Lo studio delle correnti ioniche di singolo canale

mediante la tecnica del patch-clamp

Era noto da lungo tempo che attraverso la membrana plasmatica è possibile un rapido scambio di ioni. Tuttavia, Neher e Sakmann furono i primi a mostrare l’esistenza di canali ionici specifici

La tecnica del patch clamp

Erwin Neher & Bert Sakmann Premi Nobel per la medicina nel 1991 per lo sviluppo della tecnica del patch-clamp rendendo possibile la caratterizzazione di singoli canali ionici

Per chiarire come funziona un canale ionico, cioè come esso si apre e si chiude, è necessario poter registrare la corrente che lo attraversa.

Antecedentemente all’era del patch-clamp ciò appariva elusivo in quanto la corrente ionica attraverso un singolo canale è molto piccola.

Con la tecnica del patch-clamp si poterono superare tali difficoltà.

Il setup per il patch-clamp

computer

oscilloscopio

amplificatore

microelettrodo

micromanipolatore

preparato

microscopio

gabbia di Faraday

La configurazione di cell-attached

Registrazione di una corrente elettrica che fluisce attraverso un singolo canale ionico

Elettrodo di registrazione:micropipetta di vetro 10-6 m

Resistenza della saldatura: >1 G

Quando un singolo canale si apre, gli ioni si muoveranno attraverso il canale come una corrente elettrica

Con un opportuno equipaggiamento elettronico e opportune condizioni sperimentali è possibile misurare questa corrente “microscopica”

Amplificatore

Quale tipo di informazioni è possibile ottenere dalla registrazione

di correnti di singolo canale?

Ampiezza media di

singolo canale

Ampiezza media della corrente attraverso un singolo canale

20 ms

1 pA

Chiuso

Aperto

Traccia di corrente attraverso un singolo canale

Causa la presenza di un rumore di fondo che è riducibile ma non eliminabile, l’ampiezza della corrente che fluisce attraverso un singolo

canale è soggetta a fluttuazioni.

Di essa è pertanto possibile conoscere solo il suo valore medio

Il calcolo di tale valore richiede la costruzione di un istogramma di ampiezza derivato dalla registrazione di singolo canale

20 ms

1 pA

Chiuso

Aperto

Costruzione di un istogramma di ampiezza

Occorre una lunga registrazione di singolo canale Si misurano le ampiezze di tutte le aperture Tali ampiezze vengono riportate in un grafico (istogramma di ampiezza) ll dominio dell’ampiezza (ascissa del grafico) viene suddiviso in intervalli costanti a ciascuno dei quali si associa il numero di aperture aventi ampiezza corrispondente

=1.7 pA

1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 2.00

200

400

600

800

1000

Nu

me

ro d

eg

li e

ven

tiAmpiezza (pA)

La larghezza dell’istogramma dipende dal rumore di fondo della registrazioneL’andamento dell’istogramma può essere descritto da una funzione gaussiana del tipo:

dove: = ampiezza media di corrente= deviazione standard

A = area della distribuzione

2

2

2 22

)x(

expA

N

-30 mV

0 mV

+40 mV

-100 mV

-100 mV

-100 mV

La “conduttanza di singolo canale ()” è un parametro biofisico caratteristico di un certo tipo di canale

La relazione corrente-voltaggio a canale aperto è generalmente lineareiopen single = γ (V-EK)

Misurando le correnti di singolo canale è possibile costruire la relazione I-V a canale aperto

Probabilità di

apertura

Cos’è la probabilità di apertura?

chiuso stato nello tot. tempo aperto stato nello tot. tempo

aperto stato nello trascorsototale tempo P

OPEN

aperto stato nello trascorso tempo delfrazione POPEN

vale a dire,

Chiuso

Aperto

A1 A8A2 A3 A4 A5 A6 A7 A9 A10

C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9

nn

nopen C.....CCCA.....AAA

A.....AAAP

321321

321

chiuso

aperto

Tracciati di singolo canale che mostrano Po diverse

0.1

0.25

0.5

0.75

0.9

chiuso

aperto

chiuso

aperto

chiuso

aperto

chiuso

aperto

-30 mV

0 mV

+40 mV

-100 mV

-100 mV

-100 mV

Po nel caso di un canale voltaggio-dipendente:

Essa varia al variare del potenziale

Currente, conduttanza, e voltaggio

I = N·P·i

I = corrente “macroscopica”N = numero di canali funzionaliP = probabilità che un canale sia apertoi = corrente attraverso un singolo canale aperto

i = (V – VR)

= conduttanza del singolo canale apertoV = potenziale di membranaVR = potenziale di inversione

I = N·P· (V – VR)I = g (V – VR)

Corrente = Conduttanza Driving force

g = Conduttanza “macroscopica” g = N p se è costante, g è proporzionale a P

I = g (V – VK)

Quale altro tipo di informazione può dare l’analisi delle correnti di singolo

canale?

1. Il numero degli stati in cui il canale può esistere

2. Il tempo medio di permanenza in ciascun stato

3. Le velocità di transizione tra gli stati

chiuso

aperto

I tre tracciati mostrano la stessa probabilità di apertura ma cinetiche diverse

chiuso

aperto

chiuso

aperto

100 ms

1 pAChiuso

Aperto

Durata delle aperture e delle chiusure

Traccia di corrente attraverso un singolo canale ottenuta ad un potenziale fisso senza alcun tipo di sollecitazione (stato stazionario).

La corrente passa frequentemente dall’uno all’altro di due distinti livelli

il canale pur in condizioni stazionarie può trovarsi in almeno due stati conformazionali : chiuso e aperto

La traccia mostra una notevole variabilità nella durata delle aperture e delle chiusure

Non è possibile prevedere quanto tempo il canale rimarrà in ciascun stato funzionale (chiuso o aperto), né quando avverrà la successiva transizione:

Siamo di fronte a variabili casuali (stocastiche)

Le leggi che le governano possono essere dedotte dalla distrubuzione di probabilità di un elevato numero di eventi (aperture e chiusure)

Come ricavare la distribuzione di probabilità delle aperture e delle chiusure

• Occorre una lunga registrazione di singolo canale

• Si misurano le durate di tutte le aperture (e chiusure)

• Tali durate vengono riportate in un grafico (istogramma di durata)

• ll dominio temporale (ascissa del grafico) viene suddiviso in intervalli costanti a ciascuno dei quali si associa il numero di aperture aventi durata corrispondente

100 ms

Chiuso

Aperto

Tempi di apertura

5 10 15 20 25 300

50

100

150

200

250

300

350

Num

ero

de

gli

eve

nti

Durata aperture (ms)

Tempi di chiusura

20 40 60 80 100 120 1400

100

200

300

400

500

Num

ero

de

gli

eve

nti

Durata chiusure (ms)

∑aperture=950 ∑chiusure=950

Tempi di apertura

5 10 15 20 25 300

50

100

150

200

250

300

350

Num

ero

de

gli

eve

nti

Durata aperture (ms)

Tempi di chiusura

20 40 60 80 100 120 1400

100

200

300

400

500

Num

ero

de

gli

eve

nti

Durata chiusure (ms)

Notare l’andamento decrescente delle due distribuzioni:

• gli eventi di breve durata sono i più frequenti• gli eventi più lunghi sono via via sempre meno numerosi

t

expa)t(N

Le due distribuzioni delle durate sono ben descritte da funzioni del tipo:

dove:

• N(t) = numero di aperture comprese tra (t-0.5dt) e (t+0.5dt)• dt =intervallo in cui è suddivisa l’ascissa• a e sono costanti tipiche del canale

In particolare, =costante di tempo è un indice di quanto rapidamente la distribuzione declina verso zero:

è il tempo a cui la distribuzione è il 37% del suo valore iniziale

Nel caso di uno schema cinetico a due stati (C↔O) a=1/

=8 ms =26 ms

C

O

Come sono correlati i tempi di permanenza e le costanti di velocità nel caso di un modello a due stati?

)/texp()t(N ooo 1 )/texp()t(N ccc 1

Tempo Medio di Apertura (MOT o o) = 1/

 Tempo medio di chiusura (MCT o c) = 1/

Per esempio, se = 250 s-1 e = 1000 s-1, allorala durata media dei soggiorni nello stato aperto sarà 1/ = 1 mse la durata media di soggiorni nello stato chiuso sarà 1/ = 4 ms

Cioè: Il tempo medio che il canale trascorre in un particolare stato (il soggiorno in quello stato) e’ il reciproco della costante di velocità di transizione che porta fuori da quello stato.

)texp()t(N o )texp()t(N c Si può dimostrare che:

La frazione di tempo che il canale trascorre in uno dei due stati dipende da entrambe le costanti di velocità e . Pertanto:

Fraz. di t nello stato aperto =

MCTMOT

MOT

Se misuriamo un gran numero di tempi di apertura successivi, che tipo di distribuzione osserviamo?

Supponiamo che un canale aperto abbia una probabilità P= 0.3 di chiudersi nei successivi 0.1 ms. Allora, misurando 1000 aperture, circa 700 volte si avrebbero aperture con un to>0.1ms, ecc.

N. eventi con .. t o > di..70% di 1000 700 0.170% di 700 490 0.270% di 490 343 0.370% di 343 240 0.4

…. …. ….0

100

200

300

400

500

600

700

800

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6

Quindi, in uno schema cinetico a 2 stati: MOT=1/ e MCT=1/

Quando il canale è aperto vi è una probabilità costante che esso cambi il suo stato da O a C in un breve e definito intervallo di tempo t, indipendentemente da quanto a lungo già si trovava nello stato O, o da come ci era arrivato. Supponiamo per esempio che esista una probabilità P=0.3 che la transizione avvenga nei successivi 0.1 ms. Ciò significa che possiamo fare predizioni statistiche circa il cambiamento da O a C. Avendo osservato un gran numero di canali aperti, circa nel 30% di essi il cambiamento a C sarà avvenuto nei primi 0.1 ms. Quindi, dopo 0.1 ms il 70% di essi è ancora nello stato O. Nei successivi 0.1 ms, un ulteriore 30% del rimanente 70% cambierà a C, e così via.

Processi con tali caratteristiche, che la probabilità di un particolare cambiamento rimane costante in piccoli intervalli di tempo successivi, sono esempi di processi Markoviani.

Chiuso

Aperto

Tempi di apertura

5 10 15 20 25 300

50

100

150

200

250

300

350

Num

ero

ap

ert

ure

Durata aperture (ms)

=8 ms 1=2.3 ms a1=0.42=25 ms a2=0.6

10 20 30 40 50 600

50

100

150

200

250

300

350

Num

ero

ch

iusu

re

Durata chiusure (ms)

Tempi di chiusura

Canali con più stati chiusi distinguibili

Schemi cinetici possibili:

In questo caso le relazioni tra i tempi medi di apertura e di chiusura e le costanti di

velocità dipendono dallo schema cinetico scelto

C1 C2 O

C1 O C2

Importanza di:

Frequenza di campionamento

Filtraggio dei segnali

nella registrazione di correnti di singolo canale

Seguiranno esempi di tracciati mostranti la perdita di informazione con una frequenza di campionamento bassa o con un filtraggio eccessivo

4 ms

0.5 pA

Effetto del filtraggio su un tracciato di corrente di singolo canale

Traccia filtrata a 10000 Hz Traccia filtrata a 1000 Hz

In pratica per correnti di singolo canale il filtraggio analogico del segnale è normalmente compreso tra 5 e 3 KHz

4 ms

0.5 pA

Effetto della frequenza di campionamento su un tracciato di corrente di singolo canale

Freq. camp. = 0.1 ms/punto Freq. camp. = 0.4 ms/punto

Teorema del campionamento: i dati dovrebbero essere campionati ad una frequenza almeno doppia di quella della banda passante

Molte informazioni sul meccanismo di funzionamento dei canali ionici sono il risultato di una collaborazione tra elettrofisiologi e biologi molecolari

Supponiamo per esempio di voler testare l’ipotesi che una particolare catena laterale della proteina-canale sia implicata nel processo di apertura/chiusura.

Viene fatta “esprimere” laproteina con una catena laterale alterata

Gene (DNA)

Ipotesi circa una importante catena laterale

Vengono mutati i codons desiderati

Mutagenesi Sito-Diretta sul Canale Ionico

misura

RNA o cDNA