1

Facultatea de Zootehnie Specializarea: Controlul i expertiza produselor alimentare Lucrare practic nr.2

Metode generale de izolare a toxicelor

I. Izolarea toxicelor din aer

Substanele toxice prezente n atmosfer pot fi detectate fie direct la surs, fie dup recolarea probelor de aer.

A. Detectarea toxicului direct la surs se poate realiza cu ajutorul hrtiilor, creioanelor sau tuburilor indicatoare.

a. Hrtiile indicatoare sunt reprezentate de diferite benzi sau role de hrtie de filtru, ce pot fi impregnate cu reactivi speciali. Prin expunerea acestora direct n atmosfera poluat ori prin intermediul unui dispozitiv de aspirare a aerului, pot conduce la detectarea toxicului prin modificarea culorii ca urmare a reaciei toxic-reactiv. Folosirea hrtiilor indicatoare poate sta la baza unor determinari semicantitative ale toxicelor, n funcie de timpul necesar modificrii culorii acestora (metoda static), volumul de aer aspirat, lungimea poriunii colorate sau intensitatea coloraiei (metoda dinamic).

b. Creioanele indicatoare sunt confecionate prin includerea reactivului ntr-un material de umplutur amestecat cu un liant, totul modelat sub forma unui creion. Lucrul cu aceste creioane presupune trasarea unei linii pe un suport de hrtie sau de lemn aflat n atmosfera de cercetat i identificarea toxicului pe baza modificrii coloraiei linei trasate.

c. Tuburile indicatoare sunt confecionate dintr-un cilindru mic de sticl n care se introduce o pulbere absorbant (porelan, silicagel) impregnat cu un reactiv specific toxicului ce urmeaz a fi identificat. La aspirarea aerului, culoarea pulberei se modific ca urmare a reaciei dintre reactiv i toxic. Concentraia toxicului n atmosfera studiat va fi direct proporional cu lungimea stratului colorat.

B. Detectarea toxicului dup recoltarea probelor de aer. Pentru recoltarea probelor de aer se pot folosi urmtoarele procedee:

a. Recoltarea probelor de aer n recipiente nchise (procedeu de moment), reprezentate de flacoane de sticl prevzute cu dop strbtut de un tub lung i altul scurt, la ale cror extremiti se gsesc robinete cu care se poate face vid, flacoane cu tubulatur n T sau flacoane simple cu dop rodat (fig.1). De asemenea, se mai pot folosi pipetele de gaz, numite i tonometre (fig.2), reprezentnd tuburi de sticl cu capaciti de 200-500 ml, cu ambele extremiti nchise cu robinete sau tuburi de cauciuc cu

2

cleme, ori saci, camere sau baloane de cauciuc, ns care au utilizare limitat pentru c unii toxici fie difuzeaz prin membran (CO2), fie sunt absorbii de aceasta (SO2).

Atunci cnd toxicul nu reacioneaz cu apa, recoltarea probelor n aceste recipiente se poate face prin dislocuire de lichid, flaconul umplut complet cu ap golindu-se la locul de recoltare, aerul de cercetat lund astfel locul apei. Pentru toxicele care reacioneaz cu apa se practic recoltarea prin dislocuire de aer, aerul de cercetat fiind introdus prin tubul lung al flaconului adaptat la un dispozitiv de aspirare, sau prin creare de vid, flaconul cu tubulatur n T ori pipeta de gaz fiind puse n legtur cu o pomp de vid, recipientul vidat astfel deschizndu-se la locul de recoltare i permind ptrunderea aerului de cercetat n acesta.

Toate aceste procedee ns, au o utilizare limitat, pe de o parte pentru c permit efectuarea numai a probelor de scurt durat (probe de moment), iar pe de alt parte pentru c prin capacitatea maxim a recipientului de 5 litri nu se pot realiza concentrri suficiente ale toxicului.

b. Recoltarea prin aspirare (procedeu continuu): se preteaz pentru toxicele aflate chiar i n concentraii mici n mediul de analizat. Aerul se aspir cu ajutorul dispozitivelor de aspirare cu capaciti cuprinse ntre 1 i 50 litri (aspiratoarele hidraulice) sau peste 100 litri (aspiratoarele mecanice).

Aspiratoarele hidraulice se utilizeaz atunci cnd nu exist surs de curent electric dar exist surs de ap, acestea fiind reprezentate de:

Vasele comunicante sunt dou vase din sticl, cu capaciti egale, unite printr-un tub de cauciuc pe care se afl o clem. Unul din vase se aeaz la un nivel superior celuilalt, dup care se umple cu ap i se deschide clema. Datorit diferenei de nivel, apa curge n vasul inferior, fcnd vid n vasul superior i permitnd aspirarea aerului din exterior (fig.3).

Trompa de ap este format dintr-un tub cuplat la extremitatea sa superioar la o surs de ap. n poriunea sa mijlocie, tubul se efileaz i ptrunde n alt tub, care se continu pn

3

la extremitatea inferioar a trompei. n momentul scurgerii apei, la nivelul piesei are loc o aspirare de aer, curent ce ptrunde n tromp printr-un tub lateral la care se adapteaz un dispozitiv de reinere (fig.4).

Aspiratoarele mecanice includ pompele de vid, aspiratoarele de praf i pompele de aer comprimat. Volumul de aer recoltat este msurat cu ajutorul gazometrelor, care indic volumul de aer aspirat prin citire direct pe cadran i debitmetrelor, reprezentate de reometre i rotametre, care indic cantitatea de aer aspirat pe unitatea de timp. Deoarece temperatura i presiunea modific sensibil volumul de aer, pentru a obine rezultate comparabile trebuie fcut corecia la condiiile normale de temperatur i presiune (0 0C i 760 mm Hg). Pentru aceasta se utilizeaz ecuaia de stare a gazelor perfecte:

PV = P0V0 (1+t) unde, P = presiunea aerului n momentul recoltrii; P0 = presiunea normal de 760 mm Hg; V = volumul aerului aspirat (litri); V0 = volumul aerului adus n condiii normale (litri); = coeficientul de dilatare volumetric a aerului (1/273); t = temperatura aerului n momentul recoltrii (0C).

Considernd relaia anterioar, V0 = V* *

Dac la recoltare se folosete un recipient vidat, atunci se introduce n calcul presiunea remanent (Pr) iar formula devine:

V0 = V* *

4

n general, pentru recoltarea probelor prin aspirare, stabilirea locului i momentului recoltrii trebuie s fie ct mai reprezentative iar volumul de aer recoltat trebuie s permit determinarea a minimum jumtate din concentraia maxim admis.

C. Recoltarea probelor de aer direct n dispozitivele de analiz, numite i analizoare de gaze. Acestea asigur recoltarea, depistarea i chiar dozarea toxicelor, a substanelor inflamabile sau explozive, n stare de gaze sau de vapori, individual sau n amestec, direct din atmosfera poluat. Dup principiul pe care se bazeaz, analizoarele sunt optice, termochimice i electrochimice.

Analizoarele optice de gaze msoar absorbia luminii de ctre toxic sau de ctre produsul de reacie dintre toxic i mediul absorbant, solid sau lichid. Msurarea absorbiei se poate realiza n domeniul vizibil, UV i infrarou, folosind celule fotoelectrice i dispozitive de nregistrare, eventual de nmagazinare i prelucrare. Analizoarele termochimice de gaze msoar energia caloric rezultat din reaciile chimice ale toxicelor, n timp de analizoarele electrochimice msoar variaia conductivitii electrice a soluiei absorbante dup reinerea toxicului din amestecul gazos.

Utilizarea analizoarelor de gaze reprezint o soluie ideal pentru ssupravegherea continu a atmosferei poluate, permind semnalarea depirii concentraiilor maxime admise.

Exprimarea concentraiei toxicelor din aer se face n: greutate/volum (g/v), cnd toxicul se exprim n uniti de greutate iar aerul n uniti de

volum; volum/volum (v/v), cnd att toxicul ct i aerul se exprim n uniti de volum, i

anume:

procente de volum (% volum), pentru concentraii mai mari de 0,1%; pri per milion (ppm), pentru concentraii cuprinse ntre 0,1 ppm i 100 ppm

(reprezint un volum de toxic la 1 000 000 volume de aer); pri per bilion (ppb), pentru concentraii sub 0,01 ppm (reprezint un volum de

toxic la un miliard de volume de aer).

II. Izolarea substantelor toxice din produse biologice sau alte produse

n funcie de natura lor, substanele toxice, inclusiv medicamentele, pot fi izolate din proba de analizat (urin, snge, organe, alimente etc.) prin diferite metode, astfel:

A. Izolarea substanelor toxice volatile se poate face prin: a. distilare, atunci cnd toxicul are punctul de fierbere sub 100 0C, pentru aceasta fiind

folosite instalaii adaptate la cantitatea de produs analizat (micro- i macrodistilatoare). Balonul de distilare, prevzut cu un termometru, este ataat la un refrigerent descendent terminat cu o alonj, al crei capt este introdus n recipientul de recoltare (de regul, un balon cotat ce conine civa ml de ap sau alt lichid adecvat). nclzirea se face direct pe sit sau pe baie electric (fig.8). Pentru prevenirea descompunerii produsului prin piroliz (grec. pyr foc, lysis separare), precum i apariia unor compui neoformai (de

5

exemplu, HCN din descompunerea substanelor organice), nclzirea se poate face i pe o baie de clorur de calciu 40%. Cnd toxicul este necunoscut, sunt necesare dou distilri, prima efectundu-se n mediul acid (alturi de substratul mrunit i omogenizat, se adaug ap distilat i soluii de H2SO4, HNO3 sau acid tartic) pentru separarea toxicelor de natur acid sau neutr, iar a doua n mediul alcalin (incluznd adaosuri de Na2CO3 10%), pentru toxicele alcaline. Toxicul din distilat este identificat i dozat fie din distilatul ca atare, fie din reziduul rezultat prin evaporarea solventului (cu care a fost epurat distilatul) pe baie de ap (cnd toxicul este termostabil i are volatilitate redus) sau n vid (cnd toxicul este termolabil).

Fig.8: Instalaie pentru distilarea substanelor toxice volatile

b. antrenarea cu vapori de ap, atunci cnd toxicul are puctul de fierbere superior punctului de fierbere al apei sau cnd produsul se descompune la temperatura sa de fierbere. Instalaiile folosite n acest sens sunt compuse dintr-un balon generator de vapori (A), un balon de antrenare (B) i un refrigerent (C) (fig.9). Produsul de analizat este omogenizat i introdus n balonul de antrenare (B), dup care se trateaz cu un volum egal de ap i apoi se aciduleaz. Dup conectarea balonului la generatorul de vapori (A) i la refrigerent (C), produsul se supune antrenrii cu vaporii de ap rezultai din fierberea acesteia n balonul generator de vapori (A). Dup rcire, reziduul rmas n balonul de distilare este alcalinizat i supus unei noi antrenri pentru izolarea toxicelor volatile cu pH alcalin, care vor fi colectate n H2SO4 0,1 N.

6

c. antrenarea cu un curent de aer, atunci cnd se dorete izolarea unor toxice precum benzenul, HCN din snge sau hidrocarburile aromatice din organe. Instalaia se compune din recipientul cu produsul de analizat (A), absorbitorul cu reactivul specific toxicului de cercetat (B), dispozitivul de aspirare (pompa de vid) pus n legtur cu absorbitorul i, opional, dispozitivul de purificare a aerului (C) montat naintea recipientului cu produsul de analizat (fig.10).

Fig. 10: Instalaie pentru antrenare cu un curent de aer a toxicelor volatile

d. difuzia simpl, atunci cnd se dorete determinarea acetonei din snge sau urin.

B. Izolarea substanelor toxice minerale. Acestea pot exista n organism sub form ionic sau sub forma unor combinaii complexe (proteinai ai metalelor grele), puin sau deloc ionizabile. Compuii ionizabili (hidrosolubili) pot fi pui n eviden n maceratul apos al produsului de analizat, pe cnd combinaiile proteice ale metalelor grele, neionizabile, nu pot fi depistate direct. n acest caz, se impune mineralizarea - distrugerea matricei organice pentru a elimina aciunea perturbatoare a substanelor proteice i a ioniza din nou toxicul mineral. Aadar, n funcie de starea n care se gsesc, toxicele minerale pot fi izolate din produsele organice prin urmtoarele procedee:

Fig. 9: Instalaie pentru antrenarea cu vapori de ap a toxicelor volatile

7

a. dializa: se preteaz pentru toxicele minerale disociabile (acizi, baze, sruri) din resturile alimentare, vom, coninut stomacal i mai rar esuturi, unde o parte din aceste substane sunt legate ca proteinai. Iniial, se procedeaz la macerarea cu ap a produsului, apoi filtrarea sau supunerea la dializ. Dializorul este un tub de sticl cu diametrul de 3-4 cm, pe la una din extremiti introducndu-se maceratul sau filtratul, iar cealalat extremitate, acoperit cu o membran semipermeabil, este introdus ntr-un cristalizor cu ap distilat n care toxicul difuzeaz rapid.

b. electrodializa: se bazeaz pe migrarea toxicelor spre anod sau catod pe baza polaritii lor. Produsul de analizat este plasat ntr-un recipient cu ap distilat, separat prin membrane semipermeabile de alte dou recipiente (A anodic i C catodic) (fig.11), fiecare dintre acestea dou coninnd doar ap distilat i electrozii corespunztori. La trecerea curentului electric se favorizeaz eliberarea toxicului din combinaia proteic n care se afl i orientarea spre anod sau catod, n funcie de afinitatea sa.

Fig.11: Electrodializor

c. mineralizarea: se realizeaz pe cale uscat (calcinare) sau umed. mineralizarea pe cale uscat (calcinare) poate fi:

simpl (direct), cu avantajul obinerii unei cenui fr reziduu organic, n care metalul se gsete n majoritatea sa sub form de carbonat;

cu diferite adaosuri de oxidani (azotat de K sau Mg, oxid de Mg, Na2CO3 etc.) n vederea nlturrii dezavantajelor calcinrii simple legate, n principal, de pierderile de toxic;

n curent de oxigen, cu dezavantajul unor pierderi de toxic prin volatilizare. Nici una din aceste variante nu se aplic mercurului. Procedeul general de lucru al variantei celei mai avantajoase implic triturarea produsului de analizat cu adaosuri de oxidani, transferarea sa n creuzet, uscarea la 105-1100C la etuv i apoi la 500-6000C n cuptorul de calcinare. Ulterior, se adaug H2SO4 concentrat i se nclzete, dup care reziduul de dizolv n HCl 10% i se filtreaz. Toxicul se determin n soluie. De obicei, aceast tehnic se folosete pentru determinarea arsenului n produsele biologice cnd, datorit combustiei substanelor organice, arsenul trece n arseniat de Mg, nevolatil.

8

mineralizarea pe cale umed comport unele adaosuri n proba de analizat, precum compui cu clor (clorat de K, HCl, acod percloric), HNO3, H2SO4, permanganat de potasiu, perhidrol, toi acetia acionnd asupra matricei organice, mineraliznd-o i permind trecerea metalelor sub form ionic. Tehnicile de lucru au unele particulariti ns, ca principiu general, mineralizarea se face n baloane nchise n care se introduce proba de analizat, peste care se adaug produsele de mineralizare anterior menionate, n cantitai diferite n funcie de tehnica aleas. Amestecul se nclzete pe baia de nisip, fie pn la carbonizare (urmat de resolubilizarea produsului carbonizat), fie pn cnd i schimb culoarea n galben pai sau incolor. Lichidul de mineralizare se supune analizei de cuantificare a toxicelor minerale, cea mai cunoscut fiind metoda spectrofotometriei de absorbie atomic.

C. Izolarea substanelor toxice organice nevolatile, incluznd medicamentele, alcaloizii, pesticidele, acizii organici, aditivii alimentari, toxine vegetale i animale etc., se face prin extragere cu diveri solveni organici. O parte din toxice poate fi extras prin electrodializ iar o alt parte a substanelor toxice, incluznd n special nicotina i amfetamina, prin antrenare cu vapori de ap.

Extragerea cu solveni organici este cea mai important tehnic, bazndu-se pe principiul conform cruia solubilitatea substanelor este invers propoional cu masa loc molecular. Spre deosebire de izolarea toxicelor volatile i minerale, izolarea prin extragere cu solveni organici prezint o serie de dificulti, i anume: extragerea concomitent cu toxicul i a unor produi jenani (proteine, lipide, colorani etc.), pierderile de toxic prin absorbie pe precipitatele din cursul operaiunilor de purificare sau extragerea incomplet a toxicului. n general, se urmrete ca solventul s extrag toxicul nealterat, precipitnd n acelai timp proteinele. Adeseori, se adaug substane adjuvante (acizi, baze) pentru a mri eficiena solventului.

Metodele de extracie cu solveni organici se clasific n funcie de eficiena lor (extracie prin echilibrare, extracia exhaustiv) sau solventul folosit (extracie general, extracie selectiv).

extracia prin echilibrare se bazeaz pe agitarea produsului de analizat cu o anumit cantitate de solvent, n acest fel realizndu-se o echilibrare de repartiie a toxicului ntre substrat (produsul analizat) i solvent. Din lichidul de extracie ajuns la echilibru se determin toxicul.

extracia exhaustiv se bazeaz pe epuizarea produsului de analizat cu solvent mereu proaspt, operaia repetndu-se pn la extragerea complet. Se pot folosi variante de extracie cu solvent care recircul (aparate Soxhlet, Kumagawa) sau extracie cu solvent care se rennoiete (n plnia de separare).

extracia general se realizeaz cu solveni organici cu capaciti de dizolvare a unei game largi de toxice i care, totodat, sunt i deproteinizani (de exemplu, alcoolul etilic). Metoda este indicat pentru analiza toxicologic general, cnd lipsesc indicaii asupra naturii toxicului.

extracia selectiv se refer la utilizarea solvenilor specifici toxicului cercetat i presupune cunoaterea naturii acestuia.

Reziduul obinut dup evaporarea solventului organic, de cele mai multe ori nu conine doar toxicul ci i diferite impuriti ca substane de natur proteic, lipidic, colorani etc. care ngreuneaz

9

sau chiar mpiedic recunoaterea toxicului analizat. n general, purificarea reziduurilor se realizeaz prin modificarea pH-ului mediului (de la acid la alcalin i invers), ndeprtarea impuritilor prin extragere cu solveni, revenirea la pH-ul iniial i apoi extragerea toxicului cu solveni adecvai.

n toate cazurile trebuie s se in cont de posibilitatea producerii de pierderi prin purificare, n special n cazul toxicelor volatile: amfetamin, metadon, unuii alcaloizi.

n prezent ns, exist metode moderne precum electroforeza sau cromatografia, care permit separarea cantitailor foarte mici de toxice, att a celor cu structur similar ct i de impuritaile propriu-zise.