Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

INTRACELLULÁRIS/ NUKLEÁRIS RECEPTOR JELÁTVITEL

Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni EgyetemenAzonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Berki Tímea és Boldizsár FerencJelátvitel

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Történeti háttér

• G. T. Beatson skót sebész inoperábilis emlőrák regresszióját írja le ovariektómia után

• Az állatok kasztrációja javítja a hús minőségét• Ősi kínai orvoslás placenta extraktumot használ• 1926 Kendall ésReichstein kortizon és tiroxin• Butenandt/Doisy ösztrogén (terhes nő vizeletében)• Androszteron és progeszteron (sertés corpus

luteumból izolálták) • “estrus” ~ “oistros” (Greek) = bögöly• 1961 Jensen: ösztrogén receptor• 1980-as évek: ER, GR, TR klónozása (Chambon,

Evans és Vennström)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Hatásmechanizmus

• Nukleáris receptorok a sejtekben található fehérjék, amelyek a szteroid és thyroid hormonok és más lipofil molekulák érzékelését végzik

• Ligand kötődése a nukleáris receptorhoz annak konformációváltozását idézi elő, amely aktiválódva, transzkripciós faktorként viselkedik

• A receptor aktivációja gének átíródásának fokozását vagy gátlását eredményezi.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Transzkripciós faktorok

Transzkripciós faktorok: szekvencia-specifikus DNS-kötő faktorok• Szabályozzák a DNS genetikai

információjának átíródását mRNS-re• Aktivátorként hatnak (= segítik a

génexpressziót) vagy represszorok (= gátolják a génexpressziót) szabályozva az RNS polimeráz toborzását

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Transzkripciós faktorok vizsgálata

Transzkripciós faktor aktivitás:• Luciferáz teszt• Kromatin immunoprecipitáció (ChIP)• Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

Transzkripciós faktor interakció:• Ko-immunoprecipitáció

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Luciferáz riporter assay

1. A célsejt transzfekciója Luc Vectorral

2. A sejtek aktiválása

3. Signaling, TF aktiváció

4. Luciferáz szintézis

5. Fényelnyelődés mérése

Promóter Reporter gén

RNS polimeráz éstranszkcripciós faktorok

Transzkripció

mRNS

Transzláció

Reporter fehérje

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Ligandok

Lipofil hormonok: A keringésben transzport fehérjékhez kapcsolódnak; a plazmamembránon transzport fehérjéhez kötődve vagy passzívan lépnek át

17-b-ösztradiolÖsztrogén receptor

(ER)

TesztoszteronAndrogén receptor

(AR)

KortizolGlükokortikoid receptor

(GR)

KalcitriolD-vitamin receptor

(VDR)

Trijódtironin (T3)Tiroid hormon receptor

(TR)

A-vitaminRetinsav receptor

(RAR)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A nukleáris receptorok faji megoszlása

• A nukleáris receptorok állatokra jellemzőek, algákban, gombákban és növényekben nincsenek

• A C. elegans-nak 270 ismert receptora van • Számos orphan receptor létezik!!!• Az emberi nukleáris receptorok száma 48,

egérben és patkányban 49 illetve 47 nukleáris receptort találtak

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Intracelluláris receptorok

Szteroid hormon rec. Ösztrogén rec. (ER) Ösztradiol

Glükokortikoid rec. (GR) Kortizol

Mineralokortikoid rec. (MR) Aldoszteron

Androgén rec. (AR) Tesztoszteron

Progeszteron rec. (PR) Progeszteron

Tiroid hormon rec. Tiroid hormon rec. (TR) T3

Retinoid rec. Retinsav rec. (RAR) All-transz-retinsav

Retinsav X rec. (RXR) 9-cisz-retinsav

D-vitamin rec. D-vitamin rec. (VDR) 1,25-hidroxi-kolekalciferol

Lipid szenzorok Máj X rec. (LXR) Oxiszterolok

Farnesoid X rec. (FXR) Epesavak

PPAR Peroxiszóma proliferátor aktivált rec.

Zsírsavak, eicosanoidok (pl. LT-k, PG-k)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Nukleáris receptor családok

GR GR

Szteroid Recetorok

Glükokortikoid

Mineralokortikoid

Progeszteron

Androgén

GR

MR

PR

AR

Dimer „Orphan”- Árva Receptorok

RXR

COUP

HNF-4

TR2

TLX

GCNF

9-cisz RA

RXRRXR

Monomer „Orphan” - Árva Receptorok

NGFI-B

SF-1

Rev-erb

ROR

ERR

RXR

T3R

RAR

VDR

PPARa

PPARg

EcR

FXR

CAR

LXR

PXR/SXR

RXR Heterodimerek

Tiroid hormon

All-transz RA

1,2,5-(OH)2-VD

Zsírsavak

15d-Δ12,14-PGJ

Ekdizon

Epesav

Androsztán

Oxiszterol

Xenobiotikumok

RXR R

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A nukleáris receptorok szerkezeti felépítése

AF-1: aktivációs funkció 1 (ligand-független)AF-2: aktivációs funkció 2 (ligand-függő)

AF-1 AF-2

A/B C E FD

N-terminális domén Hinge régió C-terminális domén

DNS-kötő domén (DBD) Ligand-kötő domén (LBD)

Dimerizáció

200-250 aminosav, mérsékelten konzervált

50-500 aminosav, variábilis

70 aminosav, konzervált

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A szteroid receptorok hatás-mechanizmusai

HSPGRGRGR

HSP

GR

HRE

Ko-aktivátorRNS

polimerázGRGR

Ko-aktivátor

RNSpolimeráz

Ko-aktivátorRNS

polimerázRXR R

HRE

Ko-aktivátor

RNSpolimeráz

Ko-aktivátorRNS

polimeráz

HRE

RXRRXR

Ko-represszor

Hormon

Sejtmag

Plazma membrán

Citoplazma

Ko-represszorRXR R

HRE

Transzkripció Transzkripció Transzkripció

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A GC hatás időbeli lefolyása

GRE

Ezred-másodperc (?)

Másodpercek-percek (?)

Órák-napok

Ko-regulátorok

TF-ok

Sejtmag

Dimerizáció

Kötődés

Molekulák találkozása

?

?

Szabályozásszintjei

CBG kötésa vérben

MDR amembránban

Metabolizmus és anukleáris receptor

sorsa

Transzkripció

MR/GRSzteroid

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

NR-ok típusai

• I-típusú nukleáris receptorokhoz tartoznak a 3-as alcsoport receptorai, mint az androgén receptor, ösztrogén receptorok, glükokortikoid receptor és progeszteron receptor

• II-típusú nukleáris receptorokhoz főleg az 1-es alcsoport tartozik, mint a retinsav receptor, retinoid X receptor és tiroid hormon receptor

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

I-típusú receptor hatás

Sejtmag

Plazma membrán

Citoplazma

Hormon

HSPNR NR NR

HSP

NR

HRE

Ko-aktivátor

RNSpolimeráz

NRNR

Ko-aktivátor

RNSpolimeráz mRNS

Célgén

mRNS

Fehérje Megváltozott sejtműködés

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

I-típusú NR jellemzői

• Ligand hiányában a citoszolban találhatóak• Hormon kötődése a receptor disszociációját okozza a

hősokkfehérjéről (Hsp), majd annak dimerizációja után a receptor nukleáris transzlokációját

• A sejtmagban specifikus DNS szakaszokhoz (Hormone Response Element, HRE) kapcsolódik

• A NR-DNS komplex egyéb fehérjék toborzását indítja el, amelyek felelősek a transzkripció és új fehérjék transzlációjának elindításáért, amely végül a sejt funkciójának megváltozását eredményezi

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A citoplazmatikus receptor komplex

• Hsp90, 70, 40 + ko-chaperone p23 + immunophilin (pl. FKBP52): dynein-hez (motorfehérje) kapcsolja a komplexet

• Dinamikus összekapcsolódás-szétkapcsolódás

• Ligand-kötött receptorok a mikrotubulusok mentén transzportálódnak a nukleáris pórusokhoz

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

II-típusú receptor hatás

Ko-aktivátor

RSApolimeráz

RXR TR

HRE

Ko-represszor

Ko-aktivátor

RNSpolimeráz

Sejtmag

Plazma membrán

Citoplazma

mRNS

Célgén

mRNS

Fehérje

Megváltozott sejtműködés

Hormon

Ko-represszorRXR TR

HRE

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

II-típusú NR-ok

• A ligand jelenlététől függetlenül a sejtmagban helyezkednek el, általában hetero-dimer formában (általában RXRel) kapcsolódnak a DNS-hez

• Ligand hiányában a II-típusú nukleáris receptorok gyakran ko-represszor fehérjékkel kapcsolódnak

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Nukleáris receptor heterodimer formája

PPRgamma (zöld) és RXR alpha (kék) kettősszálú DNS-sel komplexben (lila), NCOA2 ko-aktivátor peptiddel (piros).

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

DNS kötés

DNS kötőhelyek (= Response Elements):• 2x6 bázispár• Szteroid rec. (homodimer): palindrom, invert

ismétlődő szakaszok 3bp spacer-rel elválasztva (IR3)– GR, MR, PR, AR: 5’-AGAACA-3’– ER: 5’-AGGTCA-3’

• Nem-szteroid rec.: 5’-AGGTCA-3’direkt ismétlődő szakaszok (DRn, n=spacerek száma)– homodimerek (pl. TR, VDR)– heterodimerek (pl. TR, VDR, RAR, LXR, FXR, PXR,

CAR, PPAR)

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A NR-ok genomikus hatása

Ligand

LBD

DBDRE

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A DNS-kötő domén (DBD) szerkezete

A humán progeszteron receptor DNS-kötő doménjének dimerje (kék és zöld) és kettősszálú DNS (lila) komplexe. A cinkatomokat szürke pontok jelölik.

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Gén szabályozás

Transzaktiváció:• Ligand-kötött receptor ko-aktivátorokat toboroz →

transzkripció aktiválása: interakció általános transzkripciós faktorokkal + kromatin felnyitása (ATP-dependens kromatin remodeling/hiszton acetiláció)

• Ligand-kötés → ko-represszor disszociáció → ko-aktivátor kötése

Transrepresszió: • Ligand hiányában a transzkripció folyamatos, ligand-

kötés gátolja a transzkripciót

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Transzrepresszió – ligand szelektivitás• Bizonyos nukleáris receptorok nemcsak közvetlenül

kapcsolódnak DNS szakaszokhoz, hanem képesek transzkripciós faktorokhoz is kötődni. Ez a kötődés általában a másik transzkripciós faktor inaktiválását eredményezi.

• Bizonyos GR ligandok, un. szelektív glükokortikoid receptor agonisták (SEGRA-k) képesek a GR-t úgy aktiválni, hogy az erősebb transzrepressziós, mint transzaktivációs hatású

• Ez a ligand-szelektivitás lehetővé teszi olyan ligandok kifejlesztését, amelyek erősebb gyulladásgátló hatásúak, kevesebb nemkívánatos metabolikus mellékhatást okozva

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A NR-ok szabályozása

A transzkripciós aktivitás növelése:• Foszforiláció:

– Ser maradványok az N-terminális A/B doménen – Ciklin-dependens kinázok– PKC, PKA– ERK– PKB/Akt– JNK/SAPK– p38-MAPK

• AF-1: CDK, ERK, JNK, p38-MAPK, PKB• AF-2: Src az ER-nál

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

A NR-ok szabályozása

A transzkripciós aktivitás gátlása:• A DNS-kötő domén (DBD) foszforilációja PKC vagy

PKA által

TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

Terápiás lehetőségek – hormon analógok• Glükokortikoidok: anti-inflammatorikus,

immunoszupresszív kezelések (pl. autoimmun betegségek, transzplantáció, egyes leukémiák)

• Szexuál szteroidok: szubsztitúciós terápia (endokrin betegségek), fogamzásgátlás, emlőrák

• Tiroxin: tiroidectomia után szubsztitúciós therápia • A/D-vitamin deficiencia