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Locorotondo, 4-5 Giugno 2009 c/o Aula polifunzionale Istituto Tecnico Agrario "Basile-Caramia"
Con il patrocinio delComune di Locorotondo
Università degli Studidi Bari
Istituto per i Processi Chimico-FisiciCNR Bari
Università del SalentoDipartimento di
Scienza dei Materiali
CON IL CONTRIBUTO DI
SPAGNUOLO FRANCESCO STRUMENTAZIONE SCIENTIFICA
BARI
Società Italiana di FotoBiologia Sezione Nazionale della International Union for Photobiology
Congresso Annuale 2009 4 – 5 giugno 2009 Locorotondo (BA)
ATTI DEL CONVEGNO
Comitato Organizzatore
Lucia Catucci
Luigi Ceci
Roberto Comparelli
Livia Giotta
Francesca Italiano
Francesco Milano
Massimo Trotta
Comitato Scientifico
Gianfranco Canti Sergio Caffieri
PierGiacomo Calzavara-Pinton Giovanni Checcucci
Franco Fusi Francesco Ghetti
Giulio Jori Giuseppe Palumbo
Massimo Trotta
Segreteria Organizzativa Francesco Milano
Istituto per i Processi Chimico-Fisici – CNR sede di Bari Via Orabona, 4 – 70126 Bari
PROGRAMMA
Giovedì 4 giugno 9.00 Apertura del Congresso. Saluto delle Autorità
Chairperson Massimo Trotta 9.30 – 10.10 Plenary Lecture: Péter Maróti Luminescence as indicator of state of the photosynthetic apparatus of
bacteria Comunicazioni orali (15 minuti): 10.10 – 10.25 Federica Gevi: Characterization of antenna isoforms from spinach leaves
grown under different light conditions 10.25 – 10.40 Tomas Morosinotto: Regulation of light harvesting in plants: a structural
basis for the pH-dependent xanthophyll cycle 10.40 – 11.55 Roberto Improta: Quantum-mechanical studies of the DNA excited states:
from the isolated nucleobases to the double strand 10.55 – 11.10 Vincenzo De Leo: Activity of cytochrome bc1 complex in cardiolipin
enriched chromatophores from Rhodobacter sphaeroides
11.10 – 11.30 Coffee Break
Comunicazioni orali: Chairperson Francesco Ghetti 11.30 – 11.45 Leonardo Beccarisi: Valutazione delle condizioni ambientali nella grotta
Zinzulusa in relazione all’impianto d’illuminazione 11.45 – 12.00 Mariateresa Volpicella: Analisi per mutagenesi inserzionale della resistenza
ai metalli pesanti del batterio fotosintetico R. sphaeroides 12.00 – 12.15 Fulvio Ciriaco: Interpretazione quantitativa delle oscillazioni del
semichinone in centri di reazione indotte da luce impulsata: un approccio simulativo
12.15 – 12.30 Ivan Husu: Intensità della luce di misura e costanti cinetiche caratteristiche del processo di ricombinazione di carica nel centro di reazione di Rb. sphaeroides
12.30 – 12.45 Disma Mastrogiacomo: Heavy metal binding properties of photosynthetic biofilms studied by ATR-FTIR difference spectroscopy
12.45 – 13.00 Fabio Mavelli: Studio teorico-sperimentale delle cinetiche di ricombinazione di carica in liposomi a composizione variabile
13.00 – 14.30 Pausa pranzo
Chairperson Franco Fusi 14.40 – 15.20 Plenary Lecture: Teresa Pellegrino
Novel Inorganic hybrid nanostructures for biomedical applications
15.20 – 15.40 Coffee Break
Tavola Rotonda FotoBiologia e Nanostrutture Moderatori Roberto Comparelli & Giuseppe Palumbo
15.40 – 16.00 Marco Marchetti Nanotubi inorganici geomimetici sintetici per applicazioni biomediche
16.00 – 16.20 Nicoletta Depalo Funzionalizzazione e bioconiugazione di nanocristalli colloidali
16.20 – 16.40 Elena Reddi Nanosistemi per ottimizzare la terapia fotodinamica dei tumori: aspettative e limitazioni
16.40 – 17.00 Cosimo D’Andrea Tecniche di imaging e spettroscopia di fluorescenza di nanoparticelle per applicazioni diagnostiche e terapeutiche
17.00 – 17.20 Luca De Stefano Biosensori e biochip ottici basati sulla nanotecnologia del silicio poroso
17.20 – 18.20 Discussione.
18.30 Assemblea dei Soci
20.30 Cena sociale
Venerdì 5 giugno
9.00 – 9.30 Giorgio Petrelli (Sindaco di Locorotondo) Francesco Dall’Acqua Luigi Musajo: padre della fotobiologia italiana Chairperson Francesco Dall’Acqua 9.30 – 10.10 Plenary Lecture: PierGiacomo Calzavara-Pinton PDT e dermatologia: dove siamo
Comunicazioni orali: 10.10 – 10.25 Sergio Caffieri: Fotostabilità di flavonoidi 10.25 – 10.40 Andrea Ventrella: Studies on the influences of heavy metals and herbicides
on photosynthetic materials by using optical assays 10.40 – 10.55 Raffaella Verrone: Effect of cyclodextrins on mycotoxin photodegradation 10.55 – 11.10 Francesca Cialdai: Caratterizzazione dell’autofluorescenza di cellule di
neuroblastoma (SH-SY5Y) sottoposte a campo elettrico
11.10 – 11.30 Coffee Break
Chairperson PierGiacomo Calzavara-Pinton Comunicazioni orali: 11.30 – 11.45 Marina Venturini: Microscopia laser confocale a riflettanza per la
valutazione in vivo di lesioni melanocitarie e tumori cutanei non melanoma 11.45 – 12.00 Elisa Corteggiani Carpinelli: Biofuel from microalgae, exploiting solar
energy for future sustainability 12.00 – 12.15 Angela Chiaviello: Photodynamic therapy combined with aspirin, causes
proteasome malfunctioning and promotes apoptosis of human-derived H1299 and A549 lung adenocarcinoma cells
12.15 – 12.30 Fulvio Ratto: Analisi di seconda armonica nella saldatura laser della cornea 12.30 – 12.45 Giovanni Romano: Sicurezza nell’uso dei laser in fotobiologia e
fotomedicina 12.45 – 13.00 Gabriele Bonaventura: Evidenze per una transizione globulare del dna
forza ionica indotta: uno studio di light scattering
13.00 – 14.30 Pausa pranzo
Chairperson Giuseppe Palumbo 14.40 – 15.20 Plenary Lecture: Clara Fabris
Fotosensibilizzazione di agenti patogeni di origine microbica: studi di base e prospettive terapeutiche
Comunicazioni orali: 15.20 – 15.35 Francesca Italiano: Studio della risposta metabolica di cellule di
rhodobacter sphaeroides esposte a stress abiotico da ioni cromato 15.35 – 15.50 Fernanda Ricchelli: Switch from inhibition to activation of the
mitochondrial permeability transition during hematoporphyrin-mediated photooxidative stress
15.50 – 16.05 Carlo Musio: Structural and regulatory facets of the opsin-like visual pigments in Hydra
15.05 – 16.20 Andrea Pardini: Spatial distribution of pigments in selected heterotrich ciliates by means of Multidimensional Confocal Fluorescence Microscopy
16.20 – 16.40 Coffee Break
Chairperson Gianfranco Canti Comunicazioni orali: 16.40 - 16.55 Monica Camerin: Sintesi e caratterizzazione di squaraine come
fotosensibilizzatori nella terapia fotodinamica 16.55 - 17.10 Barbara Cellamare: Attività fotodinamica dei complessi di inclusione
pigmento fotosintetico/ciclo destrina 17.10 - 17.25 Antonella Di Poto: The effect of photodynamic treatment combined with
antibiotic action or hostdefence mechanisms on staphylococcus aureus biofilms
17.30 Saluti finali e chiusura del Congresso
PLENARY
LECTURES
2
LUMINESCENCE AS INDICATOR OF STATE OF THE PHOTOSYNTHETIC APPARATUS OF BACTERIA
Péter Maróti and Emese Asztalos
Department of Biophysics, University of Szeged, Hungary
Although the importance of fluorescence of bacteriochlorophyll from photosynthetic bacteria has been recognized since decades, it has not become a routine tool in photosynthesis research in sharp contrast to chlorophyll fluorescence in oxygenic phototrophs. By kinetic measurements of prompt and delayed fluorescence from bacteriochlorophyll in purple nonsulphur bacteria Rhodobacter sphaeroides on wide (from 10 s to 1 s) time range, we will show its widespread use in investigation of function and structural organization the photosynthetic apparatus including the energetics, energy transfer, electron transport and proton uptake of the primary processes. Special interest will be paid to detect delayed fluorescence that has extremely small intensity (about 106 times smaller than that of the prompt fluorescence) and is always accompanied with the intense prompt fluorescence that blinds the photodetector. Several examples will demonstrate that native luminescence combined with kinetic absorption change spectrometry characterizes light-induced redox changes and their reverse (waste) processes in different levels of organizations (isolated reaction center protein, membrane fragments and intact whole cells) of the bacteria. By synchronization of the growth of bacteria, some luminescence-detected phenomena can be revealed which might be specific to age, to level of organization of the intracytoplasmic membrane (ICM) or to cell cycle of the bacteria (see the
Figures). As all of these characteristics are sensitive to assembly of photosynthetic units and to environmental effects, luminescence can be used to monitor these processes.
3
NOVEL INORGANIC HYBRID NANOSTRUCTURES FOR BIOMEDICAL APPLICATIONS
Teresa Pellegrino
National Nanotechnology Laboratory of CNR-INFM, Unità di ricerca Istituto Italiano di Tecnologia and Scuola Superiore ISUFI Via per Arnesano, 73100 Lecce (Italy)
The development of nanoscale "devices" able to perform, in parallel several tasks will offer
new solutions in both diagnosis and medical therapy.
In particular, nanostructures displaying at the same time fluorescence and magnetic properties
are potentially useful tools for biomedical applications, as dual modality imaging probes
based on optical and magnetic resonance imaging (MRI), or for bio-separation and bio-
sensing as for example the simultaneous magnetic separation and multiplexing optical
detection of different tumour cell populations. We report here the fabrication of two different
kinds of magnetic-fluorescent nano-tools. The first type is based on single superparamagnetic
nanoparticles functionalized with fluorophore molecules while the second type consists of
spherical nano-beads which display both fluorescent and magnetic features, based on grafting
fluorescent oligothiophene molecules to an amphiphilic polymer that is then used to enwrap
iron oxide nanoparticles acting as the magnetic domain. We report also cell imaging and cell
separation experiments, in which we demonstrate a cell separation efficiency of the level
required for cell sorting applications.
4
LUIGI MUSAJO: PADRE DELLA FOTOBIOLOGIA ITALIANA
Francesco Dall’Acqua
Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università di Padova
Luigi Musajo nasce a Locorotondo nel 1904. Si laurea in Chimica nel 1926 a Bologna,
elaborando una tesi sperimentale con il Prof. Ciamician. Si trasferisce a Bari, sotto la guida
del prof. Ciusa, come aiuto alla Cattedra di Chimica Farmaceutica. Ottiene la Libera Docenza
nel 1932 e frequenta nel 1937 il Laboratorio di Chimica dell’Università di Vienna, sotto la
direzione del prof. Späth.
Nel 1942 è chiamato in cattedra a Cagliari, quindi a Modena, dove rimane dal 1945 al 1951,
per poi passare a Padova, dove percorrerà tutta la sua carriera accademica (Direttore
dell’Istituto di Chimica Farmaceutica e del Centro sulla Chimica del Farmaco del CNR,
Preside, Prorettore, ecc.), assumendo importanti incarichi a livello nazionale e internazionale.
Luigi Musajo muore a Modena nel 1974.
Proprio a Vienna, sotto la guida del prof. Späth, scopre le furocumarine (dette anche
psoraleni); si dedica all’estrazione ed alla caratterizzazione di varie furocumarine, coltivando
essenzialmente l’aspetto della chimica delle sostanze naturali.
L’incontro con la fotobiologia avviene qualche anno più tardi: in occasione di un periodo di
licenza come ufficiale delle Armi Navali, si trova in una spiaggia poco lontana da
Locorotondo per fare qualche bagno di sole. In quella circostanza Musajo segue un
suggerimento popolare secondo il quale applicando sulla pelle dell’olio di bergamotto ed
esponendosi successivamente al sole, si ottiene un’intensa abbronzatura. Altro che
abbronzatura! Durante la notte infatti si sviluppa nella parte della pelle che ha trattato, un
forte eritema con gonfiore e dolore.
La sua curiosità di scienziato lo stimola a voler approfondire le motivazioni di un fenomeno
così pesante; grazie agli studi viennesi, si rende conto che l’effetto fotosensibilizzatore (come
egli lo definì) poteva venir attribuito proprio ad uno psoralene contenuto nell’olio di
bergamotto, il bergaptene, che ora chiamiamo 5-metossipsoralene o 5-MOP.
Da questo momento il Prof. Musajo dedica molto del suo impegno alla fotobiologia, e le
ricerche sue e del gruppo di ricercatori da lui forgiato si distingue a livello internazionale per
gli studi sul meccanismo d’azione delle furocumarine, portando infine, in collaborazione con i
dermatologi della Harvard Medical School, alla terapia PUVA.
5
TERAPIA FOTODINAMICA IN DERMATOLOGIA, OGGI
PierGiacomo Calzavara-Pinton
Clinica Dermatologica, Università e Spedali Civili di Brescia.
Dopo più di 100 anni dalle prime evidenze, la terapia fotodinamica (PDT) ha conquistato un
ruolo per quanto ancora (?) marginale nell’armamentario terapeutico dermatologico.
In Europa sono registrati attualmente due farmaci per uso locale dermatologico: il
metilaminolevulinato (Metvix, Galderma e Photocure) con l’indicazione basalioma, malattia
di Bowen e cheratosi attinica e gli ALA-patch di Intendis e Photonomic, non disponibili in
Italia. Levulan, DUSA è registrato solo negli USA e Canada. Sono inoltre disponibili varie
preparazioni locali galeniche di ALA per quanto vi siano dubbi sulla liceità della loro
commercializzazione dato che ALA è in vendita come reagente ma non è disponibile/
registrato come farmaco in Europa.
L’ uso di Metvix è frenato dal costo elevato e dalla mancata rimborsbilità del farmaco da
parte dei diversi SSR in Italia. Attualmente solo le Regioni Veneto e Lombardia hanno
deliberato sul loro rimborso per quanto con codici DRG diversi (Asportazione chirurgica per
il Veneto, Chemioterapia per la Lombardia: questi corrispondono a un rimborso di circa 700/
1000 euro nel primo caso e 424 nel secondo. Inoltre la Lombardia ha posto dei criteri
dimensionali precisi.
L’ efficacia/tollerabilità di ALA/MAL sono state poi investigate in un ampio spettro di
patologie dermatologiche infettive, infiammatorie e neoplastiche, talora senza solidi dati
sperimentali che ne giustificassero l’ impiego. I dati pubblicati si riferiscono perlopiù a studi
osservazionali su piccole casistiche o casi anedottici e come tali non possono mostrare gli
effettivi vantaggi della PDT in confronto al benchmark delle terapie convenzionali. E difatti l’
uso della PDT per queste indicazioni non si è mai diffuso nella pratica clinica.
L’ uso di fotosensibilizzanti per via generale è stato limitato a pochissime situazioni cliniche
e difficilmente si intravede in grado di attrarre un significativo interesse e conseguenti
investimenti nei prossimi anni.
L’ esperienza di questi ultimi anni ci permette di prevedere che ALA/MAL si stabilizzerà in
una nicchia consolidata di mercato per le indicazioni oncologiche attualmente registrate
mentre la ricerca di nuove molecole per uso locale e sistemico in Dermatologia soffre di una
grave carenza di investimenti limitata ad una frazione infinitesimale del budget dedicato alla
ricerca farmacologica.
6
FOTOSENSIBILIZZAZIONE DI AGENTI PATOGENI DI ORIGINE MICROBICA: STUDI DI BASE E PROSPETTIVE TERAPEUTICHE
Clara Fabris
Dipartimento di Biologia, Università di Padova
L’individuazione di modalità terapeutiche diverse dall’impiego di antibiotici per la cura di
infezioni di origine microbica rappresenta un settore di ricerca molto attivo. L’applicazione
della terapia fotodinamica (PDT) in campo antimicrobico costituisce una valida alternativa
per il trattamento di infezioni localizzate grazie ad una duplice selettività: l’applicazione in
situ del fotosensibilizzatore e l’irradiamento diretto dell’area lesionata.
L’utilizzo di fotosensibilizzatori con cariche positive intrinseche o l’inserimento di gruppi
funzionali carichi positivamente nel macrociclo tetrapirrolico di derivati porfirinici ha
consentito di indurre un’estesa inattivazione di un ampio spettro di microrganismi tra cui
batteri Gram-positivi e Gram-negativi, funghi, lieviti, micoplasmi e protozoi parassiti.
La PDT antimicrobica risulta particolarmente favorevole grazie ad alcune caratteristiche, tra
cui, oltre all’ampio spettro d’azione, l’efficienza di inattivazione nei confronti di specie
antibiotico-resistenti, la ridotta probabilità di insorgenza di processi mutageni, la mancanza di
selezione di ceppi fotoresistenti e l’elevata selettività d’azione nei confronti dei patogeni
rispetto ai principali costituenti dei tessuti ospiti.
Studi condotti in vitro e su modelli animali hanno permesso di studiare dettagliatamente
l’efficacia e la potenzialità della PDT antimicrobica. Sulla base dei dati ottenuti è possibile
ipotizzare che la PDT potrà trovare un ruolo specifico per il trattamento di determinate
patologie originate da microrganismi.
7
TAVOLA
ROTONDA
8
NEW SYNTHETIC GEOMIMETIC INORGANIC NANOTUBES FOR BIOMEDICAL APPLICATIONS
M. Marchetti1, I. Foltran1,2, E. Foresti1, M. Lelli1, I.G. Lesci1, F. Pierini1, and N. Roveri1
1Alma Mater Studiorum University of Bologna, Department of Chemistry “G. Ciamician”, Via Selmi 2, 40126 Bologna – Italy.
2University of Eastern Piedmont “Amedeo Avogadro”, Department of Medical Sciences, Via Solaroli 17, 20068 Novara – Italy.
Asbestos is a mineral group formed by anphibole (inosilicate minerals) like amosite,
crocidolite and serpentine like chrysotile. We hardly find only chrysotile in nature, because
this material usually enhances together its polymorphous like lizardite and antigorite[1].
Moreover these fibres are usually contaminated by metal traces like iron, aluminium and
nickel, which substitute themselves to silicon or to magnesium or they can create different
structural anomalies. The main problem regarding natural chrysotile is its high toxicity grade [2-3]. In nanotechnology natural chrysotile is scarcely utilized just because of its high toxicity
and non homogenous chemicals and structural properties. This problem can be overcome by
the synthesis of stoichiometric geomimetic chrysotile fibres utilizing the previously reported
synthetic method starting from SiO2, MgCl2*6H2O, H2O in a basic medium at 300 °C and 82
atm for 36 h[4].Geomimetic synthetic chrysotile fibres have a tubular morphology with
variable length and external and internal diameter of 21±1 nm and 7±1 nm respectively. They
can be synthesized with controlled and homogeneous stoichiometry, morphology and
structure. The absence of metallic ions contamination makes these nanotubes not toxic.
For technological applications metallic nanowires can be prepared filling the geoinspired
nanotubes with metallic nanoparticles of Ag, Cu, Au and for biomedical applications they
can be utilize as innovative drug delivers. Furthermore they can also be used to prepare
innovative nano-hybrids consisting of chrysotile nanotubes[4-5] as inorganic building blocks,
and of functional organic molecules such as porphyrin chromophores [6].
1 D.R. Veblen, and P.R. Buseck, Science, 206 1979, 1398. 2 E. Gazzano, E. Foresti, I. G. Lesci, M. Tomatis, C. Riganti, B. Fubini, N. Roveri, D. Ghigo, Toxicology and
Applied Pharmacology, 206, 2005, 356-364. 3 C. Riganti, E. Aldieri, L. Bergandi, I. Fenoglio, C. Costamagna, B. Fubini, A. Bosia, and D. Ghigo, Free
Radical Biol. Med., 32, 2002, 938. 4 G. Falini, E. Foresti, M. Gazzano, A. E. Gualtieri, M. Leoni, I. G. Lesci, N. Roveri, Chem. - Eur. J., 10, 2004,
3043-3049. 5 N. Roveri, G. Falini, E. Foresti, G. Fracasso, I. G. Lesci, P. Sabatino, J. Mater. Res., 21, 2006, 2711-2725. 6 G. De Luca, A. Romeo, V. Villari, N. Micali, I. Foltran, E. Foresti, I. G. Lesci, N. Roveri, T. Zuccheri, L.
Monsù Scolaro JACS (Communication), 2009, In press.
9
FUNZIONALIZZAZIONE E BIOCONIUGAZIONE DI NANOCRISTALLI COLLOIDALI
N. Depalo1,2, R. Comparelli2, P. Carrieri1, M. Corricelli1,2, M. Striccoli2, M. L. Curri2, A.Agostiano1,2
1Dipartimento di Chimica – Università degli Studi di Bari; 2Istituto per i Processi Chimico Fisici – CNR, sede di Bari
Negli ultimi anni, lo studio della materia su scala nanometrica ha suscitato notevole interesse
nel campo della ricerca scientifica, in virtù della forte dipendenza tra le proprietà chimico-
fisiche dei nanomateriali e le loro dimensioni. In particolare, l’interesse verso i sistemi
nanocristallini nasce dalla possibilità di ottenere differenti proprietà del sistema: funzionalità,
reattività e solubilità. Una tale versatilità può essere conseguita mediante un’opportuna
modulazione delle dimensioni, della forma e della superficie dei nanocristalli, sia durante che
subito dopo il processo di sintesi. Inoltre, la combinazione tra materiali differenti permette di
generare caratteristiche innovative che non potrebbero diversamente essere peculiari di una
singola nanostruttura.
Infine, la possibilità di manipolare opportunamente la loro superficie, allo scopo di
aumentarne la bio-compatibilità e per ottenerne l’immobilizzazione su substrati e/o
l’incorporazione in matrici differenti, rende le nanoparticelle colloidali estremamente versatili.
Uno degli obiettivi principali nelle applicazioni dei nanocristalli è dunque la loro solubilità in
ambienti chimico-fisici differenti. Ciò si può ottenere attraverso trattamenti post-sintesi che li
rendano biocompatibili e solubili in acqua, preservando il più possibile le loro specifiche
proprietà.
Nel presente seminario verranno illustrate alcune tra le più recenti tecniche di
funzionalizzazione e bioconiugazione di nanocristalli colloidali di differente composizione e
forma (CdSe@ZnS, CdS, TiO2, Fe2O3 e TiO2/Fe2O3) e le loro possibili applicazioni.
10
NANOSISTEMI PER OTTIMIZZARE LA TERAPIA FOTODINAMICA DEI TUMORI: VANTAGGI E LIMITAZIONI
Compagnin C.1, Mancin F.3, Moret F.1, 2Papini E., Rio Echevarria I.1, Segat D.1, Selvestrel F.1,Tavano R.2, Reddi E.1
1Dipartimento di Biologia, 2Dipartimento di Scienze Biomediche Sperimentali e 3Dipartimento di Scienze Chimiche, Università di Padova
La terapia fotodinamica (PDT) è una procedura per il trattamento dei tumori solidi che
prevede la somministrazione di un agente foto sensibilizzante (PS) seguita da irradiamento
con luce rossa della massa neoplastica. Il PS attivato dalla luce produce specie reattive
dell’ossigeno (ROS) e di conseguenza la morte delle cellule tumorali. La PDT è poco invasiva
e più selettiva delle convenzionali terapie antitumorali perché il danno cellulare è limitato
all’area esposta ad irradiamento. Tuttavia alcuni effetti collaterali, come la fotosensibilità
cutanea prolungata e generalizzata, rendono desiderabile un miglioramento della PDT
soprattutto per quanto riguarda la localizzazione del PS nel tumore che attualmente è poco
selettiva. Una aumentata selettività di localizzazione potrebbe rendere la terapia efficace con
diminuite dosi di PS e minori effetti collaterali. Come, in generale per le terapie antitumorali,
si ritiene che le nanotecnologie possano fornire gli strumenti adatti per raggiungere questo
obiettivo. Infatti l’incorporazione di PS in nano sistemi di diversa natura è oggetto di studio
molto intenso perché considerata una strategia promettente che permetterà di sfruttare
pienamente le potenzialità della PDT. In teoria, un miglioramento della selettività di
accumulo nei tumori di PSs veicolati da nano sistemi di opportune dimensioni, dovrebbe
essere possibile sfruttando un targeting sia passivo che attivo basato sull’effetto EPR
(enhanced permeabilità and retention) dovuto alla maggiore permeabilità della
vascolarizzazione del tumore rispetto ai tessuti sani. Non solo liposomi e nanoparticelle (NP)
di polimeri biodegradabili vengono utilizzati per il delivery di diversi PS alle cellule tumorali
ma anche NP non biodegradabili e metalliche vengono proposte nonostante non siano
disponibili informazioni adeguate sulla loro biocompatibilità. La maggior parte degli studi sul
delivery di PS mediante NP sono stati effettuati con cellule tumorali in vitro mentre solo
alcuni studi in vivo sono riportati in letteratura. Saranno presentati e discussi i risultati più
recenti e significativi sul delivery di PSs mediante NPs con lo scopo di mettere in evidenza i
potenziali vantaggi che la nano medicina può offrire per migliorare la selettività della PDT ma
anche i problemi e le limitazioni che sembrano emergere dalle informazioni sinora disponibili. Progetto NANOPHOTO, contratto 20103, finanziato da FP7.
11
TECNICHE DI IMAGING E SPETTROSCOPIA DI FLUORESCENZA DI NANOPARTICELLE PER APPLICAZIONI DIAGNOSTICHE E TERAPEUTICHE
Cosimo D’Andrea
Ingegneria dei Processi Industriali - Politecnico di Milano
L’uso di nanostrutture ha trovato recentemente vaste applicazioni in biologia e medicina
(Nanomedicina) sia per quanto riguarda l’aspetto diagnostico che terapeutico. Esse riguardano
aree quali l’imaging molecolare, diagnosi, drug delivery e rigenerazione di tessuti.
Parallelamente abbiamo assistito ad una rapida evoluzione della tecnologia che ha permesso
di osservare eventi molecolari con una maggiore sensibilità sia in vitro sia in vivo. Tra le
numerose tecniche utilizzate (MRI, PET, ottiche, etc …) le tecniche ottiche hanno assunto un
ruolo di crescente interesse per le loro caratteristiche di non invasività, elevata sensibilità e di
relativa facilità d’uso da parte dell’operatore.
In questa presentazione verranno mostrate due applicazioni, la prima in vitro su campioni
cellulari e la seconda in vivo su cavie, di tecniche ottiche di imaging e spettroscopia di
fluorescenza.
I fulleroli (fullereni idrosolubili) sono studiati per consentire ai farmaci di superare la barriera
oculare e raggiungere specifici comparti dell’occhio. Tuttavia il loro uso è subordinato allo
studio della loro fototossicità. In questa lavoro abbiamo studiato la fototossicità in vitro nel
caso di cellule umane della retina e lente. Le misure sono state realizzate in microscopia
utilizzando, come sistema di rivelazione, sia un sistema per spettroscopia di fluorescenza
risolta in tempo basato sulla tecnica di conteggio a singolo fotone correlato nel tempo
(TCSPC), sia una telecamera intensificata con risoluzione temporale inferiore ai 100 ps.
Tecniche di imaging e spettroscopia di fluorescenza sono state utilizzate insieme ad un mezzo
di contrasto (Indocyanine Cardio Green) per valutare in vivo la vascolarizzazione di tumori
impiantati in topi. Queste tecniche hanno permesso di valutare il vascular shutdown a seguito
di un trattamento con vascular disrupting agent (ZD6126).
12
BIOSENSORI E BIOCHIP OTTICI BASATI SULLA NANOTECNOLOGIA DEL SILICIO POROSO
Luca De Stefano
Istituto per la Microelettronica e Microsistemi – Consiglio Nazionale delle Ricerche
Recentemente vi è un forte interesse alla realizzazione di dispositivi su scala micro- e nano-
metrica integrati su chip che possano trovare applicazione in medicina e biologia. Date le loro
dimensioni, tali micro- e nano-sistemi possono naturalmente interagire con le biomolecole, e
funzionare quindi come biosensori “selettivi” da utilizzare nel campo della diagnostica,
oppure come biochip, ossia come mini-laboratori integrati e specializzati. L’approccio
richiesto in questo tipo di progetti di ricerca è necessariamente multidisciplinare in quanto
utilizza competenze sviluppate in diversi campi, quali la fisica, l’ingegneria, la chimica, la
biologia e la medicina. Oggetto del seminario è presentare in sintesi l’attività scientifica
recentemente sviluppata presso l’IMM-CNR di Napoli relativa alla realizzazione di biosensori
e biochip ottici in silicio – utilizzando cioè
la stessa piattaforma che è alla base dei sorprendenti avanzamenti registrati negli ultimi anni
nel campo delle tecnologie elettroniche e fotoniche - per lo studio delle interazioni
biomolecolari in proteomica e genomica.
13
COMUNICAZIONI
ORALI
14
CHARACTERIZATION OF ANTENNA ISOFORMS FROM SPINACH LEAVES GROWN UNDER DIFFERENT LIGHT CONDITIONS.
Gevi Federica, Timperio Anna Maria, Blasi Barbara and Lello Zolla
Dipartimento Scienze Ambientali (DISA), Università “La Tuscia” – Viterbo
The major light-harvesting complex (LHC-II) of higher plants plays a crucial role in capturing
light energy for photosynthesis and in regulating the flow of energy within the photosynthetic
apparatus. Native LHC-II isolated from plant tissue consists of three isoforms, Lhcb1, Lhcb2,
and Lhcb3, which form homo- and heterotrimers. Usually plants are exposed to environment
where light and temperature conditions are largely variable. The plants haven’t possibility of
moving so they have evolved several mechanism of acclimation. Among all the
environmental parameter light intensity has a major influence on plants life. When the plants
are exposed to high excess of light to optimize performance and to avoid photodamage
releases a monomers of LHCII from PSII to PSI preferentially in phosphorilated form
(Timperio et al. 2005). During light stress at 100 E m-2 s-1 plants must balance the excitation
of the two photosystem (Dilly-Hartwig H .1998, Allen et al. 2001) and so there is a migration
of light-harvesting complex type 2 (Lhcb2) from grana to PSI containing stroma exposed
membranes. Changes in the association-dissociation state of LHCII are the regulatory
mechanism that optimize light-harvesting function under different stress condition. In this
communication we want to investigate the behaviour of antenna proteins (Lhcb) during
different acclimatation, then to correlate the expression of the Lhcb1 isoforms to relative
mRNA. For this aim we used a microRotofor (Biorad) that avoid detergent and we obtained
the antenna proteins in their native form. Moreover it does not require the addition of any
chemicals such as a dye. Separation of complexes is based on the protein’s real
physicochemical properties which inevitably change when dye is added, the pH of each native
complex was also determined this is the case of various complexes of LHCII trimers, which
have different pH but similar molecular masses. Afterwards a reverse-phase HPLC method on
line with mass spectrometry allowed us to have a qualitative and quantitative analysis of Lhcb
proteins.Timperio AM, Zolla L. J Biol Chem. 2005;280(32):28858-66. Allen, J. F., and Forsberg, L. (2001) Trends Plant Sci. 6, 317–326 Dilly-Hartwig H, Allen JF, Paulsen H, Race HL. FEBS Lett. 1998 Sep 11;435(1):101-4.
15
REGULATION OF LIGHT HARVESTING IN PLANTS: A STRUCTURAL BASIS FOR THE PH-DEPENDENT XANTHOPHYLL CYCLE
Giorgia Saga1, A. Giorgetti2, GM Giacometti1, R. Bassi2, T. Morosinotto1
1Dipartimento di Biologia, Università degli studi di Padova, Italy 2Dipartimento di Biotecnologie, Università degli studi di Verona, Italy
Plants adjust their photosynthetic activity to changing light conditions. A central role in this
regulation mechanisms is played by the xanthophyll cycle in which the carotenoid
violaxanthin (V) is converted into zeaxanthin (Z) in strong light. Zeaxanthin acts as a
allosteric activator of photoprotection in plants, enhancing dissipation of the excess absorbed
energy as heat (Non Photochemical Quenching, NPQ) and the scavenging of Chl triplets and
reactive oxygen species. Violaxanthin de-epoxidase (VDE), the enzyme responsible for Z
synthesis, is activated when the thylakoid lumen becomes acidified as a result of high
illumination.
Despite the fundamental role of zeaxanthin in photoprotection, biochemical and structural
information on the enzyme responsible of its synthesis were still lacunose, impairing a deep
understanding of the regulation of the reaction. We recently obtained the first structural data
on this key enzyme of for the regulation of light harvesting and Non Photochemical
Quenching. We determined the structures of the central lipocalin domain of VDE (VDEcd) at
acidic and neutral pH. At neutral pH, VDEcd is monomeric with its active site occluded in the
lipocalin barrel. Upon acidification, the barrel opens up resulting in a functional dimerization
of the enzyme.
Site directed mutagenesis allowed the identification of the binding sites of the two substrates
as well as the key residues for enzyme activity.
In silico molecular dynamics studies coupled with site directed mutagenesis allowed also
describing a mechanisms for the pH induced protein conformational change.
Taken together, these data represent a significant step toward a better understanding of the
mechanism of zeaxanthin formation in vivo.
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QUANTUM-MECHANICAL STUDIES OF THE DNA EXCITED STATES: FROM THE ISOLATED NUCLEOBASES TO THE DOUBLE STRAND
Roberto Improta1, Fabrizio Santoro2, Alessandro Lami2, Vincenzo Barone3
1Istituto Biostrutture e Bioimmagini – CNR, Napoli; 2Istituto per i Processi Chimico Fisici – CNR, Pisa; 3Scuola Normale Superiore, Pisa.
We have studied the static [1-8] and dynamical behavior of the DNA and of its constituents in
their excited states, with special focus on solvent effect [1-4] and on the influence of base
stacking and base pairing [5-8].
Excited state geometry optimizations in solution and extensive explorations of the excited-
state surfaces in the Franck-Condon region show that solvent can modulate the accessibility
of an additional decay channel, involving a dark n/ excited state. This finding is confirmed
by quantum dynamical calculations and provides the first unifying explanation for the
experimental trend of pyrimidine excited-state lifetime in different solvents.
Quantum mechanical calculations on adenine stacked oligomers and on the double strand
tetramer formed by two thymine-adenine stacked pairs in aqueous solution provide a detailed
atomistic picture of the excited state decay and of the emission process, and highlight the
specific roles of base-stacking and pairing. While absorption involves excited states
delocalized over different stacked bases, emission mainly takes place from individual
monomers and it is ruled by thymine bases. The long living components of the excited state
population of (dA)·(dT) oligomers correspond to a dark excimer produced by inter-monomer
charge transfer between two stacked adenine bases, whereas adenine-thymine proton transfer
plays a minor role in the excited state decay.
[1] T. Gustavsson, A. Banyasz, E. Lazzarotto, D. Markovitsi, G. Scalmani, M.J. Frisch, V. Barone, R. Improta J. Am. Chem. Soc. 128 (2006) 607 [2] F. Santoro, V. Barone, T. Gustavsson, R. Improta J. Am. Chem. Soc. 128 (2006), 16312 [3] Y. Mercier, F. Santoro, M. Reguero, R. Improta J. Phys. Chem. B 112 (2008) 10769 [4] V. Karunakaran, K. Kleinermanns, R. Improta, S. A. Kovalenko J. Am. Chem. Soc. 131 (2009)
5839. [5] F. Santoro, V. Barone, R. Improta Proc. Nat. Acac. Sci. U.S.A. 104 (2007) 9931 [6] F. Santoro, V. Barone, R. Improta J. Comput. Chem 29 (2008) 957 [7] R. Improta Phys. Chem. Chem. Phys 10 (2008) 2656 [8] F. Santoro, V. Barone, R. Improta submitted
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ACTIVITY OF CYTOCHROME BC1 COMPLEX IN CARDIOLIPIN ENRICHED CHROMATOPHORES FROM RHODOBACTER SPHAEROIDES
Vincenzo De Leo1, Lucia Catucci1,2, Francesco Milano2, Angela Corcelli2,3, Angela Agostiano1,2
1Dipartimento di Chimica, Università di Bari, Via Orabona 4, 70126 Bari, Italy. 2Istituto per I Processi Chimico Fisici - CNR, Via Orabona 4, 70126 Bari, Italy.
3Dipartimento di Biochimica Medica e Biologia Medica, Università di Bari, P.zza G. Cesare, 70124 Bari, Italy
Rhodobacter sphaeroides is a Gram-negative bacterium of the Proteobacteria group, which is
capable of growing in the presence of light and in anaerobic conditions by means of
photosynthesis. Previous results demonstrated that the exposure of Rhodobacter (R.)
sphaeroides cells to hypertonic solutions of NaCl caused a considerable increase in
Cardiolipin (CL) plasma membrane content (1-2). As CL rises by increasing the incubation
time of R. sphaeroides in hypertonic solutions, it was possible to isolate chromatophores
containing different CL amounts by starting from cells incubated in NaCl solutions for
different times and to use this natural vesicles in the study of functional relationships between
CL and photosynthetic enzyme. Cytochrome bc1 is an integral enzyme complex with a
dimeric structure which plays a key role in electron transfer both in the respiratory and in the
photosynthetic processes. No previous direct evidence for a CL role on cytochrome bc1
complex of photosynthetic apparatus is available in literature. However, it is known that CL
can perform a specific function on mitochondrial bc1 complex (3). In this work, the
cytochrome bc1 enzymatic activity was comparatively evaluated in both control and CL
enriched chromatophores and a significant increase in enzymatic activity was found in the
latter. Since during the incubation time (5h) in hyperosmotic media the protein membrane
profile and the pigments of the vesicle remains unchanged, we can relate this increased
activity to an higher turnover number for the enzyme. It is concluded that, in analogy with the
mitochondrial complex, CL is required for optimal functioning of cytochrome bc1 complex in
photosynthetic bacteria.
(1) Catucci et al., (2004) Biochemistry 43, 15066-15072 (2) De Leo et al., (2009) J. Lipid Res. 50, 256–264. (3) Palsdottir et al., (2004) Biochimica et Biophysica Acta 1666, 2-18
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INFLUENZA DELL’ILLUMINAZIONE ARTIFICIALE SULLE CONDIZIONI AMBIENTALI ALL’INTERNO DELLA GROTTA ZINZULUSA
D’Agostino D.1, Beccarisi L.2, Cataldo R.3
1 Scuola Superiore ISUFI, Università del Salento; 2 Di.S.Te.B.A., Università del Salento; 3 Dipartimento di Scienza dei Materiali, Università del Salento
La Grotta Zinzulusa (Castro, Lecce) risulta tra i siti più importanti dal punto di vista
biospeleologico, a livello internazionale, per la ricchezza di specie animali endemiche. Fin
dagli anni ’50, l’impianto di illuminazione è stato del tipo a luce incandescente, favorendo lo
sviluppo di comunità vegetali fototrofiche sulle superfici rocciose nella zona interna. Nel
marzo del 2008 è stato installato un nuovo impianto di illuminazione, costituito da corpi
illuminanti a 3 e 9 led da 1 watt ciascuno, con l’obiettivo di limitare i livelli di illuminazione
ad un’intensità massima di 40 lux, ridurre le emissioni dell’ultravioletto, del rosso e
dell’infrarosso, ed evitare la diretta illuminazione delle concrezioni. Lo scopo di questo studio
è quello di valutare l’influenza dell’illuminazione artificiale sulle condizioni ambientali della
grotta. Da dicembre 2007 dieci sensori rilevano in continuo temperatura ed umidità lungo il
percorso solitamente seguito dai visitatori. Dalle misure si nota che le caratteristiche
microclimatiche risentono dell’ambiente esterno solo dopo i primi 150 m dall’ingresso. Per
quanto riguarda le misure di luminosità all’interno della grotta, prima e dopo la sostituzione
dell’impianto d’illuminazione, si osserva come l’intensità luminosa sia aumentata e
l’irraggiamento sia diffuso. La risposta delle comunità vegetali alla luce è stata studiata
attraverso un campionamento sistematico, lungo transetti disposti radialmente intorno alle
lampade e distanti tra loro 30 cm. Nella zona d’ingresso si riscontra la presenza di formazioni
dense e compatte di licheni, briofite e pteridofite. Nella zona interna sono state rilevate alghe
verdi endolitiche (Chlorophyta), cianobatteri (Cyanophyta, specialmente sugli apici
stillicidiosi delle concrezioni calcitiche), talli di briofite e piccoli licheni. In assenza di luce,
mancano le specie fototrofiche e si rinvengono solo talli fungini, frequentemente organizzati
in vermicolazioni. Le diverse comunità fototrofiche hanno una risposta sensibilmente
differente al gradiente di luce; comunque tutte trovano il loro optimum ecologico nel breve
intervallo compreso tra 50 e 150 lux. L'attuale situazione conferisce un miglior confort al
visitatore ed una migliore percezione dell’ambiente durante il percorso e non favorisce lo
sviluppo di comunità biologiche estranee alla grotta nelle immediate vicinanze dei punti luce;
questa sembra essere una buona soluzione al difficile compromesso tra fruizione e
conservazione della grotta.
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ANALISI PER MUTAGENESI INSERZIONALE DELLA RESISTENZA AI METALLI PESANTI DEL BATTERIO FOTOSINTETICO R. SPHAEROIDES
Volpicella M.1, Leoni C.1, Italiano F.2, Di Paolo F.2, Trotta M.2, Gallerani R.1, Ceci L.R.3
1Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare - Università degli studi di Bari, 2Istituto per i Processi Chimico Fisici (CNR Bari), 3Istituto di Biomembrane e Bioenergetica (CNR
Bari).
Tra i microrganismi impiegati nelle strategie di bonifica ambientale (bioremediation), grande
interesse suscitano gli organismi fotosintetici che mostrano da un lato tolleranza ai metalli
pesanti e dall’altro una buona capacità di bioaccumulo. Tra gli organismi fotosintetici i batteri
rossi non sulfurei occupano una piccola ma importante nicchia ecologica. Essi possono
crescere in condizioni in cui la fotosintesi ossigenica non può avvenire, come per esempio in
ambienti a potere riducente anche particolarmente alto.
La ricerca oggetto di questo studio intende approfondire lo studio del metabolismo di R.
sphaeroides (ceppo wild-type: 2.4.1). Esso è un batterio fototrofico facoltativo rosso, non
sulfureo, Gram-negativo, non patogeno, in grado di acquisire energia mediante diversi
processi quali la fotosintesi, la litotrofia e la respirazione aerobica ed anaerobica. E’ stata
anche dimostrata la sua efficacia nella decontaminazione del terreno di crescita da diversi
ossidi metallici e ossianioni , ed è pertanto oggetto di studi di bioremediation. Il genoma di R.
sphaeroides 2.4.1 è stato completamente sequenziato (http://mmg.uth.tmc.edu/sphaeroides/);
è costituito da due cromosomi circolari: cromosoma I (CI, ~3,0 MBP), cromosoma II (CII,
~0,9 MBP), e altri cinque repliconi.
In considerazione della capacità del R. sphaeroides di crescere in presenza di elevate
concentrazioni di ioni Co2+ (sino a 25 mM), è stata messa in atto una strategia per la
identificazione dei geni necessari alla resistenza verso tali ioni. A tale scopo è stata costruita
una libreria di R. sphaeroides mediante inserzione di trasposoni. I primi risultati dello
screening di tale libreria hanno permesso l’individuazione di mutanti incapaci di crescere su
un terreno a bassa concentrazione di Co2+ (5 mM) per i quali è in corso la determinazione
delle curve di risposta alla dose di cobalto. Lo studio delle sequenze di tali cloni mediante la
tecnica del genome walking potrebbe consentire l’identificazione di geni che conferiscono al
batterio la resistenza a basse concentrazioni di Co2+.
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INTERPRETAZIONE QUANTITATIVA DELLE OSCILLAZIONI IN CENTRI DI REAZIONE INDOTTE DA LUCE IMPULSATA: UN APPROCCIO SIMULATIVO.
Fulvio Ciriaco1, Anna Lisa Bottalico1, Donato Frascati1, Francesco Milano2, Massimo Trotta2.
1Dipartimento di Chimica, Università di Bari, 2Istituto Processi Chimico Fisici, CNR Bari.
L'osservazione delle oscillazioni del semichinone dei centri di reazione (RC) in presenza di
donatori elettronici esogeni al dimero, in seguito ad esposizione ad una successione di flash
luminosi, è una fonte preziosa di informazioni sulla cinetica e sulla termodinamica dei
processi collegati al ciclo di riduzione del chinone nel sito QB.
Nell’approccio classico all'interpretazione quantitativa dei dati si opera a concentrazioni di
chinone (Q) molto maggiori di quelle di RC; [Q] può quindi essere considerato costante
durante l'esperimento e si perviene ad una relazione lineare fra le concentrazioni a flash
successivi ottenendo facilmente una soluzione algebrica del problema.
Questo approccio presenta due limiti: il primo è che molti effetti non vengono presi in
considerazione dal modello perché non è possibile inserirli nel contesto della soluzione
algebrica del problema, il secondo è che le condizioni imposte all'esperimento diminuiscono il
numero di parametri che è possibile
ottenerne.
Per esempio, un forte eccesso di Q può
rendere inaccessibile il valore della costante
di binding per il chinone. Lo schema a
fianco mostra un modello base per la
simulazione di condizioni sperimentali
generiche. Sono state introdotte variabili
concentrazione per ciascuna delle specie
coinvolte; con un metodo adattativo
vengono trovati i valori dei parametri
sperimentali non noti che ottimizzano l'accordo fra i dati sperimentali ed i dati simulati.
L'uso di questa metodica ci ha permesso di evidenziare fattori non presenti nello schema base
e che sono stati introdotti in affinamenti progressivi del modello, come per esempio
l'inattivazione parziale del sito di legame per Q a seguito dei flash, e l’efficienza non unitaria
del flash
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INTENSITÀ DELLA LUCE DI MISURA E COSTANTI CINETICHE CARATTERISTICHE DEL PROCESSO DI RICOMBINAZIONE DI CARICA NEL CENTRO DI REAZIONE DI RB. SPHAEROIDES
M. Giomini1, M. Giustini1, I. Husu1, A. Mallardi2, G. Palazzo3
1Dipartimento di Chimica, Università di Roma “La Sapienza”; 2Istituto per i Processi Chimico-Fisici, CNR, Bari; 3Dipartimento di Chimica, Università di
Bari
Il Centro di Reazione (RC) dei batteri fotosintetici, un complesso transmembrana proteina-
pigmenti, rappresenta la più piccola unità funzionale in grado di convertire energia luminosa
in energia chimica. L'interazione con luce di frequenza opportuna induce una serie di reazioni
di trasferimento elettronico a partire da un donatore primario (un dimero di molecole di
batterioclorofilla, D), attraverso vari accettori intermedi, fino agli accettori finali (nel RC di
Rb. sphaeroides due molecole di ubichinone, Q), localizzati in domini distinti della proteina.
Il primo, QA, si trova in una tasca relativamente apolare; il secondo, QB, è in un ambiente più
polare dal quale può scambiare con il pool di chinoni presenti all’interno della membrana.
Sebbene identici, i due chinoni presentano potenziali di riduzione diversi in virtù del
differente intorno proteico. Pertanto lo stato a cariche separate D+QAQB- è più stabile di D+QA
-
ed il trasferimento elettronico da QA- a QB porta alla formazione di D+QAQB
-. In assenza di un
riducente l’elettrone, giunto fino a QA o QB, ritorna al donatore D mediante un processo noto
come ricombinazione di carica. L'alterazione dello stato redox dei cofattori del RC comporta
inoltre profonde alterazioni nel suo spettro d'assorbimento. Ciò fa sì che la fotolisi, un
particolare tipo di spettroscopia UV-Vis-NIR risolta nel tempo, sia la tecnica d’elezione per
valutare l’evoluzione delle reazioni fotochimiche nel RC. In essa due raggi non interferenti di
intensità diverse sono focalizzati sul campione: uno ha la funzione di innescare le reazioni di
trasferimento elettronico (raggio d'eccitazione), l'altro quella di monitorare le variazioni di
assorbanza indotte dall’eccitazione (raggio di misura). Se il primo provoca una perturbazione
istantanea degli stati elettronici dei cofattori (pochi ns nel nostro caso), il secondo, di intensità
ben più modesta, induce una perturbazione continua, i cui effetti sono di norma trascurati.
Il lavoro da noi presentato esamina gli effetti che l'intensità del raggio di misura induce sulla
ricombinazione di carica in soluzione, a partire dagli stati D+QAQB- e D+QA
-, in quest’ultimo
caso attinenti RC privi di chinone al sito QB od in cui il trasferimento elettronico da QA- a QB
è bloccato da inibitori (erbicidi). Il principale risultato è una formulazione dei parametri
cinetici della ricombinazione che per la prima volta in letteratura tiene conto dell’intensità
della luce di misura.
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HEAVY METAL BINDING PROPERTIES OF PHOTOSYNTHETIC BIOFILMS STUDIED BY ATR-FTIR DIFFERENCE SPECTROSCOPY
D. Mastrogiacomo1 L. Giotta2, L. Valli1, F. Italiano3, F. Milano3 and M. Trotta3
1Dipartimento di Ingegneria dell’Innovazione, University of Salento, S.P. per Monteroni,
73100 Lecce, Italy. 2 Dipartimento di Scienza dei Materiali, University of Salento, S.P. per
Monteroni, 73100 Lecce, Italy. 3Istituto per i Processi Chimico Fisici – CNR Bari via
Orabona 4, 70126 Bari, Italy
Bioadsorption of heavy metal ions on phototrophic cells represents an interesting issue due to
promising applications in bioremediation. In several cases the ability of microorganisms to
adsorb and remove toxic ions is mainly ascribable to metabolism-independent interaction of
heavy metals with cell-surface components. Moreover heavy metal cation binding properties
of bacterial surfaces are often associated to the proton uptake ability of cell envelopes, due to
the involvement of a number of acidic moieties, such as carboxylates or phosphonates, in
metal binding processes.
We have developed a new method for the identification and characterization of functional
groups lying on the surface of bacterial cells, involved in both proton and metal cation uptake.
Our approach is based on the infrared absorption analysis of bacterial biofilms deposited onto
the internal reflection element (IRE) of an Attenuated Total Reflection (ATR) device. By
means of a flow cell, attached microorganisms are exposed cyclically to bathing media
differing for pH and metal concentration. Reversible binding processes are revealed by the
appearance of characteristic signals in the resulting difference spectra. The assignment of
infrared difference bands allows eventually the identification of chemical moieties involved in
the reversible binding processes under investigation. The technique has been applied
successfully1,2 to the purple bacterium Rhodobacter sphaeroides enlightening the key role
played by outer membrane carboxylates in the immobilization of Ni2+ ions.
1 Buccolieri, A.; Italiano, F.; Dell'Atti, A.; Buccolieri, G.; Giotta, L.; Agostiano, A.; Milano, F.; Trotta,M., Annali Di Chimica 2006, 96, (3-4), 195-203
2 F. Italiano; A. Buccolieri; L. Giotta; A. Agostiano; L. Valli; F. Milano and M. Trotta (International Biodeterioration & Biodegradation accepted for publication)
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STUDIO TEORICO-SPERIMENTALE DELLE CINETICHE DI RICOMBINAZIONE DI CARICA IN LIPOSOMI A COMPOSIZIONE VARIABILE.
Altamura E.1, Mavelli F.1, Milano F.2, Trotta M.2
1Dipartimento di Chimica, Università di Bari; 2Istituto per i Processi Chimico Fisici, CNR Bari
Vescicole di molecole lipidiche vengono utilizzate come modelli cellulari per lo studio di
reazioni enzimatiche che possono avvenire sia nel pool acquoso che nella membrana. In anni
recenti, vescicole formate da fosfolipidi quali fosfatidilcolina, fosfatidilglicerolo e
cardiolipina sono state utilizzate per studiare il processo di ricombinazione di carica (CR) del
centro di reazione (RC) fotosintetico [1]. I dati ottenuti in presenza di un pool variabile di
ubichinone-10 (UQ10) sono stati confrontati con la soluzione di un sistema di equazioni
differenziali e i parametri cinetici ricavati mediante minimizzazione degli scarti quadratici
medi fra dati sperimentali e curve calcolate [2]. Il limite dell’approccio cinetico classico è che
studia l’andamento temporale medio di una vescicola senza considerare né le differenze
dimensionali dei diversi aggregati presenti in soluzione, né il loro diverso riempimento
molecolare. Per superare questo limite, abbiamo utilizzato un programma, sviluppato nel
nostro gruppo di ricerca[3], per la simulazione stocastica di sistemi reagenti
compartimentalizzati. Abbiamo così potuto studiare la cinetica del processo di CR tenendo
conto del differente stato iniziale delle singole vescicole per mettere in evidenza come le
distribuzioni molecolari dei soluti influenzino l’andamento macroscopico del sistema, in
particolare a basse concentrazioni di chinone esogeno. Tale approccio è stato anche utilizzato
nel caso di vescicole contenenti RC e chinone, perturbate mediante l’addizione di materiale
lipidico aggiuntivo sotto forma di micelle, che, rapidamente assorbite dai liposomi, fanno
diminuire la concentrazione locale di proteina e ligando, accelerando la cinetica di CR. Infine,
liposomi contenenti RC privati del chinone secondario sono state mescolati con liposomi
contenenti UQ10 portando ad un rallentamento della cinetica di CR per effetto dello scambio
del chinone fra le vescicole. In questo tipo di esperimenti la reazione di CR è stata utilizzata
per monitorare, in maniera indiretta, la dinamica delle vescicole lipidiche.
[1] Nagy L, Milano F, Dorogi M, Agostiano A, Laczko G, Szebenyi K, Varo G, Trotta M and Maroti P, Biochemistry: 43, (2004) 12913-23 [2] Milano F, Agostiano A, Mavelli F and Trotta M, Eur J Biochem: 270, (2003) 4595-4605 [3] F. Mavelli , K. Ruiz-Mirazo, Phil. Trans. R. Soc. London B: 362, (2007) 1789-1802
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FOTOSTABILITÀ DI FLAVONOIDI
Sergio Caffieri, Giorgia Miolo, Stefano Dall’Acqua
Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università di Padova
I flavonoidi sono composti naturali, ampiamente diffusi nelle piante superiori. Grazie alle loro
proprietà antiossidanti, vengono impiegati come nutriceutici per garantire l'ottimale
funzionamento di fegato e sistema immunitario, oltre a contribuire alla prevenzione di
patologie cardiovascolari, infiammatorie e tumorali. L'ampia varietà di azioni biologiche e
salutistiche ascritte ai flavonoidi dipende in gran parte dalla loro capacità di bloccare il danno
provocato dai radicali liberi. In questo senso, essi vengono considerati avere attività analoga o
addirittura sinergica con l’acido ascorbico.
Per la loro elevata capacità di assorbire in tutto il range dell’ultravioletto, alcuni di questi
composti vengono considerati anche come potenziali filtri solari. Un filtro solare deve tuttavia
rispondere, oltre ad altri, al requisito della fotostabilità. Gli studi finora condotti hanno
riportato risultati discordanti: in alcuni casi l’irradiazione prolungata dei flavonoidi in
soluzione porta ad estensiva degradazione; in altri la molecola risulta stabile.
Abbiamo voluto riconsiderare l’effetto della luce ultravioletta su cinque flavonoidi:
quercetina, rutina, apigenina, galangina e genisteina. La fotostabilità dipende dalla posizione
del fenile nel sistema cromenico e dalla presenza dell’ossidrile libero in posizione 3. Infatti,
quercetina e galangina – che hanno il fenile in 4 e l’ossidrile in 3 – si degradano, mentre
rutina (ossidrile in 3 glicosilato), apigenina (H in posizione 3) e genisteina (fenile in 3) sono
stabili.
Per la quercetina è stato caratterizzato un prodotto che deriva dalla fotodegradazione, cui
segue l’immediata ossidazione ad opera dell’ossigeno atmosferico.
L’ipotetico intermedio di questo processo è strutturalmente molto simile all’acido ascorbico.
Un meccanismo simile sembra essere alla base della degradazione della quercetina in
ambiente acquoso alcalino, che avviene tuttavia senza il coinvolgimento della luce.
Al contrario, l’ambiente alcalino favorisce la fotodegradazione della genisteina che altrimenti
risulta fotostabile.
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STUDIES ON THE INFLUENCES OF HEAVY METALS AND HERBICIDES ON PHOTOSYNTHETIC MATERIALS BY USING OPTICAL ASSAYS
A. Ventrella1, 2, L. Catucci1, 2, G. Lobascio1, A. Agostiano1, 2
1Department of Chemistry, University of Bari, Via Orabona 4, 70125 Bari, Italy; 2Istituto per i Processi Chimico Fisici - CNR, Bari, Via Orabona 4, 70125 Bari, Italy.
The widespread use of toxic compounds like heavy metals or herbicides (i.e. triazine- or urea-
derivatives) in the industrial or in the agricultural fields has increased the interest in studying
the interactions between these species and the living organisms. In particular, the
photosynthetic organisms can modify their chemical and physical properties when they grow
or they are simply in contact with different kinds of pollutants. In this work, photosynthetic
materials, i.e. chloroplasts, thylakoid membranes, photosynthetic proteins were prepared from
spinach leaves, and then studied before and after the additions of heavy metal ions (copper,
mercury, nickel, manganese and cobalt) or herbicides (diuron, atrazine and terbutryn) through
the observation of changes in their activities by means of Hill Reaction optical assays and
fluorescence emission measurements.
It was noticed that copper and mercury showed intense inhibiting effects on the electron
transfers of each photosynthetic material tested, in a way that depended on the metal
concentrations; the other heavy metal under investigation did not affect significantly the
photosynthetic activities, in the range of concentrations analyzed (10-8-10-3 M).
Concomitantly, only copper was found to exert a remarkable influence on the fluorescence
emission intensity, especially on the photosynthetic membranes: actually, emission intensity
was found to decrease at higher copper concentrations. The Hill Reaction and the emission
assays on copper were found to respond at concentrations even below the Cu(II) legal limits.
The investigations on herbicides indicated that the electron transfers of each photosynthetic
material was strongly inhibited at concentrations of toxic species higher than 10-7 M. On the
other hand, the emission measurements showed that thylakoid membranes can easily respond
to the additions of every herbicide tested, since great increments in the emission intensities
were recorded by increasing the herbicide concentrations.
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EFFECT OF CYCLODEXTRINS ON MYCOTOXIN PHOTODEGRADATION
R. Verrone1,2, L. Catucci1,2, A. Agostiano1,2, V. Lippolis3, M. Pascale3
1Dipartimento di Chimica, Università di Bari, Via Orabona 4, 70126 Bari, Italy [email protected] 2Istituto per i Processi Chimico Fisici-CNR, Via Orabona 4, 70126 Bari, Italy 3Istituto di Scienze delle Produzioni Alimentari-CNR, Via G. Amendola 122/O,
70126 Bari, Italy
Mycotoxins are toxic secondary metabolites occurring frequently in many foods and
beverages produced by several fungal species, mainly of the genera Aspergillus, Penicillium
and Fusarium. Physicochemical properties of mycotoxins depend on several factors, such as
solvent polarity or pH, and can be affected by the presence of cyclodextrins (CDs) [1-2]. In
this work, the effect of different CDs in several solvents on photodegradation of ochratoxin A
(OTA) and a fluorescent derivative of T-2 toxin with 1-anthroylnitrile (T2-AN) upon UV
steady-state irradiation has been investigated. Spectroscopic data showed that heptakis-2,6-di-
O-methyl- -CD (DIMEB) caused the most important changes in spectroscopic properties of
both OTA and T2-AN in pure water solutions. It was also proved that DIMEB affected
photodegradation in two different ways: it slowed down photodegradation rate of OTA
neutral form, whereas increased photodegradation rate of T2-AN in all tested solvents.
1. Y.V. Il’ichev, J.L. Perry, R.A. Manderville, C.F. Chignell, J.D Simon, J. Phys. Chem. B 105 (2001) 11369-11376
2. R. Verrone, L. Catucci, P. Cosma, P. Fini, A. Agostiano, V. Lippolis, M. Pascale, J. Incl. Phen. Macrocyc. Chem. 57 (2007) 475-479
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CARATTERIZZAZIONE DELL’AUTOFLUORESCENZA DI CELLULE DI NEUROBLASTOMA (SH-SY5Y) SOTTOPOSTE A CAMPO ELETTRICO
F. Cialdai1, M. Monici2, G. Romano1, S. Benvenuti1, P. Manetti3, F. Fusi1
1Dipartimento Fisiopatologia Clinica, Università di Firenze; 2ASACampus, ASA Res. Div., Dipartimento Fisiopatologia Clinica, Università di Firenze; 3Scienza e Tecnica dello Sport,
Università di Firenze
Molti tessuti sono sensibili a campi elettrici endogeni ed esogeni e presentano una spontanea
attività elettrica. Numerosi studi hanno dimostrato che i campi elettrici possono indurre una
quantità di effetti, come riorganizzazione del citoscheletro, ridistribuzione dei recettori di
superficie, cambiamenti nelle dinamiche del calcio intracellulare, migrazione, crescita di coni
neuronali, differenziazione cellulare, etc....
In campo clinico, l’elettroterapia è stata applicata con successo per il trattamento delle fratture,
per favorire i processi riparativi delle fibre nervose e la rigenerazione dei tessuti molli, nella
medicina sportiva ed anche associata alla chemioterapia.
Lo studio che descriviamo riguarda l’effetto di campi elettrici alternati (10KHz) sul
metabolismo energetico di cellule di neuroblastoma. La linea cellulare SH-SY5Y, utilizzata
per gli esperimenti, è riconosciuta come modello sperimentale per studi sulla differenziazione
neuronale ed emissione di dendriti.
Le caratteristiche scelte per il campo elettrico (in particolare ampiezza e frequenza) sono tali
da generare correnti con valori di circa 1-5 mA; tali valori sono caratteristici dei piu’ comuni
trattamenti di elettro-stimolazione muscolare, effettuati su pazienti attraverso l’applicazione di
tensioni alternate a media-alta frequenza (100Hz-10KHz).
L’effetto sul metabolismo energetico cellulare è stato studiato monitorando la fluorescenza
spontanea delle cellule, notoriamente imputabile ai coenzimi piridinici e flavinici nelle forme
ridotta ed ossidata, rispettivamente. Si sono utilizzate a questo scopo tecniche di microscopia
e spettroscopia di auto fluorescenza (AF).
I risultati preliminari dell’imaging di AF rivelano nei campioni trattati una diversa
distribuzione intracellulare dell’AF, rispetto ai controlli. In questi ultimi l’AF è diffusa e
distribuita in modo omogeneo, mentre nei trattati risulta organizzata e localizzata, con una
disposizione che sembra corrispondere a quella dei mitocondri. Parallelamente alle misure di
imaging è stata effettuata un’ analisi spettrale che rivela un significativo allargamento della
banda spettrale verso le lunghezze d’onda del rosso.
28
MICROSCOPIA LASER CONFOCALE A RIFLETTANZA PER LA VALUTAZIONE IN VIVO DI LESIONI MELANOCITARIE E TUMORI CUTANEI NON MELANOMA
Venturini M1, Sala R1, Manganoni AM1, Santoro A2, Facchetti F2, Calzavara-Pinton PG1.
1Clinica Dermatologica e MTS, Università degli Studi di Brescia, Spedali Civili di Brescia 2I° Servizio di Anatomia Patologica, Università degli Studi di Brescia, Spedali Civili di
Brescia
La microscopia laser confocale a riflettanza è una promettente ed innovativa tecnica di
diagnostica non invasiva che permette la visualizzazione in vivo ed in tempo reale di sezioni
tissutali ad alta risoluzione, sfruttando una sorgente di luce laser a diodi di 830 nm in grado di
fornire una valutazione “en-face” dell’epidermide e del derma superficiale (250-300 m)
attraverso “sezioni ottiche” orizzontali.
La fonte di contrasto è fornita dalle differenze nell’indice refrattivo delle diverse cellule
permettendo buone correlazioni isto-morfologiche in vivo con l’istologia classica sia della
cute normale sia della cute affetta da lesioni infiammatorie e neoplastiche (melanoma,
carcinoma basocellulare, cheratosi attiniche, carcinoma spinocellulare).
Il vantaggio di questa tecnica è l'immediatezza della diagnosi, la valutazione di una lesione in
vivo, la possibilità di verificare le modificazioni della lesione in seguito ad un trattamento
medico o chirurgico.
Lo scopo della nostra presentazione sarà quello descrivere tramite microscopia laser confocale
a riflettanza le caratteristiche in vivo delle lesioni melanocitarie e dei tumori cutanei non
melanoma.
29
BIOFUEL FROM MICROALGAE, EXPLOITING SOLAR ENERGY FOR FUTURE SUSTAINABILITY
Corteggiani Carpinelli E1, Sforza E 2 , Simionato D1, Longo S1 , Bertucco A2, Valle G 3Giacometti G M1, Morosinotto T1
1Department of Biology, University of Padova, via Ugo Bassi 58/B, 35121 Padova, Italy; 2Department of Chemical Engineering Principles and Practice, University of Padova, Via Marzolo 9, 35131 Padova, Italy ; 3CRIBI Biotechnology Centre, University of Padova, via
Ugo Bassi 58/B, 35121 Padova, Italy;
Biofuels may represent an important resource to balance CO2 emissions and replace
exhausting fossil fuels since they are made from non-toxic, biodegradable and renewable raw
materials.
One interesting perspective is to exploit microalgae for biofuels production, since they do not
compete for arable land with food production and they show high potential productivity.
In order to improve the efficiency of the process and make biofuels production from
microalgae economically competitive, we tested a number of microalgal species to select
strains capability for fast growth in photobioreactors and high lipid production and we
focused our attention on the eustigmatophyte Nannochloropsis. Furthermore we now aim to
optimise the biodiesel production of these microalgae using a biotechnological approach.
Such a perspective is at the moment strongly limited by the poor molecular characterisation of
the organism. To fulfil this gap in the actual knowledge we are now applying the latest DNA
sequencing technologies for de novo sequencing of nuclear and plastidial genomes of
Nannochloropsis gaditana to characterise lipid production in this organism at the molecular
level. The same techniques will be also applied to evaluate expression profiles in different
growing conditions, known to induce or inhibit lipid biosynthesis. The results of this work
will help identifying the limiting steps for lipid biosynthesis providing a framework for
genetic analysis of interesting traits, assisted selection of productive algal strains and for
subsequent genetic manipulations.
30
PHOTODYNAMIC THERAPY COMBINED WITH ASPIRIN CAUSES PROTEASOME MALFUNCTIONING AND PROMOTES APOPTOSIS OF HUMAN-DERIVED H1299 AND A549 LUNG
ADENOCARCINOMA CELLS
Angela Chiaviello1 and Giuseppe Palumbo1,2
1Dipartimento di Biologia e Patologia Cellulare e Molecolare “L. Califano” and 2Istituto di Endocrinologia ed Oncologia Sperimentale "G. Salvatore" – CNR, Università Federico II,
Naples, Italy
Purpose: We found that Photofrin/photodynamic therapy (PDT) at sub-lethal doses induced
only a transient stall in proteasome activity in the human lung carcinoma cell A549 (p53++)
and H1299 (p53--) as by the half-life lengthening of Bcl-2, I B and p27KIP1, proteins that
physiologically undergo proteasomal degradation. Since the same effects were obtained with
aspirin we evaluated whether the stall of the proteasome machinery could be protracted by
combining PDT with it and thus facilitate apoptosis of neoplastic cells surviving PDT.
Experimental Design: Of the treatment regimens tested, the most effective were those in
which aspirin was administered after PDT. Accordingly, cells were irradiated with fluences
varying from 0.54 to 1.10 Jcm-2 and then incubated with aspirin (from 10 to 1.5 mM).
Photofrin concentration and incubation time were constant (2.5 μg/mL and 16 h). Using these
conditions, we analyzed cell viability, colony-forming efficiency, cycle profiles, expression
patterns of specific proteins and ubiquitination state after individual and combined treatments.
Results: Alone, PDT and aspirin each transiently appeared to induce proteasomal malfunction
and accumulation of cells in G2M phase, but did not induce apoptosis. At variance, when
aspirin was added to cells after PDT, as a consequence of a sustained proteasome block, it was
observed a G2 accumulation, progressive caspase-3 activation and PARP cleavage. This
hypothesis was proved by direct monitoring of the proteasome activity in cells treated with
PDT or/and aspirin.
Conclusions: Protracted inhibition of proteasome using combinations of low-toxicity drugs
and PDT may improve PDT efficacy by killing apoptosis-resistant cancer cells.
31
ANALISI DI SECONDA ARMONICA NELLA SALDATURA LASER DELLA CORNEA
P. Matteini1, F. Ratto1, F. Rossi1, R. Cicchi2, C. Stringari2, D. Kapsokalyvas2, F.S. Pavone2,R. Pini1
1Istituto di Fisica Applicata “Nello Carrara”, Consiglio Nazionale delle Ricerche, Via Madonna del Piano 10, Sesto Fiorentino, I-50019, Italy; 2LENS, European Laboratory for
Non-Linear Spectroscopy, Via Nello Carrara 1, Sesto Fiorentino, I-50019, Italy
La saldatura laser di tessuti connettivi realizzata attraverso la mediazione di un cromoforo
esogeno (Indocianina Verde) risulta un’alternativa di notevole interesse per la sigillatura di
ferite accidentali e incisioni chirurgiche, in grado di minimizzare le reazioni da corpo estraneo,
la formazione di cicatrici, nonchè i tempi di guarigione. In particolare, la saldatura laser della
cornea si sta affermando come una soluzione ideale a complemento di diverse applicazioni di
chirurgia oftalmica (~ 100 pazienti trattati presso l’Ospedale della Misericordia e Dolce di
Prato). Tra le problematiche inerenti, la possibilità di monitorizzare il progresso del
trattamento al livello ultrastrutturale in vivo rappresenta una frontiera di grande attualità.
Secondo la realizzazione più efficace, la saldatura laser comporta una sostanziale
disorganizzazione dell’architettura delle componenti fibrillari dei tessuti connettivi, senza
tuttavia indurne la denaturazione. Recentemente, abbiamo dimostrato la possibilità di valutare
lo stadio di tale disorganizzazione attraverso l’analisi di opportune sequenze di immagini di
microscopia di seconda armonica modulata in polarizzazione, una sonda minimamente
invasiva, virtualmente adatta per l’utilizzo in vivo, e particolarmente specifica per le fibre di
collagene. In particolare, discutiamo qui l’elaborazione di parametri semi-empirici
direttamente associati alla composizione di ordine e disordine nel reticolo delle fibre di
collagene su scale micrometriche e submicrometriche (con risoluzione laterale migliore di ~
400 nm). Oltre all’applicazione citata nel contesto della saldatura laser della cornea, il nostro
approccio può consentire lo sviluppo di uno strumento diagnostico importante, e attualmente
insostituibile, nella caratterizzazione di diverse deformazioni patologiche dell’architettura dei
tessuti connettivi.
32
SICUREZZA NELL’USO DEI LASER IN FOTOBIOLOGIA E FOTOMEDICINA
G. Romano1, L. Mercatelli2, A. Guasti3, F. Cialdai1, M. Monici4, F. Fusi1
1Dipartimento di Fisiopatologia Clinica, Università di Firenze; 2Istituto Nazionale di Ottica Applicata-CNR, Firenze; 3 Azienda Ospedaliero-Universitaria Careggi, Firenze;
4ASACampus, ASA srl c/o Dipartimento Fisiopatologia Clinica, Università di Firenze
Negli ultimi anni si è assistito ad un crescente impiego di sorgenti laser nei laboratori di
ricerca ed ambulatori biomedici. Il loro ampio utilizzo in fotomedicina e fotobiologia, pero’,
non è stato accompagnato da un’altrettanto ampia attenzione a problematiche legate alla
sicurezza dell’utilizzatore e ad un possibile “inquinamento” del setup sperimentale dovuto
alla presenza di luce spuria (es.: riflessioni). Tali questioni, infatti, seppur ponendosi a latere
della misura o del trattamento terapeutico in questione, sono tuttavia di estremo interesse
anche ai fini dell’esecuzione di una “buona misura” o di un “buon trattamento”.
L’analisi delle succitate problematiche passa attraverso una conoscenza delle tipologie di
sorgenti laser, suddivise in base alle loro caratteristiche di emissione, ma anche attraverso
l’analisi degli effetti che si hanno quando tali sorgenti interagiscono con i vari materiali (es.:
superfici di vetro, metalliche, polimeri).
In questa comunicazione verrà in un primo tempo illustrata la classificazione dei laser in base
alle classi di pericolosità. Verranno quindi presentate e commentate alcune misure sulle
caratteristiche ottiche dei materiali (in particolare di riflettanza totale, speculare, a piccolo
angolo) effettuate nello spettro UV-visibile-vicino IR, traendo conclusioni su quali possono
essere le misure da adottare per minimizzare la presenza di radiazione luminosa indesiderata o
dannosa.
33
EVIDENZE PER UNA TRANSIZIONE GLOBULARE DEL DNA FORZA IONICA INDOTTA: UNO STUDIO DI LIGHT SCATTERING.
M. Zimbone1, P. Baeri1, M.L. Barcellona2, G. Li Volti2, G. Bonaventura2, O. Viscuso3
1Dipartimento di Fisica e Astronomia. 2Dipartimento di Chimica Biologica, Chimica Medica e Biologia Molecolare. 3Dipartimento di Scienze Chimiche, Università di Catania.
Lo studio e la conoscenza delle transizioni Coil-Globule che avvengono nel DNA senza
l’aggiunta di surfattanti cationici ricopre particolare importanza in ambito biologico sia per le
consequenze funzionali che la comprensione di tali meccanismi molecolari comporta, che per
la sua importanza nelle applicazioni biotecnologiche, come per es. vettori genici in sistemi
vettoriali non virali. Rilevante importanza riveste, inoltre, tale transizione per l’attività delle
topoisomerasi e per la modulazione della velocità di rinaturazione del DNA.
L’analisi dei processi di condensazione del DNA può essere effettuata attraverso diverse
tecniche tra le quali il dynamic light scattering (DLS) capace di monitorare cambiamenti nelle
sue caratteristiche idrodinamiche alle quali conseguono transizioni conformazionali.
Sono state analizzate molecole di DNA naturali all’interno di un intervallo di pesi molecolari
compreso tra 102 e 105 paia di basi. Sono state registrate le funzioni di autocorrelazione per
diversi valori del vettore di scattering da cui è stato calcolato il coefficiente di diffusione e
quindi il raggio idrodinamico per i diversi campioni di DNA in funzione della lunghezza della
catena, espressa come paia di basi, e delle condizioni sperimentali (forza ionica, pH).
Le analisi effettuate attraverso la tecnica del DLS indicano che le molecole di DNA con un
numero di paia di basi superiore a 105 nelle nostre condizioni sperimentali, (100mM Na+)
condensano in strutture compatte mentre molecole di lunghezza inferiore si avvicinano al
modello ‘random coil’, dove la lunghezza di persistenza è più piccola della lunghezza del
polimero. I dati ottenuti sono stati comparati con i dati riportati in letteratura per alcuni
modelli standard di polimeri in soluzione e la discrepanza tra i nostri dati e le teorie di
Mansfield e Douglas (1) per le catene corte e di Rouse-Zimm per le lunghe è stata discussa. I
nostri risultati, confortati anche da osservazioni ottenute attraverso la microscopia elettronica,
dimostrano che il rapporto raggio idrodinamico-gyration radius è direttamente dipendente
dalle dimensioni del polimero analizzato e che, anche ad una concentrazione ionica come
quella da noi utilizzata, la molecola del DNA và incontro ad una transizione, indicata come
condensazione, paragonabile a quella che in letteratura viene riportata solo in presenza di
agenti surfattanti. (1) Mansfield M., Douglas J. Macromolecules, 2008,41,5422.
34
1 m
AFM image of a chromate exposed R. sphaeroides cell
STUDIO DELLA RISPOSTA METABOLICA DI CELLULE DI RHODOBACTER SPHAEROIDESESPOSTE A STRESS ABIOTICO DA IONI CROMATO
F. Italiano1, F. Milano1, L. Giotta2, L. R. Ceci3, F. De Leo3, R. Gallerani4, L. Zolla5, A. Timperio5, A. Agostiano1 e M. Trotta1
1Istituto per i Processi Chimico Fisici – CNR, Bari; 2Dipartimento di Scienza dei Materiali – Università del Salento; 3Istituto di Biomembrane e Bioenergetica, CNR, Bari; 4Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare –Università di studi di Bari; 5Dipartimento di Scienze
Ambientali –Università della Tuscia, Viterbo
Rhodobacter (R.) sphaeroides è un batterio fotosintetico facoltativo metabolicamente versatile noto per la sua capacità di crescere in ambienti con elevato contenuto di ioni metallici tossici, tra cui CrO4
2-, e di bioassorbirne quantità significative, che si localizzano sia a livello della superficie esterna che del corpo cellulare1,2. La risposta metabolica all’esposizione a stress abiotico da cromato è qui presentata in dettaglio. R. sphaeroides è in grado di crescere fino ad una concentrazione di cromato pari a 0.4 mM. Si osserva, inoltre, un incremento della durata della fase lag all’aumentare della concentrazione di CrO4
2- nel mezzo di crescita, presumibilmente dovuto all’induzione di meccanismi di adattamento. Il microrganismo presenta una attività cromato-reduttasica principalmente legata alla frazione cellulare solubile. I dati ottenuti indicano l’esistenza di un meccanismo di resistenza basato sulla riduzione intra ed extra-cellulare di cromato e sulla conseguente immobilizzazione di Cr3+ all’interno della cellula. L’analisi proteomica degli estratti cellulari solubili di cellule cresciute in condizioni controllo ed in presenza di cromato ha consentito di ottenere numerose informazioni sulla risposta metabolica a tale contaminante. L’esposizione a CrO4
2- determina un’alterazione dell’espressione di 75 proteine solubili coinvolte nel metabolismo energetico, nella difesa dallo stress ossidativo, nel riparo di proteine e DNA, nella biosintesi di aminoacidi solforati e tioli, in processi di trasferimento elettronico, nella biosintesi della parete cellulare. In particolare, l’espressione differenziale degli enzimi D-alanina-D-alanina ligasi e dTDP-glucosio 4,6-deidratasi potrebbe indicare una variazione della composizione della parete cellulare ed un’alterazione della morfologia cellulare in accordo con quanto riportato in letteratura per E. coli3. Tali indicazioni sembrano confermate da preliminari indagini condotte mediante AFM, tecnica che consente, in condizioni fisiologiche, di ottenere immagini ad alta risoluzione della struttura cellulare e di studiarne le caratteristiche di elasticità e rigidità e come queste siano influenzate dalla esposizione al metallo4.1. Buccolieri, A. et al, Ann Chim -Rome 2006, 96, 195-204. 2. Giotta, L.; et al. Chemosphere 2006, 62, (9), 1490-1499. 3. Ackerley, D. F.; et al. J Bacteriol 2006, 188, (9), 3371-81. 4. Ubbink, J.; Schar-Zammaretti, P., Micron 2005, 36, (4), 293-320.
35
SWITCH FROM INHIBITION TO ACTIVATION OF THE MITOCHONDRIAL PERMEABILITY TRANSITION DURING HEMATOPORPHYRIN-MEDIATED PHOTOOXIDATIVE STRESS
Justina Šileikyt , Alessandra Zulian, and Fernanda Ricchelli
C.N.R. Institute of Biomedical Technologies at the Department of Biology, University of Padova, Italy
The mitochondrial permeability transition (PT) features an abrupt increase of mitochondrial
inner membrane permeability to solutes with molecular masses up to about 1500 Da. PT
results from opening of a protein channel, the mitochondrial permeability transition pore
(PTP), that is formed under certain pathological stimuli, most notably as a result of calcium
overload and oxidative stress. Although the molecular structure of PTP has yet to be
identified its role as a mechanism for the execution of cell death is no longer questioned.
We have studied the mitochondrial permeability transition pore (PTP) under oxidizing
conditions with mitochondria-bound hematoporphyrin, which generates reactive oxygen
species (mainly singlet oxygen, 1O2) upon UV/visible light-irradiation and promotes the
photooxidative modification of vicinal targets. We have characterized the PTP-modulating
properties of two major critical sites endowed with different degrees of photosensitivity: (i)
the most photovulnerable site comprises critical histidines, whose photomodification by
vicinal hematoporphyrin causes a drop in reactivity of matrix-exposed (internal), PTP-
regulating cysteines thus stabilizing the pore in a closed conformation; (ii) the most
photoresistant site coincides with the binding domains of (external) cysteines sensitive to
membrane-impermeant reagents, which are easily unmasked when oxidation of internal
cysteines is prevented. Photooxidation of external cysteines promoted by vicinal
hematoporphyrin reactivates the PTP after the block caused by histidine photodegradation.
Thus, hematoporphyrin-mediated photooxidative stress can either inhibit or activate the
mitochondrial permeability transition depending on the site of hematoporphyrin localization
and on the nature of the substrate; and selective photomodification of different
hematoporphyrin-containing pore domains can be achieved by fine regulation of the
sensitizer/light doses. These findings shed new light on PTP modulation by oxidative stress.
36
STRUCTURAL AND REGULATORY FACETS OF THE OPSIN-LIKE VISUAL PIGMENTS IN HYDRA
Silvia Santillo, Carlo Musio
Istituto di Cibernetica “E. Caianiello”, CNR, 80078 Pozzuoli (NA)
Novel opsins are non-image forming (or non-visual) photopigments which have been recently
identified in retinal and extraretinal photoreceptor cells of both vertebrates and invertebrates.
Such novel opsins detecting environmental irradiance integrate canonical visual function and
regulate physiological and behavioral rhythms. We are aimed to investigate diurnal and
circadian opsin expression oscillations in the cnidarian Hydra, an eyeless old metazoan
having only a non-visual photoreception and showing the first appearance of a nervous
system. To this regard, we have selected vertebrate opsin-like sequences - possibly related to
visual and non-visual opsin types - expressed in Hydra and available in the Hydra EST
database (GeneBank CN775258, CN554795; CB073527, DT617488). Quantitative RT-PCR
has showed fluctuations with different trends for daily and circadian cycles suggesting that
rhythms are possibly endogenous and that light has a direct role in the regulation of the
photopigment molecule supply. A recent study on Hydra genomic organization of
photopigments has proposed a large amount of distinctive opsins by means of genome
assemblies of various organisms (Hydrazome database, http://hydrazome.metazome.net). As
support for the suitability of our selected Hydra EST opsin sequences, we found in
Hydrazome that two sequences (CB073527 and CN554795) are aligned on the same contig
39347 spanning from the position 487820 to 488855. Moreover they partially overlap to form
a unique EST transcript assembly (ace7004.yi.0). The predicted peptide sequence (Hma2
233963) presents homologies with various novel vertebrate opsins including those of the
human and mouse retinal pigment epithelium. Above all, Hma2 233963 presents Tyr in the
counterion position which is an identifying structural marker of the majority invertebrate
opsins as well as of some novel vertebrate opsins (in particular melanopsin and peropsin).
Altogether those data are consistent with the hypothesis of a putative common evolutionary
similarity between vertebrate novel opsins and invertebrate opsins. In conclusion the bulk of
above results strengthens our goal to study Hydra visual pigments facing the photoregulation
of the opsin gene expression and the comparative sequence analysis. Both approaches are
addressed to a better understanding of the evolution of opsin visual pigments and overall of
the light sensing modality in Metazoa.
37
SPATIAL DISTRIBUTION OF PIGMENTS IN SELECTED HETEROTRICH CILIATES BY MEANS OF MULTIDIMENSIONAL CONFOCAL FLUORESCENCE MICROSCOPY
Andrea Pardini1, Ranieri Bizzarri2,2b, Alberto Diaspro3,3b, Paolo Bianchini3, Cesare Usai1,Paola Ramoino4, Giovanni Checcucci1 and Giuliano Colombetti1
1Istituto di Biofisica, CNR, Italy; 2NEST, Scuola Normale Superiore, Italian Institute of Technology UdR, Pisa, Italy; 2bNEST, CNR-INFM; 3LAMBS, Dept. of Physics, Univ. of
Genova, Genova, Italy; 3b Neuroscience and Brain Technology Department, IIT, Morego (GE), Italy; 4DIPTERIS, Univ. of Genova, Genova, Italy
Some colored heterotrich ciliates, like Blepharisma japonicum and Fabrea salina,
show photomotile responses triggered by endogenous pigments of the hypericin family.
B. japonicum exists in two forms: the wild one contains red blepharismin, the other one,
generated by irradiating the cells with dim visible light, blue blepharismin. B. japonicum
shows step-up photophobic response, whereas F. salina, that contains fabrein, a
hypericin-like pigment the molecular structure of which is unknown, shows step-down
photophobic responses and positive phototaxis.
We showed by confocal microscopy that the pigments are localized not only in
pigment granules, but also in the cilia, the motor organelle of these protista. . This fact implies
that the structure of the pigment in the cilia differs from that in the cell body, (being pigment
granules too big to be accommodated in the axoneme) and suggests that ciliary pigments
might play a decisive role in photoreception.
Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM) shows that there is a spatial
distribution of lifetimes, which are, for every type of organism, shorter for the pigment in the
cilia. This might indicate a functional role for these pigments. Furthermore, lifetimes for
F. salina are always longer than those of B. japonicum. In order to further characterize the
structure of ciliary pigments by means of spectroscopic methods, we have also performed
spatially resolved static and time-resolved fluorescence anisotropy measurements.
38
SINTESI E CARATTERIZZAZIONE DI SQUARAINE COME FOTOSENSIBILIZZATORI NELLA TERAPIA FOTODINAMICA
M. Camerin1, M. Soncin1, V. Rapozzi4, L. Beverina2, F. Ricchelli3, G. Pagani2 e G. Jori1
1Dipartimento di Biologia, Università di Padova, Padova, Italia; 2Dipartimento di Scienze dei
Materiali, Università di Milano-Bicocca, Milano, Italia; 3Istituto per le Tecnologie Biomediche CNR, Padova, Italia, 4Sezione Biochimica –Dipartimento di Scienze e
Tecnologie Biomediche – Università di Udine. La terapia fotodinamica è attualmente applicata su vasta scala per il trattamento di numerosi
tipi di tumore solido. I limiti dimostrati da fotosensibilizzatori “di prima generazione”
(porfirine), quali un basso coefficiente di estinzione molare nella regione 600-700 nm o
l’induzione di fotosensibilità cutanea persistente in seguito a esposizione alla luce, hanno
portato a sintetizzare e sperimentare fotosensibilizzatori “di seconda generazione”. In tale
direzione si inserisce questo progetto che ha lo scopo di testare una classe di molecole, le
squaraine, come fotosensibilizzatori nella terapia antitumorale. Le squaraine derivano dalla
condensazione di acido squarico e molecole elettrofile (es. anilina, pirroli) e sono attualmente
studiate come possibili componenti attivi in numerose applicazioni tecnologiche tra le quali
elettrofotografia, memorie ottiche e celle solari. La loro caratteristica principale è quella di
possedere bande di assorbimento elettronico molto strette localizzate nella regione del vicino
infrarosso con coefficienti di estinzione molare estremamente elevati.
Studi preliminari hanno evidenziato la possibilità di incorporare questi composti in liposomi
di dioleilfosfatidilcolina (DOPC) che consentono la loro veicolazione in modelli tumorali
dopo somministrazione sistemica. Su queste basi sono stati condotti in topi C57BL/6 portatori
di melanoma amelanotico studi di farmacocinetica e fototerapia sperimentale.
39
EVALUATION OF PHOTODYNAMIC ACTIVITY OF PHOTOSYNTETIC PIGMENT/CYCLODEXTRIN INCLUSION COMPLEXES BY MEANS OF PRIMARY ACCEPTORS
B.M. Cellamare1, P. Cosma1,2, P. Fini2, A. Ventrella1, A. Agostiano1,2
1 Dipartimento di Chimica, Università di Bari, Via Orabona 4, I-70126 Bari, Italy, 2Istituto per i Processi Chimico Fisici - CNR, Bari, Via Orabona 4, I-70126 Bari, Italy.
In order to treat certain types of malignant tumours and hyperproliferative diseases often
photodynamic therapy (PDT) is used. It is based on the use of photosensitizer (PS), herein the
chlorophyll a (Chl a), and a light having appropriate wavelength. The PS interacts with the
light producing ROS, reactive oxygen species, a powerful oxidizing agents that cause critical
damage to the tissue. It is necessary that the chlorophyll molecule is in a monomeric form.
Then in order to solubilise it in aqueous solution, we have used cyclodextrins, carriers which
are able to interact with the pigment and form the inclusion complex. The aim of this work is
to examine which type of ROS are formed in the system using specific molecules, named
primary acceptor, that react selectively with the reactive species. In fact the changes of the
absorption and the emission spectra of this molecules after the illumination of the PS provide
information on the specific ROS formation. The most effective ROS in the oxidative damage
is the singlet oxygen (1O2). Uric acid, 9,10-diphenilanthracene and singlet oxygen sensor
green (SOSG) were used as primary acceptors in order to verify the formation of the 1O2.
Moreover 2,7-dichlorofluorescin and ferricytochrome c were used to observe the presence of
the hydrogen peroxide (H2O2) and the formation of superoxide radical anion (O2·-) that
reduces Fe3+ of the ferricythcrome to Fe2+ respectively.
40
THE EFFECT OF PHOTODYNAMIC TREATMENT COMBINED WITANTIBIOTIC ACTION OR HOSTDEFENCE MECHANISMS ON STAPHYLOCOCCUS AUREUS BIOFILMS
A. Di Poto1,2, M.S. Sbarra1,2, L. Visai1,2, P. Speziale1
1University of Pavia, Department of Biochemistry, Viale Taramelli 3/b, 27100 Pavia, Italy; 2University of Pavia, Center for Tissue Engineering, Via Ferrata 1, 27100 Pavia, Italy
Introduction
Staphylococcus aureus is one of the most important etiological agents of infections associated
with medical devices. This is in part due to the ability of the organism to form biofilm, which
provides a microenvironment that protects from attack by the host’s immune system and by
antibiotics. In this study we examined the structure of polysaccharide intercellular adhesin
(PIA)-dependent or protein-based S. aureus biofilms. We defined new strategies aimed at
treatment of mature established biofilms using photodynamic treatment (PDT) combined with
chemotherapy or phagocytosis.
Materials and Methods
Bacterials strains: S. aureus BH1CC, S. aureus SA113 and S.aureus V329 were routinely
grown overnight in tryptic soy broth (TSB) (S. aureus SA113 and S.aureus V329) and in
brain heart infusion (BHI) (S. aureus BH1CC) under aerobic conditions at 37°C.
Materials: A stock solution of 1 mM TMP was prepared in PBS. TMP-treated biofilms were
irradiated at different light doses by means of white light (400–800 nm) isolated from the
emission of a tungsten lamp.
Methods: PDT, MIC assays, phagocytic assay, confocal analysis CLSM (model TCS SPII;
Leica, Heidelberg, Germany); SEM (model EVO 50 EP; Zeiss-Leica, Cambridge, UK).
Results and Discussions
Significant inactivation of bacteria was observed when structurally distinct biofilms were
exposed to the cationic porphyrin, tetra-substituted N- methyl-pyridyl-porphine (TMP), and
simultaneously to visible light.
Moreover, PDT-treated biofilms exposed to vancomycin or subjected to the phagocytic action
of whole blood resulted in their almost complete eradication. The drastic reduction in
staphylococcal survival and the disruption of biofilms were confirmed by confocal laser
scanning microscopy and scanning electron microscopy. The results suggest that PDT
combined with vancomycin and the host defences may be a useful approach for the
inactivation of staphylococcal biofilms adhering to medical implant surfaces.
Indice degli Autori
A Agostiano 9; 17; 25; 26; 34; 39 Altamura 23 Asztalos 2
B Baeri 33 Barcellona 33 Barone 16 Bassi 15 Beccarisi 18 Benvenuti 27 Bertucco 29 Beverina 38 Bianchini 37 Bizzarri 37 Blasi 14 Bonaventura 33 Bottalico 20
C Caffieri 24 Calzavara-Pinton 5; 28 Camerin 38 Carrieri 9 Cataldo 18 Catucci 17; 25; 26 Ceci 19; 34 Cellamare 39 Checcucci 37 Chiaviello 30 Cialdai 27; 32 Cicchi 31 Ciriaco 20 Colombetti 37 Compagnin 10 Comparelli 9 Corcelli 17 Corricelli 9 Corteggiani Carpinelli 29 Cosma 39 Curri 9
D D’Agostino 18 D’Andrea 11 Dall’Acqua F. 4 Dall’Acqua S. 24 De Leo F. 34 De Leo V. 17 De Stefano 12 Depalo 9 Di Paolo 19 Di Poto 40 Diaspro 37
F Fabris 6 Facchetti 28 Fini 39 Foltran 8 Foresti 8 Frascati 20 Fusi 27; 32
G Gallerani 19; 34 Gevi 14 Giacometti 15; 29 Giomini 21 Giorgetti 15 Giotta 22; 34 Giustini 21 Guasti 32
H Husu 21
I Improta 16 Italiano 19; 22; 34
J Jori 38
K Kapsokalyvas 31
L Lami 16 Lelli 8 Leoni 19 Lesci 8 Li Volti 33 Lippolis 26 Lobascio 25 Longo 29
M Mallardi 21 Mancin 10 Manetti 27 Manganoni 28 Marchetti 8 Maróti 2 Mastrogiacomo 22 Matteini 31 Mavelli 23
Mercatelli 32 Milano 17; 20; 22; 23; 34 Miolo 24 Monici 27; 32 Moret 10 Morosinotto 15; 29 Musio 36
P Pagani 38 Palazzo 21 Palumbo 30 Papini 10 Pardini 37 Pascale 26 Pavone 31 Pellegrino 3 Pierini 8 Pini 31
R Ramoino 37 Rapozzi 38 Ratto 31 Reddi 10 Ricchelli 35; 38 Rio Echevarria 10 Romano 27; 32 Rossi 31 Roveri 8
S Saga 15 Sala 28 Santillo 36 Santoro A. 28
Santoro F. 16 Sbarra 40 Segat 10 Selvestrel 10 Sforza 29 Šileikytė 35 Simionato 29 Soncin 38 Speziale 40 Striccoli 9 Stringari 31
T Tavano 10 Timperio 14; 34 Trotta 19; 20; 22; 23; 34
U Usai 37
V Valle 29 Valli 22 Ventrella 25; 39 Venturini 28 Verrone 26 Visai 40 Viscuso 33 Volpicella 19
Z Zimbone 33 Zolla 14; 34 Zulian 35