LISTERIA MONOCYTOGENES -BAKTEERIN

BIOFILMIN MÄÄRITTÄMINEN

MIKROTIITTERILEVYMENETELMÄLLÄ

LAURA TOIVANEN

Eläinlääketieteen lisensiaatin tutkielma 2009

Helsingin yliopisto

Eläinlääketieteellinen tiedekunta

Elintarvike- ja ympäristöhygienian laitos

Elintarvikehygienian oppiaine

Tiedekunta - Fakultet – Faculty Eläinlääketieteellinen tiedekunta

Laitos - Institution – Department Elintarvike- ja ympäristöhygienian laitos

Tekijä - Författare – Author Laura Toivanen Työn nimi - Arbetets titel – Title Listeria monocytogenes -bakteerin biofilmin määrittäminen mikrotiitterilevymenetelmällä Oppiaine - Läroämne – Subject Elintarvikehygienia Työn laji - Arbetets art – Level Lisensiaatin tutkielma

Aika - Datum – Month and year 3/2009

Sivumäärä - Sidoantal – Number of pages 44

Tiivistelmä - Referat – Abstract Listeria monocytogenes on merkittävä elintarvikevälitteinen patogeeni. Se on gram-positiivinen bakteeri, joka lisääntyy sekä aerobisissa että anaerobisissa olosuhteissa laajalla lämpötila-alueella. Se pystyy kasvamaan tyhjiö- ja suojakaasupakkauksissa jääkaappilämpötiloissa muodostaen elintarvikehygieenisen riskin. L. monocytogenes voi aiheuttaa hengenvaarallisen infektion erityisesti immuunipuutteisilla, raskaana olevilla ja vanhuksilla. Tauti jaetaan invasiiviseen ja ei-invasiiviseen muotoon. Taudin tyypillisiä ilmenemismuotoja ovat septikemia, meningiitti ja ei-invasiivisessa muodossa gastroenteriitti. L. monocytogenesta esiintyy laajasti ympäristössä mm. maaperässä ja vesissä. Se voi kulkeutua ympäristöstä elintarvikealan tuotantolaitoksiin muodostaen laitokseen ns. persistoivan kontaminaation. Persistoivan kontaminaation muodostuminen on monen tekijän summa. Bakteerien kiinnittymisellä, happo- ja lämpökestävyydellä, desinfioinnin epäonnistumisella, bakteerien sopeutumisella desinfiointiaineisiin, monimutkaisilla tuotantolaitteilla sekä osastoinnilla tai sen puuttumisella on tässä oma roolinsa. L. monocytogenes -kannat voidaan jakaa persistoiviin ja ei-persisitoiviin kantoihin. Persistoivat kannat kiinnittyvät ainakin metallipinnoille ei-persistoivia kantoja nopeammin. Kiinnittymisen jälkeen bakteerit tuottavat ympärilleen eksopolysakkarideja muodostaen biofilmin. Biofilmien tutkimusmenetelmiä on useita. Menetelmät voidaan jakaa suoriin ja epäsuoriin. Suorissa menetelmissä biofilmiä havainnoidaan suoraan mikroskoopin avulla. Epäsuorat menetelmät ovat usein kolorimetrisiä eli niissä kiinnittyneet bakteerit värjätään ja värin määrä mitataan biofilmin määrän arvioimiseksi. Tutkimuksen tavoitteena oli pystyttää mikrotiitterilevymenetelmä L. monocytogeneksen kiinnittymisen tutkimiseen. Samalla vertailtiin persistoivien ja ei-persistoivien L. monocytogenes -kantojen kiinnittymistä. Tutkittavana oli 20 elintarvikealan tuotantolaitoksista eristettyä L. monocytogenes -kantaa. Kiinnittymiskoe toistettiin 2-3 kertaa. Tutkimuksessa käytetyssä menetelmässä bakteerikantaa kasvatettiin elatusliemessä mikrotiitterilevyllä. Kiinnittyneet solut värjättiin kristallivioletilla ja väri liuotettiin. Väriliuoksen optinen tiheys mitattiin. Mitä suurempi oli liuoksen optinen tiheys, sitä enemmän oli kiinnittyneitä bakteereja. Osalla tutkituista kannoista kiinnittyminen erosi toisistaan tilastollisesti merkittävästi. Valtaosalla kannoista ei kuitenkaan ollut merkittävää eroa kiinnittymisessä. Persistoivien ja ei-persistoivien kantojen kiinnittyminen ei eronnut tilastollisesti merkittävästi toisistaan. Mikrotiitterilevymenetelmä osoittautui toimivaksi menetelmäksi L. monocytogeneksen biofilmin tutkimisessa, mutta sen toistettavuutta tulee vielä parantaa. Menetelmän avulla havaittiin eroja eri kantojen kiinnittymisessä. Sen avulla pystytään tutkimaan useita kantoja samanaikaisesti. Menetelmä on myös helposti mukailtavissa erilaisiin tutkimusolosuhteisiin.

Avainsanat – Nyckelord – Keywords Listeria monocytogenes, biofilmi, persistoiva, kiinnittyminen, mikrotiitterilevy Säilytyspaikka – Förvaringställe – Where deposited Viikin tiedekirjasto Työn valvoja (professori tai dosentti) ja ohjaaja(t) – Instruktör och ledare – Director and Supervisor(s) Työn valvoja: Hannu Korkeala Työn ohjaaja: Janne Lundén

Tiedekunta - Fakultet – Faculty Faculty of Veterinary Medicine

Laitos - Institution – Department Department of Food and Environmental Hygiene

Tekijä - Författare – Author Laura Toivanen Työn nimi - Arbetets titel – Title Assessing the biofilm of Listeria monocytogenes with the microtiter plate method Oppiaine - Läroämne – Subject Food Hygiene Työn laji - Arbetets art – Level Licentiate Thesis

Aika - Datum – Month and year 3/2009

Sivumäärä - Sidoantal – Number of pages 44

Tiivistelmä - Referat – Abstract Listeria monocytogenes is an important food-borne pathogen. It is a gram-positive bacterium, which multiplies in both aerobic and anaerobic conditions at a wide temperature area. It can grow in vacuum and modified atmosphere packages in refrigerated temperatures causing food hygienic risk. Listeria monocytogenes can cause life-threatening infection particularly in individuals who are immunocompromised, pregnant and elderly. The disease is divided into invasive and non-invasive form. The disease manifests typically with septicaemia, meningitis and gastroenteritis in non-invasive form. L. monocytogenes exists widely in the environment such as soil and water. It can find its way from the environment to the food processing plants and cause so called persistent contamination in the plant. The persistent contamination is a sum of many factors. Bacterial adhesion, acid and heat tolerance, the failure of disinfection, the adaptation of bacteria to sanitizing agents, complex processing machines and the existence of compartmentalization has its own role. Listeria monocytogenes strains can be divided into persistent and non-persistent strains. The persistent strains adhere to stainless steel surfaces faster than non-persistent strains. After the adhesion bacteria produce exopolysaccarides around themselves creating a biofilm. There are several methods to investigate biofilms. These methods can be divided into direct and indirect methods. In direct methods the biofilm is observed directly with microscope. The indirect methods are often colorimetric in other words the adherent bacteria are stained and the amount of colour is measured to estimate the amount of biofilm. The aim of the study was to set up a microtiter plate method to examine the adhesion of L. monocytogenes. At the same time the adhesion of persistent and non-persistent L. monocytogenes strains was compared. There were 20 L. monocytogenes strains that were isolated from food processing plants. The test was repeated 2 or 3 times. In the method which was used in this study the strain was incubated in the suspension in the microtiter plate. The adhered cells were stained and then the colour was dissolved. The optical density of the suspension was measured. The higher the optical density of the suspension was, the more there were adhered bacteria. Part of the studied strains had statistically significant difference in the adhesion. However most of the strains did not have a significant difference in adhesion. There was not statistically significant difference in the adhesion of persistent and non-persistent strains. The microtiter plate method proved to be a practical method to examine the biofilm of L. monocytogenes but its repeatability should still be improved. Differences in the adhesion of strains were observed with the method. Many strains can be examined at the same time with the method. The method is also easily modified to different research conditions.

Avainsanat – Nyckelord – Keywords Listeria monocytogenes, biofilm, persistent, adhesion, microtiter plate Säilytyspaikka – Förvaringställe – Where deposited Viikki Science Library Työn valvoja (professori tai dosentti) ja ohjaaja(t) – Instruktör och ledare – Director and Supervisor(s) Director: Hannu Korkeala Supervisor: Janne Lundén

SISÄLLYSLUETTELO

1 JOHDANTO ....................................................................................................2

2 KIRJALLISUUSKATSAUS ............................................................................3

2.1 LISTERIA MONOCYTOGENES.....................................................................................3

2.1.1 Taksonomia .............................................................................................................3

2.1.2 Ominaisuudet...........................................................................................................3

2.1.3 Esiintyminen ympäristössä.......................................................................................4

2.1.4 Patogeneesi ..............................................................................................................5

2.1.5 Listerioosi................................................................................................................6

2.2 LISTERIA MONOCYTOGENES ELINTARVIKETEOLLISUUDESSA .....................................8

2.2.1 Esiintyminen elintarvikkeissa ja elintarviketeollisuudessa ........................................8

2.2.2 Listeria monocytogeneksen aiheuttama laitoskontaminaatio....................................11

2.2.3 Listeria monocytogeneksen torjunta elintarviketeollisuudessa.................................14

2.3 BIOFILMIT ..........................................................................................................15

2.3.1 Biofilmien muodostuminen ....................................................................................15

2.3.2 Listeria monocytogeneksen muodostamat biofilmit.................................................16

2.3.3 Biofilmien tutkimusmenetelmät .............................................................................16

3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET ..................................................................19

4 AINEISTO JA MENETELMÄT ....................................................................19

4.1 LISTERIA MONOCYTOGENES -KANNAT....................................................................19

4.2 BIOFILMIN MUODOSTUKSEN TUTKIMINEN MIKROTIITTERILEVYLLÄ .......................20

4.3 TILASTOLLINEN ANALYYSI..................................................................................22

5 TULOKSET ...................................................................................................22

6 POHDINTA ...................................................................................................24

7 KIITOKSET...................................................................................................28

8 KIRJALLISUUSLUETTELO ........................................................................28

2

1 JOHDANTO

Listeria monocytogenes on merkittävä elintarvikevälitteinen patogeeni.

L. monocytogenes kuvailtiin ensimmäisen kerran jo 1924 (Murray ym. 1926), mutta

elintarvikevälitteisyys todistettiin vasta 1980-luvun alussa (Schlech ym. 1983).

L. monocytogenes -bakteeria esiintyy laajasti ympäristössä (Weis ym. 1975), jonka

seurauksena sitä päätyy myös elintarvikealan laitoksiin. Laitoksissa osa

L. monocytogenes -kannoista voi muodostaa persistoivan kontaminaation (Lundén

2004). Persistoivan kontaminaation muodostuminen on nykykäsityksen mukaan monen

eri tekijän summa. Siihen vaikuttavat esimerkiksi kannan kyky kiinnittyä pinnoille ja

hapon ja lämmön kestävyys (Lundén ym. 2000, Lundén ym. 2008). Lisäksi monet

L. monocytogenes -kannat voivat kehittää resistenssiä erilaisille desinfiointiaineille

(Lundén ym. 2003, Robbins ym. 2005, Pan ym. 2006). Tämän seurauksena laitoksiin

voi muodostua kantoja, joista on erittäin hankala päästä eroon. Elintarviketeollisuus on

kehittänyt sellaisia tuotantoprosesseja ja tuotteiden säilytystapoja, jotka suosivat

L. monocytogenesta. Tuotteissa suositaan pitkiä myyntiaikoja, suojakaasupakkaamista

ja kylmäsäilytystä. L. monocytogenes pärjää näissä olosuhteissa hyvin (Petran ym. 1989,

Hudson ym. 1994, Church ym. 1995). L. monocytogenes muodostaa riskin erityisesti

vanhuksille, raskaanaoleville ja immuunipuutoksen omaaville ihmisille (McLauchlin

1990b, Mylonakis ym. 1998). Näiden riskiryhmien osuus väestöstä kasvaa koko ajan.

Tämä lisensiaatin tutkielma sisältää kirjallisuuskatsauksen ja tutkimusosan.

Kirjallisuuskatsaus keskittyy erityisesti L. monocytogeneksen muodostamiin

biofilmeihin ja niiden tutkimiseen. Aluksi perehdytään kuitenkin L. monocytogeneksen

ominaisuuksiin ja sen rooliin elintarviketeollisuudessa.

Tutkimusosassa vertailtiin L. monocytogeneksen eri kantojen biofilmin muodostusta

Djordjevicin ym. (2002) kehittämällä mikrotiitterilevymenetelmällä. Samalla

menetelmästä pyrittiin tekemään sopiva muunnos Elintarvike- ja ympäristöhygienian

laitoksen tarpeisiin. Tutkimus kohdistui lähinnä L. monocytogeneksen kiinnittymisen

mittaamiseen. Samalla vertailtiin persistoivien ja ei-persistoivien kantojen

kiinnittymistä. Kiinnittymisellä on suuri merkitys elintarvikealan laitosten persistoivien

kontaminaatioiden synnyssä.

3

2 KIRJALLISUUSKATSAUS

2.1 Listeria monocytogenes

2.1.1 Taksonomia

Listeria monocytogenes kuuluu Listeria-sukuun, johon kuuluvat sen lisäksi nykyisen

käsityksen mukaan L. grayi, L. innocua, L. ivanovii, L seeligeri ja L. welshimeri.

Listeria-suvun tarkka fylogeneettinen sijainti on edelleen epäselvä (Rocourt ym. 2007).

Schmidin ym. (2005) tekemän fylogeneettisen analyysin, joka perustuu 16S- ja 23S-

rRNA:han, mukaan Listeria-lajit jakaantuvat kolmeen eri ryhmään. Yhden ryhmän

muodostavat L. monocytogenes ja L. innocua. Toisessa ryhmässä ovat L. welshimeri,

L. ivanovii ja L. seeligeri. L. grayi sijaitsee omassa ryhmässään ja edustaa Listeria-

suvun vanhinta osaa. Rocourtin ym. (2007) mukaan Listeria-suku jakaantuu

nykykäsityksen mukaan kahteen linjaan useiden eri tutkimusmenetelmien valossa.

L. grayi muodostaa yhden linjan ja loput Listeria-lajit toisen. L. monocytogenes jaetaan

serotyyppeihin somaattisten (O) ja flagellaaristen (H) antigeenien mukaan (Seeliger ym.

1979) Serotyyppejä on yhteensä 13kpl (Schönberg ym. 1996). Serotyypit ovat1/2a, 1/2b,

1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4c, 4d, 4e ja 7 (Rocourt ym. 2007). Elintarvikkeissa

esiintyvät useimmiten serotyypit 1/2a, 1/2b ja 1/2c (Gianfranceschi ym. 2003).

Listerioositapauksiin on useimmiten yhdistetty serotyypit 1/2a, 1/2b ja 4b (Graves ym.

2007).

2.1.2 Ominaisuudet

Listeria monocytogenes on pieni itiötön grampositiivinen sauva, joka on 1–2 µm pitkä

ja halkaisijaltaan 0,5 µm. Se esiintyy yleensä yksittäisinä soluina tai lyhyinä ketjuina.

Se on liikkuva kasvatettaessa 20–25 °C:ssa flagellan ansiosta (Rocourt ym. 2007).

Kaikkien tutkittujen Listeria-lajien genomi on ollut kooltaan 2,7–3,0 Mb ja GC-

pitoisuus on ollut 36,4–41,5 % (Hain ym. 2006).

L. monocytogenes voi kasvaa sekä aerobisissa että anaerobisissa oloissa. Monet

elintarvikkeet pakataan nykyään käyttäen hyväksi muunneltua ilmakehää. Tällaiset

4

elintarvikkeet voivat tarjota L. monocytogenekselle hyvät kasvuolosuhteet, sillä se

pystyy lisääntymään tyhjiö- ja suojakaasupakkauksissa (Hudson ym. 1994, Church ym.

1995). L. monocytogenes pystyy kasvamaan laajalla lämpötila-alueella (-1,5–45 °C)

(Petran ym. 1989, Hudson ym. 1994). Optimilämpötila on 30–37 °C välillä.

L. monocytogenes pystyy lisääntymään jääkaappilämpötiloissa ja muodostaa täten

elintarvikehygieenisen riskin. L. monocytogenes on lämpöresistentimpi kuin useimmat

muut itiöttömät ruokamyrkytyspatogeenit (Doyle ym. 2001). Tämän takia normaalit

Escherichia colille ja Salmonella-lajeille suunnitellut pastörointimenetelmät eivät

välttämättä vähennä L. monocytogeneksen määrää yhtä paljon (Orta-Ramirez ym. 2002).

L. monocytogenes voi kasvaa ainakin pH:ssa 4,7–9,2 (Petran ym. 1989). Phan-Thanhin

ym. (2000) tutkimuksessa osa kannoista selvisi pH:ssa 3,5. Sen pH-optimi on kuitenkin

lähellä neutraalia aavistuksen alkaalisella puolella (Pearson ym. 1990).

L. monocytogenes säilyy suurissa suolapitoisuuksissa ja voi kasvaa vielä 10 %:n

suolapitoisuudessa (McClure ym. 1989). Larsonin ym. (1999) tutkimuksessa

L. monocytogenesta eristettiin juustojen suolaamiseen käytetystä vedestä.

L. monocytogenes säilyi jopa 23,8 %:n suolapitoisuudessa yli 259 vuorokautta (4 °C

lämpötilassa, pH:n ollessa 4,9). L. monocytogenes säilyy ja jopa kasvaa melko

alhaisessa vesiaktiivisuudessa (Miller 1992). Nolanin ym. (1992) tutkimuksessa

L. monocytogenes pystyi kasvamaan 0,90 vesiaktiivisuudessa (aw) glyserolin läsnä

ollessa. L. monocytogeneksen kasvun optimaalinen aw on 0,97 kuten useimmilla

muillakin bakteereilla (Petran ym. 1989).

2.1.3 Esiintyminen ympäristössä

Listeria monocytogenesta esiintyy laajasti ympäristössä, jonka seurauksena ihmiset ja

eläimet altistuvat bakteerille helposti (Weis ym. 1975). L. monocytogenesta on eristetty

mm. maa-aineksesta, kasvillisuudesta (Weis ym. 1975), vedestä, jätevedestä (Watkins

ym. 1981), eläinten rehuista (erityisesti säilörehusta) (Grønstøl 1980) ja lintujen

ulosteista (Weis ym. 1975). Itse asiassa L. monocytogenes on eristetty lukuisten

eläinlajien ulosteista (Gray ym. 1966). Näin ollen on mahdollista, että eläimet voivat

erittää L. monocytogenesta ulosteisiinsa (Sauders ym. 2007). Myös ihmiset voivat

kantaa elimistössään L. monocytogenesta (Lamont ym. 1986, Schuchat ym. 1993)

L. monocytogenesta esiintyy yleisesti myös kodeissa. Beumerin ym. (1996)

tutkimuksessa eri Listeria-lajeja eristettiin 47,4 %:ssa tutkituista kodeista.

5

Tavallisimmat lajit olivat L. innocua ja L. monocytogenes. Suurimmat pitoisuudet

löytyivät tiskiräteistä ja -harjoista. Vaikka L. monocytogenestä esiintyy näin laajasti

ympäristössä, on valtaosa listerioosi-tapauksista elintarvikeperäisiä. Erityisen riskin

muodostavat valmisruuat (Hitchins ym. 2001). L. monocytogeneksen esiintymisesta

elintarvikkeissa ja elintarviketeollisuudessa kerrotaan tarkemmin kohdassa 2.2.1.

2.1.4 Patogeneesi

L. monocytogenes ja L. ivanovii ovat nykytiedon mukaan ainoat varsinaisesti

patogeeniset Listeria-lajit. L. monocytogenes voi aiheuttaa vakavan taudin sekä

ihmisillä että eläimillä (Gray ym. 1966). L. ivanovii on eläinpatogeeni aiheuttaen

lähinnä abortteja märehtijöillä (Alexander ym. 1992). L. innocuan aiheuttamasta

lampaan meningoenkefaliitista on raportoitu (Walker ym. 1994).

L. monocytogenes päätyy elimistöön pääasiassa suoliston kautta. Suolistosta se jatkaa

matkaansa paikallisten imusolmukkeiden kautta veren ja imunesteen välityksellä

maksaan ja pernaan (Werbrouck ym. 2006). Maksa on ensimmäinen varsinainen kohde-

elin, jossa L. monocytogenes lisääntyy aktiivisesti hepatosyyteissä (Werbrouck ym.

2006). Tämä saa aikaan T-soluvasteen, joka riittää tavallisesti eliminoimaan

L. monocytogenes-infektion (Werbrouck ym. 2006). Riskiryhmiin kuuluvilla

henkilöillä T-soluvaste ei ole riittävä ja infektio pääsee helpommin leviämään maksasta

veren kautta mm. keskushermostoon ja istukkaan (Werbrouck ym. 2006).

L. monocytogenes on fakultatiivinen intrasellulaarinen parasiitti (Mackaness 1962), joka

infektoi useita eri solutyyppejä kuten epiteliaalisoluja (Gaillard ym. 1987),

hepatosyyttejä (Dramsi ym. 1995) ja endoteelisoluja (Ireton ym. 1999). Se voi myös

lisääntyä makrofageissa (Mackaness 1962). Solun sisällä L. monocytogenes käy läpi

intrasellulaarisen elinkierron, joka sisältää kiinnittymisen isäntäsolun pintaan,

tunkeutumisen solun sisään, primaarirakkulasta vapautumisen, lisääntymisen

isäntäsolun sytoplasmassa, solunsisäisen liikkumisen ja leviämisen naapurisoluun

sekundaarirakkulassa (Tilney ym. 1989).

L. monocytogeneksella on tunnistettu useita geenejä, joiden avulla solunsisäinen kierto

tapahtuu. PrfA-proteiini, jota koodaa prfA, säätelee useiden solunsisäiseen kiertoon

tarvittavien geenien toimintaa (Mengaud ym. 1991a). Internaliinigeenien avulla bakteeri

6

pystyy kiinnittymään ja invasoitumaan eukaryoottisolun sisään. Internaliini A (inlA)

vaikuttaa erityisesti L. monocytogeneksen pääsyyn epiteelisoluihin (Mengaud ym. 1996)

ja interneliini B (inlB) esimerkiksi hepatosyytteihin (Dramsi ym. 1995) ja

endoteelisoluihin (Parida ym. 1998). Internalisaation jälkeen L. monocytogenes

vapautuu primaarirakkulasta listeriolysiinin (LLO) (Cossart ym. 1989) ja fosfatidyyli-

inositoli-fosfolipaasin (PI-PLC) avulla (Camilli ym. 1993). Listeriolysiini on myös

L. monocytogeneksen merkittävä virulenssitekijä (Cossart ym. 1989). Sitä koodaa hly-

geeni (Mengaud ym. 1988). Listeriolysiini tekee reikiä solukalvoon ja rakkulan kalvoon

ja edesauttaa näin rakkulasta vapautumisessa (Repp ym. 2002) Se aiheuttaa myös

verimaljoilla nähtävän hemolyysin (Kuhn ym. 2007). Fosfatidyyli-inositoli-

fosfolipaasilla on merkitystä erityisesti makrofageissa tapahtuvassa rakkulasta

vapautumisessa (Camilli ym. 1993). Sitä koodaa plcA-geeni (Mengaud ym. 1991b).

Vapautumisen jälkeen L. monocytogenes lisääntyy sytoplasmassa (Gaillard ym. 1987).

Generaatioaika on noin yksi tunti (Portnoy ym. 1988). L. monocytogenes voi liikkua

sytoplasmassa aktiinihännän avulla (Tilney ym. 1989). Se siirtyy solumembraanin

viereen ja muodostaa ulokkeen toisen solun sisään (Tilney ym. 1989). Tämän taustalla

on actA-geeni (Domann ym. 1992). Ulokkeen kautta se tunkeutuu naapurisoluun. Se on

hetkellisesti kahden solukalvon ympäröimä (Tilney ym. 1989). Se vapautuu kalvoista

LLO-, PI-PLC-, Mpl-, ja PC-PLC-proteiinien avulla (Kuhn ym. 2007). Viimeksi

mainittuja proteiineja koodaavat mpl- (Domann ym. 1991) ja plcB-geenit (Vazquez-

Boland ym. 1992). Mpl-proteiinilla on merkitystä PC-PLC:n proteolyyttisessä

aktivoinnissa, mutta se ei ole välttämätön sekundaarirakkulasta vapautumisessa

(Marquis ym. 1997). Sekundaarirakkulasta vapautumisen jälkeen uusi sykli voi jälleen

alkaa. Yksi sykli kestää noin 5 tuntia.

2.1.5 Listerioosi

Listeria monocytogenes voi aiheuttaa non-invasiivisen tai invasiivisen infektion.

Invasiivista muotoa tavataan erityisesti raskaana olevilla naisilla, syntyvillä lapsilla,

vanhuksilla ja immunipuutteisilla (esim. HIV-ja elinsiirtopotilaat) (Goulet ym. 1996,

Mylonakis ym. 1998). Esimerkiksi raskaana olevilla naisilla on 17-kertainen riski

sairastua listerioosiin (Silver 1998). Invasiivinen muoto voi ilmentyä esimerkiksi

meningiittinä tai septikemiana (McLauchlin 1990b). Listerioosi ilmenee raskauden

aikana tavallisesti kuumeena ja muina flunssan kaltaisina oireina (Lennon ym. 1984,

7

McLauchlin 1990a). Mylonakiksen ym. (2002) mukaan yli 20 % raskauden aikaisista

listerioositapauksista aiheutti keskenmenon ja 68,3 % syntyneistä lapsista oli

infektoitunut. Vastasyntyneillä tauti jaotellaan aikaiseen ja myöhäiseen muotoon

(Enocksson ym. 1990, McLauchlin 1990a). Aikaisessa muodossa on kyse

kohdunsisäisestä infektiosta ja oireet tulevat nopeasti syntymän jälkeen. Tällöin esiintyy

tyypillisesti pneumoniaa ja septikemiaa. Myöhäinen muoto ilmenee yleensä

meningiittinä muutaman viikon sisällä syntymästä. Kyseessä on todennäköisesti

synnytysteistä tai ympäristöstä saatu infektio (McLauchlin 1990a). L. monocytogenes

voi aiheuttaa non-invasiivisen gastroenteriitin muuten terveillä ihmisillä (Salamina ym.

1996, Anonyymi 1997). Tässä muodossa yleisimpinä oireina ovat kuume, ripuli, lihas-

ja nivelkivut sekä päänsärky. Tauti voi esiintyä myös flunssan kaltaisina oireina ilman

gastrointestinaalioireita (Sim ym. 2002).

Listerioositapausten esiintyvyys Euroopassa on 2000-luvulla ollut keskimäärin

3 tapausta/miljoona ihmistä (Denny ym. 2008). Tapausten määrä on lisääntynyt viime

vuosina (Denny ym. 2008). Listerioositapausten määrä Suomessa väkilukuun

suhteutettuna on vaihdellut 3–10 tapausta/miljoona ihmistä (Lyytikainen ym. 2006,

Denny ym. 2008). Vuonna 2006 Suomessa raportoitiin 46 listerioositapausta.

Raportoitujen listerioositapausten määrä Suomessa on pysynyt alle 50 (18–46/vuosi)

2000-luvulla (Denny ym. 2008). Listerioosin esiintyvyysluvut ovat melko alhaisia,

mutta L. monocytogenes on merkittävä elintarvikevälitteinen taudinaiheuttaja. Valtaosa

listerioosiin sairastuneista vaatii sairaalahoitoa (Jemmi ym. 2006) ja sairastuneista

kuolee noin 25 % (Goulet ym. 1996, de Valk ym. 2005).

Listerioosi on L. monocytogenes -bakteerin laaja-alaisesta esiintyvyydestä huolimatta

melko harvinainen sairaus. Notermansin ym. (1998) mukaan listerioosiin sairastuminen

onkin monen tekijän summa. Henkilön täytyy altistua suurelle määrälle

L. monocytogenes -bakteereja, joiden täytyy läpäistä suoliston suojamekanismit. Lisäksi

henkilön immuunivasteen on oltava hidastunut. Näin ollen suurikaan määrä

L. monocytogenes -bakteereja ei aiheuta aina tautia edes riskiryhmiin kuuluvalle

(Notermans ym. 1998). Lainsäädännössä onkin määritelty raja-arvoja L. monocytogenes

-bakteerien esiintyvyydelle elintarvikkeissa. Mikrobikriteeriasetuksen (2073/EY/2005)

mukaan terveille aikuisille ihmisille tarkoitetuissa elintarvikkeissa saa esiintyä

L. monocytogenesta 100 pesäkettä muodostavaa yksikköä grammassa elintarviketta.

8

Raja-arvojen asettaminen on tärkeää, sillä lähes kaikki L. monocytogenes -infektiot ovat

peräisin elintarvikkeista (Mead ym. 1999, Denny ym. 2008). Tavallisimmin infektio on

peräisin sellaisenaan syötävistä elintarvikkeista, joilla on pitkä myyntiaika (Hitchins ym.

2001).

Listerioosia esiintyy myös eläimillä. L. monocytogenes on merkittävä taudin aiheuttaja

erityisesti märehtijöillä, kuten lampailla, vuohilla ja naudoilla (Wesley 2007).

Listerioosi ilmenee tavallisesti enkefaliittina, abortteina ja septikemiana (Low ym.

1985). Septikemiaa esiintyy lähinnä vastasyntyneillä (Cooper ym. 1998). Listerioosin

on raportoitu ilmenevän myös iriittinä ja keratokonjunktiviittina (Walker ym. 1993).

Myös L. ivanovii voi aiheuttaa abortteja märehtijöillä (Alexander ym. 1992).

Listerioosi-infektiot ovat todennäköisesti tavallisimmin peräisin säilörehusta (Gray

1960). Linnut ja muut eläimet voivat kontaminoida ruohon L. monocytogeneksella jo

ennen niittämistä. Näin bakteeri voi päätyä säilörehupaaleihin ja se pystyy lisääntymään

niissä. Kasvua esiintyy erityisesti fermentoinnin epäonnistuessa (Fenlon 1985).

Listerioosi voi siirtyä kotieläimistä ihmisiin erityisesti synnytysavun yhteydessä

aiheuttaen harvinaisen kutaanisen listerioosin (McLauchlin ym. 1994).

2.2 Listeria monocytogenes elintarviketeollisuudessa

2.2.1 Esiintyminen elintarvikkeissa ja elintarviketeollisuudessa

Listeria monocytogenesta esiintyy laajalti myös elintarviketeollisuudessa.

L. monocytogenesta eristetään sekä raaka-aineista että valmiista tuotteista. Se voi päätyä

elintarvikkeisiin ja niiden raaka-aineisiin monia eri reittejä pitkin (kuva 1). Ihmiset ja

eläimet voivat levittää L. monocytogenesta ulosteissaan (Schuchat ym. 1993, Sauders

ym. 2007). Maaperästä ja luonnon vesistä on eristetty L. monocytogenesta (Weis ym.

1975, Watkins ym. 1981). Useissa elintarvikkeiden raaka-aineissa esiintyy

L. monocytogenesta. Sitä on eristetty mm. raakamaidosta (Moshtaghi ym. 2007), lihasta

(Bohaychuk ym. 2006), kalasta (Miettinen ym. 2005) ja vihanneksista (Beuchat 1996).

L. monocytogeneksen esiintyminen eri raaka-aineissa vaihtelee huomattavasti eri maissa

ja eri tutkimuksissa (Jay 1996). Ruotsalaisessa tutkimuksessa L. monocytogenesta ei

löytynyt lainkaan tuoreesta sianlihasta (0/45) (Ternström ym. 1987). Samoihin aikoihin

Uudessa-Seelannissa tehdyssä tutkimuksessa L. monocytogeneksen prevalenssi

9

sianlihassa oli yli 50 % (17/25) (Lowry ym. 1988). Suurta vaihtelua on esiintynyt myös

esimerkiksi vihannesten L. monocytogenes -prevalensseissa. Amerikkalaisessa

tutkimuksessa L. monocytogenesta eristettiin 27,1 %:sta (19/70) tutkituista perunoista

(Heisick ym. 1989). Italialaisessa tutkimuksessa L. monocytogenesta löytyi vain

6,9 %:ssa (7/102) tutkituista pakastevihanneksista (Gola ym. 1990). Vihannekset

saattavat siis lisätä riskiä sairastua listerioosiin, sillä ne syödään usein sellaisenaan, eikä

L. monocytogenes näin ollen tuhoudu ennen syömistä. Myös pastöroimattoman maidon

juominen aiheuttaa kohonneen riskin sairastua listerioosiin. Raakamaidon

L. monocytogenes -prevalenssit ovat vaihdelleet nollasta (0/100) lähes 20 %:iin ( 10/51)

eri tutkimuksissa (Ryser 2007).

Kuva 1: Listeria monocytogeneksen kulkeutuminen luonnossa. Lähde:

Korkeala ym. 2007.

Saastuneiden raaka-aineiden myötä L. monocytogenesta voi päätyä valmiiseen

tuotteeseen (Norton ym. 2001). Useimmiten L. monocytogenes kuitenkin vähenee

valmistusprosessin aikana turvalliselle tasolle (Mackey ym. 1990). Kyseessä onkin

tavallisesti jälkikontaminaatio, jolloin kypsä tuote saastuu L. monocytogeneksella

10

esimerkiksi kuumennuskäsittelyn jälkeen kontaminoituneen prosessilaitteen tai pinnan

välityksellä (Farber ym. 1991, Tompkin 2002). Elintarvikkeella onkin suurempi riski

kontaminoitua L. monocytogeneksella, jos sitä esimerkiksi siivutetaan (Uyttendaele ym.

1999).

L. monocytogeneksen esiintymistä on tutkittu myös prosessoiduissa elintarvikkeissa.

Italialaisessa tutkimuksessa L. monocytogenesta löydettiin mm. savustetusta lohesta,

siipikarjatuotteista, maidosta, juustosta ja makkaroista (Latorre ym. 2007). Savustetussa

lohessa L. monocytogeneksen prevalenssi oli 10,6 % (11/104), mutta muissa

elintarvikkeissa prevalenssit olivat kuitenkin pieniä (Latorre ym. 2007). Eri

tutkimuksissa on ollut huomattavaa vaihtelua L. monocytogeneksen esiintymisessä.

Tässä italialaisessa tutkimuksessa kokonaisprevalenssi oli 2,1 % (121/5788) ja

sellaisenaan syötävien elintarvikkeiden 1,9 % (74/3827) (Latorre ym. 2007).

Amerikkalaisessa tutkimuksessa sellaisenaan syötävien elintarvikkeiden Listeria

monocytogenes -prevalenssi vaihteli 0,2–4,7 %. Alhaisin esiintyvyys oli tuoreissa

pehmeissä juustoissa ja suurin salaateissa, jotka sisälsivät meren antimia (Gombas ym.

2003). Pehmeät juustot on toisaalla mainittu riskialttiiksi maitotuotteeksi (Lundén 2004).

Nykykäsityksen mukaan suurin riski sairastua listerioosiin liittyy kypsytettyjen

pehmeiden juustojen (esim. homejuustot) lisäksi kylmäsavukalan ja graavatun kalan

syömiseen, sillä L. monocytogenes ei tuhoudu näiden valmistusprosessissa.

Suomalaisten suositusten mukaan näitä tulisikin raskaana olevien naisten välttää

(Terveyden ja hyvinvoinnin laitos 2009).

L. monocytogeneksen siirtyminen elintarvikkeista ihmisiin paljastui 1980-luvun alussa

(Schlech ym. 1983). Useat epidemiat 1980-luvulla ovat olleet peräisin

pastöroimattomasta maidosta tehdyistä juustoista. L. monocytogenesta esiintyy

juustoissa edelleen melko yleisesti, mutta juustosta peräisin olevat epidemiat ovat

vähentyneet (Rudolf ym. 2001). L. monocytogenes on aiheuttanut vuosien kuluessa

useita epidemioita myös muiden elintarvikkeiden välityksellä. Listerioosiepidemioiden

aiheuttajiksi ovat paljastuneet juuston lisäksi mm. voi (Lyytikainen ym. 2000),

kylmäsavukala (Miettinen ym. 1999b) ja pastöroitu maito (Dalton ym. 1997) .

L. monocytogenesta on eristetty raaka-aineiden ja tuotteiden lisäksi tuotantolaitteista

tuotannon eri vaiheista. L. monocytogenes onkin erittäin yleinen laitosten kontaminantti

11

ja sitä eristetään usein myös siivouksen jälkeen. Aution ym. (1999) tutkimuksessa

tarkkailtiin L. monocytogeneksen esiintymistä kala-alan laitoksen tuotantotiloissa.

L. monocytogenes eristettiin 13 %:sta (16/122) siivouksen jälkeen/ennen tuotannon

alkua otetuista näytteistä. Tuotannon aikana L. monocytogeneksen prevalenssi oli 30 %

(19/65). Esimerkiksi siivutuskoneet olivat kontaminoituneet L. monocytogeneksella jo

ennen tuotannon alkua ja näin ollen pystyivät levittämään L. monocytogenesta edelleen

tuotannon aikana. L. monocytogeneksen esiintymistä tuotantoympäristöissä on tutkittu

myös liha-alan laitoksissa. Chasseignauxin ym. (2002) tutkimuksessa tarkasteltiin

L. monocytogeneksen esiintymistä sianlihan ja siipikarjan lihan tuotannossa.

L. monocytogenesta löytyi 38 %:sta tuotannon aikaisista näytteistä. Vastaava

prevalenssi siivouksen jälkeen oli 7,7 %. Pääasiassa kontaminaatio löytyi lattiapinnoilta,

mutta myös osa prosessilaitteista oli kontaminoitunut. Maitoalan laitokset ovat

tavallisesti vähemmän kontaminoituneita kuin liha- ja kala-alan laitokset (Lundén 2004).

Miettisen ym. (1999a) tutkimuksessa jäätelötehtaasta (ympäristö, prosessilaitteet, tuote)

otetuissa näytteissä saatiin kokonaisprevalenssiksi 2,8 % (71/2545).

2.2.2 Listeria monocytogeneksen aiheuttama laitoskontaminaatio

Listeria monocytogenesta voi löytyä raaka-aineiden ja tuotteiden lisäksi laitoksen

rakenteista ja prosessilaitteista. Suurimman ongelman muodostavat ns. persistoivat

L. monocytogenes -kannat, joita eristetään tuotantoympäristöstä toistuvasti

desinfiointitoimista huolimatta. Nämä kannat eivät ole yleensä lähtöisin tuotteiden

raaka-aineista (Rørvik ym. 1995, Nesbakken ym. 1996). L. monocytogenesta esiintyy

yleisesti esimerkiksi tuotantotilojen lattiakaivoissa (Rørvik ym. 1997, Autio ym. 1999).

Tämä ei suoranaisesti lisää elintarvikkeiden kontaminaatioriskiä, vaan on osoituksena

siitä, että tiloissa esiintyy L. monocytogenesta (Rørvik ym. 1997). Monet

tuotantolaitteet ovat rakenteeltaan monimutkaisia ja hankalasti desinfioitavissa (Autio

ym. 1999). Laitteisiin jää helposti orgaanista jätettä, joka on vaikeasti puhdistettavissa.

Tällöin muodostuvat hyvät kasvuolosuhteet L. monocytogenekselle (Korkeala ym.

2007). Esimerkiksi siivutuskone voi olla kontaminoitunut persistoivalla kannalla ja näin

ollen se voi saastuttaa tuotteita siivutuksen yhteydessä (Autio ym. 1999).

Persistoivat kannat ovat kantoja, joita eristetään tuotantolaitoksesta toistuvasti pitkällä

aikavälillä. Useissa tutkimuksissa on todettu, että tietty L. monocytogenes -kanta on

12

esiintynyt tietyssä elintarvikealan laitoksessa useita vuosia. Esimerkiksi Nesbakkenin

ym. (1996) tutkimuksessa eräs L. monocytogenes -kanta persistoi samassa laitteessa

neljän vuoden ajan. Suomalaisessa tutkimuksessa havaittiin erään kannan persistoineen

jäätelötehtaassa jopa seitsemän vuoden ajan (Miettinen ym. 1999a).

L. monocytogeneksen kontaminaatioreittejä on pyritty selvittämään eri tutkimuksissa.

Nesbakkenin ym. (1996) tutkimuksessa havaittiin, että vain harvoin lopputuotteessa

esiintyy sama L. monocytogenes -kanta kuin raaka-aineissa. Lopputuotteen

kontaminaatio onkin todennäköisemmin peräisin tuotantoympäristöstä kuin raaka-

aineista, vaikka laitoksen kontaminaatio on todennäköisesti alun perin lähtöisin raaka-

aineista (Lawrence ym. 1995, Hoffman ym. 2003). Nesbakkenin ym. (1996)

tutkimuksessa löydettiin samoja kantoja tuotantolaitteista, niiden tuottamasta jätteestä ja

valmiista tuotteista. Tämä antaa aiheen epäillä tuotantolaitteen siirtävän kontaminaation

valmiiseen tuotteeseen.

Vielä on epäselvää, mitkä tekijät johtavat persistoivaan kontaminaatioon.

Nykykäsityksen mukaan persistoivan kontaminaation muodostuminen on

todennäköisesti monen tekijän summa. Persistoivien kantojen on todettu kiinnittyvän

nopeammin teräspinnoille kuin ei-persistoivien (Lundén ym. 2000). Kiinnittyminen

lisää bakteerin kestävyyttä erilaisille torjuntatoimille. Lisäksi kantojen välillä on

havaittu eroja happo- ja lämpökestävyydessä (Lundén ym. 2008). Lundénin ym. (2008)

tutkimuksessa persistoivat kannat kestivät happamia olosuhteita ei-persistoivia kantoja

paremmin. Lisäksi havaittiin merkittäviä eroja kantojen lämpökestävyydessä. Näillä

tekijöillä voi olla merkitystä persistoivan kontaminaation muodostumisessa.

Persistoivan kontaminaation syntyyn vaikuttaa kantojen ominaisuuksien ohella

todennäköisesti myös tuotantolinjan rakenne. Oikeanlaisella osastoinnilla voidaan

ainakin osittain ennaltaehkäistä persistoivan kontaminaation muodostumista (Lundén

ym. 2003).

Persistoivat kannat ovat oletettavasti myös sopeutuneet erilaisiin

desinfiointitoimenpiteisiin ei-persistoivia kantoja paremmin (Aase ym. 2000).

Todennäköisesti ainakin osatekijänä vaikuttaa se, että L. monocytogeneksella on monia

eri keinoja pärjätä desinfiointiaineita vastaan. Sen kestävyys on lisääntynyt mm.

13

kvaternäärisiä ammoniumyhdisteitä vastaan (Aase ym. 2000). Kestävyyden

lisääntyminen perustuu todennäköisesti aktiiviseen ulosvirtausmekanismiin eli solut

pumppaavat desinfiointiainetta ulos itsestään (Aase ym. 2000) Lisäksi

L. monocytogeneksella on kyky sopeutua desinfiointiaineisiin. Jos L. monocytogenes

altistuu desinfiointiaineelle, jonka pitoisuus on subletaali, se voi subletaalin altistuksen

myötä sopeutua kestämään huomattavasti aiempaa korkeampia kyseisen aineen

pitoisuuksia. Lundénin ym. (2003) tutkimuksessa havaittiin, että subletaalin altistuksen

jälkeen kestävyys tutkitulle desinfiointiaineelle lisääntyi enimmillään 15-kertaiseksi.

Samassa tutkimuksessa seurattiin myös subletaalin altistuksen myötä syntyneen

kestävyyden säilymistä ja siinä oli selkeitä eroja desinfiointiaineesta riippuen.

Esimerkiksi natriumhypokloriittia kohtaan kestävyys hävisi viikossa, mutta

kvaternäärisiä ammoniumyhdisteitä vastaan se oli huomattavasti pitempi.

Huolestuttavaa on lisäksi se, että on havaittu, että subletaalista altistumisesta yhdelle

desinfiointiaineelle, voi seurata myös ristisopeutumista. Subletaali altistuminen yhdelle

desinfiointiaineelle aiheuttaa siis kestävyyden lisääntymistä myös muita

desinfiointiaineita kohtaan (Lundén ym. 2003). Lundénin ym. (2003) tutkimuksessa

kaliumpersulfaatti oli ainoa desinfiointiaine, jota vastaan kestävyys ei lisääntynyt. Se

aiheutti kuitenkin ristiresistenssiä muita desinfiointiaineita kohtaan. Lundénin ym.

(2003) tutkimuksessa lisääntynyt kestävyys ei muodostunut kuitenkaan niin suureksi,

että se olisi ylittänyt elintarviketeollisuudessa käytetyt pitoisuudet. Kestävyyden

lisääntymisellä on kuitenkin merkitystä tilanteissa, joissa desinfiointiaineiden pitoisuus

jää jostakin syystä liian alhaiseksi. Tällainen tilanne voi muodostua esimerkiksi

erityisen likaisia, märkiä tai vaikeasti saavutettavia paikkoja desinfioitaessa (Aase ym.

2000, Lundén ym. 2003).

L. monocytogeneksen kestävyyttä erilaisille tuhoamiskäsittelyille ja desinfiointiaineille

on selvitelty useissa tutkimuksissa. Aarnisalon ym. (2000) tutkimuksessa vertailtiin

kymmenen eri desinfiointiaineen tehoa kahdeksaan eri L. monocytogenes -kantaan.

Desinfiointiaineet olivat riittävän tehokkaita suspensiotestissä, mutta

desinfiointiaineiden teho aleni tutkittaessa vaikutusta ruostumattomasta teräksestä

valmistetuilla pinnoilla, joiden päälle oli ensin inokuloitu L. monocytogenesta. Teho

heikkeni erityisesti likaisilla pinnoilla. Robbinsin ym. (2005) tutkimuksessa vertailtiin

kolmen eri desinfiointimenetelmän (otsoni, kloori ja vetyperoksidi) tehoa kahteen

L. monocytogenes -kantaan. Molempia kantoja tutkittiin sekä planktonisina että

14

biofilmissä elävinä soluina. Tutkimuksessa havaittiin, että biofilmissä elävät solut

tarvitsevat selvästi suurempia pitoisuuksia kuin planktoniset solut tuhoutuakseen.

Kaikki tutkitut desinfiointimenetelmät olivat kuitenkin tehokkaita myös biofilmeissä

eläviä soluja vastaan.

2.2.3 Listeria monocytogeneksen torjunta elintarviketeollisuudessa

Listeria monocytogeneksen torjunta alkaa jo alkutuotannosta. Säilörehu on valmistettava

mahdollisimman hyvin, jotta mukaan ei joudu maa-ainesta ja pH pysyy alle 4,0.

Hyvälaatuinen säilörehu vähentää tuotantoeläinten altistusta L. monocytogenekselle

(Fenlon 1985). Tämän seurauksena elintarviketeollisuuden raaka-aineissa kuten lihassa

ja maidossa on todennäköisesti vähemmän L. monocytogenesta.

Elintarviketeollisuudessa tärkein L. monocytogeneksen torjuntavaihe on

jälkikontaminaation estäminen. Rotterudin ym. (1991) tutkimuksessa havaittiin, että

valmiin tuotteen L. monocytogenes -kontaminaatio johtuu todennäköisemmin tuotteen

jälkikontaminaatiosta kuin riittämättömästä kuumennuskäsittelystä. Jälkikontaminaation

estämiseen pyritään mm. osastoinnilla. Raaka-aineita ja valmiita tuotteita käsitellään eri

tiloissa, jotta raaka-aineet eivät voi saastuttaa kypsää tuotetta. Osastoinnin onkin todettu

vaikuttavan merkittävästi tuotantolaitoksen L. monocytogeneksen aiheuttaman

kontaminaation määrään (Lundén ym. 2003). Jälkikontaminaatiota pyritään

ehkäisemään myös koneiden hygienialla. Koneiden tulee olla helposti puhdistettavia.

Myös työskentelyhygienialla on merkitystä. Nesbakkenin ym. (1996) mukaan

tärkeimmät keinot estää L. monocytogeneksen aiheuttama tuotteiden kontaminaatio ovat

hyvät tuotantotavat (GMP=good manufacturing practices) ja kriittisten

kontrollipisteiden huomioiminen tuotannon aikana.

Torjuntaan kuuluu myös jatkuva L. monocytogenes -seuranta. Seurannassa pyritään

tutkimaan kattavasti tuotantoympäristöstä otettuja näytteitä (Tompkin 2002). Lisäksi

erityisesti riskielintarvikkeita tulee seurata (Tompkin 2002).

Jos laitokseen muodostuu persistoiva L. monocytogenes -kanta torjuntatoimista

huolimatta, on puhdistustoimenpiteitä parannettava. Persistoivasta

L. monocytogenes -kontaminaatiosta on vaikea päästä eroon. Miettisen ym. (1999a)

15

tutkimuksessa havaittiin, kuinka tärkeää on löytää saastuneet kohdat, jotta

desinfiointitoimenpiteet voidaan kohdentaa oikein. Tehostetulla ja oikein kohdistetulla

puhdistamisella/desinfioinnilla päästiin tässä tutkimuksessa eroon seitsemän vuotta

persistoineesta L. monocytogenes -kontaminaatiosta. Aution ym. (1999) tutkimuksessa

selvitettiin kala-alan laitoksen kontaminaatiopaikkoja ja tämän jälkeen tehtiin

kohdennettu eradikaatiosuunnitelma. Eradikoinnissa käytettiin kuumaa vettä, höyryä ja

ilmaa. Viisi kuukautta puhdistamisen jälkeen otetuissa näytteissä ei löytynyt

L. monocytogenesta. Oikein kohdennetuilla puhdistustoimenpiteillä voidaan päästä

eroon persistoivasta L. monocytogenes -kontaminaatiosta.

2.3 Biofilmit

2.3.1 Biofilmien muodostuminen

Biofilmi tarkoittaa soluja, jotka ovat kiinnittyneet pinnalle pysyvästi jääden samalla

solunulkoisen polymeerisen aineksen sisään (Donlan 2002). Tämä aines koostuu

pääasiallisesti polysakkarideista (Jones ym. 1969). Useat eri bakteerit voivat muodostaa

biofilmejä. Nykykäsityksen mukaan ilmeisesti mikään bakteeri ei elä täysin

planktonisessa tilassa (Carpentier ym. 1993). Biofilmeillä on suuri merkitys

elintarviketeollisuudessa, koska biofilmeissä elävät bakteerit ovat usein kestävämpiä

erilaisia teollisuudessa käytettyjä puhdistustoimenpiteitä vastaan (Carpentier ym. 1993).

Näin ollen biofilmit voivat kontaminoida jatkuvasti tuotteita päivittäisistä

puhdistustoimenpiteistä huolimatta. Biofilmit ovat ongelma myös lääketieteessä, sillä

biofilmejä voi muodostua mm. virtsatiekatetreihin ja virtsarakon pintaan (Jacobsen ym.

2008). Toisaalta biofilmejä hyödynnetään mm. jäteveden puhdistuksessa (Stams ym.

1997).

Biofilmin muodostuminen edellyttää solujen kiinnittymistä pinnalle. Tämä tapahtuu

kahdessa vaiheessa. Aluksi solut kiinnittyvät reversiibelisti pintaan pääasiassa

hydrofobisilla yhteisvaikutuksilla (Marshall ym. 1971, Carpentier ym. 1993). Solut

lähtevät vielä helposti pesemällä irti (Marshall ym. 1971). Sitten seuraa irreversiibeli

kiinnittyminen, jolloin solut tuottavat eksopolysakkarideja. Solut jäävät tuottamiensa

eksopolysakkaridien sisään (Dunne 2002). Tämän vaiheen jälkeen solujen irroittaminen

edellyttää huomattavasti suurempia voimia (esim. raaputtamista) (Marshall ym. 1971).

16

2.3.2 Listeria monocytogeneksen muodostamat biofilmit

Listeria monocytogenes voi kiinnittyä useille erilaisille pinnoille, joita käytetään

elintarviketeollisuudessa. Sen kiinnittymistä on tutkittu mm. ruostumattomaan teräkseen,

kumiin, polypropyleeniin, lasiin (Mafu ym. 1990) ja tefloniin (Blackman ym. 1996).

Kiinnittymistä tapahtuu siis sekä hydrofiilisille (ruostumaton teräs) että hydrofobisille

(teflon) pinnoille (Blackman ym. 1996). L. monocytogenes voi kiinnittyä kohtuullisen

nopeasti. Mafun ym. (1990) tutkimuksessa L. monocytogenes kiinnittyi erilaisille

pinnoille 20 minuutissa. Chaen ym. (2000) tutkimuksessa vertailtiin eri

L. monocytogenes -kantojen kiinnittymistä ja biofilmin muodostusta lasipinnoilla.

Kaikki tutkitut kannat kiinnittyivät lasiin kolmen tunnin kuluessa ja muodostivat

biofilmin vuorokaudessa. Eri kantojen välillä oli kuitenkin havaittavissa merkittäviä

eroja kiinnittyneiden solujen määrässä. Norwoodin ym. (1999) ja Lundénin ym. (2000)

tutkimuksissa elintarviketeollisuudesta eristetyillä persistoivilla kannoilla oli korkeampi

kiinnittyvyys kuin ei-persistoivilla kannoilla. L. monocytogenes muodostaa biofilmejä

laajalla lämpötilavälillä. L. monocytogeneksen biofilmin muodostusta on tutkittu ja sen

on havaittu onnistuvan 4-45 °C (Mafu ym. 1990, Smoot ym. 1998, Moltz ym. 2005).

Kiinnittymistä tapahtuu myös melko laajalla pH-alueella. Smootin ym. (1998)

tutkimuksessa kiinnittymistä tapahtui pH:ssa 4-9.

2.3.3 Biofilmien tutkimusmenetelmät

Biofilmien tutkimusmenetelmiä on lukuisia. Osa niistä perustuu biofilmin suoraan

osoittamiseen esimerkiksi mikroskopoimalla. Osa menetelmistä on ns. epäsuoria

menetelmiä, joissa mitataan jotakin muuta asiaa esim. optista tiheyttä ja sen avulla

saadaan arvio biofilmin muodostuksesta. Mikroskopointiin perustuvissa menetelmissä

voidaan käyttää mm. valomikroskopiaa (Harvey ym. 2007),

epifluoresenssimikroskopiaa (Djordjevic ym. 2002), konfokaalista laserpyyhkäisy-

mikroskopiaa (Chae ym. 2000), läpäisyelektronimikroskopiaa (Christensen ym. 1982) ja

pyyhkäisyelektronimikroskopiaa (Chavant ym. 2007). Epäsuorat menetelmät ovat usein

kolorimetrisiä menetelmiä eli niissä kiinnittyneet solut pestään, värjätään, väri

liuotetaan ja liuoksen optinen tiheys mitataan. Epäsuorissa menetelmissä käytetään

tavallisesti putkia tai mikrotiitterilevyjä apuna. Mikrotiitterilevyyn perustuvasta

17

menetelmästäkin on olemassa useita eri muunnoksia (Christensen ym. 1985, Stepanovic

ym. 2000, Djordjevic ym. 2002, Harvey ym. 2007). Osaa biofilmin

tutkimusmenetelmistä voidaan pitää lähinnä kvalitatiivisina, valtaosan ollessa kuitenkin

kvantitatiivisia.

Mikroskopointi on laajassa käytössä oleva biofilmin tutkimusmenetelmä. Se on ainoa

keino tutkia ja havannoida biofilmiä suoraan. Toinen tavanomainen menetelmä

mikroskopoinnin lisäksi on menetelmä, jossa kiinnittyneet solut ensin irrotetaan ja sitten

viljellään (Vesterlund ym. 2005). Tässä menetelmässä bakteerikantaa kasvatetaan ensin

esimerkiksi koeputkessa elatusliemessä. Liemi ja vapaat bakteerisolut kaadetaan pois

inkuboinnin päätteeksi. Tilalle lisätään uusi liemi. Sitten putken pintaan kiinnittyneet

solut irrotetaan esimerkiksi vorteksoimalla. Liemestä valmistetaan laimennossarja. Eri

laimennokset viljellään ja inkuboidaan. Inkuboinnin jälkeen lasketaan pesäkkeet.

Pesäkemäärien ja laimennuskertoimien avulla voidaan laskea kiinnittyneiden solujen

määrä alkuperäisessä liuoksessa. Menetelmän huonoja puolia ovat sen työläys sekä se,

että elävät mutta ei-viljeltävät solut jäävät havaitsematta (Rahman ym. 1994). Myös

irrotusvaiheessa kuolleet solut jäävät havaitsematta (Vesterlund ym. 2005).

Myös mikroskopointimenetelmät ovat työläitä, sillä mikroskopointia edeltää

monivaiheinen näytteiden valmistus ja itse mikroskopointivaiheessa edellytetään

useiden näkökenttien laskemista, jotta voidaan minimoida laskennasta johtuvat virheet

(Vesterlund ym. 2005). Mikroskopoinnin etuna on biofilmin suora tarkastelu.

Mikroskopointimenetelmistä on useita muunnoksia (Christensen ym. 1982, Chae ym.

2000, Djordjevic ym. 2002, Chavant ym. 2007, Harvey ym. 2007). Esimerkiksi

epifluoresenssimikroskopia perustuu fluoresoivaan väriaineeseen, joka kiinnittyy DNA-

molekyyleihin (Djordjevic ym. 2002). Epifluoresenssimikroskopia voi aliarvioida

biofilmin määrää, sillä biofilmin paksuutta ei mitata. Toisaalta se voi myös yliarvioida

solujen peittämiä alueita, sillä osa solunulkoisista polymeereistä voi värjäytyä

(Blackman ym. 1996). Huomattavaa on myös, että mikroskopoimalla 50 näkökenttää

pystytään tutkimaan vain noin 0,135mm2 alue, kun taas mikrotiitterilevyllä tutkitaan

kokonaisen kuopan pinta-ala eli n. 130mm2 (Djordjevic ym. 2002). Mikroskopointi-

menetelmiä hyödynnetään usein epäsuorien menetelmien rinnalla.

18

Laajasti käytössä olleita epäsuoria biofilmien tutkimusmenetelmiä ovat olleet

esimerkiksi Christensenin ym. (1982, 1985) kehittämät putkitesti ja

standardimikrotiitterilevytesti. Putkitestissä tutkittavaa bakteerikantaa kasvatetaan

liemessä lasi- tai muoviputkessa. Inkuboinnin jälkeen suspensio poistetaan ja putkeen

lisätään väriainetta. Ylimääräinen väri pipetoidaan pois ja putki pestään. Putket jätetään

kuivumaan ylösalaisin. Testi on positiivinen, jos putkeen jää värjäytynyttä materiaalia

eli kiinnittyneitä soluja. Putkitesti toimii vain kvalitatiivisena menetelmänä. Se siis

vastaa kysymykseen, onko biofilmiä ylipäätään muodostunut vai ei (Christensen ym.

1982). Christensenin ym. (1985) kehittämässä standardimikrotiitteritestissä

bakteerisuspensiota kasvatetaan mikrotiitterilevyllä. Inkuboinnin jälkeen kuopat

tyhjennetään, pestään ja kiinnittyneet solut fiksoidaan ja värjätään. Ylimääräinen väri

huuhdellaan pois ja levyn annetaan kuivua. Kuivumisen jälkeen mitataan levyn

kuoppien optiset tiheydet. Menetelmä on kvantitatiivinen, mutta se huomioi vain

kuopan pohjalle kiinnittyneet solut (Stepanovic ym. 2000).

Stepanovic ym. (2000) ovat kehittäneet Christensenin ym. (1985) menetelmää eteenpäin.

He ovat lisänneet värjäyksen jälkeen yhden lisävaiheen, joka irrottaa kiinnittyneen värin

ja näin päästään mittaamaan väriliuoksen optista tiheyttä. Menetelmän etuna on, että se

huomioi kuoppien pohjiin kiinnittyneiden solujen lisäksi kuoppien seinämiin

kiinnittyneet solut. Tästä menetelmästä on kehitetty lukuisia muunnelmia, joissa

käytetyt reagenssit ym. vaihtelevat. Periaate on kuitenkin sama. Eräs näistä

muunnelmista on Djordjevicin ym. (2002) kehittämä muunnos, johon tutkimusosani

perustuu.

Uusia biofilmien tutkimusmenetelmiä kehitetään jatkuvasti. Guilbaud ym. (2005) ovat

kehittäneet reaaliaikaiseen polymeraasiketjureaktioon perustuvan menetelmän. Heidän

mukaansa menetelmän etuja ovat nopeahko suoritus ja helppo käyttöisyys. Chavant ym.

(2007) ovat kehittäneet menetelmän nimeltä BioFilmRing Test®. Menetelmä perustuu

kiinnittyneiden solujen aiheuttamaan magneettisten helmien immobilisaatioon. Testi

suoritetaan erityisellä mikrotiitterilevyllä. Levyn kuoppiin lisätään magneettisia helmiä,

jotka tarttuvat kiinnittyneisiin bakteereihin. Kun kuoppien alle laitetaan magneetit,

kiinnittymättömät helmet siirtyvät kuoppien pohjaan mustaksi napiksi. Jos mustaa

täplää ei muodostu, on kuoppaan muodostunut biofilmi ja helmet ovat kiinni biofilmissä.

Chavantin ym. (2007) mukaan menetelmän hyviä puolia ovat nopeus, luotettavuus ja

19

toistettavuus. Menetelmällä voidaan tutkia useita kantoja nopeasti. Menetelmään ei

kuulu pesu- ja värjäysvaiheita, joiden on todettu olevan aikaa vieviä ja aiheuttavan

suurta vaihtelua tuloksiin (Vesterlund ym. 2005).

3 TUTKIMUKSEN TAVOITTEET

Tutkimuksen tavoitteena oli pystyttää mikrotiitterilevytesti Listeria monocytogeneksen

kiinnittymisen tutkimiseen. Lisäksi tavoitteena oli tutkia ja vertailla eri kantojen

kiinnittymistä. Kyseessä on Djordjevicin ym. (2002) kehittämä menetelmä, jonka avulla

on mahdollista tutkia useita kantoja samanaikaisesti ja saada kunkin kannan biofilmin

muodostuksesta useita toistoja nopeasti. Menetelmää ei ollut aiemmin käytetty

Helsingin yliopiston eläinlääketieteellisen tiedekunnan elintarvike- ja

ympäristöhygienian laitoksella, joten tarkoituksena oli myös muokata menetelmä

laitokselle sopivaksi ja ottaa se mahdollisesti rutiinikäyttöön L.

monocytogenes -bakteerin biofilmin muodostuksen tutkimisessa. Tavoitteena oli siis

kehittää toistettavampi, helpompi ja nopeampi menetelmä L. monocytogenes -bakteerin

kiinnittymisen tutkimiseen.

4 AINEISTO JA MENETELMÄT

4.1 Listeria monocytogenes -kannat

Tutkittavana oli yhteensä 20 erilaista Listeria monocytogenes -kantaa Elintarvike- ja

ympäristöhygienian laitoksen kokoelmista. Kannat säilytettiin pakastimessa -70 °C:ssa.

Kannat oli alun perin eristetty erilaisista elintarvikealan tuotantolaitoksista. Mukana oli

9 maitoalan laitoksista eristettyä kantaa. Lihateollisuudesta peräisin olevia kantoja

oli 11, joista 4 oli peräisin siipikarjan lihaa käsittelevistä laitoksista. Kannat oli jaoteltu

aiempien tutkimusten mukaan persistoiviin ja ei-persistoiviin kantoihin. Sekä

persistoivia että ei-persistoivia kantoja oli tutkimuksessa mukana 10kpl. Persistoiviksi

kannoiksi oli luokiteltu kannat, joita eristettiin toistuvasti (5 kertaa tai enemmän)

kolmen kuukauden (tai pidemmän) ajanjakson aikana. Kannat, joita eristettiin

satunnaisesti tai lyhyemmän kuin kolmen kuukauden ajanjakson kuluessa, luokiteltiin

20

ei-persistoiviksi (Lundén 2004). Myös kantojen serotyypit oli määritetty aiempia

tutkimuksia varten. Kannat kuuluivat serotyyppeihin 1/2a, 1/2b ja 1/2c eli

tyypillisimpiin elintarvikkeista eristettäviin serotyyppeihin. Kannat on esitelty

taulukossa 1.

Taulukko 1. Tutkitut 20 Listeria monocytogenes -kantaa ja niiden

alkuperä, persistenssi ja serotyyppi

Kanta Alkuperä Persistenssi Serotyyppi 1 Maito P 1/2b 2 Maito N 1/2b 3 Maito N 1/2b 4 Liha P 1/2c 5 Liha P 1/2a 6 Liha P 1/2c 7 Liha P 1/2a 8 Liha/Siipikarja P 1/2c 9 Liha/Siipikarja N 1/2a

10 Liha/Siipikarja N 1/2a 11 Liha/Siipikarja P 1/2c 12 Liha P 1/2a 13 Liha P 1/2a 14 Liha P 1/2c 15 Maito N 1/2b 16 Maito N 1/2b 17 Maito N 1/2b 18 Maito N 1/2b 19 Maito N 1/2b 20 Maito N 1/2

4.2 Biofilmin muodostuksen tutkiminen mikrotiitterilevyllä

Menetelmänä käytettiin modifioitua Djordjevicin ym. (2002) kehittämää menetelmää,

joka perustuu kristalliviolettiin. Kristallivioletti värjää sekä kiinnittyneet solut että

solunulkoiset polymeerit ja näin ollen sitä voidaan hyödyntää biofilmin

havainnoillistamisessa (Gamble ym. 2007). Tutkittavat kannat viljeltiin ensin

veriagareille, joita inkuboitiin 37 °C:ssa vuorokauden ajan. Tämän jälkeen jokaista

kantaa siirrostettiin yksi pesäke 10 ml:an tryptoosi-soija-lientä (TSB) (Tryptic Soy

Broth, Bacton, Dickinson and Company, Sparks, USA). TSB-putkia inkuboitiin

37 °C:ssa vuorokauden ajan. Suspensioiden optiset tiheydet mitattiin aallonpituudella

600 nm (OD600). Tätä varten TSB-putket vortexoitiin ja putkista pipetoitiin suspensiota

kyvetteihin. Kyvetit asetettiin lukulaitteeseen (Eppendorf BioPhotometer, Hamburg,

21

Germany). Kannat, joiden OD600 oli 0,97–1,01, siirrettiin mikrotiitterilevyille (Corning

Incorporated, Corning NY, USA). Tutkimuksessa pyrittiin, että kaikkien kantojen

optinen tiheys olisi tutkimuksen tässä vaiheessa lähes sama, jotta jokaisen kannan

solumäärä olisi suunnilleen sama menetelmän aloitustilanteessa. Tässä vaiheessa

kannoista tehtiin myös laimennossarja tryptoosi-soija-agareille (TSA) (Tryptic Soy

Agar, Merck, Darmstadt, Germany) solumäärän varmistamiseksi. Bakteerisuspension

solumäärä oli keskimäärin 8 x 108/ml. Jokaiseen mikrotiitterilevyn kuoppaan pipetoitiin

100 µl tutkittavaa bakteerisuspensiota tai pelkkää TSB-ravinnelientä. Yksi kanta

pipetoitiin 18–60 kuoppaan eli rinnakkaisten näytteiden määrä vaihteli välillä 18–60.

Vaihteluväli oli näin suuri, koska yhdellä mikrotiitterilevyllä tutkittiin tutkimuskerrasta

riippuen 1–3 kantaa. Levyn reunimmaiset kuopat täytettiin pelkällä ravinneliemellä,

koska näissä kuopissa haihtuminen oli levyn keskellä olevia kuoppia voimakkaampaa.

Mikrotiitterilevyjä inkuboitiin 25 °C:ssa 24 tunnin ajan. Jokainen kanta tutkittiin 2–3

kertaa.

Inkuboinnin aikana osa L. monocytogenes -bakteereista kiinnittyi mikrotiitterilevyjen

kuoppien seinämiin ja pohjiin. Inkuboinnin jälkeen mikrotiitterilevyjen kuopat

tyhjennettiin pipetillä suspensiosta, jotta kiinnittymättömät bakteerit saatiin poistetuksi.

Seuraavaksi mikrotiitterilevyjen jokaiseen kuoppaan lisättiin 150 µl 1 % kristalli-

violettia kiinnittyneiden bakteereiden värjäämiseksi. Väriaine sai vaikuttaa 45 minuuttia,

jonka jälkeen mikrotiitterilevyt pestiin mikrotiitterilevyjen pesuun tarkoitetulla laitteella

(Wellwash4MK2, Thermo Electron Corporation, Vantaa, Finland) ylimääräisen värin ja

löyhästi kiinnittyneiden solujen poistamiseksi. Aluksi pesulaite tyhjentää

mikrotiitterilevyjen kuopat. Tämän jälkeen laite pipetoi kuoppiin 200 µl puhdistettua

vettä. Seuraavaksi laite tyhjentää jälleen kuopat ja pipetoi tilalle uuden veden.

Mikrotiitterilevyt pestiin 5 kertaa eli kuopat täytettiin viidesti puhdistetulla vedellä.

Viimeisellä pesukierroksella laite tyhjensi kuopat, muttei pipetoinut enää uutta vettä.

Djordjevic ym. (2002) ei käyttänyt tutkimuksessaan vastaavaa laitetta

mikrotiitterilevyjen pesuun. Pesulaite jätti välillä osan kuopista pesemättä jostain syystä.

Tällaiset kuopat olivat silmin nähden havaittavissa kuoppalevyllä liian voimakkaasti

värjäytyneinä. Pesemättömät kuopat poistettiin tuloksista ennen tulosten tarkempaa

käsittelyä. Tulos poistettiin aina, mikäli kuopassa olevan liuoksen optinen tiheys oli

enemmän kuin 0,4.

22

Tässä vaiheessa biofilmit näkyivät kuoppien pohjilla ja seinämissä violetteina renkaina.

Seuraavaksi irroitettiin bakteereihin kiinnittynyt väriaine 95 % etanolin avulla. Etanolia

pipetoitiin 200 µl jokaiseen kuoppaan. Tämän jälkeen kuopissa olevaa suspensiota

sekoitettiin Finn-pipetillä, jolloin kiinnittynyt väriaine liukeni etanolin avulla. Tätä

suspensiota siirrettiin 100 µl jokaisesta kuopasta uudelle mikrotiitterilevylle vastaaviin

kuoppiin. Uusien mikrotiitterilevyjen kuoppien optiset tiheydet mitattiin ELISA-

lukulaitteella (Multiscan Ascent, Thermo Electron Corporation, Vantaa, Finland)

aallonpituudella 620 nm. Näin saatiin mitattua kunkin kuopan liuoksen optinen tiheys

eli saatiin mitattua epäsuorasti kussakin kuopassa olevan kristallivioletin määrä, jonka

määrä oli suoraan verrannollinen kiinnittyneiden solujen määrään.

4.3 Tilastollinen analyysi

Tuloksista laskettiin kullekin kannalle eri toistojen keskiarvot ja keskihajonnat

Microsoft excel -ohjelman avulla. Lisäksi eri toistojen tuloksista laskettiin kannan

lopullinen keskiarvo ja keskihajonta. Tilastollisena analyysinä eri kantojen keskiarvoja

vertaillessa käytettiin T-testiä, joka suoritettiin SPSS-ohjelman 15.0 versiossa. P-arvoja,

jotka olivat <0.05, pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

5 TULOKSET

Tutkimuksessa oli mukana yhteensä 20 erilaista L. monocytogenes –kantaa. Tuloksissa

on huomioitu 14 eri kannan tulokset. Loput kuusi kantaa (taulukossa 1 olevat kannat

15–20) eivät kasvaneet riittävän voimakkaasti TSB-liemessä. Niiden optinen tiheys

(OD600) ei saavuttanut tutkimuksessa vaadittua arvoa 0,97–1,01 pidennetylläkään

inkubaatioajalla. Taulukosta 2 käy ilmi kunkin kannan biofilmin muodostusta kuvaava

keskiarvo ja tulosten keskihajonta kullakin toistolla. Lisäksi taulukossa on esitetty

jokaisen kannan lopullinen biofilmin muodostumista kuvaava keskiarvo ja tulosten

keskihajonta. Mitä suurempi keskiarvo on, sitä enemmän tutkittu kanta on

kiinnittynyt/muodostanut biofilmiä.

23

Taulukko 2. Tutkittujen Listeria monocytogenes -kantojen biofilmin muodostuksen keskiarvot ja

keskihajonnat eri toistoilla ja toistojen keskiarvo ja keskihajonta

Kanta Persistenssi Toisto 1 Hajonta Toisto 2 Hajonta Toisto 3 Hajonta Keskiarvo Hajonta 1 P 0,16613 0,046507 0,156774 0,039684 0,162718 0,044132 2 N 0,146393 0,025956 0,173676 0,02482 0,1567 0,028665 3 N 0,2043 0,033678 0,143698 0,040029 0,165602 0,047699 4 P 0,122515 0,014616 0,124652 0,023988 0,123393 0,018857 5 P 0,145661 0,023792 0,147063 0,036942 0,14596 0,026845 6 P 0,152381 0,055221 0,181063 0,054716 0,164784 0,056111 7 P 0,150655 0,024326 0,125556 0,03508 0,144711 0,029053 8 P 0,157154 0,023451 0,122059 0,031178 0,148507 0,02955 9 N 0,167219 0,032511 0,143389 0,049921 0,15864 0,040827 10 N 0,151286 0,038033 0,165929 0,041878 0,155469 0,039297 11 P 0,204571 0,055642 0,1777 0,071337 0,1986 0,059674 12 P 0,119912 0,016088 0,10625 0,028106 0,11554 0,021391 13 P 0,14625 0,020672 0,133667 0,030928 0,143254 0,023856 14 P 0,140393 0,025622 0,112167 0,022843 0,114091 0,033782 0,132338 0,030591

24

Eri kantojen kiinnittymistä vertailtiin käyttäen apuna T-testiä. Muutaman kannan

kiinnittyminen erosi toisistaan merkittävästi (P<0.05). Esimerkiksi kantojen 4 ja 5

keskiarvojen ero oli tilastollisesti merkittävä (P=0.006). Myös kannat 1 ja 12 (P=0.037)

sekä 10 ja 12 (P=0.046) erosivat tilastollisesti merkittävästi toisistaan. Valtaosa

kannoista ei eronnut toisistaan kiinnittymisen suhteen tilastollisesti merkittävästi

(P>0.05). Taulukon 2 toistojen avulla vertailtiin toisiinsa persistoivia ja ei-persistoivia

kantoja. Tulokset on esitetty taulukossa 3.

Taulukko 3. Yhteenveto persistoivien (P) ja ei-persistoivien

(N) kantojen biofilmin muodostuksesta

Persistenssi Kantojen määrä Keskiarvo Keskihajonta P 10 0,144629 0,02505 N 4 0,161986 0,02073

Persistoivien ja ei-persistoivien kantojen kiinnittymistä vertailtiin T-testin avulla.

Kantojen kiinnittyminen ei eronnut toisistaan tilastollisesti merkittävästi (P>0.05).

6 POHDINTA

Tutkimukseni tavoitteena oli pystyttää menetelmä Listeria monocytogeneksen

kiinnittymisen tutkimiseen. Samalla vertailtiin eri L. monocytogenes -kantojen

kiinnittymistä. Aiemmassa tutkimuksessa menetelmän hyvinä puolina on pidetty

nopeutta, yksinkertaisuutta, toistettavuutta ja teknisesti helppoa toteuttamista

(Djordjevic ym. 2002). Työvaiheet ovat melko yksinkertaisia ja helppoja, mutta ne

jakautuvat neljälle päivälle, joten varsinaisesta pikatestistä ei ole kyse.

L. monocytogeneksen biofilmin määrittämiseen on olemassa nopeampiakin vaihtoehtoja

tänä päivänä, kuten esimerkiksi Chavantin ym. (2007) kehittämä kaupallinen

BioFilmRing Test®. Mikrotiitterilevymenetelmällä pystytään kuitenkin tutkimaan

useita kantoja samanaikaisesti ja samalla saadaan kustakin kannasta useita toistoja.

Mikrotiitterilevylle mahtuu jopa kymmenen kantaa, joista kaikista saadaan kuusi

rinnakkaista tulosta.

25

Menetelmää pidetään toistettavampana ja hyvin standardoitavissa olevana verrattuna

perinteisiin työläisiin menetelmiin, joissa kiinnittyneet solut on värjätty ja laskettu

mikroskoopin avulla. Tutkimuksessani oli kuitenkin pieniä vaikeuksia toistettavuuden

kanssa. Tulokset saattoivat erota samalla tutkimuskerralla toisistaan huomattavasti ja

keskihajonnat olivat osalla kannoista melko suuria. Keskihajonnat on esitetty taulukossa

2. Esimerkiksi kannalla 11 keskihajonnat olivat melko suuria, mutta kannalla 4 saatiin

sen sijaan hyvinkin samankaltaisia tuloksia ja keskihajonnat olivat pieniä. Myös eri

tutkimuskertojen välillä oli huomattavia eroja kiinnittymisessä. Tutkimuskertojen

väliset erot ovat nähtävissä taulukon 2 keskiarvoissa. Esimerkiksi kannalla 3 eri

kertojen väliset keskiarvot erosivat toisistaan huomattavasti. Tutkimuskerrat

jakaantuivat pitkälle aikavälille (kevät 2005–kevät 2007), joten tämä saattaa vaikuttaa

tuloksiin. Työtavat eivät välttämättä olleet aivan samanlaiset pitkistä työskentelytauoista

johtuen. Työtapojen yhdenmukaisuuteen ja laitteiden oikeanlaiseen toimintaan on

kiinnitettävä enemmän huomiota, jotta toistettavuus olisi jatkossa parempi. Lisäksi voisi

kokeilla laimeamman kristalliviolettiliuoksen käyttämistä värjäämisessä. Tämän on

havaittu vaikuttavan tulosten toistettavuuteen (Borucki ym. 2003).

Tässä tutkimuksessa käytetty menetelmä poikkesi joissakin kohdissa Djordjevicin ym.

(2002) käyttämästä menetelmästä. Djordjevicin ym. (2002) tutkimuksessa ei käytetty

kuoppalevyjen pesuun tarkoitettua laitetta. Sen sijaan kuopat pestiin käsin ja kuoppien

annettiin ilmakuivua 45 minuuttia ennen värjäystä. Käsin pesu toistettiin värjäyksen

päätyttyä. Tässä tutkimuksessa käytetystä menetelmästä puuttui ensimmäinen pesu ja

ilmakuivaus kokonaan ja jälkimmäinen pesu suoritettiin koneellisesti. Nämä tekijät

voivat myös vaikuttaa menetelmän toistettavuuteen. Kuoppalevyjen pesu tehtiin

koneellisesti, koska sen uskottiin olevan luotettavampi kuin käsin tehtävä pesu, joka on

altis inhimillisille virheille. Koneellisessa pesussakin oli kuitenkin omat ongelmansa,

sillä laite saattoi pestä osan kuopista huonosti tai jättää kokonaan pesemättä, jolloin

kuoppiin jäi liian paljon kristalliviolettia. Nämä kuopat poistettiin tuloksista ennen

tarkempaa analyysiä. Pesu- ja värjäysvaiheiden on todettu olevan merkittäviä ja

virheille alttiita kohtia kolorimetrisissä biofilmin tutkimusmenetelmissä (Vesterlund ym.

2005, Chavant ym. 2007).

Djordjevecin ym. (2002) kehittämä menetelmä on epäsuora osoitusmenetelmä

L. monocytogeneksen muodostamalle biofilmille. Menetelmässä mitataan kristalli-

26

violetin määrää liuoksessa epäsuorana osoituksena kiinnittyneistä bakteereista. Näin

ollen mitä suurempi on kristalliviolettiliuoksen optinen tiheys, sitä enemmän on

kiinnittyneitä soluja. Djordjevicin ym. (2002) tutkimuksessa menetelmällä saatiin

kuitenkin yhdenmukaisempia tuloksia kuin perinteisillä biofilmin tutkimusmenetelmillä

(mikroskooppinen biofilmin muodostumisen määritys ja epifluoresenssimikroskopia).

Menetelmän epäsuoruudesta johtuen ei itse asiassa tiedetä, mitataanko vain

kiinnittyneiden solujen määrää vai varsinaista biofilmin muodostusta. Todennäköisesti

kyseessä on pääasiassa kiinnittyneiden solujen määrän mittaaminen, sillä

L. monocytogenes on melko heikko solun ulkoisen materiaalin tuottaja ja näin ollen

menetelmä värjää lähinnä kiinnittyneitä soluja.

Menetelmän muita rajoittavia tekijöitä ovat mikrotiitterilevyjen materiaali ja tavallaan

menetelmän yksinkertaisuus. Mikrotiitterilevyjä on valmistettu vain muovista, joten

esimerkiksi L. monocytogenes -bakteerin biofilmin muodostusta metallipinnalla ei voi

tutkia tällä menetelmällä. Tässä tutkimuksessa käytetyt mikrotiitterilevyt oli valmistettu

polystyreenistä. Djordjevicin ym. (2002) tutkimuksessa havaittiin kiinnittymisen olevan

voimakkaampaa muovipinnalla kuin ruostumattomasta teräksestä valmistetulla pinnalla.

Tämän uskottiin johtuvan materiaalien erilaisista hydrofobisuuksista, muovin ollessa

hydrofobinen ja teräksen hydrofiilinen. Käytännössä L. monocytogenes -biofilmit

muodostuvat kuitenkin usein metallipinnoille esimerkiksi erilaisiin ruostumattomasta

teräksestä oleviin tuotantolaitteisiin (Kumar ym. 1998). Muovisilla mikrotiitterilevyillä

tehdyistä tutkimuksista ei voi suoraan päätellä bakteerin käyttäytymistä muilla yleisesti

elintarviketeollisuudessa käytetyillä pinnoilla kuten metallilla (Borucki ym. 2003).

Menetelmän yksinkertaisuudesta ja rajallisuudesta johtuen tässä menetelmässä ei pysty

tarkastelemaan esimerkiksi kiinnittyneiden solujen morfologiaa. Menetelmä on

kuitenkin käyttökelpoinen, kun halutaan tutkia biofilmin muodostumista määrällisesti.

Jos halutaan tarkastella biofilmiä suoraan, on käytettävä mikroskopointiin perustuvia

menetelmiä. Mikroskopointiin perustuvat menetelmät ovat kuitenkin melko työläitä

mikrotiitterilevyyn perustuvaan menetelmään verrattuna (Djordjevic ym. 2002,

Vesterlund ym. 2005).

Tutkimuksen tavoitteena oli myös vertailla persistoivien ja ei-persistoivien kantojen

kiinnittyvyyttä. Tulosten perusteella ei-persistoivat kannat kiinnittyivät persistoivia

kantoja enemmän. Tämä on ristiriidassa aiemmissa tutkimuksissa saatujen tulosten

27

kanssa (Norwood ym. 1999, Lunden ym. 2000, Borucki ym. 2003). Tilastollisesti

merkittävää eroa ei kuitenkaan ollut havaittavissa. Myöskään Djordjevicin ym. (2002)

tutkimuksessa ei havaittu eroa persistoivien ja ei-persistoivien kantojen

kiinnittyvyydessä. Saatujen tulosten taustalla voi osittain vaikuttaa se, että ei-

persistoivia kantoja on mukana selkeästi vähemmän ja niillä pystyttiin tekemään

vähemmän toistoja kuin persistoivilla kannoilla. Useita ei-persistoivia kantoja jouduttiin

jättämään pois tuloksista, koska kasvu ei ollut riittävää TSB-liemessä. Lisäksi osa ei-

persistoivista kannoista pystyttiin tutkimaan vain kerran, koska kanta ei myöhemmin

kasvanut riittävästi TSB-liemessä. Olisikin ehkä ollut järkevää asettaa OD600 -raja-arvo

alemmaksi, jotta tutkimuksessa olisi pystytty huomioimaan useamman kannan tulokset.

Kaikki tuloksista poisjätetyt kannat olivat ei-persistoivia kantoja. Tuloksissa on

huomioitu siis vain 4 ei-persistoivaa ja 10 persistoivaa kantaa, vaikka alun perin

molempia kantatyyppejä oli mukana yhtä paljon.

Tutkimuksessa mitattiin kiinnittyvyyttä vain 24 tunnin inkubaation jälkeen.

Persistoivien kantojen on havaittu kiinnittyvän ei-persistoivia kantoja paremmin

erityisesti lyhyellä kontaktiajalla (1–2 tuntia). Pidemmän ajan kuluessa kantojen väliset

erot kiinnittymisessä ovat pienentyneet (Lundén ym. 2000). Persistoivien kantojen

nopealla kiinnittyvyydellä on merkitystä persistoivan kontaminaation muodostumisessa.

Persistoivat kannat ehtivät kiinnittyä desinfiointien välissä ja kiinnittyneistä bakteereista

on hankalampi päästä eroon tavanomaisilla desinfiointitoimilla kuin vapaista soluista

(Robbins ym. 2005). Ei-persistoivat kannat eivät ehkä ehdi kiinnittyä niin suurissa

määrin desinfiointien välisenä aikana, että se muodostuisi ongelmaksi

tuotantoympäristössä. Kiinnittymisen lisäksi useat muut tekijät vaikuttavat osaltansa

persistoivan kontaminaation muodostumiseen. Persistoivat kannat kestävät happamia

olosuhteita ei-persistoivia kantoja paremmin. Myös eri kantojen lämmönkestävyydessä

on eroja (Lundén ym. 2008).

Menetelmä vaikuttaa käyttökelpoiselta työvälineeltä L. monocytogeneksen ja muiden

bakteerien kiinnittymisen tutkimiseen. Menetelmän avulla voidaan helposti tutkia,

kiinnittyykö bakteeri ja onko eri kantojen välillä eroa. Lisäksi menetelmä on helposti

muunneltavissa erilaisiin tutkimusolosuhteisiin. Elatuslientä muuttamalla voidaan tutkia

esimerkiksi kantojen kiinnittymistä erilaisissa pH-arvoissa. Kiinnittymistä voidaan

tutkia myös eri lämpötiloissa ja eri inkubaatioajoilla. Menetelmällä on siis lukuisia

28

muuntelumahdollisuuksia. Djordjevicin ym. (2002) menetelmää onkin hyödynnetty jo

muissa tutkimuksissa. Esimerkiksi Anderssonin ym. (2008) tutkimuksessa sen avulla

vertailtiin usean eri bakteerilajin biofilmin muodostusta eri elatusliemissä. Menetelmä

soveltuukin hyvin L. monocytogeneksen muodostamien biofilmien tutkimisen lisäksi

myös muiden bakteerien ja useamman eri bakteerilajin yhdessä muodostamien

biofilmien tutkimiseen.

7 KIITOKSET

Kiitokset työn ohjaajalle Janne Lundénille mielenkiintoisesta aiheesta sekä opastuksesta

ja tuesta tutkielman teossa.

Kiitokset myös työn johtajalle Hannu Korkealalle.

Lisäksi haluan kiittää Riikka Laukkasta, joka neuvoi erityisesti tulosten käsittelyssä ja

käytännön asioissa. Kiitokset myös laboratorion henkilökunnalle ja muille, jotka

autoitte minua tutkielman teossa.

Erityiset kiitokset kotijoukoille ja kurssikavereille Anna-Riikka Jalkaselle ja Maija

Koskiselle, jotka jaksoivat olla tukena ja antaa neuvoja tämän pitkähkön projektin

aikana.

8 KIRJALLISUUSLUETTELO

Aarnisalo, K., Salo, S., Miettinen, H., Suihko, M.-L., Wirtanen, G., Autio, T., Lundén,

J., Korkeala, H., Sjöberg, A.M. 2000. Bactericidal efficiencies of commercial

disinfectants against Listeria monocytogenes on surfaces. J. Food Safety 20, 237-250.

Aase, B., Sundheim, G., Langsrud, S., Rørvik, L.M. 2000. Occurrence of and a possible

mechanism for resistance to a quaternary ammonium compound in Listeria

monocytogenes. Int. J. Food Microbiol. 62, 57-63.

29

Alexander, A.V., Walker, R.L., Johnson, B.J., Charlton, B.R., Woods, L.W. 1992.

Bovine abortions attributable to Listeria ivanovii: four cases (1988-1990). J. Am. Vet.

Med. Assoc. 200, 711-714.

Andersson, S., Kuttuva Rajarao, G., Land, C.J., Dalhammar, G. 2008. Biofilm

formation and interactions of bacterial strains found in wastewater treatment systems.

FEMS Microbiol. Lett. 283, 83-90.

Anonyymi 1997. Food poisoning, listeriosis and febrile gastroenteritis. Nutr. Rev. 55,

57-60.

Autio, T., Hielm, S., Miettinen, M., Sjöberg, A.M., Aarnisalo, K., Björkroth, J., Mattila-

Sandholm, T., Korkeala, H. 1999. Sources of Listeria monocytogenes contamination in

a cold-smoked rainbow trout processing plant detected by pulsed-field gel

electrophoresis typing. Appl. Environ. Microbiol. 65, 150-155.

Beuchat, L.R. 1996. Listeria monocytogenes: incidence on vegetables. Food Control 7,

223-228.

Beumer, R.R., te Giffel, M.C., Spoorenberg, E., Rombouts, F.M. 1996. Listeria species

in domestic environments. Epidemiol. Infect. 117, 437-442.

Blackman, I.C., Frank, J.F. 1996. Growth of Listeria monocytogenes as a biofilm on

various food-processing surfaces. J. Food Prot. 59, 827-831.

Bohaychuk, V.M., Gensler, G.E., King, R.K., Manninen, K.I., Sørensen, O., Wu, J.T.,

Stiles, M.E., McMullen, L.M. 2006. Occurrence of pathogens in raw and ready-to-eat

meat and poultry products collected from the retail marketplace in Edmonton, Alberta,

Canada. J. Food Prot. 69, 2176-2182.

Borucki, M.K., Peppin, J.D., White, D., Loge, F., Call, D.R. 2003. Variation in biofilm

formation among strains of Listeria monocytogenes. Appl. Environ. Microbiol. 69,

7336-7342.

30

Camilli, A., Tilney, L.G., Portnoy, D.A. 1993. Dual roles of plcA in Listeria

monocytogenes pathogenesis. Mol. Microbiol. 8, 143-157.

Carpentier, B., Cerf, O. 1993. Biofilms and their consequences, with particular

reference to hygiene in the food industry. J. Appl. Bacteriol. 75, 499-511.

Chae, M.S., Schraft, H. 2000. Comparative evaluation of adhesion and biofilm

formation of different Listeria monocytogenes strains. Int. J. Food Microbiol. 62, 103-

111.

Chasseignaux, E., Gérault, P., Toquin, M.-T., Salvat, G., Colin, P., Ermel, G. 2002.

Ecology of Listeria monocytogenes in the environment of raw poultry meat and raw

pork meat processing plants. FEMS Microbiol.Lett. 210, 271-275.

Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. 2007. A new

device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol.

Methods 68, 605-612.

Christensen, G.D., Simpson, W.A., Bisno, A.L., Beachey, E.H. 1982. Adherence of

slime-producing strains of Staphylococcus epidermidis to smooth surfaces. Infect.

Immun. 37, 318-326.

Christensen, G.D., Simpson, W.A., Younger, J.J., Baddour, L.M., Barrett, F.F., Melton,

D.M., Beachey, E.H. 1985. Adherence of coagulase-negative staphylococci to plastic

tissue culture plates: a quantitative model for the adherence of staphylococci to medical

devices. J. Clin. Microbiol. 22, 996-1006.

Church, I.J., Parsons, A.L. 1995. Modified atmosphere packaging technology - a review.

J. Sci. Food Agric. 67, 143-152.

Cooper, J., Walker, R.D. 1998. Listeriosis. Vet. Clin. North Am. Food Anim. Pract. 14,

113-125.

31

Cossart, P., Vicente, M.F., Mengaud, J., Baquero, F., Perez-Diaz, J.C., Berche, P. 1989.

Listeriolysin O is essential for virulence of Listeria monocytogenes: direct evidence

obtained by gene complementation. Infect. Immun. 57, 3629-3636.

Dalton, C.B., Austin, C.C., Sobel, J., Hayes, P.S., Bibb, W.F., Graves, L.M.,

Swaminathan, B., Proctor, M.E., Griffin, P.M. 1997. An outbreak of gastroenteritis and

fever due to Listeria monocytogenes in milk. N. Engl. J. Med. 336, 100-105.

de Valk, H., Jacquet, C., Goulet, V., Vaillant, V., Perra, A., Simon, F., Desenclos, J.C.,

Martin, P., Listeria Surveillance Feasibility Study Participants 2005. Surveillance of

listeria infections in Europe. Euro Surveill. 10, 251-255.

Denny, J., McLauchlin, J. 2008. Human Listeria monocytogenes infections in Europe--

an opportunity for improved European surveillance. Euro Surveill. 13, 8082.

Djordjevic, D., Wiedmann, M., McLandsborough, L.A. 2002. Microtiter plate assay for

assessment of Listeria monocytogenes biofilm formation. Appl. Environ. Microbiol. 68,

2950-2958.

Domann, E., Leimeister-Wachter, M., Goebel, W., Chakraborty, T. 1991. Molecular

cloning, sequencing, and identification of a metalloprotease gene from Listeria

monocytogenes that is species spesific and physically linked to the listeriolysin gene.

Infect.Immun. 59, 65-72.

Domann, E., Wehland, J., Rohde, M., Pistor, S., Hartl, M., Goebel, W., Leimeister-

Wachter, M., Wuenscher, M., Chakraborty, T. 1992. A novel bacterial virulence gene in

Listeria monocytogenes required for host cell microfilament interaction with homology

to the proline-rich region of vinculin. EMBO J. 11, 1981-1990.

Donlan, R.M. 2002. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerg. Infect. Dis. 8, 881-890.

Doyle, M.E., Mazzotta, A.S., Wang, T., Wiseman, D.W., Scott, V.N. 2001. Heat

resistance of Listeria monocytogenes. J. Food Prot. 64, 410-429.

32

Dramsi, S., Biswas, I., Maguin, E., Braun, L., Mastroeni, P., Cossart, P. 1995. Entry of

Listeria monocytogenes into hepatocytes requires expression of inlB, a surface protein

of the internalin multigene family. Mol. Microbiol. 16, 251-261.

Dunne, W.M.,Jr 2002. Bacterial adhesion: seen any good biofilms lately? Clin.

Microbiol. Rev. 15, 155-166.

Enocksson, E., Wretlind, B., Sterner, G., Anzen, B. 1990. Listeriosis during pregnancy

and in neonates. Scand. J. Infect. Dis. Suppl. 71, 89-94.

Farber, J.M., Peterkin, P.I. 1991. Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen.

Microbiol. Rev. 55, 476-511.

Fenlon, D.R. 1985. Wild birds and silage as reservoirs of Listeria in the agricultural

environment. J. Appl. Bacteriol. 59, 537-543.

Gaillard, J.L., Berche, P., Mounier, J., Richard, S., Sansonetti, P. 1987. In vitro model

of penetration and intracellular growth of Listeria monocytogenes in the human

enterocyte-like cell line Caco-2. Infect. Immun. 55, 2822-2829.

Gamble, R., Muriana, P.M. 2007. Microplate fluorescence assay for measurement of the

ability of strains of Listeria monocytogenes from meat and meat-processing plants to

adhere to abiotic surfaces. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5235-5244.

Gianfranceschi, M., Gattuso, A., Tartaro, S., Aureli, P. 2003. Incidence of Listeria

monocytogenes in food and environmental samples in Italy between 1990 and 1999:

serotype distribution in food, environmental and clinical samples. Eur. J. Epidemiol. 18,

1001-1006.

Gola, S., Previdi, M.P., Mutti, P., Belloli, S. 1990. Microbiological investigation of

frozen vegetables, incidence of Listeria and other psychrotrophic pathogens. Industria

Conserve 65, 36-38.

33

Gombas, D.E., Chen, Y., Clavero, R.S., Scott, V.N. 2003. Survey of Listeria

monocytogenes in ready-to-eat foods. J. Food Prot. 66, 559-569.

Goulet, V., Marchetti, P. 1996. Listeriosis in 225 non-pregnant patients in 1992: clinical

aspects and outcome in relation to predisposing conditions. Scand. J. Infect. Dis. 28,

367-374.

Graves, L.M., Swaminathan, B., Hunter, S.B. 2007. Subtyping Listeria monocytogenes.

Kirjassa: Ryser E.T. Marth E.H., toim. Listeria, Listeriosis and Food Safety. 3.painos.,

283-304.

Gray, M.L. 1960. A possible link in the relationship between silage feeding and

listeriosis. J. Am. Vet. Med. Assoc. 136, 205-208.

Gray, M.L., Killinger, A.H. 1966. Listeria monocytogenes and listeric infections.

Bacteriol. Rev. 30, 309-382.

Grønstøl, H. 1980. Listeriosis in sheep. Norges veterinaerhøgskole. Oslo.

Guilbaud, M., de Coppet, P., Bourion, F., Rachman, C., Prevost, H., Dousset, X. 2005.

Quantitative detection of Listeria monocytogenes in biofilms by real-time PCR. Appl.

Environ. Microbiol. 71, 2190-2194.

Hain, T., Steinweg, C., Chakraborty, T. 2006. Comparative and functional genomics of

Listeria spp. J. Biotechnol. 126, 37-51.

Harvey, J., Keenan, K.P., Gilmour, A. 2007. Assessing biofilm formation by Listeria

monocytogenes strains. Food Microbiol. 24, 380-392.

Heisick, J.E., Harrell, F.M., Peterson, E.H., McLaughlin, S., Wagner, D.E., Wesley, I.V.,

Bryner, J. 1989. Comparison of four procedures to detect Listeria spp. in foods. J. Food

Prot. 52, 154-157.

34

Hitchins, A.D., Whiting, R.C. 2001. Food-borne Listeria monocytogenes risk

assessment. Food Addit. Contam. 18, 1108-1117.

Hoffman, A.D., Gall, K.L., Norton, D.M., Wiedmann, M. 2003. Listeria monocytogenes

contamination patterns for the smoked fish processing environment and for raw fish.

J. Food Prot. 66, 52-60.

Hudson, J.A., Mott, S.J., Penney, N. 1994. Growth of Listeria monocytogenes,

Aeromonas hydrophila and Yersinia enterocolitica on vacuum and saturated carbon

dioxide controlled atmosphere-packaged sliced roast beef. J. Food Prot. 57, 204-208.

Ireton, K., Payrastre, B., Cossart, P. 1999. The Listeria monocytogenes protein InlB is

an agonist of mammalian phosphoinositide 3-kinase. J. Biol. Chem. 274, 17025-17032.

Jacobsen, S.M., Stickler, D.J., Mobley, H.L., Shirtliff, M.E. 2008. Complicated

catheter-associated urinary tract infections due to Escherichia coli and Proteus mirabilis.

Clin. Microbiol. Rev. 21, 26-59.

Jay, J.M. 1996. Prevalence of Listeria spp. in meat and poultry products. Food Control

7, 209-214.

Jemmi, T., Stephan, R. 2006. Listeria monocytogenes: food-borne pathogen and

hygiene indicator. Rev. Sci. Tech. 25, 571-580.

Jones, H.C., Roth, I.L., Sanders, W.M.,3rd 1969. Electron microscopic study of a slime

layer. J. Bacteriol. 99, 316-325.

Korkeala, H., Lundén J. 2007. Listeria monocytogenes. Kirjassa: Korkeala, H. toim.

Elintarvikehygienia - ympäristöhygienia, elintarvike- ja ympäristötoksikologia, WSOY,

Helsinki., 54-62.

Kuhn, M., Goebel, W. 2007. Molecular virulence determinants of Listeria

monocytogenes. Kirjassa: Ryser E.T. , Marth E.H. toim. Listeria, Listeriosis and Food

Safety. 3.painos., 111-155.

35

Kumar, C.G., Anand, S.K. 1998. Significance of microbial biofilms in food industry: a

review. Int. J. Food Microbiol. 42, 9-27.

Lamont, R.J., Postlethwaite, R. 1986. Carriage of Listeria monocytogenes and related

species in pregnant and non-pregnant women in Aberdeen, Scotland. J. Infect. 13, 187-

193.

Larson, A.E., Johnson, E.A., Nelson, J.H. 1999. Survival of Listeria monocytogenes in

commercial cheese brines. J. Dairy Sci. 82, 1860-1868.

Latorre, L., Parisi, A., Fraccalvieri, R., Normanno, G., La Porta, M.C., Goffredo, E.,

Palazzo, L., Ciccarese, G., Addante, N., Santagada, G. 2007. Low prevalence of Listeria

monocytogenes in foods from Italy. J. Food Prot. 70, 1507-1512.

Lawrence, L.M., Gilmour, A. 1995. Characterization of Listeria monocytogenes isolated

from poultry products and from the poultry-processing environment by random

amplification of polymorphic DNA and multilocus enzyme electrophoresis. Appl.

Environ. Microbiol. 61, 2139-2144.

Lennon, D., Lewis, B., Mantell, C., Becroft, D., Dove, B., Farmer, K., Tonkin, S.,

Yeates, N., Stamp, R., Mickleson, K. 1984. Epidemic perinatal listeriosis. Pediatr.

Infect. Dis. 3, 30-34.

Low, J.C., Renton, C.P. 1985. Septicaemia, encephalitis and abortions in a housed flock

of sheep caused by Listeria monocytogenes type 1/2. Vet. Rec. 116, 147-150.

Lowry, P.D., Tiong, I. 1988. The incidence of Listeria monocytogenes in meat and meat

products and factors affecting distribution. Proc. 34th Int. Cong. Meat Sci. Technol. Part

B, 528-530.

Lundén, J. 2004. Persistent Listeria monocytogenes contamination in food processing

plants. Helsingin yliopisto. Helsinki.

36

Lundén, J., Autio, T., Markkula, A., Hellström, S., Korkeala, H. 2003. Adaptive and

cross-adaptive responses of persistent and non-persistent Listeria monocytogenes strains

to disinfectants. Int. J. Food Microbiol. 82, 265-272.

Lundén, J., Tolvanen, R., Korkeala, H. 2008. Acid and heat tolerance of persistent and

nonpersistent Listeria monocytogenes food plant strains. Lett. Appl. Microbiol. 46, 276-

280.

Lundén, J.M., Autio, T.J., Sjöberg, A.M., Korkeala, H.J. 2003. Persistent and

nonpersistent Listeria monocytogenes contamination in meat and poultry processing

plants. J. Food Prot. 66, 2062-2069.

Lundén, J.M., Miettinen, M.K., Autio, T.J., Korkeala, H.J. 2000. Persistent Listeria

monocytogenes strains show enhanced adherence to food contact surface after short

contact times. J. Food Prot. 63, 1204-1207.

Lyytikäinen, O., Autio, T., Maijala, R., Ruutu, P., Honkanen-Buzalski, T., Miettinen,

M., Hatakka, M., Mikkola, J., Anttila, V.J., Johansson, T., Rantala, L., Aalto, T.,

Korkeala, H., Siitonen, A. 2000. An outbreak of Listeria monocytogenes serotype 3a

infections from butter in Finland. J. Infect. Dis. 181, 1838-1841.

Lyytikäinen, O., Nakari, U.M., Lukinmaa, S., Kela, E., Nguyen Tran Minh, N., Siitonen,

A. 2006. Surveillance of listeriosis in Finland during 1995-2004. Euro Surveill. 11, 82-

85.

Mackaness, G.B. 1962. Cellular resistance to infection. J. Exp. Med. 116, 381-406.

Mackey, B.M., Pritchet, C., Norris, A., Mead, G.C. 1990. Heat resistance of listeria:

strain differences and effects of meat type and curing salts. Lett. Appl. Microbiol. 10,

251-255.

Mafu, A.A., Roy, D., Goulet, J., Magny, P. 1990. Attachment of Listeria

monocytogenes to stainless steel, glass, polypropylene and rubber surfaces after short

contact time. J. Food Prot. 53, 742-746.

37

Marquis, H., Goldfine, H., Portnoy, D.A. 1997. Proteolytic pathways of activation and

degradation of a bacterial phospholipase C during intracellular infection by Listeria

monocytogenes. J. Cell Biol. 137, 1381-1392.

Marshall, K.C., Stout, R., Mitchell, R. 1971. Mechanism of initial events in the sorption

of marine bacteria to surfaces. J. Gen. Microbiol. 68, 337-348.

McClure, P.J., Roberts, T.A., Oguru, P.O. 1989. Comparison of the effects of sodium

chloride, pH and temperature on the growth of Listeria monocytogenes on gradient

plates and in liquid medium. Lett. Appl. Microbiol. 9, 95-99.

McLauchlin, J. 1990a. Human listeriosis in Britain, 1967-85, a summary of 722 cases. 1.

Listeriosis during pregnancy and in the newborn. Epidemiol. Infect. 104, 181-189.

McLauchlin, J. 1990b. Human listeriosis in Britain, 1967-85, a summary of 722 cases. 2.

Listeriosis in non-pregnant individuals, a changing pattern of infection and seasonal

incidence. Epidemiol. Infect. 104, 191-201.

McLauchlin, J., Low, J.C. 1994. Primary cutaneous listeriosis in adults: an occupational

disease of veterinarians and farmers. Vet. Rec. 135, 615-617.

Mead, P.S., Slutsker, L., Dietz, V., McCaig, L.F., Bresee, J.S., Shapiro, C., Griffin,

P.M., Tauxe, R.V. 1999. Food-related illness and death in the United States. Emerg.

Infect. Dis. 5, 607-625.

Mengaud, J., Dramsi, S., Gouin, E., Vazquez-Boland, J.A., Milon, G., Cossart, P. 1991a.

Pleiotropic control of Listeria monocytogenes virulence factors by a gene that is

autoregulated. Mol. Microbiol. 5, 2273-2283.

Mengaud, J., Geoffroy, C., Cossart, P. 1991b. Identification of a new operon involved

in Listeria monocytogenes virulence: its first gene encodes a protein homologous to

bacterial metalloproteases. Infect. Immun. 59, 1043-1049.

38

Mengaud, J., Ohayon, H., Gounon, P., Mege, R.-M., Cossart, P. 1996. E-cadherin is the

receptor for internalin, a surface protein required for entry of L. monocytogenes into

epithelial cells. Cell 84, 923-932.

Mengaud, J., Vicente, M.F., Chenevert, J., Pereira, J.M., Geoffroy, C., Gicquel-Sanzey,

B., Baquero, F., Perez-Diaz, J.C., Cossart, P. 1988. Expression in Escherichia coli and

sequence analysis of the listeriolysin O determinant of Listeria monocytogenes. Infect.

Immun. 56, 766-772.

Miettinen, H., Wirtanen, G. 2005. Prevalence and location of Listeria monocytogenes in

farmed rainbow trout. Int. J. Food Microbiol. 104, 135-143.

Miettinen, M.K., Björkroth, K.J., Korkeala, H.J. 1999a. Characterization of Listeria

monocytogenes from an ice cream plant by serotyping and pulsed-field gel

electrophoresis. Int. J. Food Microbiol. 46, 187-192.

Miettinen, M.K., Siitonen, A., Heiskanen, P., Haajanen, H., Björkroth, K.J., Korkeala,

H.J. 1999b. Molecular epidemiology of an outbreak of febrile gastroenteritis caused by

Listeria monocytogenes in cold-smoked rainbow trout. J. Clin. Microbiol. 37, 2358-

2360.

Mikrobikriteeriasetus (2073/EY/2005) muutoksineen. http://eur-

lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=OJ:L:2005:338:0001:0026:FI:PDF,

haettu 8.3.2009.

Miller, A.J. 1992. Combined water activity and solute effects on growth and survival of

Listeria monocytogenes Scott A. J. Food Prot. 55, 414-418.

Moltz, A.G., Martin, S.E. 2005. Formation of biofilms by Listeria monocytogenes under

various growth conditions. J. Food Prot. 68, 92-97.

Moshtaghi, H., Mohamadpour, A.A. 2007. Incidence of Listeria spp. in raw milk in

Shahrekord, Iran. Foodborne Pathog. Dis. 4, 107-110.

39

Murray, E.G.D., Webb, R.A., Swann, M.B.R. 1926. A disease of rabbit characterized by

large mononuclear leucocytosis, caused by hitherto undescribed bacillus, Bacterium

monocytogenes (n. sp.). J. Pathol. Bacteriol. 29, 407-439.

Mylonakis, E., Hohmann, E.L., Calderwood, S.B. 1998. Central nervous system

infection with Listeria monocytogenes. 33 years' experience at a general hospital and

review of 776 episodes from the literature. Medicine (Baltimore) 77, 313-336.

Mylonakis, E., Paliou, M., Hohmann, E.L., Calderwood, S.B., Wing, E.J. 2002.

Listeriosis during pregnancy: a case series and review of 222 cases. Medicine

(Baltimore) 81, 260-269.

Nesbakken, T., Kapperud, G., Caugant, D.A. 1996. Pathways of Listeria

monocytogenes contamination in the meat processing industry. Int. J. Food Microbiol.

31, 161-171.

Nolan, D.A., Chamblin, D.C., Troller, J.A. 1992. Minimal water activity levels for

growth and survival of Listeria monocytogenes and Listeria innocua. Int. J. Food

Microbiol. 16, 323-335.

Norton, D.M., McCamey, M.A., Gall, K.L., Scarlett, J.M., Boor, K.J., Wiedmann, M.

2001. Molecular studies on the ecology of Listeria monocytogenes in the smoked fish

processing industry. Appl. Environ. Microbiol. 67, 198-205.

Norwood, D.E., Gilmour, A. 1999. Adherence of Listeria monocytogenes strains to

stainless steel coupons. J. Appl. Microbiol. 86, 576-582.

Notermans, S., Dufrenne, J., Teunis, P., Chackraborty, T. 1998. Studies on the risk

assessment of Listeria monocytogenes. J. Food Prot. 61, 244-248.

Orta-Ramirez, A., Smith, D.M. 2002. Thermal inactivation of pathogens and

verification of adequate cooking in meat and poultry products. Adv. Food Nutr. Res. 44,

147-194.

40

Pan, Y., Breidt, F.,Jr, Kathariou, S. 2006. Resistance of Listeria monocytogenes

biofilms to sanitizing agents in a simulated food processing environment. Appl. Environ.

Microbiol. 72, 7711-7717.

Parida, S.K., Domann, E., Rohde, M., Muller, S., Darji, A., Hain, T., Wehland, J.,

Chakraborty, T. 1998. Internalin B is essential for adhesion and mediates the invasion

of Listeria monocytogenes into human endothelial cells. Mol. Microbiol. 28, 81-93.

Pearson, L.J., Marth, E.H. 1990. Listeria monocytogenes - Threat to a safe food supply:

A review. J. Dairy Sci. 73, 912-928.

Petran, R.L., Zottola, E.A. 1989. A study of factors affecting growth and recovery of

L. monocytogenes. J. Food Sci. 54, 458-460.

Phan-Thanh, L., Mahouin, F., Alige, S. 2000. Acid responses of Listeria monocytogenes.

Int. J. Food Microbiol. 55, 121-126.

Portnoy, D.A., Jacks, P.S., Hinrichs, D.J. 1988. Role of hemolysin for the intracellular

growth of Listeria monocytogenes. J. Exp. Med. 167, 1459-1471.

Rahman, I., Shahamat, M., Kirchman, P.A., Russek-Cohen, E., Colwell, R.R. 1994.

Methionine uptake and cytopathogenicity of viable but nonculturable Shigella

dysenteriae type 1. Appl. Environ. Microbiol. 60, 3573-3578.

Repp, H., Pamukci, Z., Koschinski, A., Domann, E., Darji, A., Birringer, J., Brockmeier,

D., Chakraborty, T., Dreyer, F. 2002. Listeriolysin of Listeria monocytogenes forms

Ca2+-permeable pores leading to intracellular Ca2+ oscillations. Cell. Microbiol. 4, 483-

491.

Robbins, J.B., Fisher, C.W., Moltz, A.G., Martin, S.E. 2005. Elimination of Listeria

monocytogenes biofilms by ozone, chlorine, and hydrogen peroxide. J. Food Prot. 68,

494-498.

41

Rocourt, J., Buchrieser, C. 2007. The genus Listeria and Listeria monocytogenes:

Phylogenetic position, taxonomy, and identification. Kirjassa: Ryser E.T., Marth E.H.,

toim. Listeria, Listeriosis and Food Safety. 3.painos., 1-20.

Rørvik, L.M., Caugant, D.A., Yndestad, M. 1995. Contamination pattern of Listeria

monocytogenes and other Listeria spp. in a salmon slaughterhouse and smoked salmon

processing plant. Int. J. Food Microbiol. 25, 19-27.

Rørvik, L.M., Skjerve, E., Knudsen, B.R., Yndestad, M. 1997. Risk factors for

contamination of smoked salmon with Listeria monocytogenes during processing. Int. J.

Food Microbiol. 37, 215-219.

Rotterud, O.J., Nesbakken, T. 1991. Listeria monocytogenes i kjöttindustrien-forekomst

og forebyggende tiltak. Nor.Vet.Tidsskr. 103, 697-705.

Rudolf, M., Scherer, S. 2001. High incidence of Listeria monocytogenes in European

red smear cheese. Int. J. Food Microbiol. 63, 91-98.

Ryser, E.T. 2007. Incidence and behaviour of Listeria monocytogenes in unfermented

dairy products. Kirjassa: Ryser E.T., Marth E.H., toim. Listeria, Listeriosis and Food

Safety. 3.painos., 357-403.

Salamina, G., Dalle Donne, E., Niccolini, A., Poda, G., Cesaroni, D., Bucci, M., Fini, R.,

Maldini, M., Schuchat, A., Swaminathan, B., Bibb, W., Rocourt, J., Binkin, N., Salmaso,

S. 1996. A foodborne outbreak of gastroenteritis involving Listeria monocytogenes.

Epidemiol. Infect. 117, 429-436.

Sauders, B.D., Wiedmann, M. 2007. Ecology of Listeria species and L. monocytogenes

in the natural environment. Kirjassa: Ryser E.T., Marth E.H., toim. Listeria, Listeriosis

and Food Safety. 3.painos., 21-53.

Schlech, W.F.,3rd, Lavigne, P.M., Bortolussi, R.A., Allen, A.C., Haldane, E.V., Wort,

A.J., Hightower, A.W., Johnson, S.E., King, S.H., Nicholls, E.S., Broome, C.V. 1983.

Epidemic listeriosis--evidence for transmission by food. N. Engl. J. Med. 308, 203-206.

42

Schmid, M.W., Ng, E.Y., Lampidis, R., Emmerth, M., Walcher, M., Kreft, J., Goebel,

W., Wagner, M., Schleifer, K.H. 2005. Evolutionary history of the genus Listeria and

its virulence genes. Syst. Appl. Microbiol. 28, 1-18.

Schönberg, A., Bannerman, E., Courtieu, A.L., Kiss, R., McLauchlin, J., Shah, S.,

Wilhelms, W. 1996. Serotyping of 80 strains from the WHO multicentre international

typing study Listeria monocytogenes. Int. J. Food Microbiol. 32, 279-287.

Schuchat, A., Deaver, K., Hayes, P.S., Graves, L., Mascola, L., Wenger, J.D. 1993.

Gastrointestinal carriage of Listeria monocytogenes in household contacts of patients

with listeriosis. J. Infect. Dis. 167, 1261-1262.

Seeliger, H.P.R., Hohne, K. 1979. Serotyping of Listeria monocytogenes and related

species. Meth. Microbiol. 13, 31-49.

Silver, H.M. 1998. Listeriosis during pregnancy. Obstet.Gynecol.Surv. 53, 737-740.

Sim, J., Hood, D., Finnie, L., Wilson, M., Graham, C., Brett, M., Hudson, J.A. 2002.

Series of incidents of Listeria monocytogenes non-invasive febrile gastroenteritis

involving ready-to-eat meats. Lett. Appl. Microbiol. 35, 409-413.

Smoot, L.M., Pierson, M.D. 1998. Effect of environmental stress on the ability of

Listeria monocytogenes Scott A to attach to food contact surfaces. J. Food Prot. 61,

1293-1298.

Stams, A.J., Oude Elferink, S.J. 1997. Understanding and advancing wastewater

treatment. Curr. Opin. Biotechnol. 8, 328-334.

Stepanovic, S., Vukovic, D., Dakic, I., Savic, B., Svabic-Vlahovic, M. 2000.

A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation.

J. Microbiol. Methods 40, 175-179.

43

Ternström, A., Molin, G. 1987. Incidence of potential pathogens on raw pork, beef and

chicken in Sweden, with special reference to Erysipelothrix rhusiopathiae. J. Food Prot.

50, 141-146.

Terveyden ja hyvinvoinnin laitos. (2009). Listeria (listerioosi).

http://www.ktl.fi/portal/12903, haettu 8.3.2009

Tilney, L.G., Portnoy, D.A. 1989. Actin filaments and the growth, movement, and

spread of the intracellular bacterial parasite, Listeria monocytogenes. J. Cell Biol. 109,

1597-1608.

Tompkin, R.B. 2002. Control of Listeria monocytogenes in the food-processing

environment. J. Food Prot. 65, 709-725.

Uyttendaele, M., De Troy, P., Debevere, J. 1999. Incidence of Listeria monocytogenes

in different types of meat products on the Belgian retail market. Int. J. Food Microbiol.

53, 75-80.

Vazquez-Boland, J.A., Kocks, C., Dramsi, S., Ohayon, H., Geoffroy, C., Mengaud, J.,

Cossart, P. 1992. Nucleotide sequence of the lecithinase operon of Listeria

monocytogenes and possible role of lecithinase in cell-to-cell spread. Infect. Immun. 60,

219-230.

Vesterlund, S., Paltta, J., Karp, M., Ouwehand, A.C. 2005. Measurement of bacterial

adhesion-in vitro evaluation of different methods. J. Microbiol. Methods 60, 225-233.

Walker, J.K., Morgan, J.H. 1993. Ovine ophthalmitis associated with Listeria

monocytogenes. Vet. Rec. 132, 636.

Walker, J.K., Morgan, J.H., McLauchlin, J., Grant, K.A., Shallcross, J.A. 1994. Listeria

innocua isolated from a case of ovine meningoencephalitis. Vet. Microbiol. 42, 245-253.

Watkins, J., Sleath, K.P. 1981. Isolation and enumeration of Listeria monocytogenes

from sewage, sewage sludge and river water. J. Appl. Bacteriol. 50, 1-9.

44

Weis, J., Seeliger, H.P. 1975. Incidence of Listeria monocytogenes in nature. Appl.

Microbiol. 30, 29-32.

Werbrouck, H., Grijspeerdt, K., Botteldoorn, N., Van Pamel, E., Rijpens, N., Van

Damme, J., Uyttendaele, M., Herman, L., Van Coillie, E. 2006. Differential inlA and

inlB expression and interaction with human intestinal and liver cells by Listeria

monocytogenes strains of different origins. Appl. Environ. Microbiol. 72, 3862-3871.

Wesley, I.V. 2007. Listeriosis in animals. Kirjassa: Ryser E.T., Marth E.H., toim.

Listeria, Listeriosis and Food Safety. 3. painos., 55-84.