3), resultan-do em um grande percentual de trabalhadorescontaminados com nveis sangneos acima de25 g/dl (Araujo et al., 1999). importante res-saltar que problemas de sade tm sido asso-ciados mesmo a estes nveis de chumbo nosangue (ATSDR, 1990).

Material e mtodos

Os nveis de Pb-S e de ALA-U foram determi-nados em amostras de sangue e urina de 82trabalhadores expostos ao chumbo em dois ti-pos de atividades, dos quais 65 trabalhavam co-mo cabistas de uma companhia telefnica e 17em fbricas de baterias, localizadas na regiodo Grande Rio. Dentre os cabistas, a populaoestudada composta de homens adultos, comidade na faixa de 35 a 56 anos (x = 46), com tem-po de servio na empresa variando entre cincoe 30 anos (x = 20), sendo que 63,2% dos traba-lhadores ocupam a mesma funo h mais dedez anos. A populao das fbricas de bateriasestudada composta por homens adultos quepertenciam ao setor de montagem (rea consi-derada de maior risco), com idade na faixa de24 a 28 anos (x = 26), com tempo de servio va-riando de quatro semanas a seis anos.

Os nveis de ALA-U foram determinados pordois mtodos: HPLC e espectrofotometria UV.

Nas anlises por HPLC, o mtodo utilizadofoi o recomendado por Ogata & Taguchi (1987)modificado, que consiste no uso de metilace-toacetato na etapa de condensao e formaodo ALA-pirrol e do N-butanol para diminuir onmero de interferentes encontrados na urina,impedindo a formao de outros pirris. Todasas determinaes foram realizadas com o usode um cromatgrafo, HP modelo 1090, equipa-do com vlvula de injeo Rheodine com dete-tor espectrofotomtrico no ultra-violeta/vis-vel tipo Diode-array.

O seguinte procedimento foi adotado na re-alizao destas anlises: a 1 ml de urina foram


adicionados 0,2 ml de soluo de cido actico(60%) e 2 ml de N-butanol. A separao das fas-es orgnica e aquosa foi realizada por centrifu-gao por trs minutos a 2.000 rpm. fase aqu-osa foram acrescentados 0,5 ml de soluotampo fosfato (pH = 6,8) e 0,1 ml de metilace-toacetato. A mistura foi aquecida a 100o C pordez minutos e aps resfriamento foi injetadano HPLC. Curvas analticas foram preparadasutilizando-se solues-padro nas concentra-es de 2,5, 5, 10, 20 e 40mg/l, preparadas apartir de uma soluo-padro estoque de 1g/ldo cloridrato de ALA.

As seguintes condies operacionais foramutilizadas: fase mvel: acetonitrila/soluo deKH2PO4 50 mM a pH 2,5 ajustado com cidofosfrico (proporo de 20:80); velocidade defluxo: 1,0 ml/minuto; coluna: fase reversa C 18(15 cm/4,6 mm); deteco UV a 260 nm; tem-peratura 40o C; loop de 50 l.

Estudos de recuperao, sensibilidade e re-produtibilidade do procedimento analtico fo-ram realizados, obtendo-se valores mdios de90 +/- 2% de recuperao trabalhando-se comamostras de urina s quais se adicionou ALAat obter-se concentraes de 2, 5, 10 e 40 mg/l.As reprodutibilidade inter e intra ensaios fo-ram determinadas utilizando-se as mesmasconcentraes, e os coeficientes de variaoobtidos foram sempre inferiores a 10%.

O limite de deteco do mtodo utilizado(3) foi estimado em 0,92 g/ml. As determi-naes espectrofotomtricas de ALA-U foramrealizadas de acordo com o mtodo descritopor Tomokumi & Ogata (1980, apud Tabuchi etal., 1989), que se baseia na formao de umcomposto colorido na reao entre o ALA-pir-rol e o reativo de Erlich modificado, sendo aabsorvncia resultante medida a 532nm. Paraisto, foi utilizado um espectrofotmetro Shi-madzu 160 A.

Foram realizadas anlises dos coeficientesde variao, assim como estudos de recupera-o e reprodutibilidade. Obteve-se, em mdia,89% de recuperao para as concentraes de2,5, 10 e 40 mg/l. As reprodutibilidades inter eintra ensaios foram determinadas para as mes-mas concentraes, com coeficientes de varia-o inferiores a 12%. O limite de deteco domtodo foi estimado em 2g/ml.

Resultados e discusso

A avaliao e interpretao dos resultados tevecomo base os valores de referncia obtidos noestudo da populao no exposta da cidade deLondrina, Paran (Okayma et al., 1990), que

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so: Pb-S at 14,7 g/dl e ALA-U igual a 5,3mg/g de creatinina (mg/g cn).

Os resultados obtidos no estudo compara-tivo entre os mtodos, cromatogrfico (HPLC)e espectrofotomtrico, utilizados neste traba-lho mostrado na Figura 1. Como pode ser ob-servado, o mtodo cromatogrfico demonstroumaior especificidade, principalmente em bai-xas concentraes de Pb-S, categorizando umaporcentagem maior de indivduos abaixo de4,5 mg/g cn de ALA-U, adotado como ponto decorte.

A correlao entre os resultados obtidos pe-los dois mtodos foi boa (r = 0,968, p = 0,001),como pode ser observado na Figura 2.

Tanto as concentraes de Pb-S quanto asde ALA-U determinadas neste estudo distri-buram-se em uma ampla faixa (Pb-S entre 6,2-91,0g/dl; ALA-U entre 1,0-43,9 mg/g/cn e 2,0-35,9 mg/g cn, para os dois grupos estudados).

Na Tabela 1 so apresentados os resultadosdas concentraes de Pb-S e de ALA-U, organi-zados em grupos, utilizando-se os resultadosobtidos pelos dois mtodos. O primeiro grupofoi composto pelos trabalhadores da compa-nhia telefnica com concentraes de Pb-Sprximas ao valor utilizado como de referncia(14,3 ug/dl). A mdia dos valores do ALA paraeste grupo foi de 2,8 mg/g cn, quando utiliza-dos os dados obtidos por HPLC. No segundogrupo, foram includos os trabalhadores das f-bricas de baterias, nos quais o valor mdio dePb-S e os de ALA-U foram mais elevados. Estes

Figura 1

Relao entre a distribuio percentual dos trabalhadores com nveis de ALA-U

abaixo de 4,5 mg/g cn e os valores de Pb-S.



valores situaram-se em torno de 20,5 mg/g cn,valor muito superior ao IBMP (ndice Biolgi-co Mximo Permitido) recomendado pela le-gislao brasileira.

Nos trabalhadores do grupo 1, os valores m-dios de ALA-U determinados espectrofotome-tricamente foram 1,5 vezes maiores que os ob-tidos por HPLC, enquanto que, no grupo 2, estarelao foi de 1,7. Esses dados sugerem a interfe-rncia de outros compostos, como, por exemplo,aminoacetonas em todas as faixas de concen-trao estudadas. Esse fato foi descrito por Oga-ta & Tabuchi (1987, apud Ltorneau et al., 1988)apenas para baixas concentraes de ALA-U.

A avaliao da correlao entre os logarit-mos das concentraes de ALA-U e os nveisde chumbo em sangue, Pb-S, foi realizada uti-lizando-se os valores de ALA-U obtidos porHPLC, por ser este o mtodo mais seletivo. Es-tas correlaes foram testadas, separadamen-te, primeiro nos resultados obtidos dos traba-lhadores da companhia telefnica e, depois,nos obtidos dos trabalhadores das fbricas debaterias. Estes testes foram realizados no senti-do de verificar-se a especificidade do mtodo,principalmente em nveis baixos de PbS.

Os resultados obtidos sero apresentadosseparadamente.

Apesar das mdias das concentraes dePb-S e ALA-U dos cabistas telefnicos (17,3 g/dl e 2,8 mg/g cn, respectivamente) estarem pr-ximas ou at abaixo do valor utilizado como dereferncia (14,3 g/dl e 5,4 mg/g cn), foi en-contrada uma correlao estatisticamente sig-nificativa (r = 0,739, p = 0,01) entre os biomar-cadores estudados (Figura 3).

Esses resultados demonstram que paraconcentraes de Pb-S maiores que 6,2 g/dl,obteve-se uma boa correlao entre os doisbiomarcadores. Resultados descritos na litera-tura demonstram uma boa correlao entre osvalores de ALA-U determinados espectrofoto-metricamente e os de Pb-S apenas em concen-traes muito mais elevadas que aquelas aquidescritas (Pb-S >18 g/dl) (Skerfving, 1993). A uti-lizao de mtodos analticos cada vez mais sen-sveis e seletivos, como a HPLC, para monitora-mento ocupacional permite detectar-se nveis decontaminao, aos quais so observados apenaspequenas alteraes metablicas reversveis, fa-cilitando, desta forma, a adoo de medidas pre-ventivas (modificaes no ambiente de trabalho,mudanas para setores de menor risco ou afasta-mento do trabalhador de suas atividades), evitan-do-se maiores danos sade dos trabalhadores.

Para os trabalhadores das fbricas de ba-terias tambm foi encontrada uma boa corre-lao (r = 0,902, p = 0,001) entre Pb-S e ALA-Upara concentraes mais elevadas de Pb-S(x = 62,5 g/dl) (Tomokuni et al., 1988).

Concluso

A utilizao do ALA-U como teste screening deavaliao da intoxicao de trabalhadores porchumbo tem como vantagem evitar que indiv-duos com baixa carga corprea do metal sejamsubmetidos a exames invasivos peridicos, po-dendo, no caso de exposies leves, reduzir onmero de anlises em at 70%. As vantagensde um biomarcador que possa ser analisadoutilizando-se como matriz biolgica a urinaso claras. Este tipo de amostra no traz ne-nhum tipo de desconforto ao trabalhador, apre-senta maior facilidade na coleta, armazenamen-to, transporte e manuseio. A desvantagem cau-sada pela influncia da variabilidade inter-indi-vidual da urina pode ser contornada, em parte,pela correo das amostras pela creatinina, comos resultados expressos em mg/g de creatinina.

Portanto, pode-se sugerir a utilizao doALA-U como indicador biolgico til para sele-cionar trabalhadores expostos. Alguns cuidadosdevem ser considerados devido a possibilidadede testes falso-positivos. O fato do resultado doteste se situar na faixa de normalidade, entre-tanto, no significa sade, e qualquer sinal ousintoma apresentado pelo trabalhador no de-ve ser ignorado. Alm da necessidade de exa-mes clnicos e laboratoriais peridicos, avalia-es integradas ao monitoramento do ambien-te de trabalho so tambm imprescindveis nosentido de se garantir a sade do trabalhador.

Tabela 1

Comparao dos valores de ALA-U obtidos pelos dois mtodos em trabalhadores

da companhia telefnica e de fbrica de baterias.

Grupos ALA/espectro ALA/HPLC Pb-Smg/g cn mg/g cn g/dl

Grupo1/cabistas

Mdia (IC 95%) 3,01 0,37 2,86 0,48 17,3 2,0

Desvio padro 1,5 1,7 8,2

Faixa 1,1 - 6,8 1,0 - 10,9 6,2 - 39,3

n = 65 n = 48 n = 65

Grupo2/fbrica

Mdia (IC 95%) 24,7 6,57 14,7 2,12 63,8 8,37

Desvio padro 9,21 20,15 16,27

Faixa 3,3 - 35,5 2,2 - 43,9 41,1 - 91,0

*n = 10 n = 17 n = 17

* Nesse grupo esto includos apenas os trabalhadores de uma das fbricas de baterias.

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Figura 2

Disperso dos logaritmos dos resultados de ALA-U obtidos por HPLC e espectrofotometria UV/visvel

para todos os trabalhadores estudados.

Figura 3

Estudo da correlao entre Pb-S e log ALA-U: disperso dos resultados obtidos para os trabalhadores

da companhia telefnica.



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