บทปฏิบติัการท่ี๔การเตรยีมอาหารเล้ียงเชื้อและการนับ

จำานวนแบคทีเรยีท่ีมชีวีติ

จดัทำาโดยสมาชกิกลุ่ม ๒

๑. นายยงยุทธ ์ จนิาจนัทร ์ รหัส ๔๙๑๐๑๐๑๓๕๘

๒. นายจกัรพนัธ ์ วบูิลยม์า รหัส ๕๐๑๐๑๐๑๓๐๙

๓. นายจติพนัธ ์ ป้อมเผือก รหัส ๕๐๑๐๑๐๑๓๑๑

๔. นางสาวชมยัพร เขยีวหมา้ย รหัส ๕๐๑๐๑๐๑๓๑๗

๕. นายสภีุระ บวัเมอืง รหัส ๕๐๑๐๑๐๑๓๗๗

สาขาการประมง๔ ปี

เสนอต่ออาจารยช์นกันต์ จติมนัส

บทปฏิบติัการท่ี๔การเตรยีมอาหารเล้ียงเชื้อและการนับจำานวนแบคทีเรยีท่ี

มชีวีติ

การนับจำานวนแบคทีเรยีจากตัวปลา นำ�าและดินก้นบอ่ ทำาได้หลายวธิ ี แต่ที่จะใหนั้กศึกษาฝึกในบทปฏิบติัการนี�เป็นการนับจำานวนเซลล์แบคทีเรยีท่ีมชีวีติ โดยวธิ ีdilution plate count

วตัถปุระสงค์ เพื่อสามารถนำาไปปรบัใชใ้นการตรวจสอบปรมิาณเชื�อ

แบคทีเรยีในตัวอยา่งสตัวน์ำ�าหรอืตัวอยา่งนำ�ารวมไปถึงการทดลองที่เกี่ยวขอ้งกับประสทิธภิาพของยาปฏิชวีนะ สารเคมแีละสมุนไพร เป็นต้น

อุปกรณ์1 .แบคทีเรยี

2 .Plate3. นำ�าเกลือ

4. อาหารเลี�ยงเชื�อ5. Pipette tips6 .Micropipette

7 .Centrifuge Tube

8 .เครื่อง Spectrophotometor9 .Centrifuge

10 .Votex11 ตู้บม่เชื�อ

วธิทีำาการทดลอง1 .เก็บเซลล์แบคทีเรยีโดยการปั่ นท่ี 2500 rpm 15 นาที2 .ล้างเซลล์ด้วยนำ�าเกลือ 0.85% ท่ีฆา่เชื�อแล้ว 2 ครั�ง3 .เติมนำ�าเกลือ 0.85% ท่ีฆา่เชื�อ แล้วผสมใหเ้ขา้กันเป็นเนื�อ

เดียวกับแบคทีเรยี ก่อนนำาไปวดัความขาวขุน่ (optical density; OD) ท่ีความยาวคล่ืน 625 nm เครื่อง Spectrophotometorgmใหด้้ายค่า OD 0.08-0.1

4 .เจอืจางแบคทีเรยีลงครั�งละ 10 เท่าจนถึง 10-5, 10-6 , 10-

7 ดดูสารละลายแบคทีเรยี 0.1 ml หยดลงตรงกลางจานอาหารวุน้ แล้วเกล่ียด้วยแท่งงอท่ีฆา่เชื�อแล้ว ทิ�งใหแ้หง้ โดยแต่ละความเขม้ขน้ควรมอียา่งน้อย 3 ซำ�า

5 .นำาไปอบท่ี 28-30 องศาเซลเซยีส เป็นเวลา 18-24 ชัว่โมง6 .ใหนั้บจำานวนโคโลนี แล้วรายงานผลเป็น colony forming

unit (CFU)/ml โดยจำานวนโคโลนีท่ีนับได้บนอาหาร เลี�ยงเชื�อต้องอยูร่ะหวา่ง 30-300 โคโลนีต่อหนึ่งจานเลี�ยงเชื�อ

7. คำานวณจำานวนโคโลนีต่อตัวอยา่ง

ภาพจากการทำาการทดลอง

เก็บเซลล์แบคทีเรยีโดยการปั่ นท่ี 2500 rpm 15 นาที

เติมนำ�าเกลือ 0.85% ท่ีฆา่เชื�อ

ผสมใหเ้ขา้กันเป็นเนื�อเดียวกับแบคทีเรยี

นำาไปวดัความขาวขุน่ (optical density; OD) ท่ีความยาวคล่ืน 625 nm เครื่อง Spectrophotometorgm

อาหารเลี�ยงเชื�อ

ดดูสารละลายแบคทีเรยี 0.1 ml หยดลงตรงกลางจานอาหารวุน้ แล้วเกล่ียด้วยแท่งงอท่ีฆา่เชื�อแล้ว ทิ�งใหแ้หง้

สรุปผลการทดลอง ผลจากาการนับโคโลนีแบคทีเรยีมมีากกวา่ 300 โคโลนี

วจิารณ์ผลการทดลอง จากการทดลองบทปฏิบติัการท่ี ๔ นี�เป็นการนับจำานวน

แบคทีเรยีจากตัวปลา นำ�าและดินก้นบอ่ ทำาได้หลายวธิ ี แต่ที่จะให้นักศึกษาฝึกในบทปฏิบติัการนี�เป็นการนับจำานวนเซลล์แบคทีเรยีท่ีมีชวีติ โดยวธิ ีdilution plate count เพื่อสามารถนำาไปปรบัใชใ้นการตรวจสอบปรมิาณเชื�อแบคทีเรยีในตัวอยา่งสตัวน์ำ�าหรอืตัวอยา่งนำ�ารวมไปถึงการทดลองท่ีเกี่ยวขอ้งกับประสทิธภิาพของยาปฏิชวีนะ สารเคมแีละสมุนไพร เป็นต้น เน่ืองจากตอนท่ีไปฝึกงานก็เคยได้ทำาเลยทำาด้ายคล่องมากขึ�น เลยไมค่่อยมปีํญหาในการใชอุ้ปกรณ์

ตรวจเอกสาร

เทคนิคพื้นฐานทางจุลชวีวทิยา

1.เทคนิคท่ีใชใ้นการแยกเชื้อบรสิทุธิ์

1. 1 Spread-Plate Technique ในแหล่งธรรมชาตินั�นปกติเชื�อแบคทีเรยีจะเติบโตอยูร่วมกันหลายๆสายพนัธุ ์เพื่อการคัดแยกและจำาแนกชนิดของแบคทีเรยีแต่ละสายพนัธุจ์ะต้องมขีั �นตอนการทำาใหเ้ชื�อบรสิทุธิ ์(pure culture) โดยเทคนิคท่ีทำาได้ง่ายคือ spread plate technique ซึ่งเทคนิคนี�แบคทีเรยีที่ถกูทำาใหเ้จอืจางใหม้จีำานวนประมาณ 100-200 เซลล์ หรอืน้อยกวา่จะถกูนำาไปวางตำาแหน่งตรงกลางของจานเพาะเชื�อ (petri dish/plate) แล้วทำาการเกล่ียใหเ้ชื�อกระจายทัว่ด้วยแท่งแก้วรูปตัว L หลังจากบม่ท่ีอุณหภมูทิี่เหมาะสมและมรีะยะเวลาเพยีง

พอ จะปรากฏโคโลนี (colony) ของเชื�อแบคทีเรยีขึ�น โดยแต่ละโคโลนีจะมจีำานวนแบคทีเรยีอยูจ่ำานวนมาก และแต่ละโคโลนีจะถือวา่มาจากแบคทีเรยีสายพนัธุเ์ดียว ดังนั�นจะทำาใหเ้กิดการแยกจุลินทรยี์ออกมาเป็นเชื�อบรสิทุธิข์ึ�น เมื่อมองด้วยตาเปล่าแบคทีเรยีแต่ละสายพนัธุโ์คโลนีจะมลัีกษณะแตกต่างกันดังแสดงในภาพท่ี 1-1 นอกจากนั�นยงัสามารถทำาใหเ้ชื�อมคีวามบรสิทุธิม์ากขึ�นโดยการนำาโคโลนีท่ีต้องการไปเพาะเลี�ยงในจานเพาะเชื�อท่ีมอีาหารใหมด้่วยเทคนิคท่ีเรยีกวา่ Streak-Plate Technique

ภาพที่ 1-1 ลักษณะโคโลนีของแบคทีเรยีท่ีเจรญิบนอาหารแขง็และคำา (Key word) ท่ีใชใ้นการอธบิายลักษณะโคโลนี ท่ีมา: Prescott (2002)

1.2 Pour Plate Technique               เทคนิคการเพาะเชื�อแบบ pour-plate technique ก็เป็นอีกวธิีการหน่ึงท่ีใชใ้นการแยกเชื�อใหบ้รสิทุธิไ์ด้เชน่กัน โดยตัวอยา่งเริม่ต้นจะถกูเจอืจางใหม้คีวามเขม้ขน้หลายๆ ระดับด้วยเทคนิค serial dilution เพื่อทำาใหเ้ชื�อถกูเจอืจางมากพอที่จะทำาใหเ้กิดโคโลนีเดี่ยวๆ บนจานเพาะเชื�อ โดยนำาตัวอยา่งท่ีมคีวามเขม้ขน้ที่เหมาะสมเติมลงใน

จานเพาะเชื�อเปล่าท่ีผ่านการฆา่เชื�อแล้ว แล้วทำาการเทอาหารวุน้ลง (Agar Medium) ไปในจานเพาะเชื�อ (โดยอุณหภมูขิองอาหารเพาะเชื�อประมาณ 48-50 องศาเซลเซยีส ซึ่งจะไมท่ำาใหเ้ชื�อแบคทีเรยีและยสีต์ตายได้) ผสมอาหารและเชื�อใหเ้ขา้กันและใหเ้กิดการกระจายอยา่งสมำ่าเสมอด้วยการหมุนจานเพาะเชื�อ เมื่อวุน้เกิดการแขง็ตัว เซลล์จุลินทรยีจ์ะถกูตรงึใหอ้ยูด่้านในของอาหาร และจะเกิดโคโลนีเดี่ยวๆ ของเชื�อขึ�นมา

1.3 Streak-Plate Technique การแยกเชื�อใหบ้รสิทุธิเ์ป็นเทคนิคพื�นฐานทางจุลชวีวทิยาที่มคีวามสำาคัญอยา่งมาก เน่ืองจากสิง่แวดล้อมต่างๆ เชน่ นำ�า อากาศ พื�นหอ้งเรยีน หรอืแมแ้ต่รา่งกายของคนก็มเีชื�อจุลินทรยีอ์ยูห่ลายชนิดท่ีอาจปนเปื� อนในหลอดเพาะเชื�อได้ หลักการของการแยกเชื�อใหบ้รสิทุธิ์บนอาหารเลี�ยงเชื�อ (culture medium) คือ จะต้องแยกเชื�อใหไ้ด้โคโลนีเดี่ยวๆ (single colony) จำานวนมาก จากนั�นจงึนำาเชื�อท่ีเป็นโคโลนีเดี่ยวไปศึกษารูปรา่งลักษณะ และคณุสมบติัต่างๆ เพื่อใหท้ราบวา่เป็นเชื�อชนิดใด เทคนิคท่ีนิยมใชใ้นการแยกเชื�อบรสิทุธิคื์อ วธิ ีcross streak plate ซึ่งทำาได้โดยใชห้ว่งเขีย่เชื�อ (loop) แตะตัวอยา่งหรอืสิง่สง่ตรวจแล้วลากหรอืขดี (streak) ลงบนจานเพาะเชื�อท่ีมอีาหารแขง็ (agar plate) อยูใ่หไ้ด้แนวระนาบติดต่อกัน 4-5 เสน้ หลังจากเสรจ็ในระนาบแรกซึ่งมเีชื�อจุลินทรยีอ์ยูห่นาแน่นท่ีสดุ ให้นำาหว่งเขีย่เชื�อมาเผาไฟใหล้วดท่ีปลายรอ้นแดงเพื่อฆา่เชื�อท่ีติดให้หมด จากนั�นจงึขดีเชื�อจากสว่นของรอยลากในระนาบแรกออกมาเพยีงหน่ึงครั�งแล้วลากเป็นระนาบท่ีสอง 4-5 เสน้ติดกันโดยรอยขดีของเชื�อจะไมท่ับกับระนาบแรกอีก หลังจากนั �นก็ทำาเชน่เดียวกันกับระนาบท่ีสองจนครบทัว่ทั�งจานเพาะเชื�อซึ่งมปีระมาณสีร่ะนาบ (ภาพที่ 1-2) เมื่อได้เชื�อบรสิทุธิแ์ล้วจะมกีารศึกษาเชื�อต่อไปในด้านต่างๆ ซึ่งจะต้องมกีารถ่ายเชื�อจากอาหารเดิมไปยงัอาหารใหม ่หรอืมกีารเพาะเชื�อลงในอาหารเพื่อการทดสอบและการวเิคราะหต่์างๆ ดังนั�นการ

เรยีนรูเ้ทคนิคที่ถกูต้องในการถ่ายเชื�อจงึมคีวามสำาคัญเป็นอยา่งยิง่ซึ่งต้องอาศัยหลักการของ aseptic technique เพื่อป้องกันการปนเปื� อนของเชื�อชนิดอ่ืนซึ่งจะทำาใหผ้ลการทดลองผิดพลาดได้ อุปกรณ์พื�นฐานท่ีใชใ้นการถ่ายเชื�อคือ หว่งเขีย่เชื�อ เขม็เขีย่เชื�อ (needle) และตะเกียงอัลกอฮอล์สำาหรบัใชฆ้า่เชื�อโดยการเผา (incineration) การถ่ายเชื�อจุลินทรยีพ์วกแบคทีเรยีและยสีต์จะใช้หว่งเขีย่เชื�อเป็นสว่นใหญ่ มบีางครั �งท่ีใชเ้ขม็เขยีเชื�อปลายตรง สว่นเชื�อราท่ีเป็นเสน้สาย (filamentous fungi) มกัจะใชเ้ขม็เขีย่ปลายงอ

 

ภาพที่ 1-2 การแยกเชื�อด้วยวธิ ีcross streak plate

วตัถปุระสงค์1. เพื่อใหนั้กศึกษาเทคนิคพื�นฐานเกี่ยวกับทางจุลชวีวทิยาได้แก่ การถ่ายเชื�อที่ถกูต้องด้วยเทคนิคปลอดเชื�อ (aseptic technique) การทำา serial dilution, Spread plate, Pour plate และ Streak plate 2. เพื่อใหนั้กศึกษาเรยีนรูแ้ละเขา้ใจเกี่ยวกับขอ้ควรระวงัและความปลอดภัยในการการปฏิบติังาน

วธิกีารทดลอง

การเพาะเชื้อแบบ Spread Plate

การเจอืจางแบบ 10 serial dilutions

1. ปิเปต 1 ml ซสัเพนชนัของเชื�อตั�งต้น (100) มาใสห่ลอดที่มีนำ�าเกลือ (0.9 % NaCl) ท่ีฆา่เชื�อแล้ว ปรมิาตร 9 ml ด้วยเทคนิคปลอดเชื�อ เขยา่ใหเ้ขา้กัน จะได้เป็นซสัเพนชนัของเชื�อท่ี 10-1

2. ปิเปตซสัเพนชนัของเชื�อท่ีได้ (10-1) 1 ml ใสห่ลอดที่มนีำ�าเกลือ (0.9 % NaCl) ท่ีฆา่เชื�อแล้ว ปรมิาตร 9 ml ด้วยเทคนิคปลอดเชื�อ เขยา่ใหเ้ขา้กัน จะได้เป็นซสัเพนชนัของเชื�อท่ี 10-2

3. ปิเปตซสัเพนชนัของเชื�อท่ีได้ (10-2) 1 ml ใสห่ลอดที่มนีำ�าเกลือ (0.9 % NaCl) ท่ีฆา่เชื�อแล้ว ปรมิาตร 9 ml ด้วยเทคนิคปลอดเชื�อ เขยา่ใหเ้ขา้กัน จะได้เป็นซสัเพนชนัของเชื�อท่ี 10-3

4. นำาไปทดลองต่อในขั �นต่อไป : การเพาะเชื�อแบบ Spread Plate และ Pour Plate

ภาพที่ 1-3 ขั�นตอนการทำา serial dilutionท่ีมา: Prescott (2002)

ขัน้ตอนการ Spread plate 1. ระบุชื่อ-กลุ นักศึกษา วนัที่ทำาการทดลองที่ด้านล่างของจานเพาะเชื�อ

2. ปิเปตตัวอยา่งปรมิาตร 0.1 มลิลิลิตร ลงท่ีตำาแหน่งตรงกลางจานเพาะเชื�อ3. จุม่แท่งแก้วรูปตัวแอล (spreader) ในแอลกอฮอล์เขม้ขน้รอ้ยละ 95 แล้วเอียง spreader ท่ีขอบของบกีเกอรเ์พื่อแยกแอลกอฮอล์สว่นเกินออก4. นำาแท่งแก้วเกล่ีย spreader ท่ีผ่านการจุม่แอลกอฮอล์ไปเผาไฟจนแอลกอฮอล์ไหมห้มด และปล่อยให ้spreader เยน็5. นำา spreader เกล่ียเชื�อใหท้ัว่จานจานเพาะเชื�อ และระมดัระวงัไม่ใหม้อืสมัผัสกับขอบด้านในของจานเพาะเชื�อ6. จุม่ spreader ในแอลกอฮอล์เขม้ขน้รอ้ยละ 95 และกำาจดัแอลกอฮอล์สว่นเกินโดยใหแ้ท่งแก้วสมัผัสกับของบกีเกอร ์นำาเผาไฟจนแอลกอฮอล์ไหมห้มด ปล่อยใหเ้ยน็ และนำาไปเกล่ียเชื�อแบคทีเรยีจานในจานเพาะเชื�อท่ีเหลือ โดยขั�นตอนการ Spread plate แสดงไวใ้นภาพที่ 1-47. กลับจานเพาะเชื�อใหด้้านที่มอีาหารเพาะเชื�ออยูด่้านบน แล้วนำาไปบม่ท่ีอุณหภมู ิ37 องศาเซลเซยีส นาน 24-48 ชัว่โมง8. สงัเกตลักษณะของโคโลนีท่ีปรากฏ

ภาพที่ 1-4  ขั�นตอนเพาะเชื�อด้วยเทคนิค spread plate technique ท่ีมา: Prescott (2002)

การเพาะเชื้อแบบ Pour Plate

1. เตรยีมจานเพาะเชื�อ (เปล่า) เขยีนชื่อ-สกลุ วนัท่ีทำาการทดลองท่ีด้านล่างของจานเพาะเชื�อ

2. เตรยีมหลอดอาหาร NA ปรมิาตร 15 ml ท่ีผ่านการฆา่เชื�อแล้ว

3. เตรยีมปิเปตขนาด 1 ml  ท่ีผ่านการฆา่เชื�อแล้ว 4. ปิเปตซสัเพนชนัของเชื�อท่ีอัตราการเจอืจาง 10-1 ปรมิาตร

1.0 ml ปล่อยลงในจานเพาะเชื�อด้วยเทคนิคปลอดเชื�อ 5. เทอาหารจากหลอดอาหาร NA 15 ml ลงในจานเพาะเชื�อท่ีมี

เชื�ออยูแ่ล้ว 6. หมุนจานเพาะเชื�อเพื่อใหเ้ชื�อและอาหารผสมเขา้กันดี รอจน

อาหารกลายเป็นวุน้แขง็ดีแล้วจงึควำ่าจานเพาะเชื�อ แล้วนำาไปบม่ท่ี 3737oC 24-48 ชัว่โมง ทำาซำ้าโดยใชซ้สัเพนชนัของเชื้อท่ี 10-2 แทน โดยขั�นตอนการ pour plate แสดงไวใ้นภาพท่ี 1-5

ภาพที่ 1-5  ขั�นตอนการเพาะเชื�อด้วยเทคนิค pour plateท่ีมา: Prescott (2002)

การทำาให้เชื้อบรสิทุธิด้์วยเทคนิค Streak plate 1. ระบุชื่อ-กลุ นักศึกษา วนัที่ทำาการทดลองที่ด้านล่างของจานเพาะเชื�อท่ีมอีาหารเลี�ยงอยู ่2. ใชล้บูเขีย่เชื�อ (Loop) เขีย่เอาเชื�อออกจากหลอดท่ีมเีชื�อด้วยเทคนิคปลอดเชื�อ (Aseptic technique) ดังแสดงในภาพที่ 1-6

ภาพที่ 1-6 การถ่ายเชื�อด้วยเทคนิคปลอดเชื�อ                ท่ีมา: Prescott (2002)

3. แล้วทำาการ Streak เชื�อท่ีอยูป่ลาย loop ลงบนจานเพาะเชื�อที่มีอาหารเลี�ยงเชื�อท่ีได้เตรยีมไวแ้ล้ว ด้วยความระมดัระวงั ซึ่งมขีั �นตอนดังนี�3.1 เปิดฝาจานเพาะเชื�อใหม้ชีอ่งวา่งเพยีงพอที่จะสอด loop เขา้ไปได้ง่าย ดังแสดงในภาพท่ี 1-7 (ก) แล้วสอด Loop ท่ีมเีชื�อแบคทีเรยีอยูท่ำาการ streak ท่ีพื�นที่หมายเลข 1 โดยในระหวา่งการ streak จะต้องไมท่ำาใหผ้ิวของอาหารแตก

3.2 เมื่อ streak ท่ีบรเิวณพื�นท่ีหมายเลข 1 แล้วใหน้ำา Loop ออกมาฆา่เชื�อโดยการเผาไฟ หลังจากนั�นทำาให ้loop เยน็ลงโดยการแตะท่ีขอบของอาหารเลี�ยงเชื�อใกล้ๆ กับบรเิวณหมายเลข 13.3 หมุนจานเพาะเชื�อใหอ้ยูใ่นตำาแหน่งท่ีเหมาะสมสำาหรบัการ streak บรเิวณพื�นที่หมายเลข 2 แล้วทำาการ cross streak โดยจุดเริม่ต้นจะอยูท่ี่บรเิวณพื�นท่ีหมายเลข 1 แล้วทำาการ Streak ท่ีบรเิวณพื�นที่หมายเลข 2 ดังภาพท่ี 1-7 (ข)3.4 เมื่อ streak ท่ีบรเิวณพื�นท่ีหมายเลข 2 แล้วใหน้ำา Loop ออกมาฆา่เชื�อโดยการเผาไฟ หลังจากนั�นทำาให ้loop เยน็ลงโดยการแตะท่ีขอบของอาหารเลี�ยงเชื�อใกล้ๆ กับบรเิวณหมายเลข 23.5 หมุนจานเพาะเชื�อใหอ้ยูใ่นตำาแหน่งท่ีเหมาะสมสำาหรบัการ streak บรเิวณพื�นที่หมายเลข 3 แล้วทำาการ cross streak โดยจุดเริม่ต้นจะอยูท่ี่บรเิวณพื�นท่ีหมายเลข 2 แล้วทำาการ Streak ท่ีบรเิวณพื�นที่หมายเลข 3 ดังภาพท่ี 1-7 (ข) ถ้าหากจำาเป็นสามารถทำาการ streak ท่ีบรเิวณพื�นท่ีหมายเลข 4 ได้3.6 กลับจานเพาะเชื�อแล้วนำาไปบม่ในตู้บม่เชื�อควบคมุอุณหภมู ิ37 องศาเซลเซยีส นาน 24-48 ชัว่โมง แล้วสงัเกตการเจรญิของเชื�อ

(ก)

 

(ข)

(ค)

(ง)

ภาพที่ 1-7 ขั�นตอนการทำาเชื�อบรสิทุธิด์้วยเทคนิค Streak plateท่ีมา: Prescott (2002)

เอกสารอ้างอิง

อภิญญา  จนัทรวฒั. เทคนิคพื้นฐานทางจุลชวีวทิยา. [ออนไลน์].เขา้ถึงได้จาก :http://www.agro.kmutnb.ac.th/e-learning/521302/1.php (วนัท่ีค้นขอ้มูล:28 มถินุายน 2553)