linfocitos B
INMUNOLOGIA BASICADra. Esthela Loyo de López
!
Sociedad de Lupus, Reumatología y Autoinmunidad en República Dominicana, Inc.
Friday, September 17, 2010
• El proceso mediante el cual progenitores linfoides de MO se convierten en linfocitos maduros que irán a poblar tejidos linfoides periféricos se conoce como maduración linfocitaria.
• La colección de receptores para Ag’s, es decir especificidades, expresadas en linfocitos B y T se denomina repertorio linfocitario.
• Durante su maduración, el programa de expresión secuencial de genes conduce a proliferación de células en desarrollo, generación del repertorio, cambios en fenotipos celulares, adquisición de competencia funcional y selección de eventos para asegurar que la mayoría de linfocitos que penetran tejidos periféricos son útiles, y que responderán a Ag extraños pero no a muchos Ag propios.
• La expresión de genes para los receptores antigénicos es la característica central de maduración; hay gran similitud en los procesos entre B y T, donde B adquiere la capacidad de expresar genes de inmunoglobulinas (Ig) para el receptor de B (BCR) y T la capacidad de expresar genes para el receptor de T (TCR).
Friday, September 17, 2010
generación y maduración de linfos B [2008]
La generación de B maduras principia en el embrión y
prosigue toda la vida
Saco vitelino, hígado y MO fetal; MO adulto
Cada día produce 1 billón de linfos B, durante toda la vida
Friday, September 17, 2010
generación y maduración de linfos B [2008]
La generación de B maduras principia en el embrión y
prosigue toda la vida
Saco vitelino, hígado y MO fetal; MO adulto
Cada día produce 1 billón de linfos B, durante toda la vida
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1) DNA DE CELULAS EMBRIONARIAS Y DE CELULAS ADULTAS DE MIELOMA, DIGERIDAS CON ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
2) SEPARACION DE FRAGMENTOS Y ANALISIS DE SU CAPACIDAD DE HIBRIDIZAR CON CADENA KAPPA DE mRNA MARCADA
3) DOS FRAGMENTOS DEL DNA EMBRIONARIO PERO SOLO UNO DE CELULAS ADULTAS HIBRIDIZARON
TEORIA: DURANTE DIFERENCIACION DE LINFOS B, GENES V – C EXPERIMENTAN REORDENACION
COMPROBACION DEL MODELO DE DOS GENESS. TONEGAWA; N. HOZUMIProc. Natl. Acad. Sci, USA 1976, 73:3628
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médula ósea tejido linfoide periférico
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La maduración de linfocitos B y T consiste de estadios secuenciales en maduración de genes tempranos que tienen que ver con selección de linajes y su proliferación, expresión de genes para receptores antigénicos y selección de repertorios maduros.
Exones múltiples codifican porciones de una sola cadena H o L de Ig.Sufren reordenación a genes funcionales, antes de ser transcritos y expresados.
Durante generación, ciertos exones se escogen al azar mediante sistema genético dinámico capaz de generar más de10'°combinaciones.
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SCF = stem cell factor, división y proliferación a pre-B; expresión de IL-7R
La maduración temprana de B y T se caracteriza por elevada actividad mitótica, estimulada por interleucina 7 (IL-7).Mutaciones en la cadena de IL-7R, cadena γ común a varios receptores origina severa inmunodeficiencia, inmunodeficiencia combinada severa ligada al cromosoma X (X-linked severe combined immunodeficiency disease [X-SCID]).
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linfocito B: BCR asociado al
heterodímero alfa:betaBCR:exones de cadena pesada se
hallan en cromosoma 14
Cada linfo B tiene 2 cromosomas 14, pero elabora un solo tipo de BCR, por tanto
hay que “silenciar” los segmentos de un cromosoma
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genes V,D,J,C para cadena pesadamúltiples copias de genes con ligeras variantes, alineados en cromosoma 14
genes V,J,C para cadena ligeracromosoma 2 (k), cromosoma 22 (l)
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Recombinación de cadena pesada
Dos uniones DNA para generar un gene funcional de CP:Dh a Jh y Vh a DhJh.
Vh21, Dh7 y Jh3
+/- 100 +/- 4 +/- 6 +/- 10
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Cadena asociada a CL substituta (Vpre-B + lambda 5), asociadas a heterodímero Ig-alfa/Ig-beta
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Reordenación de cadena ligera en cromosoma 2 (k)
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Cada segmento de gene V es precedido en la terminal 5ʼ de un exón que codifica a un péptido líder (L), el cual guía la cadena pesada o ligera a través del retículo endoplásmico.
Cada linfo B maduro produce una sola clase de BCR o de Ac.La estrategia de “corte y pega” favorece diversidad de BCR y reconocimiento de cualquier molécula orgánica posible
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Al madurar, tendrá una secuencia funcional V de cadena pesada y ligera.Cada clona comprometida a un epitope específico.
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En órganos linfoides periféricos: reordenación de exones para nuevas secuencias funcionales de regiones constantes = cambio de isotipo
y por ende de funciones efectoras biológicas sin cambiar la especificidad Ag original
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reordenación somática de segmentos germinales para generar un gen funcional
DNA germinal
gen funcional
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mIg = BCR, sIg = Ac ‘s no hay TCR soluble
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linfocito T: TCR asociado al complejo CD3
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receptor de un linfocito B,selección clonal
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exclusión de alelos
• Se expresan los genes de CP y CL de un solo cromosoma heredado, por célula
• Seguridad de una clona B específica para un epitope determinado
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Se permite progresión si la reordenación es “productiva”: 1 de cada 3 pro-B a pre-BCuando pre-B exhibe receptor, experimenta múltiples divisiones: 32 a 64 descendientes
Cada progenie puede reordenar de nuevo diferentes exones de cadena ligera: mayor diversidad de Ac
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Diversidad del repertorio:recombinación somática,adición de nucleótidos,
otros
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tolerancia de B
SELECCION NEGATIVA90% de linfos B producidos cada día
sufren apoptosis
SUPRESION CLONALeliminación de B inmaduras que expresen auto-Ac, vg contra Ag
propios expresados en MO
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dinámica propuesta de poblaciones B convencionales
médula ósea
repertorio abierto de B inmadurasinducción de tolerancia
órganos linfoides periféricos, sangre
inducción de tolerancia adicional, B inmaduras auto-tolerantes, B anérgicas
falla de B para penetrar folículos linfoides
vida media de aprox 3 días linfos B
penetración exitosa a folículos linfoides
vida media prolongada de B naîves maduras recirculantes (3-8 semanas vida promedio)
estimulación por Ag’s
B de memoria, recirculantes, muy larga vida, alta afinidad IgG, IgA o IgE
10 a 20 x 106
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activación y proliferación de linfocitos B
activación, proliferación y diferenciación ocuren en órganos linfoides periféricos, requieren presencia de Ag
generación y maduración ocurren en médula ósea, independiente de Ag
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RESPUESTA HUMORALAnticuerpos secretados por
células plasmáticas
Th activan B, controlan cambio de isotipo e inician
hipermutación somática
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activación de B según naturaleza del Ag
Ag-TD: dependiente de colaboración Th
Ag-TI: independiente de colaboración Th
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(1) señal de competencia, fase G0 a G1 temprana(2) señal de progresión, G1 a S, G2 y mitosis
TIMO - DEPENDIENTES* contacto directo con Th* activación específica de B por T sensibilizadas al mismo Ag depende de presentación adecuada de péptidos en contexto CMH Clase II
TIMO - INDEPENDIENTESTIPO 1: componentes de pared bacteriana; mitógenos* verdaderamente independientes* activadores policlonales de B* activan B maduros e inmaduros* LPG de Gram (-)
TIPO 1I: moléculas muy repetitivas
Respuesta Humoral para Ag-TI es muy diferente: débil, no hay memoria, predominan respuestas tipo IgM
HLA-CII:TCRB7:CD28CD40:CD40L
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¿Cómo funciona BCR?
BCR completo:mIg reconoce el epitope o determinante antigénico
heterodímero transduce
ITAMs = immune tyrosine activation motifs
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CD19,CD21,CD81prevención de autoinmunidad
La decisión de si un invasor es o no es peligroso la realiza el sistema innato.
BCR y co-receptor* disminuye hasta 100 veces la necesidad de “clustering” de BCR
* vuelve a B muy sensibles vg Ag reconocidos por SI como peligrosos
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PAPEL DE Th EN RESPUESTA HUMORAL
CD40:CD40L*CD40L pertenece a familia de receptores de TNF [TNFR]*CD40 pertenece a familia de TNF y de citoquinas solubles que programan proliferación y apoptosis
* activación de vías tirosin-kinasas [Lyn, Syk, fosfolipasa C, factores de transcripción]
conjugado T:Breorganización de Golgi, liberación de citoquinas,
regulación de CD40L en T
HLA-CII:TCRB7:CD28
CD40:CD40L
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la respuesta humoral
¿es respuesta primaria?¿es respuesta secundaria?
* naturaleza del Ag* ruta administración* presencia o ausencia de adyuvantes* especie a inmunizar
PRIMARIAlag más corto, más rápida e intensa,más prolongada
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QUIMERAS
Clona de DNA recombinante que contiene secuencias promotoras, líderes y de regiones variables murinas, y exones de regiones constantes humanas.
RituximabInfliximab
APLICACIONES
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Rituximab, Ac monoclonal quimérico (humano-murino) anti-CD20Linfoma de células BArtritis Reumatoide¿LES, vasculitis?
Herceptin, anti-HER2
Gleevec (imatinib)*Linfoma no Hodgkin*Ca de mama:anti-HER2*Leucemia mielógena crónica (LMC)*¿Esclerodermia?
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Heteroconjugados o Ac biespecíficos:
híbridos de 2 moléculas diferentes de Ac.
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Bibliotecas de genes que codifican fragmentos Fab. El mRNA aislado para CP y CL se amplía gracias a PCR (polymerase chain reaction) y se clona en vectores.
Combinaciones al azar de genes CP y CL generan constructos CP-CL de antigenicidad específica diferente.
Science 1989, 246:1275
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Aún más lejos…
Células embrionarias reciben miniloci de genes humanos, se derivan líneas de ratones transgénicos que producen Ac Ag-específicos humanos.
N. Lonberg et al. Nature 1994, 368:856
murinoknockoutsingénicocongénicotransgénico
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Derivado de linfocitos B
Linfoma de Burkitt t(8;14) (q24.1;q32.3) más común c-myc, IgH
Leucemia Linfoblástica Aguda (pre-B ALL) t(12;21) (p13;q22) (25% en infancia) TEL1, AML1
Pre-B ALL; también Leucemia Mielógena Crónica)
t(9;22) (q34;q11.2) (25% ALL del adulto, 3% de ALL infantil) bcr, abl (cromosoma Filadelfia)
Linfoma Folicular t(14;18) (q32.3;q21.3) bcl-2, IgH
Linfoma Difuso células B, células grandes t(3;14) (q27;q32.3) bcl-6 (DNA-binding protein), IgH
Linfoma Manto t(11;14) (q13;q32.3) cyclin D1, IgH
Derivado de linfocitos T
Leucemia Linfoblástica Aguda Pre-T t(1;14) (p32;q11.2) (5% de casos); del(1p32) (20% de casos) TAL1, TCRα; TAL1, SCL
Linfoma de células T, anaplásico de células grandes t(2;5) (p23;q35) ALK (tyrosine kinase), NPM (función
desconocida)
Tipo de tumor Translocación cromosomas Genes involucrados en translocación
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próxima clase:
• Linfocitos T
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TCD4, subpoblaciones y área de influencia
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RESUMEN• Linfocitos B y T provienen de un precursor común en MO, comprometido
desde estadios tempranos al linaje linfoide. La maduración de B continúa en MO, mientras que progenitores tempranos de T migran y completan maduración en timo. La maduración temprana se caracteriza por proliferación celular inducida por citoquinas, en particular IL-7, que incrementa muchísimo el número de linfocitos inmaduros.
• Maduración de B y T implica recombinación somática de segmentos genéticos para receptores de Ag’s y expresión de moléculas de Ig en precursores de B y moléculas para TCR en precursores de T.
• La expresión de Receptores de Ag’s es crucial para la supervivencia y maduración de linfocitos en desarrollo y para los procesos de selección que conducen a repertorios diversos con especificidades antigénicas útiles muy variadas.
• Los receptores para B y T son codificados por genes derivados de la recombinación somática de un limitado número de segmentos genéticos que se hallan segregados espacialmente en loci del DNA germinal.
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• Hay loci separados que codifican la cadena pesada de Ig, la cadena ligera Ig κ, cadena ligera Ig λ, cadena TCR β, cadenas TCR α y γ, y cadenas TCR δ.
• Estos loci contienen segmentos génicos V, J, y segmentos génicos D en cadena pesada de Ig y en loci TCR β y δ.
• Recombinación somática de ambos loci Ig y TCR, implica unión de segmentos D-J en el loci que contiene los segmentos D, seguido de unión de segmentos V a los DJ recombinados en estos loci, o bien unión directa V a J en el otro loci.
• Este proceso de recombinación genética es mediado por un complejo enzimático de recombinasas, que incluye componentes linfocitarios específicos denominados RAG-1 y RAG-2.
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• La diversidad de repertorios de Ac y TCRs es generado por la asociación combinada de múltiples genes de línea germinal V, D, y J y por la diversidad de unión generada mediante adición al azar de nucléotidos en sitios de recombinación. Estos mecanismos generan mayor diversidad en la unión de regiones V y C que conforman la tercera región HV (CDR3) en polipéptidos de Ac y del TCR.
• La maduración de B ocurre en estadios secuenciales, caracterizados por patrones distintos de recombinación de genes de Ig y su expresión.
• En precursores muy tempranos de B, (células pro-B), los genes para Ig’s se hallan en configuración germinal. En el estadio pre-B, ocurre recombinación D-J y V-D-J en el locus de la cadena pesada. Se produce el transcripto primario de RNA que contiene el complejo VDJ y los segmentos genéticos de C, y los exones de la región Cµ del RNA de cadena pesada se empalman al segmento VDJ para generar mRNA maduro, el cual se traduce en la proteína µ de cadena pesada.
• Se forma el precursor de BCR (pre-BCR) al parear la cadena pesada µ con un surrogado no variable de cadena ligera y por asociación con las moléculas de señalización Igα-Igβ. Este receptor elabora señales que inhiben la reordenación del otro alelo de la cadena pesada (exclusión alélica) mientras que estimula la proliferación celular.
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• En la etapa de B inmadura, hay recombinaciones de loci κ o λ, y se expresan cadenas ligeras.
• Se ensamblan cadenas pesadas y ligeras en moléculas intactas IgM que se expresan en la superficie celular.
• B inmaduras abandonan MO para poblar tejidos linfoides periféricos, donde completan maduración final.
• B maduras son capaces de sintetizar ambas cadenas pesadas µ y δ en la misma célula debido a empalme alterno de los transcriptos primarios de RNA de cadena pesada, por tanto una misma célula puede expresar IgM e IgD de membrana al mismo tiempo.
• Durante maduración de B, procesos de selección eliminan o inactivan precursoras de B que expresen receptores antigénicos de alta afinidad para Ag propios presentes en MO (tolerancia central y periférica).
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