MMoolekullekuláris rátermettség áris rátermettség tájképektájképek

Kun Kun ÁdámÁdám

Rátermettség tájképRátermettség tájkép

Minden genotípushoz rendeljünk egy Minden genotípushoz rendeljünk egy fenotípustfenotípust

Minden fenotípushoz rendeljünk egy valósz Minden fenotípushoz rendeljünk egy valósz számot, ami a rátermettsége.számot, ami a rátermettsége.

Molekuláris rátermettség tájképMolekuláris rátermettség tájkép

Enzimek aktivitása kihat az egyed Enzimek aktivitása kihat az egyed rátermettségére.rátermettségére.

Az enzim aktivitás könnyen mérhető (az Az enzim aktivitás könnyen mérhető (az egyed rátermettsége nem)egyed rátermettsége nem)

Az enzimek könnyen mutálhatóak és Az enzimek könnyen mutálhatóak és „szaporíthatóak”„szaporíthatóak”

Az enzimek fenotípusa a 3D szerkezetükAz enzimek fenotípusa a 3D szerkezetük

Moran folyamatMoran folyamat

Populáció méret állandó.Populáció méret állandó. Átfedő generációkÁtfedő generációk Halálozás véletlenszerű, szaporodás Halálozás véletlenszerű, szaporodás

rátermettségarányosrátermettségarányos Rátermettség arányosan kiválasztunk egy Rátermettség arányosan kiválasztunk egy

egyedet. Ő fog szaporodni. Egy véletlen egyedet. Ő fog szaporodni. Egy véletlen szerint választott egyed meghal, a helyébe szerint választott egyed meghal, a helyébe szaporodik.szaporodik.

Legegyszerűbb tájképLegegyszerűbb tájképrá

term

etts

ég

Fentipusos jelleg

Fuji hegy tájképFuji hegy tájképrá

term

etts

ég

Fentipusos jelleg

Két csúcsKét csúcsrá

term

etts

ég

Fentipusos jelleg

Mi van ha 3D-t nézünk?Mi van ha 3D-t nézünk?

Visszamutáció, rescue mutationVisszamutáció, rescue mutation

Semleges mutánsSemleges mutáns Kritikus helyKritikus hely Rontó mutációRontó mutáció VisszaállítóVisszaállító

Többszörös mutációk kérdéseTöbbszörös mutációk kérdése Legegyszerűbb Legegyszerűbb

feltevés, hogy a feltevés, hogy a hatások függetlenekhatások függetlenek

A kevés rendelkezésre A kevés rendelkezésre álló adatból ez álló adatból ez nagyjából igaznak nagyjából igaznak vehető. Van egy kis vehető. Van egy kis pozitív hatás (azaz a 2. pozitív hatás (azaz a 2. mutáció negatív mutáció negatív hatása kisebb, mint hatása kisebb, mint várnánk)várnánk)

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

Equation: y = a*x^b Chi^2/DoF = 0.00617R^2 = 0.96299 a 1.10171 ±0.0598b 0.90554 ±0.10992M

easu

red

activ

ityCalculated activity

RNS struktúraRNS struktúra

Neurospora VS ribozim

144 nukleotid hosszú

RNS másodlagos szerkezetRNS másodlagos szerkezet

Bázispárok számától függ a szabadenergia.Bázispárok számától függ a szabadenergia. Dinamikus optimalizáció a bázispárok Dinamikus optimalizáció a bázispárok

számának maximalizálására (energia számának maximalizálására (energia minimalizálására)minimalizálására)

A bázispárok energetikáját kísérletesen A bázispárok energetikáját kísérletesen vizsgáljákvizsgálják

RNS másodlagos szerkezet meghatározásRNS másodlagos szerkezet meghatározás

Szekvencia R=r1, r2, r3, ..., rn; ahol ri{A,C,G,U}Másodlagos szerkezet S = i.j bázispárok rendezett halmaza

1. 1 i < j N2. j - i>33. i.j és k.l bázispárokra (i<k) igaz az egyik:

a) i=k és j=l (ugyanaz a bázispár)b) i<j<k<l (egymás után jönnek)c) i<k<l<j (i.j magába foglalja k.l-t)

Keressük a legalacsonyabb energiájú (vagy ahhoz közeli) szerkezetet, feltehetően ez a másodlagos szerkezete egy RNS molekulának

Másodlagos szerkezet energiájaMásodlagos szerkezet energiája

hajtűkanyar

halmozódó bázispár

kitüremkedés

belső hurok

elágazás

A srtruktúra energiája a hurkok energiájától függBármely struktúra egyértelműen felbontható m+1 (m a bázispárok száma) hurokra

A struktúra energiája, így az egyes hurkok energiájának összege

0

m

ii

E S e L

Struktúra a fenotípusStruktúra a fenotípus

A másolási sebesség, vagy az enzimatikus A másolási sebesség, vagy az enzimatikus aktivitás a aktivitás a struktúrátólstruktúrától függ. függ.

Egy RNS molekula fenotípusa nem a Egy RNS molekula fenotípusa nem a bázissorrend, hanem a struktúra.bázissorrend, hanem a struktúra.

44NN szekvencia lehetséges, mennyi szekvencia lehetséges, mennyi struktúra?struktúra?

Hogyan határozzuk meg a struktúrátHogyan határozzuk meg a struktúrát

RNS tájképekRNS tájképek

Kémiailag és fizikailag megalapozott Kémiailag és fizikailag megalapozott genotípus-fenotípus térképgenotípus-fenotípus térkép

Ilyen máshol még nincs a biológiábanIlyen máshol még nincs a biológiában

RNS tájképek tulajdonságai IRNS tájképek tulajdonságai I

Körülbelül 2.35Körülbelül 2.35NN struktúra, azaz egy struktúra, azaz egy struktúrához több szekvencia tartozik.struktúrához több szekvencia tartozik.

Kevés mutáció (1-3) általában nem Kevés mutáció (1-3) általában nem változtatja meg a struktúrátváltoztatja meg a struktúrát

Ha van egy kompatibilis szekvenciánk, Ha van egy kompatibilis szekvenciánk, akkor az átlagosan 7.2 mutációval olyanná akkor az átlagosan 7.2 mutációval olyanná alakítható, hogy kívánt MFE struktúrája alakítható, hogy kívánt MFE struktúrája legyenlegyen

RNS tájképek tulajdonságai IIRNS tájképek tulajdonságai II

AUCGUCUGUCGGCGAU

GCAUGACUCAUUAUGC

Mesterkópia:

Mutáns:

•Semleges utak a tájképen•Az utak 21.7%-a perkolál

Azonos struktúra

Azonos fitness

RNS tájképek tulajdonságai IIIRNS tájképek tulajdonságai III

Vannak gyakoribb struktúrákVannak gyakoribb struktúrák A szekvenciák zöme gyakori struktúrát A szekvenciák zöme gyakori struktúrát

vesz felvesz fel ( (evolvevolválódott ribozimek minden bizonnyal álódott ribozimek minden bizonnyal gyakoriakgyakoriak))

A struktúrák zömét csekély számú A struktúrák zömét csekély számú szekvencia veszi felszekvencia veszi fel

Minden szekvencia körüli kb. 20 Minden szekvencia körüli kb. 20 mutációval elérhető gömbön belül minden mutációval elérhető gömbön belül minden gyakori struktúra elérhetőgyakori struktúra elérhető

RNS tájképek következményeiRNS tájképek következményei

Az evolválódott ribozimek minden bizonnyal Az evolválódott ribozimek minden bizonnyal gyakori struktúrák.gyakori struktúrák.

Ribozimok rátermettség tájképeRibozimok rátermettség tájképe

A rátermettség tájkép A rátermettség tájkép kísérletes adatokrakísérletes adatokra épülépül

Rátermettség tájképek általános Rátermettség tájképek általános szerkezetének vizsgálataszerkezetének vizsgálata

Feltételezzük, hogy az enzimaktivitás Feltételezzük, hogy az enzimaktivitás arányos a rátermettséggel arányos a rátermettséggel (proto(protosejtsejt))

Mely ribozimok jöhetnek szóba?Mely ribozimok jöhetnek szóba?

1. 1. Jól karakterizáltJól karakterizáltCsak a természetes ribozimok teljesítik ezt a kritériumot

2. 2. Nem túl hosszúNem túl hosszú (pra(praktikus okktikus ok))Az I-es és II-es csoportbeli intronok kiesnek

3. 3. NNem lehet em lehet a transz ható enzim szerkezetbena transz ható enzim szerkezetben pspszzeudo-eudo-csomócsomó (algorit(algoritmus követelményemus követelménye))

Hepatitis Delta Virus kiesik e miatt

NeurosporaNeurospora VS Ribozyme, Hairpin, Hammerhead VS Ribozyme, Hairpin, Hammerhead

NeurosporaNeurospora Varkund Satellit Riboz Varkund Satellit Riboziimm

uaagagcguuCg-CcCgcgguaguaaGc AgG

|||||| |||A

GAACACGA CAC GUUaUgAcug||| ||| ||||||||||GAC

GCU GUG-A-CGGuAuUggc

CUC-GC-GA-UC-GU-AC-G

A

g

aua

UUAGU

GUaUUGUCA|||||||||CguAgCAGUU

uGGA

AA

aCuUuaaC||||||||uGaAauuGc

gau

-U-

3’

5’AA640

650

680

730

740

690

660

670

700710

720

750

760

770

780II

III

IV V

VI

uaagagcguuCg-CcCgcgguaguaaGc AgG

|||||| |||A

GAACACGA CAC GUUaUgAcug||| ||| ||||||||||GAC

GCU GUG-A-CGGuAuUggc

CUC-GC-GA-UC-GU-AC-G

A

g

aua

UUAGU

GUaUUGUCA|||||||||CguAgCAGUU

uGGA

AA

aCuUuaaC||||||||uGaAauuGc

gau

-U-

3’

5’AA640

650

680

730

740

690

660

670

700710

720

750

760

770

780II

III

IV V

VI

N = 144

A pozíciók 83/144 (57%) mutálva van, mi összesen 183 mutánst vettünk figyelembe

VS Ribozim: mutációs kísérletekVS Ribozim: mutációs kísérletek

144 nukleotidból 87-en végeztek mutációs kísérletetÖsszesen 183 mutánst vizsgáltak

VS RibozimVS Ribozim

Aktív hely

Szubsztrát kötés

Hossz nem fontos

Hossz nem fontos

Elágazások fontosak

Kitüremkedés nem lehet a másik száron, de törölhető

Hairpin RibozymeHairpin Ribozyme

aaacaGAGAAGUcaACCAg|||||

A G AA

AUGGUcCAUUAUAUG

A C A

GUG

CACG|||

uu

1

10

20 30

40

50

5’

3’

H1

loop A

H2 H3 H4

loop BaaacaGAGAAGUcaACCAg

|||||A G AA

AUGGUcCAUUAUAUG

A C A

GUG

CACG|||

uu

1

10

20 30

40

50

5’

3’

H1

loop A

H2 H3 H4

loop B

N = 50

A pozíciók 39/50 (78%) mutálva van, összesen 142 mutáns vettünk figyelembe

Ribozimokkal kapcsolatos általános Ribozimokkal kapcsolatos általános megfigyelésekmegfigyelések

1.1. A szerkezet a fontos, nem az egyedi bázispárokA szerkezet a fontos, nem az egyedi bázispárok

2.2. A szerkezet kissé változtathatóA szerkezet kissé változtatható

3.3. Vannak kritikus helyekVannak kritikus helyek

4.4. A tájkép multiplikatívA tájkép multiplikatív ((lehet hogy van egy gyenge szinergialehet hogy van egy gyenge szinergia))

Általános funkcionalitás tájképÁltalános funkcionalitás tájkép

Rendeljen minden lehetséges Rendeljen minden lehetséges 44NN szekvenciához egy relatív enzimaktivitástszekvenciához egy relatív enzimaktivitást

I.I. Kompatibilis szerkezetKompatibilis szerkezet

II.II. Hibás bázispárHibás bázispár

III.III.Kritikus helyekKritikus helyek

IV.IV. Jósolt struktúraJósolt struktúra sequence structure misspair critical energy

I. I. Kompatibilis szerkezetKompatibilis szerkezet

A célstruktúrának megfelelő bázis-párok A célstruktúrának megfelelő bázis-párok mindegyike – legtöbbje – ki tud-e alakulnimindegyike – legtöbbje – ki tud-e alakulni??

Néhány hibás párNéhány hibás pár ( (rosszul párosított rosszul párosított bázispárbázispár) ) megengedhetőmegengedhető, , dede– Nem lehet kettő ilyen egymás mellettNem lehet kettő ilyen egymás mellett– Nem lehet egy régióban kettőnél többNem lehet egy régióban kettőnél több

AA a szekvenciával kompatibilis a szekvenciával kompatibilis struktúrának megfelelő aktivitásstruktúrának megfelelő aktivitás..

structure

II. II. Hibás bázispárokHibás bázispárok

Minden megengedett hibás bázis-pár Minden megengedett hibás bázis-pár csökkenti az aktivitástcsökkenti az aktivitást

Az elhelyezkedésüktől függően más Az elhelyezkedésüktől függően más hatásuk lehet az egyes hibás pároknakhatásuk lehet az egyes hibás pároknak

,misspair misspair i

III. III. Kritikus helyekKritikus helyek

Minden lehetséges nukleotidhoz rendelünk Minden lehetséges nukleotidhoz rendelünk aktivitást ezeken a helyekenaktivitást ezeken a helyeken. .

,critical critical i

IV. IV. Jósolt szerkezetJósolt szerkezet

A 2D szerkezet meghatározása.A 2D szerkezet meghatározása. (Vienna RNA (Vienna RNA Package)Package)

Elfogadjuk, ha a célszerkezetbe tekeredikElfogadjuk, ha a célszerkezetbe tekeredik.. A A MFE MFE nem biztos, hogy a kísérletesen nem biztos, hogy a kísérletesen

meghatározott másodlagos szerkezetmeghatározott másodlagos szerkezet

A tájkép tulajdonságaiA tájkép tulajdonságai

0 1 2 3 4 5 6 71E-5

1E-4

1E-3

0.01

0.1

1

fract

ion

of a

ll mut

ants

# of mutation from the original sequence

Perfect ribozyme Functional ribozyme

Neurospora VS Ribozyme

0 1 2 3 4 5 6 71E-5

1E-4

1E-3

0.01

0.1

1

fract

ion

of a

ll mut

ants

# of mutation from the original sequence

Perfect ribozyme Functional ribozyme

Hairpin Ribozyme

= 0.26 = 0.22