Linfos B

linfocitos B

INMUNOLOGIA BASICADra. Esthela Loyo de López

!

Sociedad de Lupus, Reumatología y Autoinmunidad en República Dominicana, Inc.

Friday, September 17, 2010

• El proceso mediante el cual progenitores linfoides de MO se convierten en linfocitos maduros que irán a poblar tejidos linfoides periféricos se conoce como maduración linfocitaria.

• La colección de receptores para Ag’s, es decir especificidades, expresadas en linfocitos B y T se denomina repertorio linfocitario.

• Durante su maduración, el programa de expresión secuencial de genes conduce a proliferación de células en desarrollo, generación del repertorio, cambios en fenotipos celulares, adquisición de competencia funcional y selección de eventos para asegurar que la mayoría de linfocitos que penetran tejidos periféricos son útiles, y que responderán a Ag extraños pero no a muchos Ag propios.

• La expresión de genes para los receptores antigénicos es la característica central de maduración; hay gran similitud en los procesos entre B y T, donde B adquiere la capacidad de expresar genes de inmunoglobulinas (Ig) para el receptor de B (BCR) y T la capacidad de expresar genes para el receptor de T (TCR).


generación y maduración de linfos B [2008]

La generación de B maduras principia en el embrión y

prosigue toda la vida

Saco vitelino, hígado y MO fetal; MO adulto

Cada día produce 1 billón de linfos B, durante toda la vida


generación y maduración de linfos B [2008]

La generación de B maduras principia en el embrión y

prosigue toda la vida

Saco vitelino, hígado y MO fetal; MO adulto

Cada día produce 1 billón de linfos B, durante toda la vida


1) DNA DE CELULAS EMBRIONARIAS Y DE CELULAS ADULTAS DE MIELOMA, DIGERIDAS CON ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

2) SEPARACION DE FRAGMENTOS Y ANALISIS DE SU CAPACIDAD DE HIBRIDIZAR CON CADENA KAPPA DE mRNA MARCADA

3) DOS FRAGMENTOS DEL DNA EMBRIONARIO PERO SOLO UNO DE CELULAS ADULTAS HIBRIDIZARON

TEORIA: DURANTE DIFERENCIACION DE LINFOS B, GENES V – C EXPERIMENTAN REORDENACION

COMPROBACION DEL MODELO DE DOS GENESS. TONEGAWA; N. HOZUMIProc. Natl. Acad. Sci, USA 1976, 73:3628


médula ósea tejido linfoide periférico


La maduración de linfocitos B y T consiste de estadios secuenciales en maduración de genes tempranos que tienen que ver con selección de linajes y su proliferación, expresión de genes para receptores antigénicos y selección de repertorios maduros.

Exones múltiples codifican porciones de una sola cadena H o L de Ig.Sufren reordenación a genes funcionales, antes de ser transcritos y expresados.

Durante generación, ciertos exones se escogen al azar mediante sistema genético dinámico capaz de generar más de10'°combinaciones.


SCF = stem cell factor, división y proliferación a pre-B; expresión de IL-7R

La maduración temprana de B y T se caracteriza por elevada actividad mitótica, estimulada por interleucina 7 (IL-7).Mutaciones en la cadena de IL-7R, cadena γ común a varios receptores origina severa inmunodeficiencia, inmunodeficiencia combinada severa ligada al cromosoma X (X-linked severe combined immunodeficiency disease [X-SCID]).


linfocito B: BCR asociado al

heterodímero alfa:betaBCR:exones de cadena pesada se

hallan en cromosoma 14

Cada linfo B tiene 2 cromosomas 14, pero elabora un solo tipo de BCR, por tanto

hay que “silenciar” los segmentos de un cromosoma


genes V,D,J,C para cadena pesadamúltiples copias de genes con ligeras variantes, alineados en cromosoma 14

genes V,J,C para cadena ligeracromosoma 2 (k), cromosoma 22 (l)


Recombinación de cadena pesada

Dos uniones DNA para generar un gene funcional de CP:Dh a Jh y Vh a DhJh.

Vh21, Dh7 y Jh3

+/- 100 +/- 4 +/- 6 +/- 10


Cadena asociada a CL substituta (Vpre-B + lambda 5), asociadas a heterodímero Ig-alfa/Ig-beta


Reordenación de cadena ligera en cromosoma 2 (k)


Cada segmento de gene V es precedido en la terminal 5ʼ de un exón que codifica a un péptido líder (L), el cual guía la cadena pesada o ligera a través del retículo endoplásmico.

Cada linfo B maduro produce una sola clase de BCR o de Ac.La estrategia de “corte y pega” favorece diversidad de BCR y reconocimiento de cualquier molécula orgánica posible


Al madurar, tendrá una secuencia funcional V de cadena pesada y ligera.Cada clona comprometida a un epitope específico.


En órganos linfoides periféricos: reordenación de exones para nuevas secuencias funcionales de regiones constantes = cambio de isotipo

y por ende de funciones efectoras biológicas sin cambiar la especificidad Ag original


reordenación somática de segmentos germinales para generar un gen funcional

DNA germinal

gen funcional


mIg = BCR, sIg = Ac ‘s no hay TCR soluble


linfocito T: TCR asociado al complejo CD3


receptor de un linfocito B,selección clonal


exclusión de alelos

• Se expresan los genes de CP y CL de un solo cromosoma heredado, por célula

• Seguridad de una clona B específica para un epitope determinado


Se permite progresión si la reordenación es “productiva”: 1 de cada 3 pro-B a pre-BCuando pre-B exhibe receptor, experimenta múltiples divisiones: 32 a 64 descendientes

Cada progenie puede reordenar de nuevo diferentes exones de cadena ligera: mayor diversidad de Ac


Diversidad del repertorio:recombinación somática,adición de nucleótidos,

otros



tolerancia de B

SELECCION NEGATIVA90% de linfos B producidos cada día

sufren apoptosis

SUPRESION CLONALeliminación de B inmaduras que expresen auto-Ac, vg contra Ag

propios expresados en MO


dinámica propuesta de poblaciones B convencionales

médula ósea

repertorio abierto de B inmadurasinducción de tolerancia

órganos linfoides periféricos, sangre

inducción de tolerancia adicional, B inmaduras auto-tolerantes, B anérgicas

falla de B para penetrar folículos linfoides

vida media de aprox 3 días linfos B

penetración exitosa a folículos linfoides

vida media prolongada de B naîves maduras recirculantes (3-8 semanas vida promedio)

estimulación por Ag’s

B de memoria, recirculantes, muy larga vida, alta afinidad IgG, IgA o IgE

10 a 20 x 106


activación y proliferación de linfocitos B

activación, proliferación y diferenciación ocuren en órganos linfoides periféricos, requieren presencia de Ag

generación y maduración ocurren en médula ósea, independiente de Ag


RESPUESTA HUMORALAnticuerpos secretados por

células plasmáticas

Th activan B, controlan cambio de isotipo e inician

hipermutación somática


activación de B según naturaleza del Ag

Ag-TD: dependiente de colaboración Th

Ag-TI: independiente de colaboración Th


(1) señal de competencia, fase G0 a G1 temprana(2) señal de progresión, G1 a S, G2 y mitosis

TIMO - DEPENDIENTES* contacto directo con Th* activación específica de B por T sensibilizadas al mismo Ag depende de presentación adecuada de péptidos en contexto CMH Clase II

TIMO - INDEPENDIENTESTIPO 1: componentes de pared bacteriana; mitógenos* verdaderamente independientes* activadores policlonales de B* activan B maduros e inmaduros* LPG de Gram (-)

TIPO 1I: moléculas muy repetitivas

Respuesta Humoral para Ag-TI es muy diferente: débil, no hay memoria, predominan respuestas tipo IgM

HLA-CII:TCRB7:CD28CD40:CD40L


¿Cómo funciona BCR?

BCR completo:mIg reconoce el epitope o determinante antigénico

heterodímero transduce

ITAMs = immune tyrosine activation motifs


CD19,CD21,CD81prevención de autoinmunidad

La decisión de si un invasor es o no es peligroso la realiza el sistema innato.

BCR y co-receptor* disminuye hasta 100 veces la necesidad de “clustering” de BCR

* vuelve a B muy sensibles vg Ag reconocidos por SI como peligrosos



PAPEL DE Th EN RESPUESTA HUMORAL

CD40:CD40L*CD40L pertenece a familia de receptores de TNF [TNFR]*CD40 pertenece a familia de TNF y de citoquinas solubles que programan proliferación y apoptosis

* activación de vías tirosin-kinasas [Lyn, Syk, fosfolipasa C, factores de transcripción]

conjugado T:Breorganización de Golgi, liberación de citoquinas,

regulación de CD40L en T

HLA-CII:TCRB7:CD28

CD40:CD40L


la respuesta humoral

¿es respuesta primaria?¿es respuesta secundaria?

* naturaleza del Ag* ruta administración* presencia o ausencia de adyuvantes* especie a inmunizar

PRIMARIAlag más corto, más rápida e intensa,más prolongada


QUIMERAS

Clona de DNA recombinante que contiene secuencias promotoras, líderes y de regiones variables murinas, y exones de regiones constantes humanas.

RituximabInfliximab

APLICACIONES


Rituximab, Ac monoclonal quimérico (humano-murino) anti-CD20Linfoma de células BArtritis Reumatoide¿LES, vasculitis?

Herceptin, anti-HER2

Gleevec (imatinib)*Linfoma no Hodgkin*Ca de mama:anti-HER2*Leucemia mielógena crónica (LMC)*¿Esclerodermia?


Heteroconjugados o Ac biespecíficos:

híbridos de 2 moléculas diferentes de Ac.


Bibliotecas de genes que codifican fragmentos Fab. El mRNA aislado para CP y CL se amplía gracias a PCR (polymerase chain reaction) y se clona en vectores.

Combinaciones al azar de genes CP y CL generan constructos CP-CL de antigenicidad específica diferente.

Science 1989, 246:1275


Aún más lejos…

Células embrionarias reciben miniloci de genes humanos, se derivan líneas de ratones transgénicos que producen Ac Ag-específicos humanos.

N. Lonberg et al. Nature 1994, 368:856

murinoknockoutsingénicocongénicotransgénico


Derivado de linfocitos B

Linfoma de Burkitt t(8;14) (q24.1;q32.3) más común c-myc, IgH

Leucemia Linfoblástica Aguda (pre-B ALL) t(12;21) (p13;q22) (25% en infancia) TEL1, AML1

Pre-B ALL; también Leucemia Mielógena Crónica)

t(9;22) (q34;q11.2) (25% ALL del adulto, 3% de ALL infantil) bcr, abl (cromosoma Filadelfia)

Linfoma Folicular t(14;18) (q32.3;q21.3) bcl-2, IgH

Linfoma Difuso células B, células grandes t(3;14) (q27;q32.3) bcl-6 (DNA-binding protein), IgH

Linfoma Manto t(11;14) (q13;q32.3) cyclin D1, IgH

Derivado de linfocitos T

Leucemia Linfoblástica Aguda Pre-T t(1;14) (p32;q11.2) (5% de casos); del(1p32) (20% de casos) TAL1, TCRα; TAL1, SCL

Linfoma de células T, anaplásico de células grandes t(2;5) (p23;q35) ALK (tyrosine kinase), NPM (función

desconocida)

Tipo de tumor Translocación cromosomas Genes involucrados en translocación


próxima clase:

• Linfocitos T


TCD4, subpoblaciones y área de influencia


RESUMEN• Linfocitos B y T provienen de un precursor común en MO, comprometido

desde estadios tempranos al linaje linfoide. La maduración de B continúa en MO, mientras que progenitores tempranos de T migran y completan maduración en timo. La maduración temprana se caracteriza por proliferación celular inducida por citoquinas, en particular IL-7, que incrementa muchísimo el número de linfocitos inmaduros.

• Maduración de B y T implica recombinación somática de segmentos genéticos para receptores de Ag’s y expresión de moléculas de Ig en precursores de B y moléculas para TCR en precursores de T.

• La expresión de Receptores de Ag’s es crucial para la supervivencia y maduración de linfocitos en desarrollo y para los procesos de selección que conducen a repertorios diversos con especificidades antigénicas útiles muy variadas.

• Los receptores para B y T son codificados por genes derivados de la recombinación somática de un limitado número de segmentos genéticos que se hallan segregados espacialmente en loci del DNA germinal.


• Hay loci separados que codifican la cadena pesada de Ig, la cadena ligera Ig κ, cadena ligera Ig λ, cadena TCR β, cadenas TCR α y γ, y cadenas TCR δ.

• Estos loci contienen segmentos génicos V, J, y segmentos génicos D en cadena pesada de Ig y en loci TCR β y δ.

• Recombinación somática de ambos loci Ig y TCR, implica unión de segmentos D-J en el loci que contiene los segmentos D, seguido de unión de segmentos V a los DJ recombinados en estos loci, o bien unión directa V a J en el otro loci.

• Este proceso de recombinación genética es mediado por un complejo enzimático de recombinasas, que incluye componentes linfocitarios específicos denominados RAG-1 y RAG-2.


• La diversidad de repertorios de Ac y TCRs es generado por la asociación combinada de múltiples genes de línea germinal V, D, y J y por la diversidad de unión generada mediante adición al azar de nucléotidos en sitios de recombinación. Estos mecanismos generan mayor diversidad en la unión de regiones V y C que conforman la tercera región HV (CDR3) en polipéptidos de Ac y del TCR.

• La maduración de B ocurre en estadios secuenciales, caracterizados por patrones distintos de recombinación de genes de Ig y su expresión.

• En precursores muy tempranos de B, (células pro-B), los genes para Ig’s se hallan en configuración germinal. En el estadio pre-B, ocurre recombinación D-J y V-D-J en el locus de la cadena pesada. Se produce el transcripto primario de RNA que contiene el complejo VDJ y los segmentos genéticos de C, y los exones de la región Cµ del RNA de cadena pesada se empalman al segmento VDJ para generar mRNA maduro, el cual se traduce en la proteína µ de cadena pesada.

• Se forma el precursor de BCR (pre-BCR) al parear la cadena pesada µ con un surrogado no variable de cadena ligera y por asociación con las moléculas de señalización Igα-Igβ. Este receptor elabora señales que inhiben la reordenación del otro alelo de la cadena pesada (exclusión alélica) mientras que estimula la proliferación celular.


• En la etapa de B inmadura, hay recombinaciones de loci κ o λ, y se expresan cadenas ligeras.

• Se ensamblan cadenas pesadas y ligeras en moléculas intactas IgM que se expresan en la superficie celular.

• B inmaduras abandonan MO para poblar tejidos linfoides periféricos, donde completan maduración final.

• B maduras son capaces de sintetizar ambas cadenas pesadas µ y δ en la misma célula debido a empalme alterno de los transcriptos primarios de RNA de cadena pesada, por tanto una misma célula puede expresar IgM e IgD de membrana al mismo tiempo.

• Durante maduración de B, procesos de selección eliminan o inactivan precursoras de B que expresen receptores antigénicos de alta afinidad para Ag propios presentes en MO (tolerancia central y periférica).


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