lineamientos de laboratorio para la vigilancia ... · DETERMINACIÓN POR LABORATORIO DE LA CARGA VIRAL Y DE SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS CD4, CD8 Y CD3 ... la carga viral y el recuento

Dirección General de Epidemiología

Instituto de Diagnóstico y referencia Epidemiológicos“Dr. Manuel Martínez Báez”

lineamientos de laboratorio para la vigilanciaepidemiológica de la carga viral y

subpoblaciones linfocitarias enindividuos infectados por el vih

Carga Viral Página 1 de 28

Versión No.01 InDRE-RNLSP

LINEAMIENTOS DE LABORATORIO PARA LA VIGILANCIA

EPIDEMIOLÓGICA DE LA CARGA VIRAL Y SUBPOBLACIONES

LINFOCITARIAS EN INDIVIDUOS INFECTADOS POR EL VIH

DGE-InDRE-RNLSP

2015

Fotografía de la portada propiedad de HKS Arquitectos



PRIMERA EDICIÓN, 2015

CARGA VIRAL Y SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS–RNLSP

ESTE DOCUMENTO FUE AVALADO POR LOS REPRESENTANTES DE LAS INSTITUCIONES QUE

CONFORMAN EL GRUPO TÉCNICO INTERINSTITUCIONAL DEL COMITÉ NACIONAL DE

VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA (CONAVE).

TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS CONFORME A LA LEY,

© INDRE-SECRETARÍA DE SALUD

SE PERMITE LA REPRODUCCIÓN TOTAL O PARCIAL SI SE CITA LA FUENTE: “LINEAMIENTOS DE

LABORATORIO PARA LA VIGILANCIA EPIDEMIOLÓGICA DE LA CARGA VIRAL Y

SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS EN INDIVIDUOS INFECTADOS POR EL VIH” VERSIÓN NO. 01.

INDRE, 2015.

COLECCIÓN PUBLICACIONES TÉCNICAS DEL INDRE:

ISBN: EN PROCESO

INSTITUTO DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICOS DR. MANUEL MARTÍNEZ

BÁEZ

FRANCISCO P MIRANDA 177, COL. LOMAS DE PLATEROS DEL. ÁLVARO OBREGÓN, C. P.

01480, MÉXICO, D. F.

TEL. (55)53-42-75-50

www.indre.salud.gob.mx

LA EDICIÓN ESTUVO A CARGO DE: DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ

EL DISEÑO ESTUVO A CARGO DE: LIC. BRENDA ESCOBEDO LÓPEZ

IMPRESO EN MÉXICO. PRINTED IN MEXICO

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JEFE DEL DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGÍA

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QBP. LOURDES A. CANO SANTANA

JEFA DEL LABORATORIO DE CARGA VIRAL



GRUPO DE TRABAJO

QBP. LOURDES A. CANO SANTANA

JEFA DEL LABORATORIO DE CARGA VIRAL

QBP. JAIME ISRAEL FALCÓN ACOSTA

ADSCRITO AL LABORATORIO DE CARGA VIRAL

BIOL. IRMA LÓPEZ MARTÍNEZ

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DR. HUGO MARTÍNEZ ROJANO

ASESOR TÉCNICO DE LA DIRECCIÓN GENERAL ADJUNTA DEL INDRE

COORDINADOR DE MEDICINA LABORAL

DR. JOSÉ ALBERTO DÍAZ QUIÑONEZ

DIRECTOR GENERAL ADJUNTO



LINEAMIENTOS DE LABORATORIO

PARA LA VIGILANCIA

EPIDEMIOLÓGICA DE LA CARGA VIRAL

Y SUBPOBLACIONES LINFOCITARIAS

EN INDIVIDUOS INFECTADOS POR EL

VIH

DGE-InDRE–RNLSP

2015



ÍNDICE

ACRÓNIMOS Y SIGLAS .................................................................................................... 9

INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 10

ANTECEDENTES DE LA RNLSP PARA LA DETERMINACIÓN DE CARGA VIRAL

Y SUBPOBLACIÓN DE LINFOCITOS. ........................................................................... 13

MARCO LEGAL ................................................................................................................ 13

DEFINICIONES OPERATIVAS ........................................................................................ 14

OBJETIVO GENERAL ...................................................................................................... 15

DETERMINACIÓN POR LABORATORIO DE LA CARGA VIRAL Y DE

SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS CD4, CD8 Y CD3 ............................................. 15

ESTÁNDARES DE CALIDAD .......................................................................................... 19

PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO ............................... 19

CARGA VIRAL ................................................................................................................... 20

CUANTIFICACIÓN DE SUBPOBLACIÓN DE LINFOCITOS CD4, CD8 Y CD3 .......................... 20

BANCO DE MATERIAL BIOLÓGICO ..................................................................................... 21

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES .............................................................................. 21

BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................. 22

ANEXO I: TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS ......................................................................... 24

ANEXO II: CARACTERÍSTICAS DE EQUIPOS COMERCIALES ............................... 28

ANEXO III: PREPARACIÓN DE REACTIVOS .............................................................. 28



ACRÓNIMOS Y SIGLAS

ADN: Ácido Desoxirribonucleico

ARN: Ácido Ribonucleico

CONASIDA: Consejo Nacional para Prevención y Control del SIDA

CONAVE: Comité Nacional de Vigilancia Epidemiológica

CV: Carga Viral

EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético

LESP: Laboratorio Estatal de Salud Pública

NOM: Norma Oficial Mexicana

OMS: Organización Mundial de la Salud.

PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa

RNLSP: Red Nacional de Laboratorios de Salud Publica

RT-PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa tras transcripción inversa

SINAVE: Sistema Nacional de Vigilancia Epidemiológica

SIDA: Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida

TI: Transcriptasa inversa

VAL: Virus Asociado a Linfadenopatía

VIH: Virus de la Inmunodeficiencia Humana

HTLV-III: Virus T-Linfotrófico Humano tipo III



INTRODUCCIÓN

El síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) fue identificado por primera vez en el

año de 1981 como un grupo de infecciones oportunistas sin precedente, que afectaba a

individuos sin predisposición conocida a deficiencias del sistema inmunitario. El SIDA

puede considerarse una enfermedad que impide la respuesta eficaz del sistema inmunitario

cuyo agente causal es conocido como virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Este

virus fue conocido al inicio de la epidemia como virus asociado a linfadenopatía (LAV) y

virus T-linfotrófico humano tipo III (HTLV-III), términos que prácticamente no se utilizan

en la actualidad.

El VIH puede debilitar la respuesta inmunitaria hasta tal punto que el portador es incapaz

de controlar ciertos microorganismos que un sistema inmunitario sano sí controlaría. Este

tipo de microorganismos patógenos se conocen como oportunistas debido a que pueden

expresar sus efectos patógenos solo en presencia de factores predisponentes que debilitan el

sistema inmunitario.

Existen dos tipos de VIH, el VIH-1 y el VIH-2. El VIH-1 es el más conocido y también es

el responsable de la mayoría de los casos de SIDA en el mundo. El VIH-2 fue identificado

por primera vez en 1986 en pacientes de África Oriental, en donde estuvo confinado por

varios años; sin embargo, se han reportado algunos casos de infección por VIH-2 en

Europa, América del Sur, Canadá y Estados Unidos. Existen algunas diferencias clínicas

entre la infección causada por el VIH-1 y el VIH-2; el segundo tiene menor eficiencia de

transmisión y un mayor periodo de latencia antes del desarrollo del cuadro clínico de SIDA.

El VIH pertenece a la familia de los retrovirus y a la subfamilia de los lentivirus. Estos

virus tienen una serie de características específicas que son determinantes en la compleja

patogenia de la infección por el VIH:

Gran diversidad genética (virus ácido ribonucleico [ARN]) y genoma muy complejo

(lentivirus)

En su ciclo vital hay dos fases: el virión infectante (ARN) y el provirus (ácido

desoxirribonucleico [ADN]). Esta fase intermedia de integración en el genoma

huésped le permite prolongados periodos asintomáticos (latencia), a pesar de una

viremia persistente.

Se replica mediante un mecanismo inverso al habitual en los virus ARN. El papel

fundamental lo juega una enzima llamada transcriptasa inversa (TI).

Sus células huésped son los linfocitos CD4+, macrófagos, células nerviosas de la

microglía y las células dendríticas residentes en mucosas (células de Langerhans).

El VIH se puede transmitir por tres mecanismos:

Transmisión sexual: Exposición directa a secreciones de personas infectadas, como

el semen y el flujo vaginal.



Transmisión sanguínea: Exposición a sangre o sus derivados, ya sea por

transfusiones y trasplantes o por vía parenteral debido al uso de agujas

contaminadas.

Transmisión perinatal: Es el paso del virus de la madre infectada a su hijo, este

mecanismo es llamado también transmisión vertical. La infección del producto

puede ocurrir durante el embarazo, durante el parto o durante la lactancia.

La infección por el VIH se asocia en todas sus etapas con una intensa replicación viral,

principalmente en linfocitos y macrófagos. Al inicio, los mecanismos de defensa del

organismo permiten neutralizar a los nuevos viriones y regenerar las células inmunes que se

destruyen aceleradamente, lográndose un equilibrio entre la cantidad de virus circulante,

(carga viral), y el recuento de linfocitos CD4+ (respuesta del sistema inmunitario); de esta

manera, la persona infectada se mantiene asintomática (etapa A). Sin embargo, después de

un periodo variable se rompe este equilibrio, la carga viral comienza a aumentar y los

recuentos de linfocitos CD4+ declinan progresivamente.

La cuantificación del ARN del VIH-1 es un reflejo de la replicación viral activa y es

esencial en algunas situaciones clínicas de la infección por este virus. Las indicaciones

principales para su cuantificación son las siguientes:

1. La carga viral es un marcador predictivo del tiempo de progresión a Sida

independiente del número de linfocitos CD4+. Durante los primeros años de

conocerse el Sida se consideró el recuento de las células CD4+ como el mejor

marcador para pronosticar la progresión de la enfermedad, pero en la actualidad, se

utilizan ambos marcadores; la carga viral y el recuento de células CD4+.

2. La cuantificación de la CV del VIH-1 debe ser realizada antes de iniciar un

tratamiento con antirretrovirales, para evaluar la eficacia o respuesta al tratamiento,

y en el caso de que se sustituya o añada algún fármaco, bien por efectos adversos o

por sospecha de fracaso.

3. Hay situaciones excepcionales en las que la carga viral es muy útil para el

diagnóstico de la infección neonatal (la determinación de anticuerpos no es útil) e

incluso cuando se sospecha infección aguda (reduce el periodo ventana).

Hoy en día, la metodología utilizada en la mayoría de los servicios de laboratorio es la

reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real, que ha desbancado casi en su

totalidad a otras técnicas previas como la PCR convencional, la tecnología NASBA

(amplificación isotérmica de ácidos nucleicos), la reacción en cadena de la ligasa o las

tecnologías de amplificación de señal. Aunque la PCR en tiempo real está lejos de ser

considerada como la técnica ideal tiene ventajas importantes, como son una buena

sensibilidad analítica (<40 copias/mL), gran reproducibilidad y linealidad, rango dinámico

y, sobre todo, es capaz de determinar los diversos tipos y subtipos de VIH, no solamente el



VIH-1 subtipo B. Este aspecto epidemiológico es muy importante y una de las principales

preocupaciones de las compañías comerciales a la hora de desarrollar sus técnicas.

Estudios comparativos entre las diferentes plataformas de PCR en tiempo real han mostrado

resultados comparables para la detección del VIH grupo M, aunque puede haber algunas

diferencias en la detección de las formas recombinantes circulantes. En cuanto al resto de

técnicas (no-PCR en tiempo real), diversos estudios publicados demuestran que los

resultados son también comparables con escasas diferencias. En la mayoría de los estudios

comparativos realizados, la tasa de correlación entre las técnicas utilizadas para cuantificar

el ARN del VIH-1 era del 90%. A pesar de esto, en el seguimiento de los pacientes es

conveniente utilizar siempre la misma técnica a lo largo del tratamiento y, sobre todo, si se

cambia de técnica hay que asegurarse de obtener una cuantificación basal del ARN VIH-1

nueva obtenida con la técnica que se va a utilizar en el futuro.

De acuerdo a las consideraciones antes mencionadas y la importancia que implica esta

infección para la salud pública del país se efectuó el presente documento que establece los

lineamientos para la aplicación del algoritmo de diagnóstico de la carga viral y de

subpoblaciones linfocitarias del paciente infectado con el VIH.

ANTECEDENTES DE LA RED NACIONAL

Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública

La Red Nacional de Laboratorios de Salud Pública (RNLSP) es el conjunto de laboratorios

de vigilancia epidemiológica con objetivos específicos que le han permitido unificar

métodos de diagnóstico, criterios de interpretación de resultados, transferencia tecnológica,

generación de conocimiento y formación de recursos humanos. Es el soporte técnico-

científico útil para la vigilancia epidemiológica y que genera información de calidad para la

toma oportuna de decisiones a través de la confirmación de diagnósticos mediante estudios

de laboratorio en muestras biológicas.

La RNLSP depende de la Secretaría de Salud y es el Instituto de Diagnóstico y Referencia

Epidemiológicos (InDRE) su órgano rector en el área de vigilancia epidemiológica. Tiene

fundamento legal en la Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia

epidemiológica y está conformada por 31 Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP)

de las 31 entidades federativas del país (el Distrito Federal envía sus muestras al InDRE).

El Marco Analítico Básico de la RNLSP consta de 27 diagnósticos, distribuidos en 16 redes

de vigilancia específica.



ANTECEDENTES DE LA RNLSP PARA LA DETERMINACIÓN DE CARGA VIRAL

Y SUBPOBLACIÓN DE LINFOCITOS.

Red Nacional de Laboratorios para la Vigilancia de la carga viral y subpoblaciones de

linfocitos

Actualmente no se cuenta con un control de referencia biológico (material para diagnóstico

de carga viral y determinación de linfocitos CD4, CD8 y CD3) para su envío a los

diferentes Laboratorios Estatales de Salud Pública (LESP).

MARCO LEGAL

1. Ley General de Salud, México. Nueva Ley publicada en el Diario Oficial de la

Federación el 7 de febrero de 1984. Última reforma publicada en el DOF

07/06/2012.

2. Reglamento Interior de la Secretaria de Salud. México. Publicado en el Diario

Oficial de la Federación el 19 de enero de 2004. Última reforma publicada en el

DOF del 10 de enero de 2011.

a. Reforma aplicable: Decreto que reforma, adiciona y deroga diversas

disposiciones del Reglamento Interior de la Secretaría de Salud. DOF 2 de

febrero de 2010.

3. Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012, Para la vigilancia epidemiológica,

publicada en el Diario Oficial de la Federación el 19 de febrero de 2013.

http://dof.gob.mx/nota_detalle.php?codigo=5288225&fecha=19/02/2013.

4. Secretaría de Salud. Programa Sectorial de Salud 2013-2018. Diario Oficial de la

Federación DOF: 12/12/2013.

5. Plan Nacional de Desarrollo 2013-2018. Diario Oficial de la Federación, DOF:

20/05/2013, www.dof.gob.mx

6. Secretaría de Salud. Programa de Acción Específico 2013-2018. Sistema Nacional

de Vigilancia Epidemiológica, primera edición 2014.

7. Norma Oficial Mexicana NOM-010-SSA2-2010 para la Prevención y Control de la

infección por Virus de la Inmunodeficiencia Humana.

8. Norma Oficial Mexicana NOM-877-ECOL-SSA1-2002 protección ambiental- salud

ambiental- residuos peligrosos biológico-infecciosos-clasificación y especificación

del manejo.

9. Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011, Para la organización y

funcionamiento de los laboratorios clínicos. DOF: 27/03/2012.

10. Norma Oficial Mexicana NOM-039-SSA2-2002, Para la prevención y control de las

infecciones de trasmisión sexual, DOF: 19/09/2003.

http://dof.gob.mx/nota_detalle.php?codigo=5288225&fecha=19/02/2013

http://www.dof.gob.mx/



11. NMX-CC-9001 IMNC-2008, Sistemas de gestión de la calidad-Requisitos. DOF:

12/12/2008, imnc.org.mx

12. Lineamientos para los Programas de Evaluación Externa del Desempeño de la Red

Nacional de Laboratorios de Salud Pública DGE-InDRE-RNLSP, 2014.

13. Manual para la toma, envío y recepción de muestras para diagnóstico. DGE-InDRE-

RNLSP, 2014.

14. Lineamientos de la Evaluación del Desempeño “Caminando a la Excelencia”,

México, DGE-InDRE-RNLSP, 2014.

15. Lineamientos del Sistema de Reconocimiento a la Competencia Técnica de

Laboratorios que apoyan a la Vigilancia Epidemiológica. DGE-InDRE-RNLSP,

2014.

16. Lineamientos para la Gestión de Riesgo Biológico. DGE-InDRE-RNLSP, 2014.

DEFINICIONES OPERATIVAS

Sida: es la etapa final de una infección causada por un virus que tiene una duración de

varios años; por lo que en la actualidad se considera que es una infección crónica. A partir

del momento que una persona se infecta por el virus que causa el Sida, tarda en promedio

10 años para que se desarrollen las manifestaciones de la enfermedad conocida como

Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida, SIDA.

Portador asintomático del VIH: Persona que se encuentra infectada por el virus de la

inmunodeficiencia humana, pero que todavía no ha desarrollado manifestaciones de la

enfermedad.

Determinación cuantitativa de carga viral en plasma: Es el número de partículas virales

contenidas en un volumen determinado de plasma o suero. Se expresa como número de

copias del virus/mL. Existen técnicas comerciales disponibles como RT-PCR (Amplicor,

Roche), NASBA, y Nuclisens (Organon), bDNA (Quantiplex, Chiron), Digene

(Omnichen). Ha sido demostrado, que la carga viral es un marcador que pronostica el

riesgo de progresión de la enfermedad, y sirve para medir la respuesta a la terapia

antirretroviral.

Cuenta de linfocitos T CD4+: La cuenta de linfocitos T CD4+ nos permite conocer el

deterioro que ha sufrido el sistema inmune a causa del VIH, generalmente el número de

estas células disminuye conforme avanza el deterioro del sistema inmune (progresión de la

enfermedad). Los valores normales de los linfocitos T CD4+ van de 750 a 1200

células/mL, el límite superior puede variar de acuerdo al método de laboratorio utilizado.

Una cuenta igual o menor a 200 células/mL se considera como definitoria de SIDA

independientemente de la presencia de otras manifestaciones.

Las actividades de salud, y dentro de ellas los servicios del Consejo Nacional para

Prevención y Control del Sida (CONASIDA), constituyen una de las materias objeto de la

actualización normativa, la NOM-010-SSA2-2010, Para la prevención y control de la



infección por VIH, aglutina los puntos de vista, propuestas y resultados de investigaciones

que diversos organismos, tanto gubernamentales como no gubernamentales y privados han

efectuado en varios ámbitos para la prevención y control de la enfermedad.

Básicamente la NOM-010-SSA2-2010 enumera las definiciones y especificación de

términos, disposiciones generales, medidas de prevención y de control; asimismo, describe

una bibliografía básica y la concordancia que tiene con otras normas a nivel internacional,

para efectos de la NOM-010-SSA2-2010 se entenderá por:

OMS: Organización Mundial de la Salud.

CONASIDA: Consejo Nacional de Prevención y Control del SIDA.

VIH: Virus de la Inmunodeficiencia Humana, incluye al VIH-1 y al VIH-2.

OBJETIVO GENERAL

Establecer los procedimientos para la aplicación del algoritmo de diagnóstico por

laboratorio para la cuantificación de la carga viral y subpoblaciones linfocitarias en

individuos infectados con el VIH-1 y establecer el manejo adecuado de la información

generada por laboratorio, a través de la RNLSP, en apoyo a la Vigilancia Epidemiológica

de la infección.

DETERMINACIÓN POR LABORATORIO DE LA CARGA VIRAL Y DE

SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS CD4, CD8 y CD3

Cuantificación de la carga viral: Las muestras de sangre para la determinación de carga

viral deberán tomarse cuando el paciente cumpla con un ayuno mínimo de 10 horas. Se

debe de utilizar un tubo con EDTA como anticoagulante, ser transportadas a una

temperatura de entre 2 y 25 °C y centrifugarse dentro de las primeras 6 horas siguientes a

su recolección.

El volumen de sangre solicitado es de 5.0 mL, pero en caso de enviar el plasma ya separado

el volumen mínimo será de 1.2 mL.

Una vez separado el plasma de preferencia deberá congelarse, pero puede almacenarse

máximo un día a temperatura ambiente (18 a 25 °C) o a una temperatura de entre 2 y 8 °C

por 5 días.



Los tubos con las muestras deberán estar perfectamente etiquetados, sellados, y sin que

exista evidencia de derrames.

La determinación por lo general se realiza en plasma, aunque puede hacerse en otros

líquidos y tejidos.

En todas las técnicas para la cuantificación de la carga viral es necesario trabajar con

moléculas de RNA viral, las cuales son muy inestables, por lo que la toma de la muestra,

las condiciones de transporte, de almacenamiento y de procesamiento son fundamentales

para la obtención de resultados confiables.

Las variaciones de la carga viral se expresan en forma de un logaritmo de base o poder 10.

Por ejemplo, si en una primera determinación se encuentra 100,000 partículas del virus/mL,

entonces la disminución de 1 log, es igual a la disminución de 90% del número de copias,

es decir, una disminución a 10,000 copias/mL. La disminución de 2 log, es igual a la

disminución de 99% del número de copias, es decir, una disminución a 1,000 copias/mL.

La disminución de 3 log es igual a la disminución de 99.9% del número de copias, es decir,

a 100 copias/mL. Cambios de más de 0.5 log son considerados como significativos.

Cuantificación de subpoblaciones de Linfocitos CD4, CD8 y CD3. Las muestras de

sangre para la determinación de subpoblaciones de linfocitos CD4, CD8 y CD3 deben de

tomarse cuando el paciente cumpla con un ayuno mínimo de 10 horas. Se debe de

recolectar en un tubo con EDTA como anticoagulante, y transportarse a una temperatura

entre 18 y 25 °C, así como no tener más de 24 horas de haberse obtenido. El volumen de

sangre solicitado es de 5 mL.

En los casos de pacientes que requieran tanto la determinación de carga viral como de

subpoblación de linfocitos CD4, CD8 y CD3 se debe de enviar dos tubos con muestra

sanguínea que cumplan las especificaciones descritas en los párrafos anteriores.

El recuento de linfocitos CD4 tiene limitaciones de orden biológico y analítico que hay que

conocer para no cometer errores en su interpretación: Entre las de orden biológico están las

variaciones debidas a la edad, grupo étnico, momento del día en que se realiza la extracción

de la sangre, la estación del año, la influencia de infecciones concomitantes o el uso de

tratamientos. Entre las de orden analítico, están las relaciones con la variabilidad de los

resultados entre los laboratorios: la temperatura de la muestra, tiempo transcurrido entre la

extracción y el análisis; tipo de anticoagulante, reactivo e instrumento utilizado. Por último,

la variabilidad del número total de leucocitos, las proporciones de linfocitos/total de

leucocitos y linfocitos CD4+/total de linfocitos, influyen sobre la cifra absoluta de

linfocitos CD4+



ALGORITMO DIAGNÓSTICO

Figura 1. Algoritmo para la cuantificación de la carga viral del VIH

ALGORITMO PARA LA CUANTIFICACIÓN DE SUBPOBALCIÓN DE

LINFOCITOS CD4, CD8, CD3

Muestra de sangre total obtenida en tubo con EDTA

Centrifugar a 3500 rpm durante 15 minutos

Obtener el plasma, envasar y congelar a -70 °C

Realizar carga viral por la técnica de RT-PCR en tiempo real

Sensibilidad del método 40–10, 000, 000 de Copias de

ARN/mL)

RESULTADO DEL TÍTULO

1. CARGA NO DETECTADA: el valor Ct

obtenido para HIV-1 está por arriba del

límite del ensayo o no se ha obtenido un

valor Ct para HIV-1.

2. < 4.00E+01copias/mL: Las copias/mL

calculadas están por debajo del límite de

detección del ensayo.

3. ≥4.00E+1copias/mL y ≤ 1.00E+07

copias/mL: Los resultados calculados

superiores o iguales a 40 Copias/mL e

inferiores o iguales a 1.00E+07 copias/mL

se encuentran dentro del intervalo lineal

del ensayo.

4. >1.00E+07 copias/mL: Las copias/mL

calculadas están por encima del intervalo

del ensayo

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

1. Reportar como copias/mL de ARN del VIH-1 no detectado.

2. Reportar con ARN del HIV-1 detectado,

menos de 40 copias/mL.

3. Reportar como resultados calculados dentro del intervalo lineal del ensayo.

4. Reportar como más de 1.00E+07

copias/mL del ARN del HIV-1. NOTA: Si se desea obtener un resultado cuantitativo, debe diluirse la muestra original con plasma humano negativo para HIV-1 y repetirse la prueba, multiplicar el resultado obtenido por el factor de dilución.

Se reporta No. Copias de ARN/mL)



Figura 2. Algoritmo para la cuantificación de linfocitos CD4, CD8, CD3

Muestra de sangre total obtenida en tubo con EDTA

Agitar durante 30 minutos a temperatura ambiente

Mezclar 20 µL del anticuerpo monoclonal triple anti CD4, antiCD8 y anti CD3 + 100 µL de sangre

Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente y en la obscuridad

Preparar la muestra (lisa, estabiliza y fija)

Leer a las muestras, el número de células CD4, CD8, CD3 y % de cada subpoblación

en el citómetro de flujo

Reportar el número de células/µL de CD4, CD8 y relaciones CD4/CD8,

CD4/CD3 y CD8/CD3



Captura de datos y resultados

La captura de los datos se realiza en bitácoras de registro donde se concentran todos los

datos generados en el laboratorio, posteriormente los resultados se incorporan a la

plataforma “INFOLABW” y finalmente se liberan por parte del jefe de laboratorio.

ESTÁNDARES DE CALIDAD

Cuantificación de carga viral

Indicador de oportunidad

Cumplir con la emisión de los resultados de diagnóstico en 16 días en por lo menos el 90%

de las muestras recibidas = resultados de diagnósticos informados en 16 días/número de

muestras recibidas para diagnóstico X 100.

Indicador de confiabilidad

Cumplir con el 90% o más del Programa de Evaluación Externa del Desempeño (PEED)

para este diagnóstico = paneles aprobados con el 90% o más/paneles recibidos X 100.

Cuantificación de linfocitos

Indicador de oportunidad

Cumplir con las emisión de los resultados de diagnóstico en tres días en por lo menos el

90% de las muestras recibidas = resultados de diagnósticos informados en 3 días/número de

muestras recibidas para diagnóstico X 100.

Indicador de confiabilidad

Cumplir con el 90% o más del PEED para este diagnóstico = paneles aprobados con el 90%

o más/paneles recibidos X 100.

PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA DEL DESEMPEÑO

El PEED como tal no aplica para la Red Nacional de Laboratorios Estatales de Salud

Pública. Sin embargo, actualmente se cuenta con un programa de evaluación externa en el

cual participa el laboratorio de carga viral del InDRE y el laboratorio de referencia

internacional “CARPERMOR” para la cuantificación de subpoblación de linfocitos CD4,

CD8 y CD3; y un programa de evaluación externa en el cual participa el laboratorio de

carga viral del InDRE y el laboratorio de genética molecular para la cuantificación de la

carga viral de VIH.

El programa consiste en enviar un panel de 5 muestras de sangre total con EDTA como

anticoagulante cada 4 meses (cuatrimestral). El InDRE realiza el primer y tercer envío de

los paneles al laboratorio de referencia internacional “CARPERMOR” y genética



molecular, mientras que estos últimos proporcionan las muestras de los paneles segundo y

cuarto que se envían al InDRE.

Posterior al análisis de las muestras, se realiza el análisis estadístico en el cual se debe dar

cumplimiento al indicador de confiabilidad que es del 90%.

Criterios para la liberación del diagnóstico

Carga viral

En cada corrida de muestras se debe incluir un control negativo, un control positivo bajo

para VIH-1 y un control positivo alto para VIH-1. La corrida de muestras es válida y se

elabora el informe de resultados si no aparece alguna notificación que invalide los

controles.

1. Control negativo

El control negativo (-) debe dar un resultado “Target not detected” lo que se

interpreta como carga viral no detectable o que la carga está por debajo del límite de

detección del método. Si el resultado obtenido para el control negativo lleva

asociado el aviso “Invalid” (no válido), toda la corrida es inválida y debe de

repetirse.

2. Controles positivos

El intervalo asignado tanto para el control positivo bajo como para el control

positivo alto es específico para cada lote de reactivo; está incluido en los códigos de

barras de los casetes de reactivo para la prueba.

Los valores de copias del ARN del HIV-1/mL obtenido para los controles positivos

deben estar dentro de los respectivos intervalos asignados. Si uno o ambas controles

positivos tienen el aviso de no válido, toda la corrida es inválida y debe de repetirse.

Cuantificación de subpoblación de linfocitos CD4, CD8 Y CD3

1. Se utiliza el FLOW CHECK para determinar el buen funcionamiento del equipo con

respecto al sistema hidráulico y óptico ya que permite ajustar el canal de lectura y

determinar si los voltajes son los adecuados.

2. Se utiliza el INMUNO-TROL como un control interno que valida el ensayo. Es una

muestra de sangre total con valores conocidos, de manera que se toma como

referencia de las poblaciones linfocitarias CD4, CD8 y CD3 por lo que cualquier

desviación de los datos reportados en la técnica del INMUNOTROL se toma como

un desajuste del equipo.



Obtener valores de las poblaciones linfocitarias CD4, CD8 y CD3 dentro del rango

estipulado en la técnica del INMUNO-TROL, brinda la certeza de que los valores

obtenidos en el análisis de las muestras son reales.

Banco de material biológico

Con el objetivo de mantener el banco de material biológico, que sirva para la realización de

los paneles de eficiencia, así como la obtención de controles de referencia, o para estudios

que permitan la implementación de nuevas técnicas de diagnóstico, actualmente se cuenta

en el laboratorio de carga viral del InDRE con el banco de muestras que son conservadas en

congelación, y que provienen de los diferentes LESP y de instituciones públicas y privadas

del país.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

El laboratorio de carga viral participa en el curso anual de Bases y fundamentos de los

métodos de diagnóstico por el laboratorio para infecciones de transmisión sexual.

Cronograma de actividades

Actividad Ene Feb Mar Abr May Jun Jul Ago Sep Oct Nov Dic

Curso teórico-práctico XX

Envío del primer panel a los

laboratorios CARPERMOR

y genética molecular

XX

Recepción de resultados del

panel en el INDRE XX

Envío de resultados a los



XX

Envío del segundo panel a

los laboratorios

CARPERMOR y genética

molecular

XX

Recepción de resultados del

panel en el InDRE XX

Envío de resultados a los



XX

Nota: Si alguna de las fechas corresponde a un día no laborable, la actividad se realizará el

siguiente día hábil.



BIBLIOGRAFÍA

1. Palmer S, Wiegand AP, Maldarelli F, Bazmi H, et al. new real-time reverse

transcriptase-initiated PCR assay with single-copy sensitivity for human

immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma J Clin Microbiol. 2003; 41:4531-

4536.

2. Kuritzkes DR. Quantification of human immunodeficiency virus type 1 by reverse

transcriptase-coupled polymerase chain reaction. J Infect Dis. 2004; 190:2047-2054.

3. Ju Lin H, Haywood M, and Hollinger FB. Application of a commercial kit for

detection of PCR products to quantification of human immunodeficiency virus type

1 RNA and proviral DNA. J Clin Microbiol. 1996; 34:329-333.

4. Mulder J, McKinney N, Christopherson C, Sninsky J, Greenfield L, and Kwok S.

Rapid and simple PCR assay for quantitation of human immunodeficiency virus

type 1 RNA in plasma: application to acute retroviral infection. J Clin Microbiol.

1994; 32:292-300.

5. O’Brien WA, Hartigan PM, Martin D, Esinhart J, Hill A, et al. Changes in plasma

HIV-1 RNA and CD4+ lymphocyte counts and the risk of progression to AIDS. N

Engl J Med 1996; 334:426-431.

6. Ley General de Salud, México. Nueva Ley publicada en el Diario Oficial de la

Federación el 7 de febrero de 1984. Última reforma publicada DOF 07/06/2012.

7. Reglamento Interior de la Secretaria de Salud. México. Publicado en el Diario

Oficial de la Federación el 19 de enero de 2004. Última reforma publicada en el

DOF del 10 de enero de 2011

a. Reforma aplicable: decreto que reforma, adiciona y deroga diversas

disposiciones del Reglamento Interior de la Secretaría de Salud. DOF 2 de

febrero de 2010.

8. Proyecto de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-017-SSA2-2012 para la

vigilancia epidemiológica.

9. Norma Oficial Mexicana NOM-010-SSA2-2010 para la Prevención y Control de la

infección por Virus de la Inmunodeficiencia Humana.

10. Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002 protección ambiental-salud

ambiental-residuos peligrosos biológico-infecciosos-clasificación y especificación

de manejo.

11. Norma Oficial Mexicana NOM-007-SSA3-2011 para la organización y

funcionamiento de los laboratorios clínicos.

12. Norma Oficial Mexicana NOM-039-SSA2-2002 para la prevención y control de las

infecciones de trasmisión sexual.

13. Norma Mexicana IMNC: NMX-CC-9001-IMNC-2008, “Sistemas de gestión de

calidad-requisitos”. http://www.imnc.org.mx

14. GECA-P-01/2. Control de los Documentos y de los Registros.

15. GECA-G-01/0 Guía para la elaboración de la documentación del SGC.

http://www.imnc.org.mx/



16. Manual para la toma, envío y recepción de muestras para diagnóstico. Versión No.

01, InDRE, 2014.

17. CARV-P-01/1. Procedimiento para la recepción, registro, distribución,

almacenamiento y custodia de muestras en el Laboratorio de Carga Viral.

18. Miller MJ, et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical

diagnostic laboratories. MMWR Surveill Summ. 6; 61:1-102; 2012.

19. Guidelines for Biosafety Laboratory Competency. MMWR. Supplement/Vol. 60;

2011.

20. World Health Organization. Guidance on regulations for the Transport of Infectious

Substances 2013-2014; Geneva: WHO Press; 2012.

21. Chosewood C & Wilson DE. Biosafety in Microbiological and Biomedical

Laboratories–5th ed. CDC-NIH; 2009.

22. European Committee for Standardization. CWA 15793:2011 Laboratory biorisk

management standard. Brussels: CEN; 2011.

23. World Health Organization. Laboratory Biosafety Manual–3rd ed. Geneva: WHO

Press; 2004.



Anexo I: TÉCNICAS DIAGNÓSTICAS

Método para la determinación de linfocitos CD4, CD8 y CD3.

1. Realizar la recepción de la muestra de acuerdo con la ficha de proceso de

subpoblaciones linfocitarias CD4/CD8/CD3 para individuos infectados con el VIH.

2. Llevar a temperatura ambiente todos los reactivos necesarios para la realización de

la prueba.

3. Colocar los tubos de muestra e Inmuno-trol en el agitador de tubos durante 30

minutos.

4. Llenar el formato para la determinación de linfocitos CD4, CD8 y CD3.

5. Rotular todos los tubos de plástico necesarios para el análisis; los Inmuno-trol y

todas las muestras.

6. Adicionar 20 µL del anticuerpo OptiClone Monoclonal Antibodies CD4-

FITC/CD8-PE/CD3-PC5 a cada tubo y 100 µL de cada muestra o Inmuno-trol,

mezclar. Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente y en la obscuridad;

regresar a refrigeración (2-8 °C) el tubo del Inmuno-trol y el frasco del anticuerpo.

Nota: Durante esta incubación se recomienda encender el equipo Q-Prep y realizar la purga

de los tres reactivos: A, B y C.

7. Registrar la hora de inicio en la bitácora de uso del equipo Q-Prep.

8. Preparar la muestra de acuerdo con el instructivo para el manejo del Q-Prep.

9. Registrar la hora de término en la bitácora de uso del equipo Q-Prep.

10. Encender el citómetro de flujo Beckman Coulter Epics XL-MCL y esperar a que se

optimice el sistema, esto puede tardar aproximadamente 30 minutos, registrar la

hora de inicio en la bitácora de uso del citómetro de flujo Beckman Coulter Epics

XL-MCL.

11. Una vez listo el citómetro, llevar a cabo el mantenimiento con el panel “Cleaning

Panel”, como lo indica el instructivo para el manejo del citómetro de flujo Marca

Beckman Coulter Epics XL-MCL.

12. Agitar de 4 a 5 veces por inversión el frasco del Flow Check y adicionar

aproximadamente 20 gotas a un tubo de plástico limpio y rotulado. Posteriormente,

realizar el Protocolo “Qxzy Flow Check, ajustando los voltajes si es necesario.

Nota: Se recomienda que los coeficientes de variación de los histogramas no sean mayores

a 2.

13. Imprimir los histogramas correspondientes al corrimiento del Flow Check.

14. Agitar vigorosamente en el vórtex las perlas FLOW-COUNT Fluorospheres y

adicionar 100 µL al tubo del Inmuno-trol (utilizar la misma pipeta con la que se



colocó la muestra); y correr el Panel Inmuno-trol, ajustando los valores de los

voltajes y compensación en caso de que sea necesario.

15. Guardar el archivo con las siglas CN y la hora del día, imprimir el archivo generado

y revisar que los valores y los porcentajes de las células CD4, CD8 y CD3 estén

dentro de los rangos estipulados de acuerdo con la técnica del lote del kit. En caso

de que no se cumplan estos valores, preparar de nuevo el Inmuno-trol, como se

indicó anteriormente.

Nota: Estos rangos de valores son específicos para cada lote de kit, por lo que deberán

cambiar cada que se trabaje con un lote nuevo del kit FLOW-COUNT Fluorospheres.

16. Adicionar 100 µL de las perlas FLOW-COUNT Fluorospheres a cada tubo de

muestra (utilizar la misma pipeta con la que se colocó la muestra) y correr el panel

de subpoblaciones, ajustando los valores de los voltajes y compensación en caso de

que sea necesario.

17. Guardar el archivo con el número de identificación de la muestra, así como la fecha

y hora del día en que se procesó.

Nota: Durante el análisis del Inmuno-trol y muestras se pueden realizar purgas al equipo si

así se requiere

18. Registrar la hora de término en la bitácora de uso del citómetro de flujo Beckman

Coulter Epics XL-MCL.

19. Registrar en la bitácora de resultados los valores obtenidos de CD4, CD8 y CD3.

20. Archivar las hojas impresas en la carpeta de Inmuno-trol y Flow-Check.

21. Realizar el cálculo de las relaciones CD4/CD8, CD4/CD3 y CD8/CD3.

22. Reportar los resultados en el sistema INFOLAB.

23. Imprimir la hoja de resultados del sistema.

24. Llenar el formato de entrega de resultados e imprimir dos copias.

25. Llevar al área de recepción de muestras los resultados y entregar la hoja generada

por el sistema INFOLAB y una copia del formato.

26. Solicitar la firma del personal de recepción de muestras en la otra copia del formato.

Método para la cuantificación de carga viral; cuantificación del ARN del Virus de la

Inmunodeficiencia Humana tipo 1 (VIH-1)

1. Realizar la recepción de la muestra de acuerdo con la ficha de proceso de carga viral

para personas infectadas con el VIH.

2. Centrifugar las muestras a 3,500 rpm durante 15 minutos de acuerdo con el

instructivo para el manejo de centrifuga refrigerada marca: HERMLE Z300K.



3. Rotular tubos de polipropileno de 2 mL con los números de identificación de cada

muestra.

4. Separar el plasma y colocarlo en los tubos de polipropileno de 2 mL, se deben hacer

alícuotas de 1,100 a 1,200 µL.

Nota: Si la muestra no se procesara en ese momento, se debe congelar a -70 °C hasta la

realización de la prueba.

5. Sanitizar el gabinete de bioseguridad de acuerdo con el instructivo para el manejo

del gabinete de bioseguridad.

6. Llevar a cabo el mantenimiento del equipo Cobas AmpliPrep de acuerdo con el

instructivo para el manejo del mismo.

7. Llevar a temperatura ambiente todas las muestras y reactivos necesarios para la

realización de la prueba, los cassettes contenidos en el kit Cobas/AmpliPrep/Cobas

TaqMan HIV-1 Test se deben introducir al equipo Cobas AmpliPrep para

atemperar.

8. Llenar el formato para la cuantificación de carga viral.

9. Utilizar guantes, para poner los clips de los controles y muestras en la gradilla para

muestras, cuidar que los códigos de barras de los clips queden del mismo lado del

código de barras de la gradilla.

10. La posición correcta de los clips es: Clip CN (azul), clip CPL (amarillo), clip CPH

(rojo) y clips de muestras (blancos).

11. Colocar la cantidad de tubos S necesarios para todas las muestras sobre la gradilla

de muestras.

12. Rotular los clips con el número de identificación de cada muestra.

13. Envasar en los tubos S un volumen de 1,100 µL de cada muestra.

Nota: Se debe homogeneizar perfectamente cada muestra con la ayuda de un agitador tipo

vórtex, ya cargadas las muestras, aflojar un poco las tapas de los tubos para que el equipo

pueda retirarlas bien tapas.

14. Cargar reactivos y consumibles de acuerdo al instructivo para el manejo del Cobas

AmpliPrep.

15. En la pestaña “Orders” realizar una orden de trabajo en la que registre la

identificación de cada muestra y control; seleccionar el protocolo HIMCAP48, al

finalizar dar click en la pestaña “Save”.

16. Colocar los tubos K junto a cada muestra y control en la gradilla de muestras.

17. Inspeccionar que asienten bien los clips de código de barras así como los tubos S y

los K.



18. Cargar la gradilla de muestras de acuerdo con el instructivo para el manejo del

Cobas AmpliPrep.

19. Leer los códigos de barras de la gradilla para K-carrier y del K-carrier en un

intervalo menor a 5 segundos.

20. Inserte la gradilla del K-carrier de acuerdo con el instructivo para el manejo del

Cobas AmpliPrep.

21. Finalmente inspeccione por última vez el estado del sistema.

22. Presione Start

Nota: Se debe tomar en cuenta la hora de finalización del proceso en el equipo Cobas

AmpliPrep.

23. Encender el equipo Cobas TaqMan 48 de acuerdo con el instructivo para el manejo

del mismo.

24. Remover el K-carrier preparado por el equipo Cobas AmpliPrep con ayuda del

trasportador de K-carrier e introducirlo al equipo Cobas taqman48, este paso se

debe hacer antes de las 2 horas próximas de haber terminado la extracción.

25. En la pantalla de la computadora, seleccionar la pestaña del equipo Cobas TaqMan

48 y dar click en “Start”.

26. Retirar los cassettes de reactivos del Cobas AmpliPrep y almacenar de 4-8 °C.

27. Encender la luz ultravioleta “UV” de acuerdo al instructivo para el manejo del

Cobas AmpliPrep, elimine los desechos en la bolsa roja de recolección de RPBI y

apagué el equipo.

28. Al finalizar la amplificación y detección, sacar el K-carrier de equipo Cobas

TaqMan 48, desechar los tubos en la bolsa roja y anotar la hora de término en la

bitácora de uso del equipo Cobas AmpliPrep y Cobas TaqMan 48.

29. Aceptar e imprimir los resultados del software Amplilink.

30. Registrar en la Bitácora de Resultados de Carga Viral, los resultados obtenidos.

31. Reportar los resultados en el sistema INFOLAB.

32. Imprimir el informe de resultados del sistema.

33. Llenar el formato de entrega de resultados e imprimir dos copias.

34. Llevar al área de recepción de muestras los resultados y entregar la hoja generada

del sistema INFOLAB, una copia del formato Entrega de resultados y la historia

clínica del paciente.

35. Solicitar la firma del personal de Recepción de muestras en la otra copia del formato

Entrega de resultados y archivarla.



Anexo II: CARACTERÍSTICAS DE EQUIPOS COMERCIALES

Los miembros de la RNLSP deberán utilizar solo los reactivos que ha sido evaluados y

aprobados por el Laboratorio de Carga Viral del InDRE mismos que se informan de manera

anual a los representantes de cada uno de los laboratorios de la red, que acuden a las

reuniones regionales y nacionales.

Anexo III: PREPARACIÓN DE REACTIVOS

Los reactivos que se utilizan en las determinaciones de carga viral y subpoblaciones de

linfocitos CD4, CD8 y CD3 son comerciales y se reciben listos para su utilización.

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lineamientos de laboratorio para la vigilancia ... · DETERMINACIÓN POR LABORATORIO DE LA CARGA VIRAL Y DE SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS CD4, CD8 Y CD3 ... la carga viral y el recuento