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Lipid Rafts und Cavaeolae

http://www.youtube.com/watch?v=tMMrTRnFdI4&feature=related

http://www.youtube.com/watch?v=Qqsf_UJcfBc&feature=related

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Plasma Membran Komposition

Die Plasma Membran von Säugetierzellen enthält 4 Hauptklassen von Phospholipiden:

•Phosphatidylcholin•Phosphatidylethanolamin

•Phosphatidylserin•Sphingomyelin

Zusammen mehr als die Hälfte aller Lipide in zellulären Membranen

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Phospholipidebestehen aus zwei langkettigen Fettsäuren, die über eine Esterbindung an eine kleine hydrophile Gruppe gebunden sind

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Phospholipids sind amphipathisch

• Deshalb aggregieren Phospholipide nicht in Tropfenform, sondern orientieren sich spontan zu Membranen, mit den hydrophilen Gruppen nach aussen, zur wässrigen Umgebung.

• Moleküle, die mit einem Ende mit der wässrigen Umgebung interagieren und mit dem anderen Ende hydrophob sind, werden als amphipathischbezeichnet (Griechisch, “tolerant für beides”).

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Plasma Membran Komposition

Die Phospholipide sind asymmetrisch zwischendem inneren und äußeren Bi-Layer angeordnet

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Glykolipide

• Zusätzlich zu den Phospholipiden enthalten Membranen von Säugetieren Glykolipide.

• Diese Glykolipide findet man hauptsächlich im äußeren Leaflet des Bilayers, mit den Kohlenhydratresten an der Zelloberfläche.

• Sie stellen aber nur einen relative geringen Anteil aller Lipide dar (~2%).

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Struktur von Glykolipiden

Zwei Kohlenwasserstoff Ketten vereinen sich zu einer polaren Kopfgruppe über ein Serin mit einem Kohlenhydratrest (zB. Zucker)

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Cholesterin

• Zusätzlich enthalten Zellmembranen von Säugern Cholesterin. • Cholesterin, ist ein Hauptbestandteil zellulärer Membranen und damit

in gleichen molaren Mengen wie Pospholipide vertreten. • Aber: Cholesterin kann nicht spontan Membranen bilden!

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Cholesterin im Bilayer

• Die Cholesterinmoleküle orientieren sich im Bilayer mit ihren Hydroxylgruppen in die unmittelbare Nachbarschaft zu den polaren Kopfgruppen der Phospholipidmoleküle.

• Die starre, plattenförmige Steroidstruktur interagiert und stabilisiert dadurch teilweise jene Abschnitte der Kohlenwasserstoff-ketten, die am nächsten zu den polaren Kopfgruppen liegen.

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Lipid-Zusammensetzung von Membranen

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Cholesterin und Mikroviskosität

• Einflüsse von Cholesterin auf die Viskosität der Membran sind Temperaturabhängig.

• Bei höheren Temperaturen, kann Cholesterin die freie Beweglichkeit der Fettsäurenketten der Phospholipidebehindern und somit den äußeren Bilayer steifer/rigider machen.

• Dadurch verändert sich auch die Zellmembran-Permeabilität für kleine Moleküle.

• Jedoch bei niedrigen Temperaturen hat Cholesterin den gegenteiligen Effekt: Durch die Interaktion mit den Fettsäurenketten der Phospholipide, kann Cholesterin Membranen vorm Einfrieren bewahren und deren Beweglichkeit/Mikro-Viskosität bewahren.

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Das “Fluid Mosaic” Modell

• In Biomembranen sind nahezu alle Membran-proteine lateral mobil und frei diffundierbar.

• Im“Fluid Mosaic“ Modell, wird die Membran als zwei-dimensionales Mosaik dargestellt, das von Phospholipiden und Proteinen gebildet wird.

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Lipid Rafts sind Andock- und Interaktionsplattformen für Proteine

.…... formed by dynamicclustering of sphingolipids and cholesterol and move within thefluid bilayer, e.g. during signaltransduction.

From Simons and Ikonen,

Nature 1997, 387: 569-72

raft caveola

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• Sie entstehen und bestehen aus einem dynamischen Zusammen-schluss von Cholesterin und Sphyngolipiden im äußeren Leaflet des Bilayers.

• Die gesättigten Kohlenwasser-stoffketten der Sphyngolipideerlauben dem Cholesterin sich optimal in der äußeren Hälfte der Membran zu verankern.

• Das innere Leaflet enthält mehr Phospholipide mit gesättigten Fettsäuren und auch Cholesterin.

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Rafts bilden Caveaolae

Caveolae on the plasma membrane of a human fibroblast. (A) Electronmicrograph of a fibroblast in cross-sectionshowing caveolae as deep indentations in the plasma membrane. (B) Deep-etchelectron micrograph showing numerouscaveolae at the cytoplasmic side of theplasma membrane.

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• Caveoline:– 150 AS Membran

Proteine– Sind die Bausteine der

Caveolae– N- und C-Terminus

ragen ins Zytoplasma vor = integrales und nicht transmembranesProtein

– Oligomerisieren– Hydrophobes Ende

steckt in der Membran– Binden Cholesterin

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Funktionen von Caveolae:

• Endozytose, Transzytose

• Signal Transduktion

• Cholesterin Transport• Pathogen Eintritt in Zellen• Potozytose

– Lipid-verankerte Membran Rezeptoren in Caveolaenehmen kleine Moleküle wie Vitamine und Lipide auf.

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Methoden zur Untersuchung von Raft-Strukturen?

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Biochemische Anreicherung / Reinigung von Caveolae and Rafts

• Extraktion mit Triton-X 100 auf Eis.

• Rafts and damitassoziierte Proteinewerden dadurchunlöslich.

• Flotation in Zucker / Optiprep Gradienten.

• Das detergenz-unlösliche Material flotiert hoch, wegendes Lipidgehaltes.

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Flotation and Visualisierung von Rafts

Oliferenko et al., JCB 1999

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Intracelluläres Annexin II wird von Innen an antibody-crosslinked CD44 Microdomänen rekrutiert

Oliferenko et al., JCB 1999

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Keine “Cluster” wenn Cholesterin ausMembranen depletiert wird

CD44 annexin II mergeOliferenko et al., JCB 1999

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Immunogold und Freeze Fracture

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Größere Lipid-Domänen können mittels Single Molecule Microscopy dargestellt werden

• G.J. Schütz, G. Kada, V.Ph. Pastushenko and H. SchindlerEMBO J. 19 No.5 (2000) 892-901

DOPE (monounsaturated phosphoethanolamineanalogue): freidiffundierbar

DMPE (saturated acylchains): wird in Mikrodomänen fest gehalten

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Rafts Visualiserung durch Atomic Force Microscopy

• Atomic force microscopyreveals sphingomyelin rafts(orange) protruding from a dioleoylphosphatidylcholinebackground (black) in a mica-supported lipid bilayer. Placental alkalinephosphatase (PLAP; yellowpeaks), a glycosylphosphatidylinositol-anchored protein, is shownto be almost exclusively raft-associated.

Saslowsky, D.E., et al. (2002) J. Biol. Chem. 277, 26966-26970

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Photonic Force Microscopy

• Kai Simons (Dresden, Germany) has used photonic force microscopy to measure the size of lipid rafts.

• By comparing the drag force of raftproteins (such as a GPI-anchoredprotein) and non-raft proteins (such as transferrin receptor) in thepresence or the absence of cholesterol, he estimated thediameter of a single raft.

• The conclusion is that each raft isvery small and contains a verysmall subset of proteins, leading to the prediction that in order to act as signalling and/or sorting devices, they need to cluster.

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Raft Eigenschaften

• Größe: bis zu 25±10 nm• Das entspricht ungefähr 3,500 Sphyngolipid Molekülen• Protein Anzahl hängt vom Packungsgrad ab,

wahrscheinlich gibt es um die 30 Proteine in Rafts• Cluster mit bis zu 15 identen Molekülen wurden

beschrieben• Statistisch gesehen, können jedoch nur ein relativ

kleiner Anteil aller verfügbaren Raft Proteine gleichzeitig in Rafts auch sein.

• Das wiederum könnte wichtige Auswirkung auf die prinzipiellen Mechanismen der Signalweiterleitung in und durch Rafts haben.

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Raft-Typologie: Nomenklatur

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Experimentelle Tools um Rafts zu zerstören:

• Cholesterolsequestration/depletion

– Filipin (Antibiotic)– Pore formation (Saponin,

Digitonin, Streptolysin O)– Methyl-beta-cyclodextrin

• Cholesterolbiosynthesis– Lovastatin

• Raft Stability

– Exogenous Cholesterol– Exogenous Gangliosides– Exogenous

polyunsaturated fattyacids

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Signal Transduktionin Lipid Rafts und Caveolae

• FCεRI• T-cell Receptor• B-cell Receptor• CD44• H-ras• Integrins• eNOS

• EGF Receptor• Insulin Receptor• EphrinB1 Receptor• Neutrophin• GDNF• Hedgehog

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Wie werden Signale in Rafts induziert und integriert?

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Wie werden Signale in Rafts induziert und integriert?

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A n n e x in I I A n n e x in I I

CD44

Lipid rafts

Der CD44 Rezeptor ist in Rafts und intergiert mit dem Zytoskelett

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out-side-in Signaltransduktion in CD44 Rafts nachLigandenbindung durch Hyaluronsäure (HA)?

H A

A n n e x in I I A n n e x in II

CD44

Lipid rafts

H A

H A

H A

?

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.

H A

Ra c - GD PRa c - GT P

H A

H AH A

CD44

Annexin IITIAM

Bourguignon et al., 2000

lamellipodiaoutgrowthCytoskeletalrearrangements

H AOkamoto et al., 1999

Oliferenko et al., JCB 2000

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Rafts in Fc Rezeptor Signaltransduktion

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Rafts in T-Cell Rezeptor Signaltransduktion

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? Offene Fragen ?

• Wieviel Arten von Rafts?• Funktion von Caveolae in Signaltransduction?• Welche Signalwege brauchen Rafts? • Welche Proteine gehen in Rafts und warum?• Wie werden Caveolae internalisiert• Rolle des Zytoskelettes?