LIPIDPEROXIDÁCIÓ ÉS A BIOLÓGIAI LIPIDPEROXIDÁCIÓ ÉS A BIOLÓGIAI ANTIOXIDÁNS VÉDELEMANTIOXIDÁNS VÉDELEM

Life is a constant battle against becoming rancid...

(P. Cloud, 1979)

Szabad gyökök:Szabad gyökök:

azok a kémiai gyökök, amelyek külső elektronhéjukon egy

vagy több párnélküli elektront vagy antiparalell spinekkel

rendelkező elektronokat tartalmazó atomot tartalmaznak.

Oxigén szabad gyökökOxigén szabad gyökök:

azok a szabad gyökök, amelyekben a párnélküli elektron

vagy elektronok egy oxigén atom külső orbitálján helyez-

kedik el.

SzabadgyöSzabadgyökökkökSzuperoxid (O2 -): enzimatikus, auto-oxidációs, nem-enzi-matikus elektron transzfer reakciók során keletkezik. Vizes oldata oxidálja az aszkorbinsavat, redukálja a cito-krom c és más kelát vas atomját.

Hidroxil (OH) : rendkivül reaktiv gyök, amely minden bio-lógiai molekulát oxidál

Peroxil, alkoxil (RO2, RO) : tipikus szerves oxigén sza-bad gyök, amely a lipid peroxidáció során (is) keletkezik,amikor a hidroperoxidokat az átmeneti fémek redukálják. A szén-tetrakloridból képzõdõ gyök is ebbe a csoportbatartozik (CCl3O2)

Alkil-peroxil (ROO): az alkoxil gyök által indukált lánc-reakció során keletkezik a lipid peroxidáció folyamatasorán.

Nitrogén-oxidok (NO, NO2): a nitrogén-oxid in vivo az L-argininbõl keletkezik. A nitrogén-dioxid akkor keletkezik, amikor a NO oxigénnelreagál (pl. szmog, dohányfüst)

Nem sNem szabadgyözabadgyökökkökHidrogén-peroxid (H2O2): in vivo a dizmutázok és számosoxidáz hatására, valamint a hidroxil gyök és átmeneti fémjelenlétében is létrejöhet. Kis koncentrációban kevésséreaktiv, de nagyobb mennyiségben károsítja a sejtekenergia-felszabaditó rendszerét.

Hipoklór-sav (HOCl): a mieloperoxidáz hatására a neutro-fil sejtek termelik gyulladásos folyamatok során. Szuper-oxid anionnal reagálva hidroxil gyök is létrejöhet a neutrofilaktiváció során.

Ózon(O3): a légkörben keletkezik. Rendkivül reaktiv gáz. Avérplazma antioxidánsok közül oxidálja (bontja) a D- és E-vitamint és a húgysavat.

Szinglet oxigén (1O2): az oxigén külsõ két orbitálján lévõ

egyik elektron inverz spinnel rendelkezik, emiatt megválto-

zik a molekuláris oxigén kvantum-mechanikai stabilitása.

A fotoszintézis során a membránokhoz kötött oxigén szállí-

tás során keletkezik növényekben.

Szerves peroxid (ROOH): a lipidek oxidációs terméke a

lipidperoxidáció során, amely főképp szinglet oxigén

hatására keletkezik

AZ OXIGÉN SZABADGYÖKÖK FORRÁSAI

1. Mitokondriális és mikroszomális (kloroplasztisz)

elektron transzport - oxigén tetravalens redukciója

1O2 O2H+

h e- e-, H+ e-, H+ e-,H+

3O2 O2 - H2O2 OH H2O

2. Fagocitózis során a PMN leukocitákban

H2O H2O2

H2O + Cl- HOCl + H+

3. Enzimrendszerek működése során:

- NADP oxidáz

- Xantin – oxidáz

- Monoamin - oxidáz

- Citokrom P450 – oxidáz

4. Hidroxil gyök (OH) keletkezésének egyéb útja:

Fenton és Haber-Weiss reakciók révén (Fenton, 1894,

Haber és Weiss, 1934):

O2 + e- (O2)-

(O2)- + H2O2 + Mn HO- + (OH) + O2 + Mn+1

4. Szuperoxid anion (O2- ) keletkezésének fő útja:

citokróm rendszer

(gyorsan átalakul hidrogén-peroxiddá a piridoxamin-

foszfát-oxidáz, illetve a szuperoxid dizmutáz enzimek

hatására)

(O2)- + (O2)- + 2H+ H2O2 + O2

DNSDNS

LIPOPROTEINEKLIPOPROTEINEK

FEHÉRJÉKFEHÉRJÉK

TÖBBSZÖRÖSEN TELÍTETLEN TÖBBSZÖRÖSEN TELÍTETLEN ZSÍRSAVAKZSÍRSAVAK

REAKTÍV OXIGÉN GYÖKÖKREAKTÍV OXIGÉN GYÖKÖK

Deoxi guanozin

LDL oxidációLipid peroxidáció

Enzimek inaktivációja

A SZABADGYÖKÖK HATÁSA AZ EGYES A SZABADGYÖKÖK HATÁSA AZ EGYES LÉTFONTOSSÁGÚ MOLEKULÁKRALÉTFONTOSSÁGÚ MOLEKULÁKRA

A ROS SZÜKSÉGESA ROS SZÜKSÉGES:

1. SEJTMŰKÖDÉS SZABÁLYOZÁSÁBAN

2. SZIGNÁL TRANSZMISSZIÓS FOLYAMATOKHOZ

3. SEJTOSZTÓDÁSHOZ

4. GYULLADÁSOS FOLYAMATOKHOZ

5. APOPTOZISHOZ

APOPTÓTIKUS SZIGNÁLOK ROSSzignál transzmisszió : death receptors (TNF superfamily) + DD (death domain)

CASPASE-8 CASPASE- 3 Pro-caspase-3

MITOKONDRIUM D4-GDI (GDP dissociation inhibitor)

CITOKROM C KIÁRAMLÁS

CASPASE-9 AKTIVÁCIÓ

SEJTMAG GTP-ÁZOK

DNS FRAGMENTÁCIÓ MEMBRÁN (poli-(ADP)-ribóz szint )

CITOSZKELETON VÁLTOZÁSOK SOD kiáramlás

SEJTHALÁL

A lipid peroxidáció mechanizmusa

Lipid peroxidáció (oxidativ stressz):

a biológiailag aktív molekulák reakciója oxigén eredetű

molekulákkal és gyökökkel

A lipid peroxidáció folyamatának fő szakaszai:

(1) Iniciáció: szabadgyök képződés

(2) Propagáció: a szabadgyök képződés láncreakciószerű

kiteljesedése

(3) Termináció: (kvázi)stabil gyökök és molekulák

keletkezése

LIPID PEROXIDÁCIÓ – OXIDATÍV STRESSZ

LH (PUFA) LL + O2

- LOOH

ÁTMENETI FÉMEK (VAS/RÉZ) HATÁSA

LOOH + Fe(II) Fe(III) + OH- + LO

LOOH + Fe(III) Fe(II) + H+ + LOO

A C-18-as zsírsavak relatív oxidációs sebessége

(Varst, 2001 nyomán)

0

500

1000

1500

2000

2500

C18:0 C18:1 C18:2 C18:3

Sztearinsav

Olajsav

Linolsav

Linolénsav

A MEMBRÁNOK OXIDATÍV KÁROSODÁSA

ANTIOXIDÁNS VÉDELEM

NEM ENZIMATIKUS VÉDELEM E-VITAMIN ( - tokoferol) Hatása: biológiai membránok védelme kromángyűrű – fizikai kapcsolat a foszfolipidekkelfitil oldallánc – keresztkötések az arachidonil oldallánccal

OH gyök „akció radiusa” 10-9 sec = 2-3 nm

Egyes tokoferol és tokotrienol vegyületek oxidáció kinetikája

azobis iniciátor jelenlétében

TOKOFEROLOK OXIDÁCIÓJA

0

2

46

8

10

12

1416

18

20

A-T

G-T

D-T

TOKOTRIENOLOK OXIDÁCIÓJA

0

2

4

68

10

12

14

16

A-TR

B-TR

D-TR

C-VITAMIN (L-aszkorbinsav) HATÁSA: hidrogén donor redukáló tulajdonságú – tokoferol „regeneráció” - GSSG redukciója

TOC TQ + AH TOC + DHA GSSG + 2AH 2GSH + 2DHA

A gazdasági állatok képesek a C-vitamin szintézisére

DE szintézis kapacitás aktuális igény

CSIRKE VESE ASZKORBINSAV SZINTETIZÁLÓ KAPACITÁSA

0

5

10

15

ÉLETKOR (NAP)

MG

/NA

P

UBIQUINON (CoQ)

Hatása: szelén / E-vitamin hiány esetén

antioxidáns – elektron donor

Máj (hepatociták) védelme

KAROTINOIDOK (β-karotin)

Hatása: peroxil gyökfogó vegyület

máj, ovarium (c. luteum), here (Leydig sejtek) védelme

A-VITAMIN - önmagában nem antioxidáns

kémiai szerkezete alapján gyökfogó hatású

máj, ovarium, here védelme

Fémkötő (kelátképző) vegyületekFerritin (1 mol/ 45000 vas) – az állati szervezetben Idegsejtek és máj védelme

Metallothionein: Hg< Cu< Cd < Zn máj védelme (vesében felszabadul a fémion)

Egyéb antioxidáns vegyületekGlutation - -Glu-Cys-Gly Hatásai: fehérjék SH csoportjainak fenntartása

cisztein raktár

xenobiotikum konjugáció ( R + GSH GS-R + H)minden sejttípus védelme

ENZIMATIKUS VÉDELEM

Szuperoxid-dizmutáz

Cu-Zn – citoszol

Mn – mitokondrium

Fe – prokarioták

O2 + O2

+ 2H+ H2O2 + O2

minden sejttípus védelme (mitokondrium + citoszol)

Aktivitását befolyásoló tényezők:

oxidatív stressz esetén emelkedik

mikroelem hiány (Cu, Zn, Mn)

Kataláz Fe tartalmú

2H2O2 O2 + 2H2Ovörösvérsejtek, fehérvérsejtek védelme

Aktivitását befolyásoló tényezők: életkor (génexpressziója az öregedéssel csökken)takarmány megvonás (csökkenti az öregedés hatását)

Glutation-peroxidázok (aktív centruma SECIS element –szelenocisztein (TGA – UGA kodon) - Se tartalmú

2GSH + H2O2 GSSG + 2H2O

Klasszikus glutation-peroxidáz (Mills, 1957) –H2O2 (VVS)

Citoszol glutation-peroxidáz (Rotruck et al, 1973) - H2O2 +lipidperoxidok + koleszterol-7-;7-hidroperoxidokmáj-, harántcsíkolt izmok, érfal endothel sejtek, idegsejtek Foszfolipid-hidroperoxid glutation-peroxidáz (Ursini,1985) –foszfolipid-hidroperoxidok - monomer membrán kötöttenzim (madarak májában citoszol forma is)Minden sejt, spermium nukleusz GSH-Px (S-H S-S)

A "stem-loop" másodlagos mRNS 3' UTR szerkezet

felépítésének általános sémája [Low és Berry, 1996]

a.) a klasszikus glutation-peroxidáz mRNS-ében,

b.) a foszfolipid és az extracelluláris glutation-peroxidáz mRNS-ében

A szelenocisztein beépülésének sémája eukariotákban

(Berry et al., 1993)

Extracelluláris glutation-peroxidáz (Takahashi,1990) -H2O2 vérplazmában és szövetekben (extracelluláris térben)

Vérplazma glutation-peroxidáz (Avissar et.al., 1994) - H2O2

vérplazmában (szintézise: vese tubuláris rendszerében)

Gastrointestinalis glutation peroxidáz (Chu, Esworthy,1995)

H2O2 + lipid peroxidok és – hidroperoxidok vékonybél epithel sejtek

Mellékhere extracelluláris glutation peroxidáz (Williams,

1998) - H2O2 + lipid peroxidok és – hidroperoxidokmellékhere és szeminális plazma (spermium membrán)

Aktivitását befolyásoló tényezők- oxidatív stressz hatások (aktiváció gátlás)

- szöveti lokalizáció ( máj >>> agy )- endokrin hatások (androgének, melatonin) - életkor (az ivarérésig nő, az öregedéssel csökken)

- takarmányok zsírtartalma (nagy csökken az aktivitás)

- többszörösen telítetlen zsírsavak (növelik: n-6 zsírsavak)

- fehérjehiányos takarmányozás csökkenti

- szelénhiány (csökkenti - szívizomban akár 96 %-kal is)

(kivétel: agyszövet - viszonylag állandó)

- szükségletet meghaladó mennyiségű szelén kiegészítés (az élettani szint elérése felett tovább már nem fokozza sem az enzimfehérje szintézisét, sem aktivitását)

- E-vitamin (növeli a phGSHPx aktivitást a spermiumban)

5’-dejodinázok (aktív centrum SECIS element – szelenocisztein (21.aminosav) I. típus: pajzsmirigy, máj, vese, tobozmirigy II. típus: pajzsmirigy, placenta, tobozmirigy, központi idegrendszer, újszülött rágcsálók zsírszöveteIII. típus: bőr, placenta, központi idegrendszer

2HI + H2O2 I2 + 2H2O

Aktivitását befolyásoló tényezők Szelénhiány – csökkenti TSH – növeli

Glutation-S-transzferázok (specifikus GSH kötőhellyel rendelkeznek)

2GSH GST GSSG + 2H+

- szelén hiányos állapotokban aktiválódnak (nem szelén dependens glutation-peroxidázok) - hatékonyan redukálják a koleszterol-7-hidroperoxidokat - a GST A4-4 izoenzim hatékonyan redukálja a 4-hidroxi-2 nonenal-t (agyban) - phGSHPx aktivitást mutatnak

NÖVÉNYI EREDETŰ ANTIOXIDÁNSOK ÉTERIKUS OLAJOK ANTIOXIDÁNS

VEGYÜLETEI

HATÁSUK: ELEKTRON DONOR - ANTIOXIDÁNS MEMBRÁN CSATORNÁK VÉDELME

(ENTEROCITÁK FELSZÍVÓDÁS)

POLIFENOLOK: FLAVONOLOK – KVERCETIN, KEMPFEROL, MIRICETINFLAVONOK – APIGENIN, LUTEOLIN

TERPÉNSZÁRMAZÉKOK :CITRÁL, CITRONELLÁL, MENTON

SZINTETIKUS ANTIOXIDÁNSOK

HATÁSUK: - TAKARMÁNYOK ZSÍRSAVAINAK VÉDELME - TAKARMÁNYOK OXIDÁCIÓRA ÉRZÉKENY

BIOLÓGIAILAG AKTÍV VEGYÜLETEINEK VÉDELME - ENTEROCITÁK VÉDELE

HATÁSUKAT BEFOLYÁSOLJA: - ZSÍRSAVAK MENNYISÉGE - ZSÍRSAVAK TELÍTETLENSÉGE

- GYÁRTÁSTECHNOLÓGIA

AZ ANTIOXIDÁNS RENDSZER HÁROM VÉDELMI VONALA AZ ÁLLATI

SEJTEKBEN

ELSŐ VÉDELMI VONAL

a további szabadgyök képződés megelőzése

ANTIOXIDÁNS ENZIMEK

SZUPEROXID DIZMUTÁZ

GLUTATION-PEROXIDÁZ

KATALÁZ

FÉMKÖTŐ FEHÉRJÉK

MÁSODIK VÉDELMI VONALa láncreakció kiterjedésének megelőzése és

megállitása

ZSIROLDÉKONY ANTIOXIDÁNSOK A- ÉS E-VITAMIN, KAROTINOIDOK, UBIQUINOLOK

VIZOLDÉKONY ANTIOXIDÁNSOK C-VITAMIN, GLUTATION, HÚGYSAV

HARMADIK VÉDELMI VONAL

a makromolekulák károsodott szakaszainak

kivágása és helyreállitása

REPAIR ENZIMEK

LIPÁZOK – foszfolipáz A2

PEPTIDÁZOK – peroxiszóma enzimek

PROTEÁZOK – calpainok (kalcium efflux gáltás)

DNS REPAIR ENZIMEK – bázis (oxo-guanozin),

nukleotid repair Glutation-reduktáz

GSSG + 2NADPH GSSG-R 2GSH + 2NADP+

Az oxidativ stressz kialakulása fiziológiás és

patológiás folyamatok során

Oxidatív stressz: a prooxidáns és az antioxidáns anyagok egyensúlya eltolódik az előzőek javára

Az arányeltolódást előidézheti:

Külső tényezők: magas hőmérséklet – hőstressz UV sugárzás – fertőtlenítés, napfény hatása ionizáló sugárzás – fertőtlenítés

TAKARMÁNYOZÁSI HATÁSOK

Fémtoxikózisok (réz és a vas) Cu(II) + (O2)- Cu(I) + O2

Cu(I) + H2O2 Cu(II) + (OH) + OH- vagy NO + O2- ONOO- + ONOOH Cu(II) OH + NO2

vagy Fe(III) + (O2)- Fe(II) + O2

Fe(II) + H2O2 Fe(III) + (OH) + OH

Biológiai rendszerekbentiol-Fenton tipusu reakció:

Fe(III) + RSH Fe(II) + RS + H+ Fe(II) + H2O2 Fe(III) + (OH) + OH-

Glutation depléció

Előidézheti:

éhezés – baromfi fajoknál 24 óra elegendő!

metionin hiány

cisztein hiány

A-vitamin túladagolás

gátolja az E-vitamin felszívódását, illetve annak a májban

való tárolását

A-vitamin kiegészítés hatása a máj E-vitamin tartalmára brojlercsirkében

(Surai és Kuklenko, 2000 nyomán)

A-vitamin kiegészítés 42 napos 56 napos

(NE/kg) (g /g nedves szövet)

10 18,71 12,40

50 15,19 11,70

100 12,72 9,44

500 10,44 7,12

1000 8,19 5,11

2000 6,19 4,12

Nagy lipid peroxid tartalmú takarmányok felvétele: - közvetlenül kevéssé toxikus (májkárosodás, szaporodás-

biológiai zavarok, tumor képződés)

Peroxidált lipidek metastabil végtermékeinek hatása:

Alkanalok - malondialdehid

fehérjék tiol- valamint a szabad -lysil csoportjaival való

kapcsolódás - LDL oxidáció

Alkenalok - 4-hidroxi-nonenal

elektrofil vegyületek – reakcióba lép a glutationnal, fehérjék

-lysil csoportjaival.

Alkánok - pentán

kémiai reaktivitásuk kicsi

Nagy peroxid tartalmú takarmányok etetése

LIPID PEROXID TERHELÉS HATÁSA

0

50

100

150

GSHPx GSSG-R CYTP450 Cytc oxredkontroll

terhelt

Mikotoxinok jelenléte a takarmányokban

kémiailag reaktív molekulák (epoxi csoport: AFB1, T-2)

Csökkentik az antioxidánsok mennyiségét:

2GSH + O2- GSSG + H2O

Nutritív antibiotikum toxikus adagja a takarmányokban

gátolják a K+/Na+-ATP-áz működését

membrán csatornák zavara

Ca2+ efflux zavara

sejtanyagcsere zavara lipid peroxidáció

A GSH/GSSG arány alakulása T-2 toxin kezelés hatására

0

100

200

300

400

500

kontroll 3. nap 10. nap

csirke

kacsa

Nutritív antibiotikum toxikus adagja a takarmányokban

gátolják a K+/Na+-ATP-áz működését

membrán csatornák zavara

Ca2+ efflux zavara

„Mitochondrial swelling” lipid peroxidáció

A MÁJHOMOGENIZÁTUM MALONDIALDEHID TARTALMÁNAK VÁLTOZÁSA MONENZIN TOXIKÓZIS

SORÁN BROJLERCSIRKÉBEN

0

5

10

15

20

25

4 20 44 68

óra monenzin

kontroll

Akut vagy krónikus stressz hatások

- hideg környezet vagy az immobilizáció

gyökképző folyamatok intenzitása fokozódik

antioxidánsok mennyisége csökken

( pl. glutation, E-vitamin vagy aszkorbát)

Belső tényezők: fiziológiás folyamatok,

genetikai hatások,

fizikai terhelés

Fiziológiás folyamatok:

arachidonsav kaszkád metabolitokendoperoxidok (OOH)

prosztaglandinok vagy leukotriének szintézise során

ion pumpa müködésének - pl. kalcium efflux - zavara

öregedés folyamata

maximális élettartam a gerinces fajokban az in vivo gyök-

képződés függvénye

INDOMETACIN ILLETVE E-VITAMIN KEZELÉS HATÁSA A TOJÓTYÚK UTERUS PG ÉS MDA TARTALMÁRA

0

1

2

3

4

5

6

7

8

KONTR. INDO-1 INDO-2 EVIT-100 EVIT-200PGF2a

MDA

Genetikai hatások: szelekció fokozott anyagcsere intenzitás fokozottmitokondriális oxidáció fokozott szabadgyök képződés

INTENZÍV ANYAGCSERE

szelekció T4 / T3 átalakulás O2- termelés

Erőteljes fizikai terhelés: fokozott izommunka fokozott oxigénfelvétel fokozottszabadgyök képződés

gyulladásos folyamatok – tartástechnológia /fertőzések

NO NO2- mieloperoxidáz HOCl NO2Cl

Az egyes szövetek lipidperoxidáció iránti érzékenysége

AGYAGY - különösen érzékeny az oxidációs károsodásokra nagy lipid tartalom kiemelkedően nagy PUFA

tartalom gyenge antioxidáns védelemSZEM (retina)SZEM (retina) retina pigment epithel sejtjei - oxidatív hatások apoptózisEMÉSZTŐTRAKTUSEMÉSZTŐTRAKTUS ANTIOXIDÁNS VÉDELEM (glutation-peroxidáz aktivitás) gyomor>nyelőcső>vastagbél> vékonybél (kripta >>

bélbolyhok csúcsa) VÉREREK VÉREREK antioxidáns enzimek hiánya + arachidonsav kaszkád

VÖRÖSVÉRSEJTEK VÖRÖSVÉRSEJTEK oxigén “terhelés” kifejezett antioxidáns védelem(acatalasaemia (kataláz enzim hiánya) – letális)

FEHÉRVÉRSEJTEKFEHÉRVÉRSEJTEK jelentős antioxidáns (elsősorban aszkorbinsav) tartalomAszkorbinsav: T-lymphocyták > B lymphocyták >monocytákNeutrofil granulociták jelentős oxidatív terhelés H2O2 termelés – oxidatív burst

SPERMIUMOK SPERMIUMOK - rendkívül érzékenyek gyenge antioxidáns ellátottság mitokondriális rendszer fokozott aktivitása

A SZABADGYÖKÖK HATÁSA EGYES KÓROS A SZABADGYÖKÖK HATÁSA EGYES KÓROS FOLYAMATOKRAFOLYAMATOKRA

SZABAD GYÖKÖKSZABAD GYÖKÖK

SZÍVSZÍV

BŐRBŐR

TÜDŐTÜDŐ

TÖBB SZERVET ÉRINTŐTÖBB SZERVET ÉRINTŐ GASTRO-INTESTINALIS GASTRO-INTESTINALIS

RENDSZERRENDSZER

AGYAGYVESEVESE

ÍZÜLETEKÍZÜLETEK

VÖRÖSVÉRSEJTEKVÖRÖSVÉRSEJTEK

VÉREREKVÉREREK

Gyulladásos folyamatok, gyógyszer-mérgezések, vas toxikózis, táplálóanyag hiány, tumorképződés

SZEMSZEM

Microangiopathia, thrombosis

Dermatosis

RDS, szilikózis

Cataracta, Retinopathia

Diabetes, pancreatitis, intestinalis ischemia

Atherosclerosis

Oxidatív hemolízis

ArthrosisEncephalomalatia, hypoxia

Glomerulonephritis