L’INDACO

L’indaco è una sostanza blu usata come colorante tessile fin dall’antichità in quanto è estraibile dal fusto di alcune piante tropicali del genere Indigofera ed in minor misura della pianta europea Isatis tinctoria. La struttura molecolare dell’indaco fu determinata nel 1878 e la sua prima sintesi fu realizzata nel 1882.

L'indaco, nelle regioni del Sahel della Mauritania, è uno dei simboli di prestigio più ricercati.La tunica dei Tuareg, ad esempio, è tutta indaco, colore considerato nobile. I mauritani, nelle zone del corpo non coperte da indumenti, si spalmano una polvere color indaco che li protegge dai raggi solari e dà origine al soprannome di "uomini blu" conferito alle popolazioni nomadi dell'area.

Si può ricavare dalla fermentazione delle foglie di Indigofera tinctoria. Il liquido giallo-verde che si ottiene dalla fermentazione viene fatto ossidare all'aria in ampie vasche, nelle quali viene costantemente agitato. Man mano che progredisce l'ossidazione, il colore della soluzione vira gradualmente fino a diventare un viola-bluastro caratteristico, il color indaco.Il deposito melmoso che si è formato viene quindi raccolto e riscaldato per bloccarne la fermentazione. Una volta asciugato, viene messo in commercio in forma di pani.

L’INDACO

NH

O

NH

O

Adolf Von Baeyer, premio Nobel nel 1913

già nel 1897 incominciò la produzione su scala industriale dell’indaco di sintesi

Viene anche prodotto per sintesi chimica. Fu Adolf Von Baeyer, premio Nobel nel 1913, a mettere a punto per primo il processo di sintesi.Per soddisfare le esigenze del settore tessile, già nel 1897 incominciò la produzione su scala industriale dell’indaco di sintesi, che soppiantò nel giro di qualche decennio l’uso dell’indaco di origine naturale. Oggigiorno l’indaco è sempre largamente usato essendo il colorante tipico dei blu-jeans ed è tutto di origine sintetica (se ne producono, a livello mondiale, circa 17000 tonnellate all’anno).

Spettro UV/visibile

a. Spettro prodotto naturaleb. Spettro prodotto di sintesic. Spettro prodotto su tela

C

H

O

NO2

CH3 C

O

CH3

NH

O

NH

O

CH3 CO

ONa

2 + 2 + 2 NaOH

+ + 4 H2O2

SINTESI CHIMICA DELL’INDACOStechiometria della reazione2-nitro-

benzaldeide

Indaco

Procedura sperimentaleIn una beuta da 250 ml a collo largo si mettono nell’ordine 1 g di 2-nitro-benzaldeide, 20 ml di acetone e 30 ml di acqua. Mantenendo la miscela in agitazione (mediante una piastra agitante oppure semplicemente agitando il recipiente con la mano) si gocciolano lentamente con una “pipetta di Pasteur” 5 ml di una soluzione acquosa 2 Molare di idrossido di sodio. Poichè la reazione provocata dall’idrossido di sodio è esotermica, la miscela di reazione si scalda: occorre regolare la velocità di gocciolamento in modo che la miscela rimanga tiepida e non superi i 45 °C (cioè non scotti). Terminata l’aggiunta, si lascia sotto agitazione per 30 minuti in modo che la reazione si completi. A questo punto, si raccoglie il solido formatosi mediante filtrazione su Buchner con aspirazione; se rimane un po’ di solido nella beuta di reazione, si usa acqua per effettuarne il trasferimento sul filtro. Il solido raccolto sul Buchner viene spremuto con la spatola, lavato con 10 ml di acqua, spremuto di nuovo e quindi lavato con 10 ml di etanolo. Si trasferisce il prodotto in un pallone da 50 ml con collo a smeriglio e, tramite una bolla paraspruzzi, lo si lascia sotto vuoto per 15 minuti per essiccarlo.

Meccanismo della reazioneLa formazione dell’indaco, la cui prima sintesi è stata certamente un risultato non previsto ed in parte frutto della casualità, non è di immediata comprensione poiché essa comporta una serie di trasformazioni che avvengono in spontanea e rapida successione e che sono state chiarite con uno studio decennale. 1°) Reazione di addizione al doppio legame carbonio-ossigeno del gruppo funzionale “aldeidico”, resa possibile dalla presenza di una base che facilita la rottura eterolitica del legame carbonio-idrogeno dell’acetone (ovvero la deprotonazione dell’acetone):

C

H

O

N+

O

O

CH2 C

O

CH3

H C

N+

O

O

H OHCH2 C

O

CH3

+ NaOH

C

N+

O

O

H OHCH2 C

O

CH3

N

H OH

C

O

CH3

O

H2O + +

N

H OH

C

O

CH3

O

NC

O

CH3

O

+H2O+

NC

O

CH3

O

N

O

H CH3 CO

ONa+ NaOH +

2°) Reazione di condensazione (= eliminazione di una molecola di acqua) tra due gruppi funzionali della stessa molecola con formazione di un ciclo:

3°) Ossido-riduzione tra due gruppi funzionali della stessa molecola, in quanto uno è ossidabile (il gruppo funzionale “alcol secondario”) e l’altro ha proprietà ossidanti (il gruppo funzionale “N-ossido”):

4°) Reazione di frammentazione della molecola per rottura del legame tra i due atomi di carbonio adiacenti ad atomi molto elettronegativi (ossigeno, azoto) i quali polarizzano gli elettroni di legame favorendo l’attacco nucleofilo da parte dell’anione idrossido:

N

O

HNH

O

NH

O

2

5°) Dimerizzazione a seguito dello spostamento dell’atomo di idrogeno dal carbonio all’azoto:

SINTESI BIOCATALITICA DELL’INDACOStechiometria della reazione

NH

O

NH

O

NH

+ 22 + O2 + 2 NADH NAD+3 + H2O4+2 H+

Meccanismo della reazione

La formazione biocatalizzata dell’indaco comporta una serie di trasformazioni che avvengono in successione e che sono in parte catalizzate dall’enzima e in parte spontanee.

indolo

NB indolo è un sottoprodotto della digestione del triptofano

1°) Reazione di addizione al doppio legame carbonio-carbonio dell’anello eterociclico dell’indolo, resa possibile dalla presenza di un enzima ossidativo che utilizza l’ossigeno atmosferico e due equivalenti di potere riducente. Il sito catalitico contiene uno ione Fe2+ in grado di attivare la molecola di ossigeno. Successivamente, intervengono due elettroni, attraverso una catena ossidoriduttiva di trasporto che li ottiene dal NADH. Quest’ultimo deve poi essere rigenerato; nelle cellule ciò avviene nella respirazione.

NH

OO

NH

O

O

H

H

NH

H

HOH

OHE. coli JM109(pVL 1343A+pMS13)

2e-

2H+

2°) Reazione di eliminazione di una molecola di acqua con ripristino dell’aromaticità.

NH

H

HOH

OH

NH

OH

+ H2O

3°) Ossidazione spontanea all’aria con dimerizzazione. Si forma dapprima l’indossile (stesso intermedio della sintesi chimica.

NH

OH

N

O

N

O

NH

O

NH

O

+ H2O+ O2

2

+ H+2 2 2

Reazione di sintesi dell’indaco(Chimica)Risospendere in una beuta da 100 mL la cellule precedentemente preparate in 20 ml di tampone fosfato (o terreno minerale) a pH 7 e misurare la densità ottica, utilizzando un spettrofotometro UV/visibile alla lunghezza d’onda di 600 nm. La misura viene effettuata prelevando con una pipetta calibrata 100 μL di sospensione cellulare, diluendo a 1 mL con terreno minerale ed effettuando la lettura dell’assorbanza.Aggiungere 10 μL di una soluzione al 40% (pari a 4 mg) di glucosio (0.2% w/v) e 10 mg di indolo (0.5g/L, i.e. 4.3 mM), pesati utilizzando una bilancia analitica (precisione = 0.0001 g). Inserire un’ancoretta magnetica e mettere in agitazione su piastra a 30 °C per 30 minuti. Si sviluppa una colorazione blu.Estrarre la sospensione aggiungendo 20 ml di AcOEt, prelevati con un cilindro graduato, direttamente nella beuta di reazione, e agitando bene per 10 minuti. Fermare l’agitazione e lasciare separare le fasi.Prelevare con una pipetta calibrata 200 μL di AcOEt e diluirli a 1 mL, trasferire in una cella da UV e misurare l’assorbanza a 600 nm (ripetere l’operazione 3 volte).Utilizzando una retta di taratura (o il coefficiente di estinzione molare per l’indaco), calcolare la quantità di indaco formatosi, la resa della reazione e l’attività del biocatalizzatore, espressa come mmoli/min/DCW. DCW = Dry Cell Weight, in grammi; si può ottenere approssimativamente dall’OD, secondo un rapporto che dipende dal microrganismo (nel caso di E.coli il rapporto è 1 unità OD = 0.5 g DCW).Tempo totale dell’esperienza chimica 90 minuti

Reazione di sintesi dell’indaco(Chimica)Determinazione della velocità di reazione (se possibile)Effettuare 4 prelievi da 1 mL ogni 15 minuti (tempi: 15, 30, 45, 60) utilizzando la pipetta calibrata, metterli in una provetta ed estrarre la sospensione aggiungendo 3 ml di AcOEt, prelevati con la pipetta graduata, tappare la provetta e agitare bene per 1-2 minuti. Fermare l’agitazione e lasciare separare le fasi.Prelevare con una pipetta calibrata 2 mL di AcOEt (Etil acetato: Ac Acetato - O- Et etilico  C2H3O-O-C2H5) e trasferirli in una cella da UV e misurare l’assorbanza a 600 nm. Utilizzando una retta di taratura (o il coefficiente di estinzione molare per l’indaco), calcolare la quantità di indaco formatosi e riportare su un grafico la concentrazione in funzione del temp, calcolare la velocità di reazione, espressa come mmoli/min/DCW.