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première semaine : lundi

Préparation des bactéries compétentes.Cette manipulation est faîtes deux fois.Par nous le dimanche qui précède votre arrivée et par vous le prmier lundi.

Matériel.

1. E. coli1 MRAP II / Glycérol2. Solution de maltose à 20% p: 23. Solution de MgSO4 1M p: 24. 2 Tubes avec 5 ml de LB2 medium stérile5. Bac de glace (pour conserver les échantillons à environ 4°C.

Méthode.

1. Décongeler le microtube contenant les bactéries (E. coli MRAP II)2. Agiter la suspension de bactéries et la conserver sur la glace.3. Ajouter stérilement aux 2 tubes contenant le LB medium, du maltose

à 20% pour obtenir une concentration finale de 0,2% et du MgSO4 1Mpour obtenir une concentration finale de 10 mM (faîtes et notez le calcul).

4. Ajouter stérilement 5 µl de bactéries au tube n°1 et 10 µl au tube n°2.5. Le tube n°3 ne reçoit que 5 µl de bactéries.6. Mettre les tubes à 37°C pour la nuit.

[ ] f inalen° du tube 1 2 3

LB medium 5 ml 5 ml 5 mlVol de MgSO4 1M . . . µl . . . µl - 10 mMVol de Maltose à 20% . . . µl . . . µl - 0,20%E. coli MRAP II 5 µl 5 µl 5 µl

(le tube numéro 3 est destiné mardi à la conservation de bactéries)

1 E. Coli: Escherichia coli2 LB : Luria-Bertani

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Préparation des solutions.

1. Maltose à 20%Maltose monohydraté (ref Merck: 5910)Stériliser une bouteille vide à l’autoclave pendant 20 min à 1kg/cm2

Dissoudre 20 g de maltose dans 80 ml d’eau distillée.Ajuster le volume à 100 ml avec de l’eau distillée.Stériliser la solution par passage sur filtre de 0,45 micron (voir figure).Conserver la solution à 4°C

2. MgSO4 1MMgSO4 7H2O (ref Sigma: M-9397)Dissoudre 24,65 g d’MgSO4 dans 80 ml d’eau distillée.Ajuster le volume à 100 ml avec de l’eau distilléeStériliser la solution à l’autoclave pendant 20 min à 1kg / cm2

3. LB medium (Luria-Bertani medium)Luria-Broth ( ref Sigma: L-3522)Solution contenant 10 g de Bacto-tryptone, 5 g de bacto-yeast extract et 10 g d’NaClDans un bécher d’un litre, peser 25 g de luria broth.Ajouter environ 800 ml d’eau distillée et agiter la solution jusqu’à dissolution complète.Ajuster le pH à 7 avec de l’NaOH 5MAjuster le volume à un litre avec de l’eau distillée.Stériliser la solution à l’autoclave pendant 20 min à 1 kg / cm2

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Préparation des milieu de culture.

Matériel.

1. LB medium p: 22. MgSO4 1M p: 23. Agar ref Sigma: A-50544. Boite de Pétri5. Tubes en pyrex + bouchons6. Bain marie à 50°C7. Erlen de 300 ml + bouchon en cellulose

Méthode.Bottom agar1. Préparer 120 ml de bottom3 agar dans un erlen de 300 ml.2. Dissoudre l’agar en chauffant la solution (quantité voir tableau ci dessous).3. Ajouter à cette solution de MgSO4 1M pour obtenir une concentrationfinale égale à 10 mM (voir tanleau ci dessous)

tableau[ ] f inale

LB medium 120 mlAgar . . . g 15 g/lMgSO4 . . . µl 10 mM

Top agar4. Pour préparer la solution de top4 agar, laisser refroidir la solutionjusqu’à ± 50°C et transférer 1,5 ml de bottom agar dans les tubes en pyrex.5. Ajouter à tous les tubes 1,5 ml de LB medium, mettre un bouchon surles tubes et sur l’erlen6. Stériliser le tout à l’autoclave pendant 20 min à une pression de 1 kg / cm2

7. Aprés la stérilisation, mettre les tubes et l’erlen dans un bain marie à 50°C.8. A cette température et dans un environnement stérile, couler environ 20

mlde bottom agar dans les boites de pétri.

3 Bottom agar : LB medium + 15 g / l d’agar4 Top agar : LB medium + 7,5 g / l d’agar

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Dilution du phage lambda et infection.

Matériel.

1. Solutionde SM5 p: 52. Phage lambda3. 2 rangées de 5 microtubes de 1,5 ml4. Tubes avec 3 ml de top agar à 50° C.5. Bottom agar dans boites de Pétri stériles6. Bain marie à 50°C

Méthode.

Première partie infection1. Numéroter 5 microtubes de la première rangée de 1 à 52. Mettre 270 µl de SM dans tous les microtubes.3. Ajouter au microtube n°1, 30 µl de la solution de phage lambda.

Agiter et centrifuger la solution brièvement.4. Ajouter au microtube n°2, 30 µl de la dilution du microtube n°1

Agiter la solution et centrifuger brièvement.5. Ajouter au microtube n°3, 30 µl de la dilution du microtube n°2

Agiter la solution et centriguger. Procéder ainsi jusqu’au 5e microtube.6. Numéroter les 5 microtubes de la seconde rangée de 1’ à 5’7. Mettre dans ces microtubes 100 µl de bactéries compétentes.8. Transférer dans le microtube n°1’, 100 µl de la dilution n°19. Dans le microtube n°2’, 100 µl de la dilution n°2 et ainsi de suite jusqu’au

dernier microtube.10. Incuber les microtubes à 37°C pendant 20 min.

5 SM : Sel - Magnésium

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Seconde partie : étalement

11. Introduire stérilement 100 µl du microtube n°1’ dans le tube contenantle Top agar à 50°C

12. Agiter avec précaution et couler stérilement cette solution dans une boitede Pétri. Etaler le solution en imprimant un mouvement circulaire à la boite.

13. Laisser solidifier à température ambiante. Mettre les boites dans l’étuve à 37°C pour la nui

Préparation des solutions.

1. SM (Sel - Magnésium)Solution de Tris 1M et de pH = 7Solution d’MgSO4 1MSolution de gelatine à 2%NaCl (ref Promege: H5271)

Solution contenant du Tris 50 mM, NaCl 0,1M, MgSO4 25 mM et 0,01% degelatine

Dans un ballon de 100 ml transférer 0,58 g d’NaCl, ajouter 2,5 ml d’ MgSO4

1M,5 ml de Tris 1M pH 7 et 0,5 ml de la solution de gelatine à 2%.Porter au volume avec de l’eau distillée et stériliser la solution à l’autoclave

pendant20 min à 1kg/cm2.

2. Solution de gelatine à 2%Gelatine ref Sigma : G9391

3. Tris 1M pH = 8Tris: Tris (hydroxymethyl) aminomethane.Tris-Hydrocloride ref Promega: H5123

Dissoudre 12,11 g de Tris dans environ 80 ml d’eau distilée.Ajuster le pH à 8 avec de l’HCl 10 N, Porter au volume de 100 ml avec de l’eaudistillée et stériliser la solution 20 min à 1kg/cm2