Linee guida per la validazione dei metodi analitici e per il calcolodellincertezza di misuraI. ScaroniEccellenza Microinquinanti OrganiciARPA Emilia-Romagna - Sezione di RavennaGruppo di lavoro chimici Multisito ARPA Emilia-RomagnaA.A. Alimenti: C. Bergamini, E. Errani (sez. BO);M. Ferrari (sez. RA); A. Incerti (sez. RE). A.A. Ambientale: R. Messori (sez. RE); D. Ferri (sez. BO); L. Billi (sez. RA). Eccellenze: I. Scaroni (sez. RA); M. Morelli, P. Carioli (sez. FE); S. Forti, G. Piccinini (sez. MO); G. Pecchini (sez. RE).I50451/LM Validazione e calcolo dellincertezza di misura dei metodi di prova chimiciQualit del dato analiticoValidit dei risultati Confrontabilit dei laboratori Tracciabilit dei risultatiRiferibilit delle misureRiferibilit propriet del risultato di una misura che attesta una relazione con riferimenti stabiliti, generalmente campioni nazionali o internazionali, attraverso una catena ininterrotta di confronti, ognuno dei quali presenta unincertezza definitaValidazione conferma sostenuta da evidenze oggettive, che i requisiti relativi ad una specifica utilizzazione o applicazione prevista, sono stati soddisfattiIl percorso di validazioneP50431/LM Progettazione dei Metodi di provaP50451/LM Validazione e Approvazione dei Metodi di provaI50451/LM Validazione e calcolo dellincertezza di misura dei metodi di prova chimiciP40302/LM Preparazione ed emissione dei Metodi di provaPARAMETRI TECNICI E/O STATISTICI DA CONSIDERARE NELLA VALIDAZIONE DEI METODISelettivitLimite di rivelabilitLimite di quantificazioneCampo di applicazioneIntervallo di linearitPrecisioneLimite di ripetibilit EsattezzaAccuratezzaSensibilitRobustezzaRecuperoIncertezza di misuraLoperatore sceglie e valuta quellisignificativiper il metodoBISOGNA VALUTARLITUTTI ?NOQUALI PARAMETRI TECNICI E/O STATISTICI POSSO TRASCURARE NELLA VALIDAZIONE DEI METODI?a) Diluizione campione e analisi: (metalli nelle acque e nei vini, anioni nelle acque, acidit di un olio) recupero da trascurare;b) Propriet intrinseche della matrice: (umidit nelle farine, proteine nella carne, lipidi nella pasta) LDR, LOQ non sono importanti;c) Analisi gravimetriche e titolazioni: sensibilit e intervallo dilinearit sono da trascurare;d) Metodi normalizzati: selettivit e robustezza non necessariovalutarle.Metodicontenuti in pubblicazioni governative (EPA, FDA, Reg. CEE ..)forniti da enti di normazione (ISO, ASTM, UNICHIM, .) dati da organismi di competenza (ISS, ICRAM, APAT, IRSA-CNR, )contenuti in libri editi da organismi professionali (AOAC, RSC, ..)forniti da organizzazioni di categoria (oli e grassi, vini, ..)pubblicati nella letteratura scientifica (J. Chrom. , The Analyst, .)interni sviluppati dal laboratorio per proprie esigenzecon dati di precisioneNormalizzatisenza dati di precisioneNormalizzati modificatiSperimentati e valutati anche da altri laboratori(organizzazioni di categoria, pubblicazioni,)Interni sviluppati dal laboratorio per proprie esigenzeMetodiMetodi normalizzatiCon dati di precisione Senza dati di precisioneA Sr/r BRiportati nel metodo:SelettivitCampo di applicazionePrecisione Limite di ripetibilitEsattezzaAccuratezzaRobustezzaRecuperoIncertezzaDa verificare:Limite di rivelabilitLimite di quantificazioneIntervallo di linearitSensibilitRiportati nel metodo:SelettivitCampo di applicazioneRobustezzaDa verificare:Limite di rivelabilitLimite di quantificazioneIntervallo di linearitSensibilitDa valutare:PrecisioneLimite di ripetibilitEsattezzaAccuratezzaRecuperoIncertezzaRIFERIMENTIManuali ARPA Accreditamento e Certificazione: Linee guida per la validazione dei metodi analitici e per il calcolo dellincertezza di misura Ed. settembre 2003Norma UNI CEI ENV 13005:2000 Guida allespressione dellincertezza di misuraQuantifying uncertainty in analytical measurement Eurachem, second Edition 2000.Documento SINAL DT-0002 Rev.1 Febbraio 2000 Guida per la valutazione e lespressione dellincertezza di misuraDocumento SINAL DT-0002/3 Rev.0 Aprile 2000 Avvertenze per la valutazione dellincertezza nel campo dellanalisi chimicaDocumento SINAL DT-0002/4 Rev.0 Aprile 2000 Esempi applicativi di valutazione dellincertezza nelle misurazioni chimicaThe fitness of purpose of analytical methods A laboratory guide to method validation and related topics Eurachem 1998.Manuale UNICHIM 179/0 Linee guida per la validazione di metodi analitici nei laboratori chimici Edizione 1999Manuale UNICHIM 179/1 Valutazione della precisione (ripetibilit stretta ) di un metodo analitico eseguito in un unico laboratorio da un solo operatore su di un unico strumento in un breve intervallo di tempo Edizione 2001Manuale UNICHIM 179/2 Valutazione della precisione (ripetibilit) di un metodo analitico eseguito in un unico laboratorio con pi operatori/strumenti Edizione 1995M. Thompson and P. Lowthian The Horwitz Function revisited J .A.O.A.C. 80 (1997) 676-679M. Thompson Recent trends in inter-laboratory precision at ppb and sub-ppb concentrations in relation to fitness for purpose criteria in proficiency testing Analyst 125(2000) 385-387.AOAC/FAO/IAEA/IUPAC - Guidelines for single laboratory validation of Analytical Methods for trace level concentrations of organic chemicals Rapporti Istisan 97/23 Metodi multiresiduo per lanalisi di residui di antiparassaitari in prodotti vegetaliDocument Sanco/3103/2000: Quality control procedures for pesticide residues analisys. Guidelines for residues monitoring in the European Union second editino, 1999/2000SELETTIVITALa selettivit un parametro che non pu essere stimato numericamente, mavienevalutatosullabasedellaprobabilitcheilrisultatodellaprova possasubireinterferenzedidiversaorigine;bisognastabilirecheil segnaleprodottonellafasedimisurasiaattribuibileinmanieraunivoca allanalita di interesse. Enecessarioindicarequaliaccorgimentivengonopresiperevitarefalsi positiviofalsinegativi.Taliaccorgimentidevonoesseredescrittinei metodi di prova o nelle istruzioni di dettaglio ad essi allegate.Incromatografia permigliorarelaselettivitsipuutilizzareunafase stazionariaadiversapolaritocambiareilsistemadirivelazioneoppure accoppiare il sistema con uno spettrometro di massa.Imetodicheprevedonotecnichebidimensionali(colonnediversee/o detectordiversi),GC/MS,LC/MS,ICP/MS,MSn hanno unaelevata selettivit.LIMITE DI RIVELABILITAMinima concentraziome di analita rilevabile con ragionevole affidabilitB BS C LDR 3 + =bSLDRX Y /3=Stabilire la soglia al di sotto della quale vi la possibilit di falsi negativi non superiore ad un valore prefissato (10%)Valutazione delle caratteristiche metrologiche Pu 312345B BS C LDQ 10 + =bSLDQX Y /10=LDR LDQ = 3Fissare a priori un valore di precisione target da non superare1234LIMITE DI QUANTIFICAZIONEConcentrazione minima che pu essere determinata con un accettabile livello di precisionePRECISIONERipetibilit stretta: applicabile alle prove effettuate con lo stesso metodo su uno stesso materiale, nello stesso laboratorio, dallo stesso operatore, utilizzando la stessa apparecchiatura, in intervallo di tempo breve.Ripetibilit intermedia: stesso metodo e stesso laboratorio ma operatori e/o strumenti e/o condizioni ambientali diverse ed esecuzione inintervallo di tempo esteso.Riproducibilit: stesso metodo ma laboratori, operatori, strumenti, condizioni ambientali diverse.a) Ripetibilit stretta ad 1 livello di concentrazioneb) Ripetibilit stretta a pi livelli di concentrazionec) Ripetibilit intermedia ad 1 livello di concentrazioneI50451/LMPRECISIONE E RECUPERORipetibilit stretta ad 1 livello di concentrazione1 operatore e 10 repliche ad 1 livello di concentrazioneDati sperimentali (Xi)Trattamento statisticoTest di normalit di Shapiro-WilksTest di anomalia di Dixon e GrubbsRisultatiMedia, varianza, scarto tipo di ripetibilit, ripetibilit, coefficiente di variazione,intervallo di confidenzaPRECISIONE E RECUPERORipetibilit stretta ad 1 livello di concentrazioneScarto tipo di ripetibilit o deviazione standard( )112= =nX XSniiScarto tipo di ripetibilit del valore medio ( )( )nSn nX Xx Snii= ==112Coefficiente di variazione percentuale:XSDSR CV100100 %= =Recupero e recupero percentualeVNXRii =VNXRii100%=Limite di ripetibilit r2 = S t rPRECISIONE E RECUPERORipetibilit stretta a pi livelli di concentrazione1 operatore e 6 repliche per ogni livello di concentrazioneDati sperimentali (Xi)Trattamento statistico per ogni livello di conc.Test di normalit di Shapiro-WilksTest di anomalia di Dixon e GrubbsRisultatiper ogni livello di conc.Media, varianza, scarto tipo di ripetibilit, ripetibilit, coefficiente di variazione,intervallo di confidenzaPRECISIONE E RECUPERORipetibilit stretta a pi livelli di concentrazione1) se lo scarto tipo di ripetibilit si mantiene statisticamente costante in tutto lintervallo esaminato, si calcola la media quadratica pesata degli scarti tipo ottenuti, che sar assunta come parametro caratteristico del metodo;2) se lo scarto tipo di ripetibilit varia in tutto lintervallo considerato si prendono in esame i tre modelli di relazione funzionale che possono descrivere landamento dello scarto tipo di ripetibilit in funzione del livello di concentrazione: retta passante per lorigine; retta con intercetta diversa da 0; curva logaritmica.Uno di questi modelli consente di interpretare i dati sperimentali ottenuti.Si sceglie il modello di relazione funzionale che meglio approssima i punti sperimentali con la minima varianza dei residui.tqii irSS==122X b Si =X b a Si + =X d c Silog + =PRECISIONE E RECUPERORipetibilit intermedia ad 1 livello di concentrazione2 operatori, 6 repliche ciascuno ad 1 livello di concentrazioneDati sperimentali (Xi)Trattamento statisticoTest di normalit di Shapiro-WilksTest di anomalia di Dixon e GrubbsTest di Cochran e varianza minimaAnalisi della varianza a un fattore (ANOVA)Test di uguaglianza delle medie di ScheffRisultatiMedia, varianza, scarto tipo di ripetibilit, ripetibilit, coefficiente di variazione,intervallo di confidenzaESATTEZZAMisura quanto vicino al valore vero si posiziona la media di una serie di misure ,22pVNcalctunSx VNt += ,2212pNNcalctnsnsx xt +=A sN/r BA s/r BFsperimentale = sN2/ s2 Ftabulato( ) ,221222pNLNcalctnsnsSx xt + + =1) con CRM 2) Confronto con metodo normalizzato3) Confronto con altro laboratorioVerificare primaSENSIBILITA2)(2/= ny ySi ix y22/) ( =x x nxS Siix y a2/) (=x xSSix yba t x Sab t x SbScarto tipo retta di regressionet di student al 95% e per n-2 gdL, done n il numero di punti della rettaVerifiche linearitCoeff. correlazione > 0.97b Sensibilit =INTERVALLO DI LINEARITAROBUSTEZZALa robustezza la capacit del metodo di non essere significativamente influenzato da possibili variazioni deliberate introdotte in almeno una delle sue fasi di realizzazione. La valutazione della robustezza deve partire da un esame complessivo del metodo che deve portare alla eventuale individuazione delle fasi o dei parametri la cui variazione possa ragionevolmente incidere sul risultato finale. La valutazione della robustezza avviene attraverso deliberate variazioni al metodo che possono effettivamente avvenire, anche se con probabilit ridotta, durante la esecuzione routinaria del metodo di prova.Le variazioni devono riguardare quelle variabili che, dallesame dei singoli stadi della procedura analitica, sono ritenute pi significative. La verifica deve avvenire almeno per 2 livelli diversi dei parametri critici individuati. Per limitare il numero delle prove da eseguire possibile ricorrere alle tecniche di analisi statistiche relative a sperimentazioni fattoriali frazionate.Nel caso che si individuino 3 parametri critici di robustezza sufficiente eseguire 4 prove su una matrice certificata o comunque a concentrazione nota. Le variazioni dei parametri da apportare al metodo per eseguire le 4 prove sono riportate nella tabella sottostante:Parametri criticiProva n A B C1 - - -2 + - +3 - + +4 + + -Nella tabella il segno + indica un incremento del parametro rispetto al valore ottimale mentre il segno ne indica un decremento.Il metodo si pu definire robusto se i risultati ottenuti con i parametri variati sono congruenti con i parametri ottenuti dalle prove di validazione.La ripetibilit ottenuta in queste condizioni deve essere confrontata con quella ottenuta in fase di validazione attraverso il test F di Fisher. Se il risultato positivo il metodo si pu definire robustoa) analisi del bianco reagentib) analisi di un campione biancoc) analisi di soluzioni standard a concentrazione notad) Rette di taratura 22 2 2+ + rip TAR RIFS S SXt Xif) analisi di campioni/soluzioni fortificate.La verifica del recupero ha esito positivo se si ha la seguente condizione:( ) ( )2 22RRiS S R Ri + g) analisi di un campione in doppio. La prova in doppio pu essere condotta sia da operatori diversi che dallo stesso operatore, in funzione delle condizioni in cui si sono eseguite le prove di validazione (ripetibilit stretta o intermedia). r x x 2 1CONTROLLO QUALITAe) analisi su matrici di riferimento certificateh) utilizzo di carte di controlloi) Test interlaboratorio (Collaborative trial o Proficiency test)RIVALIDAZIONELa rivalidazione di un metodo un procedimento che deve essere attuato ogni qualvolta vengano apportate significative variazioni del metodo.MODIFICHE PARAMETRIOperatore diverso Qualifica operatore e verifica della ripetibilitVariazioni di prodotti per le provePrecisione e esattezzaModifica alle apparecchiature di misuraCurva di taratura, LOD e LOQModifica al metodo (es. matrice, campo di applicabilit, solvente, etc)Precisione, esattezza, curva di taratura, LOD e LOQCalcolo dellincertezzaLa precisione statisticamente significativa quando le prove ripetutevengono eseguite in condizioni indipendenti.Il laboratorio dovrebbe nellesecuzione delle prove fare variare tutte le condizioni: operatore, apparecchiatura, prodotti per le prove, vetreria, etc.In questo modo gli scarti sistematici dovuti a questi contributi divente-rebbero casuali e la precisione tenderebbe al valore dellincertezza tipo composta. Purtroppo queste condizioni non sono di facile attuazione nel laboratorio quindi il calcolo della ucdeve essere fatto in modo diverso attraverso 3 approcci: Horwitz Olistico o decostruttivo o top-down Metrologico o bottom-upCalcolo dellincertezza secondo HorwitzSi basa su una relazione empirica ottenuta da un numero elevato di misure ricavate da esercizi di intercalibrazione svolti negli ultimi anni.xCR22 . 0 = ) log 5 . 0 1 (2 %CCV=100%Cx CVR = 2 * ) ( cR Eu U =Approccio olistico1. Metodo normalizzato: Occorre verificare che le prestazioni operative del laboratorio siano congruenti a quelle descritte nelmetodo:A Slab/Sr B Slab scarto tipo di ripetibilit del laboratorioSr scarto tipo di ripetibilit del metodo normalizzatoA questo punto si fa proprio lo Scarto tipo di riproducibilit del metodo2. Partecipare ad un collaborative trial: tutti i laboratori impegano lo stesso metodo, sulla stessa matrice, per lo stesso parametroper il quale si vuole calcolare lincertezza. Dal risulatato della elaborazione fatta dallente si ottiene lo Scarto tipo di riproducibilit a cui corrisponde lincertezza composta.Approccio olistico4. Avere i risultati di un collaborative trial : pur non avendo partecipato allesercizio, il laboratorio pu utilizzare lo Scarto tipo di riproducibilitprevia verifica della sua ripetibilit con quella riportata dal collaborativetrial.3. Partecipare ad un proficiency test: i laboratori impegano il metodo normalmente in uso. Dai risultati dellesercizio, dopo estrapolazione dei dati ottenuti con il metodo per il quale si vuole valutare lincertezza, si calcola lo Scarto tipo di riproducibilit e da questo lincertezza estesa.A Slab/Sr B Determinazione di Idrocarburi PolicicliciAromatici in oli vegetali mediante gascromatografia / spettrometria di massaPesataCampioneAggiunta di standard internoEstrazione liquido-liquidoPurificazioneAnalisi GC/MSDiagramma Causa-EffettoSTD tarSTD intVol nom. matraccioVariabilit ConcVol di PrelievoVol nom. matraccioVariabilit ConcVol di PrelievoPesataTaratura StrumentaleArea CampioneArea std internoRecupero Vol FinaleTARATURASTRUMENTALERetta di taraturaVOLUME FINALETaratura PipettaPESATAPeso campionePeso taragmlSTDSTD STDtarSTDtar STDCampioneSTDSTD Campioneg ngPVC AC AAC AQ =intintintint/*IPA in oli vegetaliRelazione funzionaleTaraturaTaraturaRIPETIBILITAFonti di incertezza Incertezza di ripetibilit espressa come precisione del metodo (Contributo di Categoria A) Incertezza di taratura strumentale (Contr. Cat B) Incertezza di pesata (Contr. Cat B) Incertezza del volume finale (Contr. Cat B) Incertezza di preparazione standard interno (Contr. Cat B) Incertezza della soluzione di taratura (Contr. Cat B)INCERTEZZA COMPOSTA2 2int2 2 2 2STDtar STD vol pesata tarstrum rip Cu u u u u u u& & & & & & &+ + + + + =Incertezza di ripetibilit2 operatori, 6 repliche ciascuno su olio di sansa addizionato ad 1 livello di concentrazioneDati sperimentali (Xi)Trattamento statisticoTest di normalit di Shapiro-WilksTest di anomalia di Dixon e GrubbsTest di Cochran e varianza minimaAnalisi della varianza a un fattore (ANOVA)Test di uguaglianza delle medie di ScheffRisultatiMedia, varianza, scarto tipo di ripetibilit, ripetibilit, coefficiente di variazione,intervallo di confidenzaIncertezza di ripetibilit( )112= =nX XSniiripScarto tipo di ripetibilit:NSu rip =Incertezza tipo di ripetibilit:Xuuriprip =&Incertezza relativa di ripetibilit:Lincertezza relativa di ripetibilit viene corretta moltiplicando per la radice di n, per tenere conto che la misura del campione incognito viene eseguita una sola volta, mentre in sede di validazione sono state eseguite n prove Retta di taratura: 5livelli ( l ) di concentrazione (C) : concentrazione media 3 analisi ripetute per ogni livello di concentrazione : valore medio della risposta dello strumento per ogni livello di concentrazione : retta di regressione lineare : residui : scarto tipo dei residui Prove di ripetibilit: n prove replicate m volte, n valori di YCn scarti tipo della regressione:Incertezza di taratura strumentale (I)) (CCYbC a yC+ =C CY Y2)(2/= lY YSC CC Y+ +=2 2) ( C C b l m bStar 2/) (1 1Y YSCC YIncertezza di taratura strumentale (II)nnSutartar1*2=Incertezza tipo di taratura :Xuutartar =&Incertezza relativa di taratura:Lincertezza relativa di taratura viene corretta moltiplicando per la radice di n, per tenere conto che la misura del campione incognito viene eseguita una sola volta, mentre in sede di validazione sono state eseguite n proveIncertezza di pesataIncertezza composta della bilancia: 2_ Bilancia eBilanciaUu =PesouuBilanciaPesata =&Incertezza relativa della pesata: Tenendo conto della tara lincertezza relativa della pesata :2 u upesata& &=3auvetreria =Volumeuuvetreriavetreria =&Incertezza di volumeIncertezza relativa del volume: a = tolleranza del costruttoreIncertezza del volume: Incertezza di preparazione standard di taraturaIncertezza CRM100 g/ml 0.5 g/ml Soluzione di taratura si prepara diluendo 100 L di CRM in matraccio da 50 mL per ottenere una soluzione a 200 ng/mLvolume var iabilit da specif ica for nit or e (ml) cat . Bincer t ezza (ml) cat . Bincer t ezza r elat iva50 0,05 0,0289 0,000580,1 0,001 0,0006 0,005770025 . 010025 . 0= =stdu&Contributi allincertezza composta relativaIPA in oli vegetaliu pesatau misure di volumeu standard internou standard taraturau ripetibilitu taratura strumentaleu composta0,120 0,02 0,04 0,06 0,08 0,100,12Confronto tra approccio Metrologico, di Horwitz e Olistico per IPA in oli vegetaliApproccio metrologico benzo(a)antracene = 2.50 g/kg 0.50 g/kg Approccio metrologico indeno(123cd) pirene = 2.50 g/kg 0.76 g/kg Approccio Horwitz = 2.50 g/kg 1.10 g/kg Approccio olistico* 2003 benzo(a)antracene = 2.50 g/kg 0.31 g/kg Approccio olistico* 2004 benzo(a)antracene = 2.50 g/kg 0.25 g/kg Approccio olistico* 2004 indeno(123cd) pirene = 2.50 g/kg 0.30 g/kg Approccio MetrologicoContri butial l 'i ncertezza composta rel ati va PCB terreni , fanghie sedi menti0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12u pesatau misure divolumeu standardu taraturastrumentaleu ripetibilitu compostarelativaConfronto tra approccio Metrologico, di Horwitz e Olistico per PCB nei terreni, fanghi e sedimentiApproccio metrologico PCB 153 = 42.0 g/kg 5.4 g/kg Approccio Horwitz = 42.0 g/kg 18.5 g/kg Approccio olistico* 2004 PCB 153 = 42.0 g/kg 10.5 g/kg QualityConsult 2004Confronto tra approccio di Horwitz e Olistico per IPA in materiale di discaricaProgetto Europeo COEPTMetodo: in uso nei laboratori partecipantiBenzo(a)pireneApproccio Horwitz = 13.3 mg/kg 2.9 mg/kg Approccio olistico* 2004 = 13.3 mg/kg 2.3 mg/kg Confronto tra approccio di Horwitz e Olistico per Diossine in fango di depurazioneUNICHIM Metodo: pretrattamento acido secondo EPA 8290Approccio Horwitz = 0.23 ng/g 0.10 ng/g Approccio olistico = 0.23 ng/g 0.16 ng/g 23478 PeCDF