MỞ ĐẦU - cnsh.vnuf.edu.vncnsh.vnuf.edu.vn/documents/1235177/0/Cong nghe nuoi cay mo te bao thuc... · vật nhằm phục vụ sinh viên, học viên sau đại học và các

1

Cng ngh nui cy m t bo thc vt http://www.ebook.edu.vn

M U

Cng ngh sinh hc l s ng dng tng hp ca sinh ha hc, vi sinh vt hc v cc khoa hc v cng ngh t n s ng dng cng nghip cc nng lc ca vi sinh vt, ca cc t bo, cc t chc nui cy v cc thnh phn ca chng. Cng ngh sinh hc nh mt thn cy m nhng r chnh ca cy ny l vi sinh vt hc, di truyn hc, sinh ha hc, in t hc, nng hc, cng ngh hcv trn vm l vi hng nghn qu l cc loi sn phm phc v trng trt, chn nui, y hc, nng lng mi, vt liu mi, tuyn khong, bo v mi trng... Nh ng dng cc thnh tu mi m ca cng ngh sinh hc nh k thut nui cy m t bo, k thut ti t hp di truyn, ngi ta c th to ra c nhng ging cy trng khng nhng c nng sut cao m cn chng chu c vi su bnh, hn hn v iu kin ngho phn bn. Nh b qua c vic lai cho v khc phc c s tng khc sinh sn m vic lai to ging rt ngn c nhiu thi gian. K thut ti t hp AND v cc k thut in vitro m ra kh nng lai khc loi v lm tng nhanh tnh a dng di truyn. i vi cc loi cy trng c gi tr thng mi ln, k thut nui cy m em li nhng hiu qu kinh t ht sc r rt. Hin nay, ngi ta bt u ng dng kh nng nui cy t bo thc vt tch ri qui m cng nghip thu nhn cc sn phm, cc hot cht sinh hc c gi tr kinh t cao. Nui cy m t bo thc vt l mt ngnh khoa hc tr c nhiu trin vng, c ng dng nhiu trong cc lnh vc kinh t. thc c trin vng to ln ca ngnh khoa hc hin i ny, chng ti xin gii thiu quyn sch cng ngh nui cy m t bo thc vt nhm phc v sinh vin, hc vin sau i hc v cc c quan c lin quan .

Ni dung cun sch bao hm ton b nhng vn c bn trong ni dung cng ngh nui cy m thc vt. Chng ti xin cm n GS. Trn Vn Minh cung cp cho chng ti nhiu ti liu chnh bin son. Chng ti chn thnh cm n nh xut bn Khoa hc v K thut v ban bin tp cho xut bn cun sch c sm n vi bn c.

2


Phn 1. NUI CY T BO

Chng 1. GII THIU CHUNG V LCH S PHT TRIN

1.1. Gii thiu chung

Khi nim biotechnology - cng ngh sinh hc c xut nm 1917 bi mt k s ngi Hungari tn l Karl Erky m t qu trnh ch bin c ci lm ngun thc n phc v sn xut ln vi qui m ln. Theo Karl Erky, Biotechnology l t dng ch "Tt c nhng cng vic trong cc sn phm c sn xut ra t cc nguyn liu th vi s gip ca cc vt cht sng". Nm 1961 mt nh vi sinh vt hc ngi Thu in l Carl Goren Hedn ngh i tn tp ch khoa hc Journal of microbiological and Biochemical Engineering and technology thnh Biotechnology and Bioengineering ng ti cc nghin cu trong lnh vc vi sinh hc ng dng v ln men cng nghip. T , Biotechnology tr nn r rng v lun gn lin vi nhng nghin cu v "s sn xut cng nghip cc loi hng ho v dch v thng qua cc qu trnh c s dng cc c th, h thng sinh hc v ch bin". Cc nghin cu v cng ngh sinh hc c pht trin da trn cc lnh vc chuyn mn nh vi sinh, ho sinh v cng ngh ha hc. Cng ngh sinh hc theo W.H Stone (1987) c th nh ngha: L nhng cng ngh s dng cc c th sng hoc cc phn ca c th nh t bo, to ra hoc thay i cc sn phm nhm ci tin cc cy trng v vt nui, hoc pht trin cc vi sinh vt vo cc ng dng c hiu. Theo lin on cng ngh sinh hc chu u (EFB): Cng ngh sinh hc l ng dng tng hp ca sinh ho hc, vi sinh vt v cc khoa hc v cng ngh t ti s ng dng cng nghip cc nng lc ca vi sinh vt, ca cc t bo, cc t chc nui cy v cc thnh phn ca chng. n nay, nh ngha v cng ngh sinh hc c nhiu nh khoa hc cng nh nhiu nc trn th gii thng nht nh sau: Cng ngh sinh hc l cc qu trnh sn xut quy m cng nghip c s tham gia ca cc tc nhn sinh hc ( mc c th, t bo hoc di t bo) da trn cc thnh tu tng hp ca nhiu b mn khoa hc, phc v cho vic tng ca ci vt cht ca x hi v bo v li ch ca con ngi. Theo quan im hin i, cc tc nhn sinh hc tham gia vo qu trnh sn xut trn l nhng ging sinh vt mi hoc cc sn phm ca chng c to ra bng k thut di truyn hin i (cng ngh gen). T nh ngha c ng ny c th thy:

+ Cng ngh sinh hc khng phi l mt b mn khoa hc nh ton, l, ho, sinh hc phn t... m l mt phm tr sn xut.

3


+ Cng ngh sinh hc khng ch to ra thm ca ci vt cht, m cn hng vo vic bo v v tng cng cht lng cuc sng con ngi. + Thc t, cng ngh sinh hc mang tnh ng dng, tuy nhin hng lot k thut ca cng ngh sinh hc ang l nhng cng c sc bn nghin cu khoa hc sinh hc v lm sng t cc c ch ca cc hin tng sng mc phn t. nc ta, theo Ngh nh s 18/CP ca Chnh ph ngy 11/3/1994 v pht trin cng ngh sinh hc th: Cng ngh sinh hc l mt tp hp cc ngnh khoa hc (sinh hc phn t, di truyn hc, vi sinh vt hc, sinh ha hc v cng ngh hc) nhm to ra cc cng ngh khai thc quy m cng nghip cc hot ng sng ca vi sinh vt, t bo thc vt v ng vt.

- Khi nim v cng ngh sinh hc nng nghip (Agriculture Biotechnology) Theo Ngh nh s 18/CP ca Chnh ph ngy 11/3/1994 v pht trin cng ngh sinh hc Vit nam th: Cng ngh sinh hc l mt tp hp cc ngnh khoa hc (sinh hc phn t, di truyn hc, vi sinh vt hc, sinh ha hc v cng ngh hc) nhm to ra cc cng ngh khai thc quy m cng nghip cc hot ng sng ca vi sinh vt, t bo thc vt v ng vt. Vy, Cng ngh sinh hc nng nghip l mt tp hp cc ngnh khoa hc (sinh hc phn t, di truyn hc, vi sinh vt hc, sinh ho hc v cng ngh hc) nhm to ra cc cng ngh sn xut sn phm nng nghip quy m cng nghip. Chng ta c th hiu, cng ngh sinh hc nng nghip l mt nhnh ca cng ngh sinh hc m i tng phc v l sn xut nng nghip; c th l ng dng cc thnh tu chung ca cng ngh sinh hc phc v cho sn xut nng nghip ca con ngi Da vo vic ng dng thnh tu ca cng ngh sinh hc phc v cc chuyn ngnh khc nhau trong sn xut nng nghip m ngi ta c th chia cng ngh sinh hc nng nghip thnh 2 loi sau: - Cng ngh sinh hc trong trng trt (bao gm c trng cy lm nghip, cy dc liu) gm nui cy m t bo thc vt, nui cy ht phn, chuyn gen vo t bo thc vt ch... - Cng ngh sinh hc trong chn nui (bao gm c chn nui thu sn) gm nui cy m t bo ng vt, sn xut t bo gc, cy chuyn phi, nhn bn v tnh... Hin nay, t nhng thnh tu ca cng ngh sinh hc trong nui cy m t bo, nui cy ht phn v chuyn gen c th ng dng rt nhiu vo lnh vc trng trt, nh: - Nhn nhanh v tnh cc ging cy qu: t mt mu nui cy ngi ta c th to ra hng triu cy con nh nhau nu thi gian cy chuyn. Tuy nhin, h s cy chuyn ph thuc tu ging, cng cy chuyn nhiu ln cng to nhiu bin d. V d, cc nh khoa hc kt lun t mt chi da a vo nui cy trong ng nghim c th nhn ra hng triu cy da ging; t mt chi chui a vo nui cy c th nhn ra 2.000 cy

4


chui ging, nu qua s ny s c t l bin d cao. - Ci lng ging cy trng bng nui cy nh sinh trng (meristerm): phc trng nhng ging cy qu nhim virus ngi ta c th nui cy nh sinh trng nhn nhanh. Qua mt s ln nui cy theo kiu ny s to ra c nhng cy hon ton sch bnh t cy nhim virus. - To dng n bi t nui cy bao phn v nui cy t bo ht phn: Ngi ta ng dng k thut nui cy bao phn v ht phn to nhng cy n bi t bao phn hoc ht phn, sau lng bi ho v to thnh dng ng hp t. K thut ny thnh cng nhiu nhng cy h c. - Khc phc lai xa bng cch th phn trong ng nghim nh k thut nui cy phi: Nh nui cy trong ng nghim khc phc tnh bt hp giao t trc v sau khi th tinh i vi lai gia cc cy khc nhau kh xa v mt di truyn. - Lai v tnh cn gi l dung np t bo trn (Protoplast): Nh k thut nui cy m t bo thc vt m ngi ta to thnh cy lai t 2 ging khc nhau kh xa v mt di truyn bng cch dng cc enzim ho tan mng t bo ri cho cc t bo trn (khng cn mng) vo nui cy chung trong mi trng nhn to v chng pht trin thnh khi m so (callus), t chuyn khi callus ny sang cc mi trng phn ho chc nng t bo v nui cy thnh cy lai. - To ging cy trng mi bng k thut chuyn gen: Trn c s xc nh c tnh trng qu m gen quy nh, ngi ta c th chuyn nhng gen vo nhng cy trng khc vi mong mun to c nhng ging mi mang c tnh mong mun. 1.2. S lc lch s pht trin

Nm 1665, Robert Hooke quan st thy t bo sng di knh hin vi v a ra khi nim "t bo - Cell". Anton Van Leuwen Hoek (1632-1723) thit k knh hin vi khuych i c 270 ln, ln u tin quan st thy vi khun, t bo tinh trng trong tinh dch ngi v ng vt. Nm 1838, Matthias Schleiden v Theodore Schwann xng hc thuyt c bn ca sinh hc gi l Hc thuyt t bo:

+ Mi c th sng c cu to bi mt hoc nhiu t bo. + T bo l n v cu trc v chc nng c bn ca c th sng, l hnh thc nh nht ca s sng. + T bo ch c to ra t t bo tn ti trc . Nm 1875, Oscar Hertwig chng minh bng quan st trn knh hin vi rng s th

thai l do s hp nht ca nhn tinh trng v nhn trng. Sau , Hermann P., Schneider F.A v Butschli O. m t chnh xc qu trnh phn chia t bo. Nm 1883, Wilhelm Roux ln u tin l gii v phn bo gim nhim c quan sinh dc. T mt t bo thc vt nui cy in vitro c th ti sinh thnh mt c th sng hon chnh. Kh nng ny ca

5


t bo thc vt c gi l tnh ton nng. Nm 1902, Haberlandt ln u tin th nghim nui cy m cy mt l mm nhng khng thnh cng. Nm 1934, Kogl ln u tin xc nh c vai tr ca IAA, 1 hoocmon thc vt u tin thuc nhm auxin c kh nng kch thch s tng trng v phn chia t bo. Nm 1939, ba nh khoa hc Gautheret, Nobecourt v White ng thi nui cy m so thnh cng trong thi gian di t m thng tng (cambium) c rt v thuc l, m so c kh nng sinh trng lin tc. Nm 1941, Overbeek v cs s dng nc da trong nui cy phi non cy c rt Datura. Nm 1955, Miller v cs pht minh cu trc v sinh tng hp ca kinetin - mt cytokinin ng vai tr quan trng trong phn bo v phn ho chi m nui cy. n nm 1957, Skoog v Miller khm ph vai tr ca t l nng cc cht auxin: cytokinin trong mi trng i vi s pht sinh c quan (r hoc chi). Khi t l auxin/ cytokinin (v d: nng IAA/ nng kinetin) nh hn 1 v cng nh, m c xu hng to chi. Ngc li khi nng IAA/ nng kinetin ln hn 1 v cng ln, m c xu hng to r. T l nng auxin v cytokinin thch hp s kch thch phn ho c chi v r, to cy hon chnh. Nm 1949, Limmasets v Cornuet pht hin rng virus phn b khng ng nht trn cy v thng khng thy c virus vng nh sinh trng. Nm 1952, Morel v Martin to ra cy sch bnh virus ca 6 ging khoai ty t nui cy nh sinh trng. Ngy nay, k thut ny vi mt s ci tin tr thnh phng php loi tr bnh virus c dng rng ri i vi nhiu loi cy trng khc nhau. Nm 1952, Morel v Martin ln u tin thc hin vi ghp in vitro thnh cng. K thut vi ghp sau c ng dng rng ri trong to ngun ging sch bnh virus v tng t virus nhiu cy trng nhn ging bng phng php v tnh khc nhau, c bit l to ging cy n qu sch bnh. Nm 1960, Morel thc hin bc ngot cch mng trong s dng k thut nui cy nh sinh trng trong nhn nhanh cc loi a lan Cymbidium, m u cng nghip vi nhn ging thc vt. Nm 1960, Cocking ln u tin s dng enzym phn gii thnh t bo v to ra s lng ln t bo trn. K thut ny sau c hon thin tch nui t bo trn nhiu cy trng khc nhau. Nm 1971, Takebe v cs ti sinh c cy t t bo trn m tht l (mesophill cell) thuc l. Nm 1972, Carlson v cs ln u tin thc hin lai t bo sma gia cc loi, to c cy t dung hp t bo trn ca 2 loi thuc l Nicotiana glauca v N. langsdorfii. Nm 1978, Melchers v cs to c cy lai soma "C chua Thuc l" bng lai xa t bo trn ca 2 cy ny. n nay, vic ti sinh cy hon chnh t t bo trn hoc t lai t bo trn thnh cng nhiu loi thc vt.

6


Nm 1964, Guha v Maheshwari ln u tin thnh cng trong to c cy n bi t nui cy bao phn ca cy c Datura. K thut ny sau c nhiu tc gi pht trin v ng dng rng ri trong to dng n bi (1x), dng thun nh bi kp (2x), c nh u th lai (nui cy bao phn hoc ht phn ca dng lai F1 to ging thun mang tnh trng u th lai). Nm 1959, Tulecke v Nickell th nghim sn xut sinh khi m thc vt quy m ln (134 lt) bng nui cy chm. Nm 1977, Noguchi v cs nui cy t bo thuc l trong bioreactor dung tch ln 20,000 lt. Nm 1978, Tabata v cs nui t bo cy thuc quy m cng nghip phc v sn xut shikonin. H chn lc c dng t bo cho sn lng cc sn phm th cp (shikonin) cao hn. Nm 1985, Flores v Filner ln u tin sn xut cht trao i th cp t nhn nui r t Hyoscyamus muticus. Nhng r ny sn xut nhiu hot cht hyoscyamine hn cy t nhin. Hin nay, cng ngh nui cy t bo v m (v d, m r ca nhn sm) trong cc bioreactor dung tch ln c thng mi ho mc cng nghip sn xut sinh dc. Nm 1981, trn c s quan st cc bin d xy ra rt ph bin trong nui cy m v t bo vi ph bin d v tn s bin d cao, Larkin v Scowcroft a ra thut ng "bin d dng soma" (Somaclonal Variation) ch cc thay i di truyn tnh trng xy ra do nui cy m v t bo in vitro. T cc dng t bo hoc cy bin d di truyn n nh c th nhn nhanh, to ra cc dng v ging t bin c nng sut, hm lng hot cht hu ch cao, khng mt s cc iu kin bt li nh bnh, mn, hn,

n nay cc nh khoa hc khng nh rng mc thnh cng ca chuyn gen vo cy trng ph thuc rt nhiu vo h thng nui cy v ti sinh t bo thnh cy in vitro sau chuyn gen. Nm 1974, Zaenen v cs pht hin plasmid Ti ng vai tr l yu t gy u (crown gall) cy trng. Nm 1977, Chilton v cs chuyn thnh cng T-DNA vo thc vt. Nm 1979, Marton v cs xy dng quy trnh chuyn gen vo t bo trn bng ng nui cy t bo trn v Agrobacterium. Nm 1982, Krens chyn thnh cng DNA vo t bo trn. Nm 1985, Fraley v cs thit k vector plasmid Ti loi b cc gen c gy hi s dng cho vic thit k vector chuyn gen vo thc vt. Cng trong nm, Horsch v cs chuyn gen vo mnh l bng Agrobacterium tumefaciens v ti sinh cy chuyn gen. An v cs (1985) pht trin h thng hai vector cho chuyn gen thc vt. Nm 1987, Klein v cs s dng sng bn gen (particle gun) mang vi n trong chuyn gen v ti sinh c cy biu hin gen chuyn. Nm 1994, thng mi ho ging c chua chuyn gen 'FlavrSavr' Cc bc pht trintrong lch s cng ngh t bo thc vt c tm tt bng 1.1.

7


Bng 1.1. Nhng mc chnh trong lch s pht trin ca cng ngh t bo thc vt

Nm Nhng pht minh v s kin quan trng

1665 Robert Hooke quan st c t bo sng di knh hin vi v a ra khi nim t bo.

1838 Matthias Schleiden v Theodore Schwann xng hc thuyt t bo. Schleiden M. J., Arch. Anat., Physiol. U. wiss. Med. (J. Muller), 1838: 137-176; Schwann T., W. Engelman, No. 176 (1910).

1902 Haberlandt ln u tin th nghim nui cy m cy mt l mm nhng khng thnh cng. Haberlandt G., Sitzungsber Akad. Wiss. Wien, Math.-Naturwiss. Kl., 111: 69-92.

1904 Hannig tin hnh cc th nghim nui cy phi u tin cc loi h ci Crucifers. Hannig B., Bot. Zeitung, 62: 45-80.

1922 Cho ht phong lan ny mm in vitro. Knudson L., Bot. Gaz., 73: 1-25.

1924 Hnh thnh callus t r c rt trong mi trng c acid lactic. Blumenthal F. and Meyer P. Z. Krebsforsch. 21: 250-252.

1925 Lm ht phong lan ny mm in vitro. Knudson L., Bot. Gaz., 29: 345-379.

1929 Laibach s dng nui cy phi khc phc hin tng bt ho hp khi lai Linum spp. Laibach F., J Hered., 20: 201-208.

1934 White thnh cng khi nui cy m r c chua trong thi gian di. White P. R., Plant Physiol., 9: 585-600.

1934 Kogl ln u tin xc nh c vai tr ca IAA, 1 hoocmon thc vt u tin c kh nng kch thch s tng trng v phn chia t bo. Kogl F. et al., Z. Physiol. Chem., 228: 90-103.

1936 Nui cy phi cc loi cy ht trn khc nhau. LaRue C. R., Bull. Torrey Bot. Club, 63: 365-382

1939 Gautheret, Nobecourt v White ln u tin nui cy m so thnh cng trong thi gian di t m thng tng (cambium) c rt v thuc l. Gautheret R. J., C. R. Acad. Sci. (Paris), 208: 118-120; Nobecourt P., C. R. Soc. Biol. (Paris), 130: 1270-1271; White P. R., Am. J. Bot., 26: 59-64.

1941 Overbeek v cs s dng nc da trong nui cy phi non c rt. Overbeek

8


J. van et al., Science, 94: 350-351.

1942 Gautheret ln u tin theo di s hnh thnh cht trao i th cp trong

nui cy m so thc vt. Gautheret R. J. Bull. Soc. Chim. Biol. 41: 13..

44 Skoog ln u tin nghin cu s hnh thnh chi ph t nui cy m thuc l in vitro. Skoog F., Am. J. Bot., 31: 19-24.

1946 S to cy u tin t nh chi Lupinus v Tropaeolum. Ball E., Am. J. Bot., 33: 301-318.

1948 Hnh thnh chi ph v r thuc l. Skoog F. and Tsui C., Am. J. Bot., 355: 782-787.

1950 Ln u tin nui cy thnh cng cy mt l mm bng nc da. Morel G. C. R. Acad. Sci., 230: 2318-2320.

1951 Nitsch ln u tin nghin cu nui cy non tch ri in vitro. Nitsch J. P., Am. J. Bot., 38: 566-577.

1951 Skoog nghin cu s dng cc ho cht iu ho sinh trng v pht sinh c quan. Skoog F., Annee Biol., 26: 545-562.

1952 Morel v Martin ln u tin to c cy Dahlia sch virus bng nui cy nh sinh trng. Morel G. and Martin C., C. R. Hebd. Seances Acad. Sci. (Paris), 235: 1324-1325.

1952 Morel v Martin ln u tin thc hin vi ghp in vitro thnh cng. Morel G. and Martin C., C. R. Acad. Sci. (Paris), 235: 1324-1325.

1953 Tulecke ln u tin thnh cng trong nui cy bao phn v to m so n bi t ht phn Ginkgo biloba. Tulecke W. R.., Science, 117: 599-600.

1954 Muir v cs ln u tin to c m so t m nui dng (nurse culture). Muir W. H. et al., Science, 119: 877-878.

1955 Miller v cs pht minh cu trc v con ng sinh tng hp kinetin. Miller C. et al., J. Am. Chem. Soc., 77: 1392 & 2662-2663.

1957 Skoog v Miller khm ph vai tr t l nng cc cht auxin : cytokinin trong mi trng i vi s pht sinh c quan (r hoc chi). Skoog F. and Miller C. O., In vitro Symp. Soc. Exp. Biol., No. 11: 118-131.

9


1957 Vasil nghin cu nui cy bao phn tch ri Allium cepa. Vasil I. K., Phytomorph., 7: 138-149.

1958 Maheshwari thc hin nui cy non tch ri in vitro cy anh tc Papaver somniferum. Maheshwari N., Science, 127: 342.

58 Maheshwari ti sinh thnh cng phi soma t phi tm (nucella) trong nui cy non Citrus. Maheshwari P. and Rangaswamy N. S., Ind. J. Hort., 15: 275-281.

1959 Tulecke v Nickell th nghim sn xut sinh khi thc vt quy m ln (134 L) bng nui cy chm. Tulecke W. and Nickell L. G., Science, 130: 863-864.

1959 Reinert v Steward ln u tin to c phi v tnh t nui cy m c rt.

1960 Kanta ln u tin thc hin th tinh trong ng nghim Papaver rhoeas. Kanta K., Nature, 188: 683-684.

1960 Cocking ln u tin s dng enzym phn gii thnh t bo to ra s lng ln t bo trn. Cocking E. C., Nature, 187: 927-929.

1960 Morel ln u tin thnh cng trong nui cy m nh sinh trng nhn nhanh phong lan. Morel G., Am. Orchid Soc. Bull., 29: 495-497.

1962 Murashige v Skoog pht minh mi trng nui cy m t bo thc vt- mi trng MS. Murashige T. and Skoog F., Physiol. Plant., 15: 473-497.

1964 Guha v Maheshwari ln u tin thnh cng trong to c cy n bi t nui cy bao phn ca cy c rt. Guha S. and Maheshwari S. C., Nature, 204: 497 and Nature, 212: 97-98 (1966).

1967 Bourgin v Nitsch to cy n bi t ht phn thuc l. Bourgin J. P. and Nitsch J. P., Ann. Physiol. Veg., 9: 377-382 & 10: 69-81.

1969 Phn lp t bo trn t nui cy t bo dch lng (huyn ph) ca Hapopappus gracilis. Ericksson T. and Jonassen K., Planta, 89: 85-89

1970 Chon lc t bin sinh ho thuc l. Carlson P. S., Science, 168: 487-489.

1971 Takebe v cs ti sinh c cy t t bo trn m tht l thuc l. Takebe I. et al., Naturewiss., 58: 318-320.

1972 Carlson v cs to c cy t lai xa t bo trn u tin nh dung hp t bo trn ca 2 loi thuc l Nicotiana glauca v N. langsdorfii. Carlson P. S. et al., P. N. A. S. (USA), 69: 2292-2294.

10


1973 Pht hin cytokinin c kh nng ph ng Gerberas. Pierik R. L. M. et al., Sci. Hort., 1: 117-119.

1974 Zaenen v cs pht hin plasmid Ti ng vai tr l yu t gy u (crown gall) cy trng. Zaenen I. et al., J. Molec. Biol., 86: 109-127; Larebeke N. van et al., Nature, 252: 169-170.

1974 Melchers v Lalib to c cy a bi t dung hp t bo trn n bi. Melchers G. and Lalib G., Mol. Gen. Genet. 135: 277-294.

1975 Gengenbach v Green chn lc dng t bo khng bnh nm Helminthosporium maydis trong nui cy m so ng. Gengenbach B. G. and Green C. E., Crop Sci., 15: 645-649.

1977 Chilton v cs chuyn thnh cng T-DNA vo thc vt. Chilton M. D. et al., Cell, 11: 263-271.

1977 Noguchi v cs nui cy t bo thuc l trong bioreactor 20,000 L. Noguchi M. et al., Plant Tissue Culture & its Biotechnological Application, Springer Verlag, Berlin,: 85-94.

1978 Melchers v cs to c cy lai soma c chua- thuc l bng dung hp t bo trn. Melchers G. et al., Carlsburg Res. Comm., 43: 203-218.

1978 Tabata v cs nui t bo thc vt quy m cng nghip phc v sn xut shikonin (chn lc dng t bo cho sn lng cc sn phm th cp cao hn). Tabata M. et al., Frontiers of Plant Tissue Culture 1978, Univ. Calgary Press, Calgary,: 213-222.

1979 Marton v cs xy dng quy trnh chuyn gen vo t bo trn bng ng nui cy t bo v Agrobacterium. Marton L. et al., Nature, 277: 129-131

1980 Alfermann v cs s dng cc t bo nui cy trong chuyn ho sinh hc digitoxin thnh digoxin. Alfermann A. W. et al., Planta Medica, 40: 218.

1981 Larkin v Scowcroft a ra thut ng "bin d soma" ch cc thay i di truyn tnh trng xy ra do nui cy m v t bo in vitro. Larkin P. J. and Scowcroft W. R., Theor. Appl. Gen., 60: 197-214.

1982 Krens chyn DNA vo t bo trn. Krens F. A. et al., Nature, 296: 72-74.

11


1982 Zimmerman s dng k thut xung in trong dung hp t bo trn. Zimmermann U., Biochim. Biophys. Acta, 694: 227-277.

1983 Cng ty Mitsui Petrochemicals ln u tin sn xut cht trao i th cp trn quy m cng nghip bng nui cy t bo dch lng Lithospermum spp. Mitsui Petrochemicals.

1983 Zambryski v cs thit k cc vector chuyn gen thng qua Agrobacterium. Zambryski P. et al., EMBO J., 2: 2143-2150.

1984 Chuyn gen vo t bo trn thuc l Nicotiana bng ADN plasmid v ti sinh cy chuyn gen. Paszkowski J. et al., EMBO J., 3: 2717-2722.

1985 Fraley v cs thit k vector Ti plasmid loi b cc gen c gy hi cho vic chuyn gen vo thc vt. Fraley R. T. et al., Bio/Technol., 3: 629-635.

1985 Horsch v cs chuyn gen vo mnh l bng Agrobacterium tumefaciens v ti sinh cy chuyn gen. Horsch R. B. et al., Science, 227: 1229-1231.

1985 An v cs pht trin h thng hai vector cho chuyn gen thc vt. An G. et al., EMBO J., 4: 277-284.

1985 Chuyn gen vo t bo trn cy mt l mm v hai l mm bng phng php in thm. Fromm M. E., P. N. A. S. (USA), 82: 5824-5828.

1985 Flores v Filner ln u tin sn xut cht trao i th cp t nhn nui r t Hyoscyamus muticus. Nhng r ny sn xut nhiu hot cht hyoscyamine hn cy t nhin. Flores H. E. and Filner P., Primary & Secondary Metabolism of Plant Cell Cultures. Springer Verlag, (Eds. Neumann K. H., Barz W. and Reinhard E.): 174-186.

1986 Crossway v cs chuyn gen vo t bo trn thuc l bng vi tim AND trc tip. Crossway A. et al., Mol. Gen. Genet., 202: 179-185.

1987 Klein v cs s dng sng bn gen (Particle gun) mang vi n trong chuyn gen v ti sinh cy biu hin gen chuyn. Klein T. M. et al., Nature, 327: 70-73.

1987 Bytebier v cs ln u tin chuyn gen vo cy mt l mm (Asparagus) bng Agrobacterium tumefaciens. Bytebier B. et al., P. N. A. S. (USA), 84: 5345-5349.

1988 Klein v cs ti sinh cy chuyn gen n nh thng qua phng php bn gen. Klein T. M. et al., P. N. A. S. (USA), 85: 4305-4309.

12


1991 Sn xut cy mang gen u tin thng Larix decidua bng chuyn gen qua Agrobacterium rhizogenes. Huang Y. et al., In vitro Cell Dev. Biol., 27: 201-207.

1992 La khng cht dit c nh chuyn gen vo t bo trn thng qua PEG. Dutta S. K. et al., Plant Mol. Biol., 20: 619-629.

1993 Kranz v Lorz thc hin th tinh in vitro to ra v nui cy phi hp t ng. Cc qu trnh pht trin v phn ho ca phi sau c quan st di knh hin vi v phn tch biu hin ca gen nhm xc nh cc gen tham gia trong tng giai on pht trin ca phi. Kranz E. and Lorz H., The Plant Cell, 5: 739-746.

1994 Thng mi ho ging c chua chuyn gen 'Flavr-Savr'

1998 Hamilton v cs pht trin vector mang NST nhn to ca hai vi khun (BBIC) cho chuyn gen thng qua Agrobacterium (kh nng chuyn 150 kb). Hamilton C. M. et al., P. N. A. S. (USA), 93: 9975-9979

1.3 S lc cc k thut dng trong nui cy m

1.3.1. Nui cy phi.

S ghi nhn u tin v nui cy phi l cng trnh ca Charles Bonnet th k XVIII. ng tch phi Phascolus v Fagopyrum trong trong t v nhn c cy nhng l cy ln. T u th k XX cc cng trnh nui cy phi dn c hon thin hn. T cc cng trnh nghin cu trc , Knudson (1922) nui cy thnh cng phi cy lan trong mi trng cha ng v khm ph ra mt iu l nu thiu ng th phi khng th pht trin thnh protocom.

Raghavan ( 1976, 7980) cng b rng phi pht trin qua hai giai on d dng v t dng. giai on d dng ( tin phi) cn c cc cht iu ho sinh trng pht trin. Trong giai on t dng s pht trin ca phi khng cn cht iu ho sinh trng.

i vi nui cy phi, nh bit ng ng vai tr rt quan trng. Trong nhiu trng hp th ng sucrose cho kt qa tt hn cc ng khc. Ngoi ra mt s cht t nhin nh nc da, nc chit malt, casein thu phn, l nhng cht rt cn trong nui cy phi. Cc cht kch thch sinh trng nh GA3, auxin, cytokinine thng c

13


dng nhiu trong nui cy phi. Auxin thng dng nng thp. Kinetin c vai tr c bit cho s pht trin ca phi.

Cc yu t ngoi cnh nh nhit , nh sng cng nh hng n s pht trin ca phi nui cy in vitro. Thng phi nui cy cn nhit v nh sng thp hn phi pht trin t nhin.

1.3.2. Nui cy m v c quan tch ri

Wetmore (1946) nui cy nh chi cy nho di, cng vi mt s tc gi khc, ng chng minh cc b phn ca cy u c th nui cy khi gp iu kin thun li. Lon v Ball (1946) vi th nghim nui cy nh chi cy mng ty cho thy khi nui cc b phn ca cy nh l, thn, hoa th kh nng to m so nhiu hn.

Nhu cu dinh dng khi nui cy cc b phn khc nhau ca cy l khc nhau nhng c th thy mt s yu cu chung nh ngun cacbon di dng ng v cc mui ca cc nguyn t a lng ( nito, phospho, kali, calxi) v vi lng ( Mg, Fe, Mn, Co,Zn,...). Ngoi ra cn mt s cht c bit nh vitamin (B1, B6, B3, ...) v cc cht iu ho sinh trng. Mun duy tr sinh trng v pht trin ca c quan nui cy cn thng xuyn cy chuyn qua mi trng mi.

i vi nui cy m, ngoi nhng thnh phn dinh dng nh i vi nui cy c quan tch ri, cn b sung thm cc cht hu c cha t nit di dng acide amine, ng v inositol. Trong trng hp nui cy m, cc cht iu ho sinh trng c vai tr quan trng hn v cc m tch ri khng c kh nng tng hp cc cht ny.

1.3.3. Nui cy m phn sinh

M phn sinh thng l cc m nh chi v cnh c kch thc 0,1mm 1cm. Cc m phn sinh dng nui cy thng tch t cc mm non, cc chi mi hnh thnh hoc cc cnh non.

i vi nui cy m phn sinh s cn bng gia cc cht iu ho sinh trng rt quan trng. Mun kch thch to chi cn b sung cytokinine hoc t hp cytokinine vi auxin. Mun to r th b sung cc auxin nh NAA, IAA,...

Nui cy m phn sinh c s dng loi virus to cy sch virus v nhn ging in vitro. Nui cy m phn sinh cn c s dng nghin cu qu trnh hnh thnh c quan, to cy a bi qua x l colchicin.

1.3.4. Nui cy bao phn

K thut nui cy bao phn pht trin v hon thin nh cng trnh nghin cu ca Bourgin v Nitsch (1967) trn cy thuc l, Niizeki v Oono (1968) trn la.T cui

14


nhng nm 1970 nhn c cy n bi t nui cy bao phn trn 30 loi cy. Kt qu nghin cu ca nhiu tc gi cho thy ht phn nui cy c th pht trin thnh cy n bi hon chnh trong iu kin nui cy in vitro bng con ng to phi trc tip hoc gin tip thng qua to m so v to c quan.

Hnh 1.1 Mt s k thut dng trong nui cy m t bo thc vt

A. M so t Catharanthus roseus. (B)Nui cy dch t bo t Coryphanta spp. (C) Nt sn C. roseus. (D) u r t C. roseus. (E)Ti sinh cy t C. roseus callus. (F) Protoplasts t Coffea arabica (G) Vi nhn ging ca Agave tequilana. (H) Phi v tnh ca cy Coffea canephora. (I) Nui cy r cy Psacalium decompositum.

1.3.5. Nui cy t bo n

Ngoi kh nng nui cy cc c quan v m thc vt, t bo thc vt c th c tch v nui ring r trong mi trng ph hp. Nhng cng trnh v nui cy t bo n c tin hnh t nhng nm 50 ca th k XX.

T bo n c th nhn c bng con ng nghin m, hoc x l enzym. Mi lai cy, mi loi t bo khc nhau i hi nhng k thut nui cy khc nhau.

Nui cy t bo n c s dng nghin cu cu trc t bo, nghin cu nh hng ca cc iu kin khc nhau ln cc qu trnh sinh trng, pht trin v phn ho ca t bo. Nui cy t bo n cn c s dng trong chn dng t bo.

15


1.3.6. Nui cy protoplast

Nui cy protoplats c pht trin nh cng trnh ca Cocking (1960). ng l ngi u tin dng enzym thu phn thnh t bo v tch c protoplast t t bo r c chua. Trong iu kin nui cy ph hp protoplast c th ti sinh thnh t bo mi, phn chia v ti sinh thnh cy hon chnh.

Do khng c thnh t bo nn protoplast tr nn mt i tng l tng trong nghin cu bin i di truyn thc vt. Bng phng php dung hp hai protoplast c th to ra cc cy lai soma. Ngoi ra cn c th s dng k thut dung hp protoplast chuyn cc bo quan v chuyn gene.

16


Chng 2. NHNG KHI NIM C BN

2.1. Hc thuyt t bo

Nm 1662, Robert Hooke thit k knh hin vi n gin u tin v quan st c cu trc ca ming bc bn bao gm nhiu ht nh, ng gi cc ht nh l t bo (cells). Nm 1675, Anton Van Leeuwenhoek xc nhn c th ng vt cng bao gm cc t bo. ng quan st di knh hin vi thy mu ng vt c cha cc hng cu v ng gi l cc t bo mu. Nhng mi n nm 1838, Matthias Jacob Schleiden (nh thc vt hc) v 1839, Theodor Schwann (nh ng vt hc) mi chnh thc xy dng hc thuyt t bo. Schleiden v Schwann khng nh rng: Mi c th ng thc vt u bao gm nhng th tn ti hon ton c lp, ring r v tch bit, chnh l t bo. C th ni Schleiden v Schwann l hai ng t ca hc thuyt t bo. Tuy nhin, c hai ng khng phi l cc tc gi u tin pht biu mt nguyn tc no , m ch l din t nguyn tc y r rng v hin nhin ti mc n c ph bin rng ri v cui cng c a s cc nh sinh hc thi y tha nhn.

2.1.1. Tnh ton th ca t bo (cell totipotency).

Haberlandt (1902) l ngi u tin xng ra phng php nui cy t bo thc vt chng minh cho tnh ton th ca t bo. Theo ng mi mt t bo bt k ca mt c th sinh vt a bo u c kh nng tim tng pht trin thnh mt c th hon chnh.Nh vy mi t bo ring r ca mt c th a bo u cha y ton b lng thng tin di truyn cn thit ca c sinh vt v nu gp iu kin thch hp th mi t bo c th pht trin thnh mt c th sinh vt hon chnh. Hn 50 nm sau, cc nh thc nghim v nui cy m v t bo thc vt mi t c thnh tu chng minh cho kh nng tn ti v pht trin c lp ca t bo. Tnh ton th ca t bo thc vt c tng bc chng minh. Ni bt l cc cng trnh: Miller v Skoog (1953) to c r t mnh m ct t thn cy thuc l, Reinert v Steward (1958) to c phi v cy c rt hon chnh t t bo n nui cy trong dung dch, Cocking (1960) tch c t bo trn v Takebe (1971) ti sinh c cy hon chnh t nui cy t bo trn ca l cy thuc l. K thut to dng (cloning) cc t bo n c phn lp trong iu kin in vitro chng minh mt thc t rng cc t bo soma, di cc iu kin thch hp, c th phn ha pht trin thnh mt c th thc vt hon chnh. S pht trin ca mt c th trng thnh t t bo n (hp t) l kt qu ca s hp nht s phn chia v phn

17


ha t bo. biu hin tnh ton th, cc t bo phn ha u tin tri qua giai on phn phn ha (dedifferentiation) v sau l giai on ti phn ha (redifferentiation). Hin tng t bo trng thnh tr li trng thi phn sinh v to ra m callus khng phn ha (undifferentiation) c gi l phn phn ha, trong khi kh nng cc t bo phn phn ha to thnh cy hon chnh (whole plant) hoc cc c quan thc vt c gi l ti phn ha. ng vt, s phn ha l khng th o ngc tr li. Nh vy, s phn ha t bo l kt qu c bn ca s pht trin nhng c th bc cao, n thng c gi l cytodifferentiation.

2.1.2. Th bi v gen

Gen quyt nh cc tnh trng thc vt. C tnh trng tng ng vi mt gen nhng cng c nhiu tnh trng lin quan n nhiu gen, cc tnh trng gi l tnh trng n gen v tnh trng a gen.

Hai gen nm trn mt v tr nht nh trn nhim sc th tng ng gi l allen. Tuy cng tham gia quyt nh mt tnh trng nhng mi allen qui nh mt c im ring. V d mu hoa, mt allen c th mang thng tin di truyn cho hoa mu , allen kia cho hoa mu trng.Trng hp ny ta c c th d hp t v tnh trng mu hoa, nu c 2 allen u mang thng tin di truyn cho mu th ta c c th ng hp t. i vi c th d hp t, mt allen c th l allen tri, allen cn li l allen ln. Allen tri quyt nh tnh trng. C trng hp tri hon ton v tri khng hon ton. Tri khng hon ton khi t hp 2 allen s cho tnh trng trung gian.

Th bi l danh t ch s b nhim sc th c trong t bo, m, c th thc vt vi qui nh chung l cc t bo sinh sn c 1 b nhim sc th c gi l th n bi. Hp t, sn phm dung hp ca 2 giao t n bi, c th l nh bi vi s nhim sc th 2n. Tt c cc t bo soma hnh thnh do s phn chia hp t u l nh bi. Trn thc t c th tm thy cng lc nhiu mc bi th khc nhau cc m khc nhau ca c th thc vt.(4n, 8n) l hin tng a bi ha do ni gim phn. Khong mt na thc vt bt cao mc a bi th. S nhim sc th c bn ca loi l X ( l s n bi nh nht trong dy a bi), cc c th c X nhim sc th c gi l th nht bi phn bit vi th n bi.

V d : cy la m c 2n=42 . Trn thc t n l th lc bi 6X, trong s nhim sc th c bn ca loi l X=7. Th n bi ca cy la c n=3X=21 nhim sc th.

2.1.3.Th bo t v th giao t

Th bo t gm c hp t v tt c cc t bo sn sinh t hp t k c ht phn trong ti phn v non.

18


Th giao t gm c ht phn ny mm v tt c cc t bo do n sn sinh ra, bao gm cc giao t. Khi 2 giao t khc ging dung hp, th bo t 2n c ti lp. thc vt bc cao, th giao t thng khng qu 3 t bo trong 2 t bo l cc giao t. cc loi thc vt mc th bi dao ng theo chu trnh sau:

S 2.1. Chu trnh dao ng mc bi th

thc vt bc cao, th giao t ( trong cc trng hp c bit, c th pht trin thnh bo t n bi) cha n nhim sc th. Th bo t n bi c th ra hoa nhng cc bo t hnh thnh khng c sc sng. To th bo t n bi v nhng cy n bi kp l mc ch ca nui cy ti phn v ht phn.

2.1.4. Sinh sn hu tnh v sinh sn v tnh

Sinh sn v tnh l hin tng 1 c th to ra cc c th mi t mt phn c quan sinh dng ca mnh, khng h c s tham ca cc yu t quy nh gii tnh, c th con sinh ra hon ton ging ht c th m. Sinh sn v tnh c rt nhiu hnh thc. sinh vt n bo c phn i t bo. Mt s c th a bo bc thp th mt t bo sinh dng phn chia to ra mt nhnh mi v sau tch ra khi c th chnh nh thy tc chng hn, cng c th mt mu ca c th m t ra ri n mc ra mt c th khc kiu nh to lam. Mt s khc th c hn mt loi t bo sinh sn ring nhng m vn hon ton khng c tnh cht gii tnh g c m ch l t c th m to ra m thi. chnh l hin tng sinh sn v tnh bng bo t. Bo t cc c th n bo c th l khi mi trng bt li th chng t rt nc ra khi t bo, tr thnh dng tim sinh i thi c sng li. sinh vt a bo th ti ng cc t bo gi l bo t v tnh. n ma sinh sn chng s pht tn cc t bo ra mi trng xung quanh. Khi gp iu kin thun li th mi bo t to ra mt c th mi. thc vt th khc, n tn ti c hai kiu sinh sn v

Th bo t (2n)

Th tinh

Bo t (n)

giao t (n) Th giao t (n)

Gim phn

Th bo t n bi (n)

19


tnh v hu tnh. Sinh sn v tnh y cng l t mt phn ca c th m tch ra v to ra mt c th mi. Sinh sn hu tnh phi c s tham gia ca cc yu t quy nh gii tnh, bao gm c v ci. Cc yu t ny c th trn cng mt c th hay khc c th, bn cht ca cc yu t l do cc nhim sc th gii tnh quy nh. Sinh sn hu tnh cng c nhiu kiu. Kiu s khai nht l tip hp, l hin tng hai t bo c, ci trao i nhn cho nhau. Sau l sinh sn hu tnh bng bo t nh ru, dng x,... Ln ti nhng lp trn th l th tinh vi s tham gia ca cc giao t c v ci, mi loi giao t nm cc t bo khc nhau.

2.2. T bo thc vt.

C th sng cu to t mt t bo n c hoc mt phc hp cc t bo. T bo rt a dng, khc nhau v hnh thi, kch thc, cu trc v chc nng. T bo ng vt v t bo thc vt l nhng bin i ca cng mt kiu c s ca n v cu trc. Trn c s hc thuyt t bo c hnh thnh do Mathias Schleiden v Theodor Schawn vo na u th k XIX. Thut ng t bo ln u tin c Robert Hooke t ra vo nm 1665 da trn nhng quan st cc khoang nh c vch bao quanh ca nt bn v v sau ng cn quan st thy trn m ca nhiu cy khc. Ni cht ca t bo v sau mi c pht hin v c gi l cht nguyn sinh, cn thut ng th nguyn sinh l do Hanstein xng nm 1880 ch cht nguyn sinh c trong 1 t bo n c. Nhn c Robert Brown pht hin nm 1831.

Mi t bo l mt h thng m, t duy tr v t sn xut: t bo c th thu nhn cht dinh dng, chuyn ha cc cht ny thnh nng lng, tin hnh cc chc nng chuyn bit v sn sinh th h t bo mi nu cn thit. Mi t bo cha mt bn mt m ring hng dn cc hot ng trn.

Mi t bo u c mt s kh nng sau: - Sinh sn thng qua phn bo - Trao i cht t bo bao gm thu nhn cc vt liu th, ch bin thnh cc thnh

phn cn thit cho t bo, sn xut cc phn t sinh nng lng v cc sn phm ph. thc hin c cc chc nng ca mnh, t bo cn phi hp thu v s dng c ngun nng lng ha hc d tr trong cc phn t hu c. Nng lng ny c gii phng trong cc con ng trao i cht

- Tng hp cc protein, y l nhng phn t m nhim nhng chc nng c bn ca t bo, v d nh enzyme. Mt t bo ng vt thng thng cha khong 10,000 loi protein khc nhau.

20


- p ng vi cc kch thch, hoc thay i ca mi trng bn trong v bn ngoi nh nhng thay i v nhit , pH hoc ngun dinh dng.

- Di chuyn cc ti tit.

2.2.1. Cu trc ca t bo thc vt

Cc t bo thc vt cc c th khc nhau, hoc cc m, cc c quan khc nhau ca cng mt c th s khng ging nhau v hnh dng, kch thc v cu trc nhng v bn cht c bn cc t bo u c mt s c im chung.

T bo thc vt chia lm 2 phn chnh: Thnh t bo v phn nguyn sinh cht, y l phn quyt nh nhng c tnh sng ch yu ca t bo thc vt.

Hnh 2.1. M hnh cu trc t bo thc vt in hnh

Mi t bo u c mng t bo, dng bao bc t bo, cch bit thnh phn ni bo vi mi trng xung quanh, iu khin nghim ngt s vn chuyn vo v ra ca cc cht, duy tr in th mng v nng cc cht bn trong v bn ngoi mng. Bn trong mng l mt khi t bo cht c (dng vt cht chim ton b th tch t bo). Mi t bo u c cc phn t DNA, vt liu di truyn quan trng v cc phn t RNA tham gia trc tip qu trnh tng hp nn cc loi protein khc nhau, trong c cc enzyme. Bn

21


trong t bo, vo mi thi im nht nh t bo tng hp nhiu loi phn t sinh hc khc nhau.

2.2.1.1. Thnh t bo

Thnh t bo l cu trc thit yu i vi nhiu qu trnh sinh l v pht trin ca thc vt. L lp v bao bc, thnh t bo c vai tr nh b khung xng qui nh hnh dng t bo. Thnh t bo c mi quan h mt thit n th tch v p sut ca t bo do rt cn thit cho qu trnh trao i nc bnh thng thc vt. Thnh t bo thc vt tham gia xc nh di c hc ca cu trc thc vt, cho php chng sinh trng n mt cao kh ln.

S a dng v chc nng ca thnh t bo bt ngun t s a dng v phc tp trong cu trc ca chng. Nhn chung cc thnh t bo c chia thnh hai nhm chnh: thnh s cp v thnh th cp. Thnh s cp hnh thnh bi cc t bo ang tng trng v thng c coi l tng i cha bit ha. Thnh th cp c hnh thnh sau khi t bo ngng tng trng, c mc chuyn ha cao c v thnh phn v cu trc. Trong thnh t bo s cp cc vi si xeluloza c gn cht trong mt mng li hydrat ha cao. Mng li ny bao gm s cc nhm polisaccarit thng l hemixenluloza v pectin cng 1 lng nh protein cu trc.

B khung t bo l mt thnh phn quan trng, phc tp v linh ng ca t bo. N cu thnh v duy tr hnh dng t bo; l cc im bm cho cc bo quan; h tr qu trnh thc bo (t bo thu nhn cc cht bn ngoi); v c ng cc phn t bo trong qu trnh sinh trng v vn ng. cc protein tham gia cu thnh b khung t bo gm nhiu loi v c chc nng a dng nh nh hng, neo bm, pht sinh cc tm mng.

2.2.1.2. Cc bo quan

Khng bo Khng bo l mt khoang ln nm trong trung tm cht nguyn sinh ca t bo.

Nhng t bo thc vt trng thnh thng c mt khng bo ln cha y nc v chim t 80-90% th tch t bo. Khng bo c bc trong mt lp mng gi l mng khng bo (tonoplast). Trong khng bo cha nc, cc mui v c, ng, cc enzim v nhiu cht trao i th cp.

Mng sinh cht Ranh gii gia thnh t bo vi cht nguyn sinh cng nh gia cht nguyn sinh

vi khng bo c hnh thnh bi cc mng. Mng sinh cht ngn cch cht nguyn sinh vi mi trng xung quanh nhng cng cho php cht nguyn sinh c th hp th hay o thi cc cht khc ra khi t bo.

22


Mng t bo - Tm o ngoi

V bc bn ngoi ca mt t bo eukaryote gi l mng sinh cht (plasma membrane). Mng ny cng c cc t bo prokaryote nhng c gi l mng t bo (cell membrane). Mng c chc nng bao bc v phn tch t bo vi mi trng xung quanh. Mng c cu thnh bi mt lp lipid kp v cc protein. Cc phn t protein hot ng nh cc knh vn chuyn v bm c nm khm vo lp lipid mt cch linh ng (c th di chuyn tng i). V bc bn ngoi ca mt t bo eukaryote gi l mng sinh cht (plasma membrane).

Mng li ni cht Mng ni cht l mt h thng mng phc to,th hin trn bn ct ngang l h thng

cc ti dp hoc cc ng nh gm hai lp mng v gia l mt khong hp T bo cht Bn trong cc t bo l mt khng gian cha y dch th gi l t bo cht

(cytoplasm). N bao hm c hn hp cc ion, cht dch bn trong t bo v c cc bo quan. Cc bo quan bn trong t bo cht u c h thng mng sinh hc phn tch vi khi dung dch ny. Cht nguyn sinh (cytosol) l ch ring phn dch th, ch khng c cc bo quan.i vi cc sinh vt prokaryote, t bo cht l mt thnh phn tng i t do. Tuy nhin, t bo cht trong t bo eukaryote thng cha rt nhiu bo quan v b khung t bo. Cht nguyn sinh thng cha cc cht dinh dng ha tan, phn ct cc sn phm ph liu, v dch chuyn vt cht trong t bo to nn hin tng dng cht nguyn sinh. Nhn t bo thng nm bn trong t bo cht v c hnh dng thay i khi t bo di chuyn. T bo cht cng cha nhiu loi mui khc nhau, y l dng cht dn in tuyt vi to mi trng thch hp cho cc hot ng ca t bo. Mi trng t bo cht v cc bo quan trong n l yu t sng cn ca mt t bo.

Nhn t bo - trung tm t bo: Nhn t bo l bo quan ti quan trng trong t bo eukaryote. N cha cc nhim sc th ca t bo, l ni din ra qu trnh nhn i DNA v tng hp RNA. Nhn t bo c dng hnh cu v c bao bc bi mt lp mng kp gi l mng nhn. Mng nhn dng bao ngoi v bo v DNA ca t bo trc nhng phn t c th gy tn thng n cu trc hoc nh hng n hot ng ca DNA. Trong qu trnh hot ng, phn t DNA c phin m tng hp cc phn t RNA chuyn bit, gi l RNA thng tin (mRNA). Cc mRNA c vn chuyn ra ngoi nhn, trc tip tham gia qu trnh tng hp cc protein c th. cc loi

23


prokaryote, cc hot ng ca DNA tin hnh ngay ti t bo cht (chnh xc hn l ti vng nhn).

Ribosome - b my sn xut protein: Ribosome c c trong t bo eukaryote v prokaryote. Ribosome c cu to t cc phn t protein v RNA ribosome (rRNA). y l ni thc hin qu trnh sinh tng hp protein t cc phn t mRNA. Qu trnh ny cn c gi l dch m v thng tin di truyn m ha trong trnh t phn t DNA truyn qua trnh t RNA quyt nh trnh t amino acid ca phn t protein. Qu trnh ny cc k quan trng i vi tt c mi t bo, do mt t bo thng cha rt nhiu phn t ribosomethng hng trm thm ch hng nghn phn t.

Ty th v lc lp - cc trung tm nng lng: Ty th l bo quan trong t bo eukaryote c hnh dng, kch thc v s lng a dng v c kh nng t nhn i. Ty th c genome ring, c lp vi genome trong nhn t bo. Ty th c vai tr cung cp nng lng cho mi qu trnh trao i cht ca t bo. Lc lp cng tng t nh ty th nhng kch thc ln hn, chng tham gia chuyn ha nng lng mt tri thnh cc cht hu c (trong qu trnh quang hp). Lc lp ch c cc t bo thc vt.

Mng li ni cht v b my Golgi - nh phn phi v x l cc i phn t: Mng li ni cht (ER) l h thng mng vn chuyn cc phn t nht nh n cc a ch cn thit ci bin hoc thc hin chc nng, trong khi cc phn t khc th tri ni t do trong t bo cht. ER c chia lm 2 loi: ER ht (rm) v ER trn (nhn). ER ht l do cc ribosome bm ln b mt ngoi ca n, trong khi ER trn th khng c ribosome. Qu trnh dch m trn cc ribosome ca ER ht thng tng hp cc protein tit (protein xut khu). Cc protein tit thng c vn chuyn n phc h Golgi thc hin mt s ci bin, ng gi v vn chuyn n cc v tr khc nhau trong t bo. ER trn l ni tng hp lipid, gii c v b cha calcium.

Lysosome v peroxisome - h tiu ha ca t bo: Lysosome v peroxisome thng c v nh h thng x l rc thi ca t bo. Hai bo quan ny u dng cu, mng n v cha nhiu enzyme tiu ha. V d, lysosome c th cha vi chc enzyme phn hu protein, nucleic acid v polysacharide m khng gy hi cho cc qu trnh khc ca t bo khi c bao bc bi lp mng t bo.

Vt liu di truyn - Yu t duy tr thng tin gia cc th h: Vt liu di truyn l cc phn t nucleic acid (DNA v RNA). Hu ht cc sinh vt s dng DNA lu tr di hn thng tin di truyn trong khi ch mt vi virus dng RNA cho mc ch ny. Thng tin di truyn ca sinh vt chnh l m di truyn quy nh tt c protein cn thit

24


cho mi t bo ca c th. Tuy nhin, mt nghin cu mi y cho thy c th mt s RNA cng c s dng nh l mt bn lu i vi mt s gene phng sai hng.

cc sinh vt prokaryote, vt liu di truyn l mt phn t DNA dng vng n gin. Phn t ny nm mt vng t bo cht chuyn bit gi l vng nhn. Tuy nhin, i vi cc sinh vt eukaryote, phn t DNA c bao bc bi cc phn t protein to thnh cu trc nhim sc th, c lu gi trong nhn t bo (vi mng nhn bao bn ngoi). Mi t bo thng cha nhiu nhim sc th (s lng nhim sc th trong mi t bo l c trung cho loi). Ngoi ra, cc bo quan nh ty th v lc lp u c vt liu di truyn ring ca mnh (xem thm thuyt ni cng sinh).

V d, mt t bo ngi gm hai genome ring bit l genome nhn v genome ty th. Genome nhn (l th lng bi) bao gm 46 phn t DNA mch thng to thnh cc nhim sc th ring bit. Genome ty th l phn t DNA mch vng, kh nh v ch m ha cho mt vi protein quan trng.

2.2.2. Cc qu trnh chc nng ca t bo

2.2.2.1. Sinh trng v trao i cht ca t bo

Gia nhng ln phn bo, cc t bo thc hin hng lot qu trnh trao i cht ni bo nhm duy tr s tn ti cng nh sinh trng ca mnh. Trao i cht l cc qu trnh m t bo x l hay ch bin cc phn t dinh dng theo cch ring ca n. Cc qu trnh trao i cht c chia lm 2 nhm ln:

Qu trnh d ha (catabolism) nhm phn hu cc phn t hu c phc tp thu nhn nng lng (di dng ATP) v lc kh;

Qu trnh ng ha (anabolism) s dng nng lng v lc kh xy dng cc phn t hu c phc tp, c th v cn thit.

Mt trong cc con ng trao i cht quan trng l ng phn (glycolysis), con ng ny khng cn oxy. Mi mt phn t glucose tri qua con ng ny s to thnh 4 phn t ATP v y l phng thc thu nhn nng lng chnh ca cc vi khun k kh.

i vi cc sinh vt hiu kh, cc phn t pyruvat, sn phm ca ng phn, s tham gia vo chu trnh Kreb (hay cn gi l chu trnh TCA) phn hu hon ton thnh CO2, ng thi thu nhn thm nhiu ATP. sinh vt eukaryote, chu trnh TCA tin hnh trong ty th trong khi sinh vt prokaryote li tin hnh ngay t bo cht.

25


Hnh 2.2. Qu trnh sinh tng hp protein

2.2.2.2.Sinh tng hp protein

S qu trnh sinh tng hp protein: Trong vng cht nhn, cc gene c phin m thnh nhng phn t RNA. Sau

khi thc hin cc sa i sau phin m, phn t mRNA trng thnh c vn chuyn ra t bo cht tin hnh tng hp protein ti y. Cc ribosome tin hnh dch m ca mRNA nh mi lin kt hydro theo nguyn tc b sung gia b ba m sao trn mRNA vi b ba i m trn tRNA tng ng. Nhng phn t protein sau khi c tng hp thng c tin hnh mt s sa i cho ph hp vi chc nng, v d gn thm cc gc ng

Sinh tng hp protein l qu trnh t bo tng hp nhng phn t protein c trng v cn thit cho hot ng sng ca mnh. Qu trnh phin m l qu trnh tng hp nhng phn t RNA thng tin da trn trnh t khun ca DNA. Trn khun mRNA mi c to ra, mt phn t protein s c to thnh nh qu trnh dch m.

B my t bo chu trch nhim thc hin qu trnh tng hp protein l nhng ribosome. Ribosome c cu to t nhng phn t RNA ribosome v khong 80 loi protein khc nhau. Khi cc tiu n v ribosome lin kt vi phn t mRNA th qu trnh dch m c

tin hnh. Khi , ribosome s cho php mt phn t RNA vn chuyn (tRNA) mang mt loi amino acid c trng i vo. tRNA ny bt buc phi c b ba i m c trnh t b

sung vi b ba m sao trn mRNA. Cc amino acid ln lt tng ng vi trnh t cc b ba nucleotide trn mRNA s lin kt vi nhau to thnh mt chui polypeptide.

2.2.2.3.Hnh thnh cc t bo mi

Phn bo l qu trnh sinh sn t mt t bo (gi l t bo m) phn chia thnh hai t bo non. y l c ch chnh ca qu trnh sinh trng ca sinh vt a bo v l hnh thc sinh sn ca sinh vt n bo. Nhng t bo prokaryote phn chia bng hnh thc phn ct (binary fission) hoc ny chi (budding). T bo eukaryote th s dng hnh thc

26


phn bo l nguyn phn (mitosis) (mt hnh thc phn bo c t). Nhng t bo lng bi th c th tin hnh gim phn to ra t bo n bi. Nhng t bo n bi ng vai tr giao t trong qu trnh th tinh hnh thnh hp t (lng bi). Trong phn bo, qu trnh nhn i DNA (dn n nhn i nhim sc th) ng vai tr cc k quan trng v thng din ra ti k trung gian gia cc ln phn chia.

Cc pha trong chu k t bo:

Pha G0 l mt giai on ca chu k t bo cell cycle m t bo trng thi lng yn.

Pha G1 l pha pht trin u tin ca chu k.

Pha S, trong pha ny DNA c sao chp, ch S xut pht t synthesis of DNA c ngha l tng hp DNA (cn gi l axt nhn ADN: Axt Dezoxy riboNucleic).

Pha G2 l pha pht trin th hai, cng l pha chun b cho t bo phn chia.

Pha M, hay pha phn bo mitosis, v trng thi hot ng ca t bo (cytokinesis), s phn chia t bo thc s din ra to thnh hai t bo mi ging nhau.

H thng kim sot, cn gi l cc im kim sot, kim tra cc tn thng ca DNA v cc sai st trong cc qu trnh quan trng ca chu k t bo. Trong trng hp c s khng tng thch no , cc im kim sot c th chn qu trnh lun chuyn qua cc pha ca chu k t bo. Chng hn nh, im kim sot iu khin sao chp DNA v gi cho t bo sao chp hon ton DNA trc khi bc vo qu trnh phn bo (mitosis). Cng vy, im kim sot con thoi (spindle checkpoint) s ngn cn qu trnh chuyn dch t pha bin k (metaphase) sang pha hu k trong (anaphase) trong qu trnh phn bo nu nh khng c tt c cc nhim sc th (chromosomes) tp trung nh vo thoi phn bo.

Nu h thng ny pht hin c iu g bt thng, th mt mng li cc phn t dn truyn thng tin (signal transduction) s hng dn t bo ngng phn chia ngay. Chng cn cn th gip cho t bo bit c c th sa cha tn thng hay khng hay l khi ng qu trnh t bo cht c lp trnh, mt dng ca n c gi l apoptosis. Qu trnh t bo cht c lp trnh gip hn ch cc t bo tn thng pht trin. V d nh, mt protein, c gi l p53, nhn cm cc tnh hiu xut pht t cc DNA tn thng. N p ng bng cch kch thch sn xut ra cc protein c ch dng qu trnh sao chp DNA li. Nu chc nng ca p53 khng hot ng ng th dn n vic ng

27


cc DNA tn thng khng c kim tra. Hu qu trc tip ca iu l cc gene tn thng s pht trin sang cc dng ung th. Ngy nay, nhng thm d cho thy p53 c phi hp vi nhiu loi ung th khc nhau nh l mt vi dng ung th v v ung th i trng.

Mt vi t bo nh l t bo thn kinh, khng bao gi phn chia khi n lun dng li pha G0. Tuy nhin, cc nghin cu gn y cho thy nhng trng hp tn thng cht t bo th t bo thn kinh vn c th i vo li chu k t bo. Ngoi ra cc cht c ch chu k t bo ngn cn t bo khi ci cht c lp trnh c bit nh l apoptosis.

2.3. Thc vt

C th thc vt c cu to t nhng n v hnh thi c gi l t bo, mi t bo c lin kt vi nhng t bo khc bi cht kt dnh gian bo bao quanh. Trong khi lin kt c nhng nhm t bo khc bit v hnh thi hoc v chc nng hoc c hai vi nhng nhm khc. Nhng nhm nh th c gi l m. Mt s m cu to n gin, ch gm mt loi t bo, nhng m khc phc tp hn gm nhiu hn mt kiu t bo

Cc m t bo trong c th thc vt u c ngun gc t hp t tc l t t bo trng th tinh qua cc giai on pht trin ca phi v sau pht trin thnh c th trng thnh. C th thc vt sinh trng nh c m phn sinh. M phn sinh ngn phn chia v phn ha thnh cc phn mi ca chi v r. l s sinh trng s cp. S sinh trng th cp thc vt hai l mm v ht trn l do hot ng ca m phn sinh th cp c gi l tng pht sinh. Trong s sinh trng th cp cn c tng phn sinh bn l m phn sinh th cp hnh thnh nn chu b. Tng pht sinh v tng sinh bn c gi l m phn sinh bn v n v tr bn ca than v r phn bit vi m phn sinh s cp l m phn sinh ngn.

C th thc vt c phi pht trin k t khi ht ny mm gm r pht trin xung t v chi gm thn mang l pht trin trong kh quyn. S pht trin ca chi v r l t cc t bo ca m phn sinh ngn. Thn l v r c gi l c quan dinh dng. Khi trng thnh th hoa c hnh thnh. Sau s th phn l s th tinh v s hnh thnh phi, ht v qu. Nhng c quan c gi l c quan sinh sn. Chu trnh pht trin ca c th thc vt c th k t khi hp t hnh thnh v kt thc trc khi xy ra s th tinh ca cc giao t to nn th h sau.

28


2.3.1. S ny mm ca ht v s pht trin ca cy con

a. S ny mm ca ht

S ny mm ca ht bt u khi ht hp thu rt nhiu nc v tng th tch ln mt cch ng k, c khi n 200%. Kt qu ca s hp thu nc ny lm cho phi gii phng gibberellin, v y l yu t cm ng tng hp mt s cc enzim thy gii trong c c amylaza. Nhng enzim ny thy phn nhng cht d tr trong phi nh, cung cp nng lng cho s tng trng ca phi. T bo bt u phn ct, tng hp thm t bo cht mi, gia tng kch thc nh s hp thu nc. Phi tng trng lm bung v ht ra v nhanh chng hnh thnh mt cy con, c r v thn phn bit.

Hnh 2.3. S ny mm ca ht

Khi ht ny mm, trc h dip c mc ra trc tin. Trc h dip mc xung theo chiu trng lc, d ht nm theo hng no. Cng lc trc thng dip bt u pht trin nhanh chng, r mm phn cui ca trc h dip, to ra mt h thng r con gn vo trong t v hp thu nc v mui khong. mt s cy song t dip, phn trn ca trc h dip mc di ra thnh dng hnh vm, mc ngc ln v chui ra khi mt t. Khi trc h dip l ra ngoi khng kh, n mc thng ln, t dip v trc thng dip c a ra khi mt t. Sau trc thng dip bt u mc di ra. y l kiu ny mm thng a.

Nhng cy Song t dip khc, th d nh u H lan, Nhn c mt kiu ny mm hi khc, nhng cy ny, trc h dip khng mc thnh hnh vm v t dip khng

29


c a ln khi mt t. Thay vo l trc thng dip bt u mc di ra ngay sau khi h thng r con bt u c hnh thnh; n lun lun mc thng ng v chng bao lu nh ra khi mt t. Kiu ny mm ny tng t nh ht La, Bp... thuc cc cy n t dip, ch c mt t dip, nhng giu phi nh . y l kiu ny mm h a. Bp trc thng dip bt u di ra ngay sau khi h thng r c thnh lp. Thn non c dip tiu (l u tin hnh ng) bao bc.

b. S pht trin ca cy con

u tin cy con tng trng hi chm, nhng sau tng trng vi mt tc nhanh hn trong mt thi gian di hn v cui cng chm li v c th dng tng trng khi cy sp trng thnh. nhng cy a nin, s tng trng tip tc xy ra trong sut i sng ca cy, trong khi nhng cy nht nin nh cc cy u, cy C ci... tng trng ngng li khi cy trng thnh v cy cht i sau mt ma sinh trng. S tng trng ca r v thn ca cy con c c l nh s phn ct v s tng di ca t bo. Hai hot ng ny chu nh hng ca nhiu hormon sinh trng khc nhau, c bit l auxin, gibberellin v cytokinin. nhng cy ch c m s cp th s phn ct t bo v s tng di ca t bo ty thuc vo s hot ng ca hai m phn sinh ngn r v ngn thn.

2.3.2. S tng trng ca r v thn

a. S tng trng ca r

S hot ng ca m phn sinh ngn r lm cho r tng trng. M phn sinh r c bo v bi mt chp r hnh nn, gm mt khi t bo khng phn ct c. Khi r mc di ra v u r mc su vo trong t th mt s t bo mt ngoi ca chp r c th b tn thng v sau c thay th bng nhng t bo mi do s phn ct t bo ca m phn sinh ngn. Ngay sau ca chp r l vng m phn sinh ngn r, vng ny ngn v gm nhng t bo nh c kh nng phn chia tch cc. Phn ln cc t bo mi c to ra nm xa chp r. M phn sinh tip tc phn ct cho t bo mi v u r tip tc mc su vo trong t. Chnh cc t bo c to ra t m phn sinh ny s thnh lp m s cp cho r.

30


Khi cc t bo c mi c y ra khi vng m phn sinh ngn, do s lng t bo tng ln s phn ct chm li th s gia tng kch thc t bo l qu trnh chnh.

Phn ln s tng kch thc lm r tng trng chiu di nhiu hn l chiu rng. S tng di ca t bo chu tc ng ca cc hormon m c bit l auxin v gibberellin. Vng t bo tng di nhiu nht l vng ngay sau vng m phn sinh v thng di ch vi milimet. K tip l vng t bo trng thnh, ni y t bo bt u trng thnh v c hnh thnh dng c trng. Vng ny d nhn bit nh cc lng ht c mc di ra t nhng t bo biu b.

b. S tng trng ca thn

S phn ct t bo m phn sinh

ngn thn to ra m s cp ca thn v khi s khi ca l Cc t bo mi c to ra t m phn sinh ngn thn gn nh ngn, mc di y ngn thn thng ng ln. S tng trng ca thn khc vi s tng trng ca r l c s to ra l pha bn ca nh ngn thn. Cch khong u n m phn sinh ngn thn to ra nhng khi s khi ca l (leaf primordia), sau ny s to ra nhng l mi. Ni l mc ra t thn gi l mt (node) v khong gia hai mt l lng (internode). Phn ln thn di ra l do s tng di ca t bo nhng lng cn non.

Hnh 2.5. nh ct dc ca chi ngn

Hnh 2.4 Cu to ca r

31


nh ca thn l mt chui nhng lng cha c mc di ra. Nhng khi s khi ca l rt nh ngn cch cc lng un cong; cc khi s khi gi hn, to hn ca l bao ly cc khi s khi tr hn, nh hn bn trong. Cu trc gm m phn sinh ngn v cc lng cha c tng di c bao bc trong cc khi s khi ca l c gi l chi (bud). nhng cy tng trng theo ma th chi c bo v bi nhng vy, l nhng l bin i mc t di y ca chi. Vo ma xun, khi cc chi ng ny n ra, th cc vy che ch rng i v nhng lng cha bn trong cc chi bt u tng di mt cch nhanh chng. Do cc lng s dn dn c tch xa nhau ra, s phn ct t bo xy ra khi s khi ca l v to ra l non. Trc khi l c hnh thnh mt cch hon chnh, mt u nh ca m phn sinh thng mc ra gia y l v lng. Mi mt vng m phn sinh mi ny s to ra mt chi bn (lateral, axillary bud) c c im tng t nh chi ngn . S tng di ca cc lng ca chi bn trong ma sinh trng k tip s to ra nhnh.

2.3.3. S chuyn ha ca t bo

Tt c nhng t bo mi c sinh ra t m phn sinh th c bn ging nhau, chng s tr thnh cc loi m khc nhau. Qu trnh t bo thay i t nhng hnh dng cha trng thnh n trng thnh gi l s chuyn ha (differentiation).

Trong s tng trng ca r v thn, t bo bt u chuyn ha thnh cc loi m khc nhau khi chng vn cn trong vng m phn sinh. Sau khi s phn ct t bo v s tng di ca t bo hon tt, t bo bt u trng thnh c hnh dng nht nh. lt ct ngang c th phn bit c ba vng ng tm ngay sau m phn sinh ca r l lp tin b (protoderm), k tip l mt vng m cn bn dy nm ngay di tin b v trong cng l m tin dn truyn (provascular tissue) gm nhng t bo. Ngay trong phi, tin b ngoi tr thnh biu b, m cn bn tr thnh v v ni b, phn trong cng to ra m dn truyn s cp, chu lun v tng tng libe g. S chuyn ha trong thn ang tng trng cng theo cch tng t ngoi tr c hai vng m cn bn, mt vng nm gia tin b v tr tin dn truyn s to ra v v ni b, v mt vng th hai nm trong tr tin dn truyn s tr thnh li. S tng trng theo ng knh ca r v thn ty thuc vo s thnh lp m th cp do s hot ng ca nhng m phn sinh bn, c bit l tng tng libe g. Di nh hng ca auxin, nhng t bo mi c to ra pha ngoi ca tng tng s chuyn ha thnh m libe th cp, trong khi nhng t bo mi c to ra pha trong ca tng tng s to nn m g th cp.

32


Hnh 2.6. S chuyn ho ca r non

Thc vt c xu hng mc v hng c nh sng. t mt chu cy trong phng, cy s mc cong hng v pha ca s, nu xoay cy hng vo trong, sau mt thi gian ngn cy li mc hng v pha ca s. Hin tng cy p ng li vi nh sng bi s xoay ny c gi l quang hng ng (phototropism) ca thc vt. Thc vt cn c cc tnh hng ng khc nh a hng ng (gravitropism) l p ng ca cy hng theo chiu ca trng lc, thy hng ng (hydrotropism) p ng vi nc.

p ng ny l do s sinh trng chuyn ha; mt pha ca thn cy hay r mc nhanh hn pha bn kia, lm cho cy cong i. Thn c quang hng ng dng, xoay v hng c nh sng; r th ngc li, c quang hng ng m, xoay trnh nh sng. ngha thch nghi ca quang hng ng thn l xoay thn l nhn c nh sng ti a cn thit cho s quang hp.

2.4. Phng th nghim

2.4.1. Cc thit b , dng c cn thit ca phng th nghim nui cy m

Mt phng th nghim nui cy m t bo thng bao gm: -Phng ra dng c -Phng chun b mi trng, hp tit trng v cha dng c

33


- Phng cy v trng - Phng nui mu - Phng quan st v thu nhn s liu

S tng quan nh sau:

1.Phng ra v sn xut nc ct 2. Phng sy hp, kho thy tinh sch 3. Phng chun b mi trng 4. Phng chun b mu 5. Phng cy v trng 6. Phng nh 7. Phng knh hin vi 8. Phng nui 9.Phng nui 10. Phng sinh ha Bn cnh phng th nghim cn c h thng nh li v vn m trng cy

ly nguyn liu nui cy v trng cy ti sinh trong qu trnh chn lc nvitro. a. Phng ra v ct nc: Phng ra dng c phi c bn ra ln , c ng thot nc ring cho axit, c

k cc thit b:

- My ct nc mt ln - My ct nc hai ln - My sn xut nc kh ion b.Phng sy hp: - T sy 60-6000C (loi c dung tch ln) - Ni p sut loi nh (20-30 lt) - Ni p sut loi ln (70-100 lt) c.Phng chun b mi trng:

1 2 3 4 5

6

7 8 9 10

34


- pH meter - My khuy t - Cn phn tch 10-4 g - Cn k thut 100-2g - My rt mi trng - Bp in - Microwave - T lnh 100-200 l - T lnh su (-20 n -800C) d. Phng cy v trng Phng cy v trng nn l mt phng nh, kn, sn v tng cn c lt gch

men hoc sn lau chi v kh trng thng xuyn. Ca phng cy nn l ca knh v trong khi thao tc cy rt d b pht n cn do cn phi d lin lc vi bn ngoi trong lc cn thit. Trn tng gn n UV kh trng phng.

C hai loi t cy thng c s dng: t cy tnh v t cy thi kh v trng. Trong t cy phi c n trng d lm vic v c n UV kh trng trc khi lm vic

- Laminar -Qut thng gi - n t ngoi treo trn hoc treo tng - Thit b lc khng kh - Gi v bn mi trng - B dng c cy, n cn e. Phng nui mu cy:

Tt c cc mu cy u c nui trong iu kin nhit nh sng, m, di chiu sng, thng kh thch hp.

Phng nui c nhit 15-300C ty theo mu cy v mc ch ca th nghim. Nhit phi c phn b u trong ton phng nui, phi c y nh sng hunh quang v c th iu khin c cng v thi gian chiu sng. Phng nui phi c thi kh ng nht v bin m c iu chnh t 20-98%.

- Phng nui sng: tng nn sn mu trng. Cc gi n c lp n ng chiu sng. Trong phng cn gn cc my mc kim tra chnh xc nhit , m.

- Phng nui ti nui m so v cc x l c bit. Phng cn tt c cc iu kin nh phng sng ch khc l khng cn lp n chiu sng cho cy, ca s cn c che kn bng vi en.

35


- Cc gin n hunh quang nhiu ngn, c chiu sng ch bnh nui cy t 2000-3000 lux.

- My iu ha nhit - My lc nm ngang 100-200 vng/pht - Cc thit b v dng c nui cy t bo n -T m.

f. Phng sinh ha : Phng ny dng tin hnh cc phn tch sinh ha, phn t v di truyn. - T ht, t m - Cn cc loi - My ct tiu bn - My o pH - Ly tm lnh - My in di, my soi AND - My PCR,my sc k,quang ph - T lnh thng, t lnh su - L vi sng - Pipet t ng cc loi - My soi v chp nh gel -Cc t ng ha cht, t ht kh c. * Cc nhn t m bo thnh cng trong nui cy m t bo thc vt: c 3 nhn t

chnh: - m bo iu kin v trng. -Chn ng mi trng v chun b mi trng ng cch - Chn m cy v x l m cy thch hp trc v sau khi cy.

2.4.2. Cc th tc c bn trong phng th nghim:

2.4.2.1. Cn

Vic chun b mi trng i hi thao tc cn phi chnh xc. Trc ht cn phi c t v tr n nh, khng b rung, khng kh khng b dao ng nhiu. Cn v da cn phi c gi gn sch s. Quan trng nht l khng c cn qa trng lng cho php v nn s dng cc vt ng ha cht c trng lng nh hoc bng giy khi cn. Khng c ha cht tip xc trc tip vi mt cn.

2.4.2.2. ong cht lng

Cc dng c thy tinh c chia vch (ng ht c chia , cc thy tinh c chia vch, ng ong) cn thit pha mi trng. ng ong c th tch 10,20,100 v 1000ml

36


c s dng ong nhng cht lng c th tch ln cn ng ht c chia , bnh nh mc dung ong nhng th tch cn chnh xc. ong cc dung dch ch chnh xc khi y ca khng kh ngang vi vch nh du.

2.4.2.3. Xc nh pH

pH ca mi trng cy hu ht c chnh 5,5 +-0,1 trc khi hp kh trng. pH nh hng n kh nng ha tan ca cc ion trong mi trng khong, kh nng ng t agar v s tng trng ca t bo. V vy xc nh chnh xc pH l cn thit. Murashige v Shoog nhn thy rng pH 5,7-5,8 thch hp duy tr s ha tan cc cht khong trong mi trng MS. Nu mi trng MS c s dng dng lng th c th chnh pH 5, mi trng cy huyn ph c pH thp phn no gim bt tnh trng nhim. pH ca mi trng thng c iu chnh bng NaOH hoc HCl sau khi pha xong mi trng v chun b a v hp kh trng. C th chnh pH bng pH k bn, pH k cm tay hoc giy o pH. Thng th nhit cao s lm tng tnh axit ca mi trng. Mann v cng s nhn thy rng nu trc khi hp pH=5,7 th sau khi hp pH =5, Nu mun pH =5,7-5,9 th trc khi hp kh trng cn iu chnh pH n 7.

2.4.2.4. Ra dng c thy tinh v bnh nui cy bng plastic

Thng thng bnh nui cy sau khi s dng cn phi c ra k bng x bng bt cho ht cc cht bm trn thnh chai ri trng li nhiu ln bng nc sch cui cng trng li bng nc ct. Cc dng c thy tinh b qu bn cn phi c ngm trong axit HCl hoc sulfuric sau ra sch bng nc my v trng bng nc ct. Cc bnh mi trng b nhim trng trong qu trnh nui cy cn phi c hp tit trng trc khi ra. Cc dng c thy tinh sau khi ra phi c sy kh trong t sy v c ct cn thn.

2.5. m bo iu kin v trng

2.5.1. ngha ca v trng trong nui cy m v t bo thc vt

Mi trng nui cy m v t bo thc vt c cha ng, mui khong, vitamin..rt thch hp cho cc loi nm v vi khun pht trin. Do tc phn bo ca nm v vi khun ln hn nhiu so vi cc t bo thc vt, nu trong mi trng nui cy b nhim bo t nm hoc vi khun th sau vi ngy s ph y vi khun hoc nm,khi m nui cy s cht dn th nghim phi b i. Thng thng mt chu k nui cy m v t bo thc vt di t 1-5 thng, trong khi th nghim vi sinh vt c th kt thc trong mt vi ngy. Nh vy mc v trng trong th

37


nghim nui cy m v t bo thc vt i hi rt nghim ngt, iu kin ny c bit quan trng trong nui cy t bo n trong cc bioreactor.

C 3 ngun nhim tp chnh: - Dng c thy tinh, mi trng v nt y khng c v trng tuyt i. - Trn b mt hoc bn trong m nui cy tn ti cc si nm, bo t vi khun. - Trong qu trnh thao tc lm ri nm hoc vi khun theo bi ln mi trng.

2.5.2.Kh trng

2.5.2.1. Kh trng phng cy v t cy

Phng cy thng l phng c din tch hp, rng t 10-15m2, c hai lp ca trnh khng kh chuyn ng t bn ngoi trc tip a bi vo. Sn v tng c lt gch men d lau chi. Trc khi a vo s dng bung cy cn c x l bng hi Formol bng cch rt formaldehyde (formalin)4% ra mt s da petri ri rc vi ni trong phng cho bc hi t nhin. ng kn ca phng cy trong 24 gi, sau b formaldehyde i v kh hi formaldehyde d bng dung dch NH3 25% trong 24 gi. Cc dng c mang vo bung cy u v trng trc: t qun o chong, m vi, khu trang, dao ko..Trn bn cy thng xuyn c mt n cn s dng khi cy v mt cc ng cn 95% nhng dng c lm vic

Trc khi cy, th nghim vin cn ra tay bng x phng v lau k n khuu tay bng cn 900. m bo mc v trng cao cn c mt n t ngoi treo trn trn.

Phng cy ln c kh trng tin nht l bng n cc tm.Thi gian kh trng ty theo kch thc ca phng v n cc tm ch c s dng khi khng c ngi. Phng cng c th c kh trng bng cch lau ra hai ln/thng vi cc dung dch chng nm. Phng nh hn v t cy cng c kh trng bng tia cc tm hay cc dung dch kh trng. T cy thi gi c kh trng bng cch m qut gi v lau tt c cc b mt bng cn 95% trong 15 pht trc khi bt u lm vic.

Phng nui cng c kh trng trc ht l bng x bng bt. Sau lau bng dung dch hypoclorit sodium 2% hoc bng cn 95%. Tt c sn, trn u c lau nh vy mi tun. Cn thn khng nn khuy ng nhng ni b nhim trnh pht tn bo t.Cn gim s chuyn ng ca khng kh trong bung cy n mc ti thiu v vy tt c cc dng c phc v vic cy u phi chun b y trong khi cy trnh i li ra vo bung cy nhiu ln.

2.5.2.2. Kh trng bnh cy v cc dng c khc

a. Dng c:

38


Dng c thy tinh dung cho nui cy m v t bo thc vt phi l bnh thy tinh trong sut nh sng qua c mc ti a v trung tnh trnh kim t bnh thy tinh gy nh hng n s pht trin ca m nui cy. Cn ra sch dng c thy tinh trc khi a vo s dng. Thng thng ch cn x l bng sulfochromate mt ln u khi a vo s dng v sau ch cn ra sch bng x phng, trng nhiu ln bng nc my cui cng trng bng nc ct. Sauk hi ro nc dng c thy tinh cn c v trng bng cch sy 1600C/gi. Sau khi ngui c ly ra ct vo ch t bi.

Dng c kim loi, giy nhm cn c kh trng bng khng kh nng (130-1700C) trong 2-4 gi trong t sy. Tt c cc vt dng ny phi c gi kn trc khi kh trng nhng khng c gi bng giy v giy b phn r 1700C. Khng nn hp kh trng dng c kim loi v iu kin nng m s lm cho kim loi b r st v b n mn.

Trc khi s dng cc dng c c kh trng bng khng kh nng, cc dng c c ly ra khi giy gi, nhng vo cn 950 v t trn ngn la n cn. Sauk hi dng xong, dng c ny phi c t li bng cn trc khi s dng tip. Khi s dng cn cn lu y n s an ton ti a v rt d b pht.

Autoclave l phng php kh trng bng hi nc di p sut nht nh.Nt gn, vi, cc dng c thy tinh, bnh nui cy bng plastic, nt cao su, pipet, nc, mi trng khong u c th kh trng bng ni hp. Gn nh tt c vi sinh u b cht bi hi nc trong ni hp trong 10-15 pht 1210C.

b. Nt y: Thng dng nht l nt y lm bng bng khng thm nc. Nt phi tng

i cht m bo bi khng i qua c, ng thi nc t mi trng khng b bc hi qu d dng trong qu trnh nui cy. Bng khng thm nc l loi nt n gin nht nhng c nhc im sau:

+ Nu khi hp nt bng b t hoc dnh mi trng th v sau s b nhim nm nht l cc th nghim nui cy trong thi gian di.

+Thao tc lm nt bng chm, khng thun tin khi nui cy trn qui m ln. + Ch dng c mt vi ln sau phi b. Hin nay ngi ta s dng nhiu loi np y khc nhau thay th nt bong.

Cc hng sn xut dng c nui cy m cung cp loi np ng nghim v bnh tam gic bng nha chu nhit c th hp 1200C m khng b bin dng. Mt s phng th nghim s dng np inox hoc cao su rt thun tin cho vic vt trng.

Cc dung dch m dng pha ch mi trng (dung dch mui khong, vitamin..) cn c bo qun trong t lnh. Dung dch vitamin nn chia thnh nhiu loi

39


nh v bo qun trong ngn ca t lnh. Khng nn pha mt lng qu ln dung dch m cc cht sinh trng, thng ch nn dng cc l c dung tch 100-200 ml.

c. Kh trng mi trng khong: kh trng mi trng khong thng s dng hai phng php hp tit trng

v lc bng mng lc v trng. Mi trng nui cy, nc ct v cc ha cht n nh khc c th cha trong bnh thy tinh v y bng nt gn, giy nhm hoc np nha. Tuy nhin mi trng c cc cht khng bn nhit th cn s dng phin lc milipore. Ni chung mi trng khong c hp tit trng 1210C, 1 atm. Vi nhng th tch nh (100 ml hoc t hn) thi gian kh trng l15-20 pht. Vi lng mi trng ln th phi kh trng trong 30-40 pht. p sut khng nn cao qu 1 atm vi p sut cao s lm phn hy carbohydrate v cc phc hp nhy cm vi nhit

Bng 2.1 . Thi gian ti thiu hp kh trng mi trng nui cy m 1210C (Burgerr, 1988)

Thi gian kh trng ti thiu (pht)Th tch mi trng (ml)24 20-25 26 50

28,5 100 31,5 250

35 500 40 1000 48 2000 55 3000 63 4000

Nhiu loi protein, vitamin, amino axit, hormone..khng bn nhit v vy nn dng phin lc micropore kh trng. Phin lc milipore hoc phin lc seitz u c th s dng vi kch thc l khng ln hn 0,2 m. Cc bnh ng thy tinh cn phi c hp tit trng trc khi lc.

Mi trng khong c cht khng bn nhit c th c tin hnh chun b theo cc bc sau: u tin cc cht khong bn vi nhit c hp tit trng, sau lm lnh xung cn 50-600C trong iu kin v trng khi nhng cht khng bn vi nhit s c lc v trng. Dung dch kh trng ny s phi hp vi nhau trong iu kin v trng to ra mt mi trng hon chnh

2.5.2.3.Kh trng mu cy thc vt

Cc loi mu cy thng c s dng trong nui cy m

40


V mt nguyn tc, cc t bo cn sng phn ha u c kh nng phn phn ha tr li trng thi tr ha v ti lp kh nng phn chia. Tuy nhin c th nhn xt chung l cc m ang pht trin mnh (m phn sinh ngn, tng tng) khi t vo mi trng c cha mt lng cht sinh trng thch hp u c kh nng to m so cao. bt u nghin cu nhn ging v tnh mt cy nht nh, trc tin ngi ta ch y n chi nch v m phn sinh ngn.Cc m thc vt thng c s dng nui cy l:

- nh sinh trng thn, r - Chi bn - Tng tng - Vy c - Chi ngn - Nhu m l, nhu m v thn - Chi ny t c Cn bit l tuy mang mt lng thng tin di truyn nh nhau, cc m khc nhau trn

cng mt cy c th cho cc m so pht trin khc nhau vi kh nng ti sinh chi, r hay cy hon chnh rt khc nhau. V vy khi khi u chn ging, nhn ging mt cy c th trc ht cn tm hiu phn ng ca cc b phn khc nhau ca cy trong nui cy cc nng cht sinh trng khc nhau.

Kh trng mu cy l vic lm kh v mu sng khng th kh bng nhit cao m phi gi c bn cht sinh hc ca n. Do mu cy thc vt phi c kh trng bng cc dung dch kh trng. Cc dung dch kh trng thng dng l hypoclorit calcium, hypoclorit sodium, chlorua thy ngn, oxi gi T l v trng thnh cng ph thuc thi gian kh trng v nng cc cht kh trng v kh nng xm nhp ca chng vo cc k lch li lm trn b mt m nui cy, kh nng y ht cc bt kh bm trn b mt m nui cy. Cc dung dch dng kh trng mu phi bo v c m thc vt nhng thi gian kh trng phi tiu dit ngun gy nhim l nm v vi khun.

Cc mu cy khi chn la phi c ra trc bng x phng di dng nc chy ri mi cho vo ngm trong dung dch kh trng tng tnh linh ng v kh nng xm nhp ca cht dit khun, thng thng ngi ta x l m nui cy trong cn 70% trong 30 giy, sau mi x l trong dung dch dit khun. Trong thi gian x l, m cy phi c ngp hon ton trong dung dch dit khun. Khi x l xong m cy c ra nhiu ln trong nc ct v trng (3-5 ln). Nhng phn trn m cy b tc nhn v trng lm cho trng phi ct b trc khi t m cy ln mi trng. trnh nh hng trc tip ca tc nhn v trng ln m

41


cy, nn ch y li mt lp bc ngoi khi ngn m vo dung dch dit khun. Lp cui cng ny s c ct b hoc bc i trc khi t m cy ln mi trng.

i vi nhng mu kh kh trng th vic x l mu phi c lp li sau 24-48 h trc khi cy. iu ny cho php nhng vi sinh vt cha cht c thi gian pht trin n giai on nhy cm vi thuc kh trng.

Bng 2.2. Nng v thi gian s dng 1 s cht dit khun x l m cy thc vt

Stt Cht kh trng Nng Thi gian kh

trng (pht) Hiu qu

1 Hypochlorite calcium

9-10% 5-30 Rt tt

2 Hypochlorite sodium

0,5-5% 5-50 Rt tt

3 Nc bromine 1-2% 2-10 Rt tt 4 Oxy gi 3-12% 5-15 Tt 5 Chlorua thy

ngn 0,1-1% 2-10 Tt

6 Nitrate bc 1% 5-30 Tt 7 Khng sinh 4-50mg/l 30-60 kh

Cc cht khng sinh trn thc t t c s dng v tc dng khng trit v c nh hng xu ngay ln s sinh trng ca m cy.

Vic x l thnh cng ngun gy nhim phn ln ph thuc vo k thut x l trong nui cy v trng. Cc ngun gy nhim l bi tc, tay, qun o v vy trong khi cy phi ra tay,lau bng cn 700 ti khy tay, tay o phi xon cao ln, kp tc gn.. Khng ni chuyn hoc nhy mi trong khi ang cy. Khi cy khng nn chm tay vo mt trong ca bnh cy cng nh cc dng c cy. Khng a vo t cy cc bnh cy b nhim v bo t c th pht tn trong t cy.

2.6. Mi trng

Mt trong nhng yu t quan trng nht trong s tng trng v pht trin hnh thi ca t bo v m thc vt trong nui cy m l thnh phn mi trng nui cy.

42


Thnh phn mi trng nui cy t bo v m thc vt thay i ty theo loi v b phn nui cy. i vi cng mt mu cy nhng ty theo mc ch th nghim th thnh phn mi trng cng s thay i ty theo giai on phn ha ca mu cy.

2.6.1. Thnh phn ho hc ca cc mi trng nui cy m, t bo thc vt

Mi trng nui cy m v t bo thc vt tuy rt a dng nhng u gm mt s thnh phn c bn sau:

- Cc mui khong a lng v vi lng - Cc vitamin - Cc amino axt - Ngun cc- bon: mt s cc loi ng - Cc cht iu ho sinh trng - Cc cht hu c b sung: nc da, dch chit nm men, dch chit khoai ty,

bt chui kh... - Cht lm thay i trng thi mi trung: cc loi thch (agar)

Tt c cc hp cht ny u tham gia vo mt hoc nhiu chc nng trong s sinh trng v phn ho ca thc vt nui cy in vitro.

Cc nh khoa hc s dng cc mi trng nui cy rt khc nhau. Vic la chn mi trng nui cy vi thnh phn ho hc c trng ph thuc vo mt s yu t:

- i tng cy trng hoc m nui cy khc nhau c nhu cu khc nhau v thnh phn mi trng.

- Mc ch nghin cu hoc phng thc nui cy khc nhau (nui cy to m so phi ho hoc phi v tnh, nui cy t bo trn hoc dch lng t bo, vi nhn ging)

- Trng thi mi trng khc nhau (c, lng, bn lng). 2.6.1.1. Cc cht khong

i vi cy trng, cc cht v c ng vai tr rt quan trng. V d, Mg l mt phn ca phn t dip lc, Ca l thnh phn ca mng t bo, N l thnh phn quan trng ca amino axt, vitamin, protein v cc axt nucleic. Tng t, Fe, Zn v Mo cng l thnh phn ca mt s enzym.

Cc mi trng khc nhau c hm lng v thnh phn cht khong khc nhau, v d thnh phn v nng khong ca mi trng White hoc Knop kh ngho nn, nhng li rt giu mi trng MS v B5.

43


Mui khong l thnh phn khng th thiu trong cc mi trng nui cy m v t bo thc vt:

- Mui khong l cc vt liu (ngun N, S, P....) cho s tng hp cc cht hu c. Nit, lu hunh, pht-pho l cc thnh phn khng th thiu ca cc phn t protein, cc axt nucleic v nhiu cht hu c khc. Canxi v axt boric c tm thy ch yu thnh t bo, c bit l canxi c nhim v quan trng gip n nh mng sinh hc.

- ng vai tr nh mt thnh phn khng th thiu ca nhiu enzym (l cc co-factor): Magie, km, st... v nhiu nguyn t vi lng l nhng phn quan trng ca cc enzym.

- Cc ion ca cc mui ho tan ng vai tr quan trng n nh p sut thm thu ca mi trng v t bo, duy tr th in ho ca thc vt. V d, K v C rt quan trng trong iu ho tnh thm lc ca t bo, duy tr in th v tham gia hot ho nhiu enzym.

Trong mi trng, cc mui khong c chia thnh cc nguyn t vi lng v a lng:

- Cc cht dinh dng a lng bao gm su nguyn t: nitrogen (N), phosphorus (P), potassium (K), calcium (Ca), magnesium (Mg) v sulphur (S) tn ti di dng mui khong, l thnh phn ca cc mi trng dinh dng khc nhau. Tt c cc nguyn t ny l rt cn thit cho sinh trng ca m v t bo thc vt. Mi trng nui cy phi cha t nht 25 mmol/L nitrate v potassium. Tuy nhin, hu ht cc nghin cu u cho thy ngun N cung cp trong mi trng di c 2 dng nitrate v amonium (2-20 mmol/L) l tt hn c. Trong trng hp ch dng amonium, th cn phi b sung thm mt acid dng mch vng (cycle acids), tricarboxylic acid hoc mt s acid khc na (dng mui), nh: citrate, succinate, hoc malate sao cho mi nh hng c do nng ca amonium vt qu 8 mmol/L trong mi trng c gim bt. Khi cc ion nitrate v amonium cng hin din trong mi trng nui cy, th ion sau c s dng nhanh hn. Cc nguyn t chnh khc, nh: Ca, P, S v Mg, nng thng dng trong khong 1-3 mmol/L.

2.6.1.2. Cc nguyn t a lng

a. Ngun carbon (C)

ng sucrose (saccharoza) l ngun cacbon ch yu v c s dng thng xuyn trong hu ht cc mi trng nui cy m, k c khi mu nui cy l cc chi xanh c kh nng quang hp. Khi kh trng, ng sucrose b thu phn mt phn, thun li hn cho cy hp th. Trong mt s trng hp, v d nui cy m cy mt l mm, ng glucose t ra tt hn so vi sucrose. M thc vt c kh nng hp thu mt s

44


ng khc nh maltose, galatose, lactose, mannose, thm ch tinh bt, nhng cc loi ng ny hu nh rt t c s dng trong nui cy t bo v m thc vt.

M v t bo thc vt nui cy in vitro sng ch yu theo phng thc d dng, mc d nhiu trng hp chng c th sng bn d dng nh iu kin nh sng nhn to v lc lp c kh nng quang hp. V vy, vic a vo mi trng nui cy ngun carbon hu c l iu bt buc. Ngun carbon thng dng nht c kim chng l sucrose, nng thch hp ph bin l 2-3%, song cng cn ph thuc vo mc ch nui cy m thay i c khi gim xung ti 0,2% (chn dng t bo) v tng ln n 12% (cm ng stress nc). Tip n l glucose cng thng c a vo mi trng nui cy v cho hiu qu tng ng sucrose (glucose thng dng cho nui cy protoplast), cn fructose cho hiu qu km hn. Sucrose, trong khi kh trng mi trng, b bin i thnh glucose v fructose. Trong tin trnh ny, u tin glucose s c s dng v sau l fructose. Cc carbohydrate khc, nh: lactose, galactose, rafinose, maltose, cellobiose, melibiose v trehalose cng c th nghim, nhng t ra km hiu qu v ch c dng trong nhng trng hp c bit. Cc dng polysaccharide nh tinh bt, pectine, dextrine cng c th dng cho nui cy, tuy nhin nhng loi t bo c nui trn mi trng c cha mt trong cc polysaccharide trn nht nh phi th hin kh nng thy phn thng qua cc enzyme chng hn nh amylase. C nhng chng t bo nui cy gii phng ra mi trng cha tinh bt kh nhiu amylase. Chuyn chng ln mi trng ch cha sucrose lng amylase thi ra s gim ngay. Glycerin cng c th c t bo s dng. Mannitol hoc sorbitol hon ton trung tnh v khng thm nhp vo bn trong t bo, nhng chng c s dng rng ri trong nui cy huyn ph v nui cy protoplast vi chc nng l cht n nh p sut thm thu, hoc tng t sucrose chng cng c dng cm ng stress nc. Cc loi ru nh ethanol, methanol t hiu qu, cn propanol v butanol th rt c. Acid hu c thng khng phi l ngun carbon thch hp cho t bo nui cy. Th nghim vi cc acid: folic, succinic, pyruvic v keto-glutaric ch t 15% sinh trng so vi sucrose. Cc m v t bo thc vt trong mi trng nui cy t c kh nng t dng v v th cn thit phi b sung ngun carbon bn ngoi cung cp nng lng. Thm ch cc m bt u lc ha hoc hnh thnh dip lc t di cc iu kin c bit trong sut qu trnh nui cy khng t dng carbon. Vic b sung ngun carbon bn ngoi vo mi trng lm tng phn chia t bo v ti sinh cc chi xanh.

45


S thy phn tng phn sucrose xut hin khi mi trng c kh trng. Cc t bo v m nui cy sinh trng trn mi trng c sucrose c kh trng bng autoclave tt hn trn mi trng c sucrose c kh trng bng mng lc (filter). iu ny cho thy cc t bo thch hp vi ngun d tr c sn ca glucose v fructose do thy phn sucrose khi kh trng bng autoclave. S dng fructose c kh trng bng autoclave khng c cp n v n c th gy bt li cho sinh trng ca m.

b. Nit (N):

Thnh phn chnh ca hu ht cc mi trng l nit v c di dng nitrat (NO3

-

) hoc amonium (NH4

+). Cc mui c dng ph bin l kali nitrat (KNO

3), nitrat amon

(NH4NO

3) v canxi nitrat (Ca(NO

3)2.4H

2O). Nhng hp cht ny cung cp nit v c

cho thc vt tng hp cc phn t cht hu c phc tp.

M , t bo thc vt trong nui cy c th s dng nitrogen khong nh aminonium v nitrate, ng thi cng s dng cc dng nitrogen hu c nh amino acid. T l amonium v nitrate thay i ty theo loi v trng thi pht trin ca m.

Nitrate c cung cp di dng mui Ca(NO3)2.4H2O, KNO3, NaNO3 hoc NH4NO3. Amonium c cung cp di dng (NH4)2SO4 hoc NH4NO3. Trong mt s t trng hp c th cung cp di dng urea. Tng nng ca NO3+ v NH4+ trong mi trng nui cy thay i ty theo i tng nui cy v mc ch nghin cu.

Amonium ch yu c d tr r nh ngun nit hu c. Nitrat c th c vn chuyn theo mch xylem n cc b phn ca cy, ti n s tham gia vo qu trnh ng ho nit. Nitrat c th c d tr khng bo v thc hin chc nng quan trng trong vic iu chnh s thm thu v cn bng ion ca cy trng.

S bin i nitrat: Nitrat khng th s dng ngay lp tc sinh tng hp cc cht hu c phc tp m trc tin cn phi c kh thnh amoniac. Phn ng din ra nh sau:

NO3

- + 8H

+ + 8e

- NH

3 + 2 H

2O + OH

-

Phn ng ny c thc hin qua 2 bc nh hai enzym: nitrat- v nitrit reductaza. Trc tin, nitrat c bin i thnh nitrit nh nitrat reductaza. Tip theo, nitrit b kh thnh amoniac nh enzym nitrit reductaza. S bin i ca nitrat thnh nitrit din ra trong t bo cht. Trong hu ht cc cy trng, s kh nitrat c th din ra c l v nh chi. S kh nitrat din ra mc no ph thuc rt ln vo cc nhn t nh:

46


loi, tui cy, nng nitrat. C th, cc loi cy thn g c kh nng kh nitrat rt cao. Khi nng nitrat thp, s kh hu nh din ra r. Ngc li, nu nng nitrat cao th qu trnh ny din ra c l. Cc cation kt hp vi nitrat c vai tr quan trng trong

vic hp thu nitrat. Nu cation l K+

th hot ng ca enzym nitrat reductaza r thp v

nitrat s c vn chuyn ln cc nh chi ca cy. Trong trng hp cation l Ca2+

th s kh r li din ra mnh hn.

S kh nitrit thnh NH3

nh enzym nitrit reductaza din ra trong l cy, trong

in t cn thit cho phn ng ny c cung cp t s kh cc hp cht st trong h thng quang hp.

S kh nit cha trong cc hp cht: Amonium v amoniac l nhng cht c i vi thc vt ngay nng thp. Do chng cn c chuyn ho tht nhanh thnh cc hp cht phn t lng nh c cha N nh: asparagin, arginin, allantoin v betain. Sinh tng hp glutamin v glutamat din ra c r v nh chi l cc qu trnh c bn trong s chuyn ho amonium.

Bn cnh s kh c tnh ca amonium v amoniac, cc hp cht cha nit phn t lng thp cn c mt s chc nng khc. Chc nng quan trng nht l cung cp N trong cc lin kt hu c v -NH

2 c thc vt hp th nh ngun N hu c cho qu

trnh sinh tng hp cc amino axt v protein. Cc hp cht phn t lng nh ny cn c s dng lm cht mang cation nh Mn, Cu vn chuyn cc cation qua h thng mch dn trong cy. Ngoi ra, chng cn nh mt kho d tr nit d tha. Ngc li vi con ngi v ng vt, thc vt khng th bi tit cc hp cht nit hu c nh ur nhng nh c ch ny cho php thc vt d tr c nit hu c.

c. Phospho (P):

Photpho l nguyn t quan trng trong i sng thc vt . N tham gia vo vic vn chuyn nng lng, sinh tng hp protein, acid nuclic v tham gia cu trc ca mng.

Trong mi trng nui cy, Photpho c cung cp di dng mono hay dihydrogenphosphate potasium hay sodium. Ion photphate ha tr 1 v 2 c th chuyn i ln nhau ty theo pH. Ion H2PO4- chim u th pH nh hn 7, y l c tnh ca hu ht mi trng nui cy m t bo thc vt cng l ion d c thc vt hp th nht. Photpho thng c cung cp di dng photphate ha tan hn ch.

Nng photphate ha tan cao trong mi trng s lm gim s tng trng ca m, c th do calcium v mt s nguyn t vi lng b kt ta trong mi trng hoc b gim hp thu vo trong m. Nng ion photphate cho vo mi trng cao nht l 18,9 mM, trung bnh l 1,7 mM, hu ht cc mi trng cha photphate khong 1.3 mM.

47


Phospho dng HPO4

2- c hp th nh h thng r ca thc vt v ngc li vi

nitrat, sunfat, n khng b kh. N c th c mt trong thc vt di dng P v c hoc dng hp cht este (R-O-P). Nng lng thu c khi gii phng mt nguyn t P khi cc lin kt (cao nng lng) l rt quan trng i vi qu trnh trao i cht ca t bo.

Axit nucleic : P l mt nguyn t thit yu trong cu to ca DNA v RNA ni cc n phn t axt ribonucleic to thnh i phn t.

Phospholipid: Phospholipid ca mng sinh hc cng c cha mt lng ln P. Trong nhng phospholipid ny, P (qua lin kt este) to nn cu ni gia diglyxerit vi mt amin, axit amin hoc mt ru. Phospholipid c mt u ho nc, phn t

diglyxerit v mt u k nc c cha PO4

3-. C hai u c chc nng quan trng trong

vic gi n nh mng t bo. Mng t bo bao gm hai lp phospholipid n ghp li to thnh lp mng kp lipid. u a nc ca lp phospholipid quay ra ngoi hng v pha cc phn t nc trong khi ui k nc li quay vo pha trong gia hai lp ca mng t bo v tng tc ln nhau.

Qu trnh chuyn ho nng lng: Phospho dng lin kt este cao nng (C-P) rt quan trng i vi qu trnh chuyn ho nng lng v tng hp sinh hc thc vt. ng vai tr quan trng hn na l cc lin kt cao nng gia hai nguyn t P nh trong phn t ATP (P-P = 30 kJ). Nng lng gii phng trong sut qu trnh thu phn glucoza, qu trnh oxi ho, phosphoryl ho hoc quang hp c s dng tng hp ATP. Ngc li nng lng ny khi cn li c gii phng ra qua phn ng thu phn ATP thnh ADP v P v c. V vy ATP c chuyn ho v tng hp mi lin tc. Mt gram nh r ang trong giai on trao i cht mnh c th tng hp 5g ATP/ ngy vi tc tng hp trung bnh l 30 giy.

Vng d tr P (phosphat): Trong t bo bao gm hai vng d tr phosphat khc nhau. Vng trao i, ch yu phosphat dng este, nm trong t bo cht v ty th. Vng khng trao i, ch yu l dng P v c, nm trong khng bo. Nu ngng cung cp P cho cy, nng P v c trong khng bo ngay lp tc s gim trong khi vng trao i tc gim chm hn nhiu. Khi tng cng cung cp P, nng P cha trong cc c quan ca t bo cng tng theo, tuy nhin khi tng qu mc bnh thng th ch c P v c trong khng bo tng ln. V vy c th ni, P d tha c d tr khng bo di dng P v c.

Cc enzym: P v c cng c kh nng iu chnh tt trong nhiu qu trnh trao i cht ca thc vt. Vy nn s phn b P l cn thit iu chnh qu trnh trao i

48


cht ca t bo. c chua, s gim P v c khng bo trong t bo cht kch thch hot tnh ca enzym phosphofructokinaza. Enzym ny l enzym quan trng trong s phn gii c cht ca phn ng thu phn glyco v lm tng s h hp ca t bo trong qu trnh chn. Cng trong thi gian ny, s thiu ht P c th lm chm qu trnh chn ca qu.

Trong qu trnh tng hp tinh bt ca lc lp, P cng ng mt vai tr quan trng. Ch vi nng thp, P v c c th gy c ch qu trnh tng hp tinh bt. S d nh vy l do ADP-gluco-pyrophosphorylaza, enzym quan trng nht trong qu trnh tng hp tinh bt, b km hm bi P v c v c kch thch nh cc triossephosphat. V th, s cn bng gia cc hp cht c cha P l rt quan trng trong iu ho tng hp tinh bt lc lp. Ngoi ra, P v c cng tham gia qu trnh ny theo mt con ng khc. Cc phn t vn chuyn phosphat mng t bo s mang P v c vo t bo v cc triosephosphat ra ngoi t bo, lm nng P v c trong lc lp tng, triosephosphat gim. iu ny li tc ng n qu trnh tng hp tinh bt theo c ch trnh by trn. Ribuloza biphosphat (RuBP), vi vai tr nh mt cht nhn CO

2, l hp cht quan

trng trong s c nh CO2. S ti tng hp ny i hi phi c cc triosephosphat. Khi

nng P v c cao s kch thch gii phng cc triosephossphat ra khi lc lp, gy thiu ht cc cht ny, do lm km hm qu trnh c nh CO

2. Ngoi ra, phospho cn

quan trng trong vic iu khin hot ng ca nhiu enzym khc. Nng phospho ti u cho s sinh trng ca thc vt l 0,3 0,5 g/ kg trng lng kh. S thiu P lm cy chm ln, l cy c mu xanh thm do trong thi gian b thiu P, s pht trin ca l chm hn s tng hp dip lc t nn lm tng nng dip lc t trong l cy.

d. Lu hunh (S):

Lu hunh nh SO4

2- c hp th r cy vi tc chm. Ging nh nitrat,

lu hunh phi c kh trc khi s dng sinh tng hp cc hp cht c cha lu hunh nh amino axt, protein v enzym. Lu hunh dng cha kh c kt hp trong cc sulpholipid v cc polysaccharid.

S ng ho lu hunh: Bc u tin trong qu trnh ng ho lu hunh l s

hot ho gc SO4

2- nh enzym ATP sulfurylaza. Phn ng ny to ra adenosine

phosphosulfate (APS) v P v c. Tip theo l hai qu trnh ho hc hon ton khc nhau. Mt qu trnh khng din ra s kh lu hunh m to lin kt vi cc polysaccharide trong sulpholipid. Trong qu trnh th hai, lu hunh c kh thnh nhm SH (nhm thiol) v nhm sulfuryl ca APS c vn chuyn ti gluthantione (Glut-SH). Sau nhm SH c vn chuyn ti cho acetylserine v phn tch thnh acetat v cystein.

49


Cystein l sn phm bn u tin trong qu trnh ng ho v l tin cht ca tt c cc hp cht hu c c cha lu hunh trong thc vt, v d nh: protein, co-enzym, cc hp cht trao i cht th cp... Qu trnh ng ho lu hunh ch yu din ra lc lp. Khi thiu lu hunh, sinh tng hp protein b km hm, lng dip lc t trong l cy b gim st.

Cc protein: Lu hunh c mt trong cc protein c cha cystein v methionin. C hai axt amin ny u l tin cht ca tt c cc hp cht c cha lu hunh trong thc vt. Lu hunh, cu t hp thnh ca nhiu coenzym v cc nhm prosthetic, c chc nng quan trng trong rt nhiu phn ng oxy ho kh, c biu din nh sau:

R-SH + HS-R R-S-S-R.

Gc R c th l phn cn li ca phn t cystein nhng cng c th l tripeptit gluthatione. Gluthatione tan c trong nc v do , n ng vai tr nh mt h oxi ho kh lc lp v dch bo. Cu lu hunh gia hai phn t cystein rt quan trng trong cu trc bc ba ca phn t protein v hot ng ca enzym. Nhm SH, nh cp trn c trong thnh phn ca cc coenzym v APS, to thnh mt phn ca nhm chc nng trong phn t enzym.

Cc metallothionein: Cc hp cht phn t lng thp c cha lu hunh- metallothionein, thng hay c tm thy trong thc vt. Hu ht cc cht ny u c cha cystein. c bit, cc kim loi nh: ng, cadimi v km thng lin kt trong metallothionein. Gn nh chc chn nhng phn t protein nh ny tham gia vo s bi tit cc ion kim loi trn khi chng d tha, trc khi lin kt vi nhm chc nng SH ca cc

Documents

MỞ ĐẦU - cnsh.vnuf.edu.vncnsh.vnuf.edu.vn/documents/1235177/0/Cong nghe nuoi cay mo te bao thuc... · vật nhằm phục vụ sinh viên, học viên sau đại học và các