Më ®Çui.vietnamdoc.net/data/file/2015/Thang03/16/tao-chung-vi... · Web viewDo vậy, một yêu cầu cấp bách đặt ra là chúng ta phải tự thiết kế được các

MỞ ĐẦU

Mức độ gia tăng dân số nhanh chóng đã đẩy toàn nhân loại phải đối mặt với

thách thức lớn lao, đó là khắc phục sự đói nghèo. Vấn đề làm sao để tăng sản lượng

nông nghiệp, cung cấp lương thực ổn định cho con người luôn là mối quan tâm đặc

biệt của nhiều quốc gia trên thế giới. Tình hình lương thực bấp bênh còn khá phổ

biến ở nhiều nơi. Bên cạnh những nguyên nhân chính như nông nghiệp chưa được

coi trọng đúng mức, đất đai chưa được sử dụng hợp lý, thì sâu bệnh, đặc biệt là côn

trùng, là một trong những tác nhân gây thiệt hại chủ yếu cho mùa màng. Theo thống

kê của Dean & Adang [65], Oerke & đtg [154], những tổn thất mùa màng nghiêm

trọng trên toàn cầu do sâu bệnh gây ra ước tính chiếm từ 35 đến 42% tổng sản

lượng nông nghiệp hàng năm, trong đó thiệt hại do côn trùng chiếm từ 13-16%.

Mức độ thiệt hại có khi lên tới 70% nếu như cây trồng không được áp dụng các biện

pháp bảo vệ.

Hiện nay, rất nhiều loại thuốc trừ sâu hoá học đang được sử dụng để phòng

trừ sâu bệnh với chi phí tốn kém, gây ô nhiễm môi trường và gây độc hại cho sức

khoẻ con người, vật nuôi. Để cải thiện tình hình này, chúng ta cần ứng dụng những

kỹ thuật tiên tiến trong bảo vệ cây trồng nhằm xây dựng một nền nông nghiệp sạch,

bền vững. Việc tạo ra các giống cây trồng biến đổi di truyền (Genetically Modified

Crops, GMOs) có khả năng kháng sâu bệnh và côn trùng nói riêng nhờ kỹ thuật tạo

dòng phân tử, kỹ thuật chuyển gen thực vật được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng

thực tiễn nhằm nâng cao năng suất cây trồng và đem lại lợi ích tối đa cho nền nông

nghiệp. Hơn nữa, các tiến bộ đạt được còn khắc phục được những hạn chế khi sử

dụng các biện pháp trừ sâu hoá học cũng như các biện pháp sinh học truyền thống,

nâng mức độ an toàn cho con người, vật nuôi và cải thiện môi trường sinh thái.

Bằng các kỹ thuật di truyền mới này, triển vọng tạo ra các giống cây trồng mang

những đặc tính mong muốn trong thời gian tương đối ngắn đã trở thành hiện thực.

Đến nay hàng loạt gen mã hoá protein có hoạt tính diệt côn trùng gây hại (gen

1

kháng côn trùng) như gen cry của vi khuẩn Bacillus thuringiensis, gen mã hoá các

chất ức chế proteaza và ỏ-amylaza… được chuyển vào thực vật nhờ các phương

pháp thích hợp với sản phẩm là những cây trồng có khả năng tự kháng sâu bệnh.

Trên thế giới, khá nhiều phương pháp chuyển gen thực vật đã được nghiên

cứu và áp dụng thành công, như phương pháp vi tiêm, sử dụng súng bắn gen, xung

điện. Trong đó, phương pháp có giá trị thực tiễn cao và được sử dụng rộng rãi nhất

là phương pháp biến nạp gen thông qua vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens.

Với ưu điểm như ít tốn kém, dễ áp dụng trên các đối tượng cây trồng nên phương

pháp này rất phù hợp với điều kiện của các nước đang phát triển như Việt Nam [1].

Nhiều nơi trên thế giới, kỹ thuật chuyển và biểu hiện gen kháng côn trùng nói riêng

và gen có lợi nói chung vào cây trồng thông qua phương pháp này đã và đang là

công cụ hỗ trợ chính trong chọn giống thực vật. Ở nước ta, nghiên cứu chuyển gen

thực vật mới chỉ bắt đầu, chủ yếu tại các phòng thí nghiệm của Viện Công nghệ

Sinh học và Viện Sinh học Nhiệt đới (thuộc Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công

nghệ Quốc gia), Viện Di truyền Nông nghiệp và Viện Nghiên cứu Lúa đồng bằng

sông Cửu Long (thuộc Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn). Hầu hết các

nghiên cứu sử dụng gen chỉ thị và một số gen khác trên các vectơ plasmit được thiết

kế sẵn. Tuy nhiên, phần lớn các vectơ tái tổ hợp và các kết cấu gen được các nhà

sáng chế và công ty/ cơ quan đăng ký sở hữu trí tuệ dưới dạng các sáng chế hoặc

các giải pháp hữu ích. Về khía cạnh sở hữu trí tuệ, để được quyền sử dụng mỗi

thành phần trong vectơ tái tổ hợp, thông thường người nhận phải liên lạc với các

nhà sáng chế, cơ quan hoặc công ty sở hữu để ký các hợp đồng chuyển giao nguyên

liệu (Material Transfer Agreement, MTA). Qua các hợp đồng này, chúng ta thường

chỉ được sử dụng nguyên liệu cho mục đích nghiên cứu với rất nhiều ràng buộc về

khía cạnh xuất bản, sản phẩm nghiên cứu, sở hữu, chuyển giao... Rõ ràng, để có

được những vectơ mang gen tái tổ hợp có giá trị do nước ngoài thiết kế, bên cạnh

những chi phí lớn, còn có nhiều khó khăn phức tạp trong chuyển giao nguyên liệu

và công nghệ. Do vậy, một yêu cầu cấp bách đặt ra là chúng ta phải tự thiết kế được

các vectơ chuyển gen thực vật nói chung và vectơ mang đoạn khởi động đặc hiệu để

2

điều khiển biểu hiện gen kháng côn trùng nhằm mục đích chuyển và biểu hiện các

gen này trong các đối tượng cây trồng ở nước ta.

Trên cơ sở ý nghĩa lý luận và thực tiễn của hướng nghiên cứu này, chúng tôi

đã tiến hành đề tài: “Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen

kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng”, với các mục đích và nội dung nghiên

cứu chính sau đây:

Môc ®Ých nghiªn cøu

Sö dông çc kü thuËt sinh häc ph©n tö vµ c«ng nghÖ gen ®Ó nghiªn cøu çc ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt vµ gen cã ho¹t tÝnh kh¸ng c«n trïng. Trªn c¬ së ®ã, thiÕt kÕ çc vect¬ Ti-plasmit vµ t¹o chñng A. tumefaciens phôc vô c«ng nghÖ chuyÓn gen nh»m môc ®Ých n©ng cao tÝnh kh¸ng s©u bÖnh cña c©y trång.

Néi dung nghiªn cøu Su tËp vµ ph©n lËp çc ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt vµ

gen cã ho¹t tÝnh kh¸ng c«n trïng. ThiÕt kÕ çc vect¬ Ti-plasmit mang gen kh¸ng c«n trïng díi sù

®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng c¬ ®Þnh hoÆc ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt trong tÕ bµo E. coli.

T¹o çc chñng A. tumefaciens mang çc vect¬ Ti-plasmit chøa gen kh¸ng c«n trïng ®Ó chuyÓn vµo c©y trång.

ThiÕt kÕ vect¬ vµ biÓu hiÖn gen kh¸ng c«n trïng trong tÕ bµo E. coli.

T¹o kh¸ng thÓ kh¸ng protein cã ho¹t tÝnh diÖt c«n trïng phôc vô cho nghiªn cøu vµ gi¸m ®Þnh c©y chuyÓn gen.

Nh÷ng ®ãng gãp míi cña luËn ¸n

3

B¶n luËn ¸n nµy cã nh÷ng ®ãng gãp míi vÒ khoa häc vµ thùc tiÔn nh sau:

1. §· nh©n, t¹o dßng vµ ®äc tr×nh tù ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza (sucrose synthase) ë gièng lóa C71 cã kh¶ n¨ng ®iÒu khiÓn sù biÓu hiÖn gen ®Æc hiÖu ë bã m¹ch. §©y lµ ®o¹n khëi ®éng gen ®Çu tiªn ®îc ph©n lËp vµ ®äc tr×nh tù tõ mét gièng lóa ViÖt Nam. Tr×nh tù cña ®o¹n khëi ®éng nµy ®· ®îc ®¨ng ký trong çc Ng©n hµng tr×nh tù gen quèc tÕ.

2. §· t¹o ®îc mét kÕt cÊu gen míi ®ã lµ gen cryIA(c) díi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu bã m¹ch C71S-P nh»m môc ®Ých chuyÓn vµo çc gièng lóa ViÖt Nam t¹o kh¶ n¨ng kh¸ng s©u ®ôc th©n lóa.

3. §· thiÕt kÕ thµnh c«ng 4 vect¬ Ti-plasmit míi, cung cÊp nguyªn liÖu cho çc nghiªn cøu chuyÓn gen vµo c©y trång vµ nghiªn cøu ®o¹n khëi ®éng. Trong ®ã, gen cryIA(c) díi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng Ubiquitin hoÆc ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ë gièng lóa C71 ®· ®îc ®a vµo vect¬ Ti-plasmit c¶i tiÕn vµ vect¬ chuyÓn gen thÕ hÖ míi nhÊt sö dông hÖ thèng chän läc tÝch cùc (Positive Selection System).

4. §· hoµn thiÖn vµ sö dông ph¬ng ph¸p xung ®iÖn vµ ph¬ng ph¸p phèi ba bè mÑ ®Ó t¹o 4 chñng A. tumefaciens míi, trªn c¬ së çc chñng LBA4404 vµ EHA105, mang çc vect¬ Ti-plasmit chøa gen kh¸ng c«n trïng ®Ó chuyÓn vµo c©y trång.

5. LÇn ®Çu tiªn trong ®iÒu kiÖn ViÖt Nam ®· thµnh c«ng trong viÖc biÓu hiÖn gen cryIA(c) tæng hîp ho¸ häc b»ng vi khuÈn E. coli. Protein CryIA(c) t¸i tæ hîp sau khi tinh chÕ ®· ®îc dïng ®Ó s¶n xuÊt kh¸ng thÓ kh¸ng CryIA(c) nh»m môc ®Ých sö dông

4

lµm c«ng cô kiÓm tra sù cã mÆt cña s¶n phÈm gen cryIA(c) ë çc c©y trång ®îc chuyÓn gen.

6. Çc vect¬ Ti-plasmit míi ®· vµ ®ang ®îc ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc chuyÓn vµo lóa vµ çc lo¹i c©y trång quan träng kh¸c. Ngoµi ra, 2 chñng A. tumefaciens míi còng ®· ®îc chuyÓn giao cho ViÖn Nghiªn cøu Ng« (thuéc Bé N«ng nghiÖp vµ Ph¸t triÓn N«ng th«n) nh»m triÓn khai çc nghiªn cøu hîp t¸c chuyÓn gen cry vµo c©y ng« ViÖt Nam.

5

Ch¬ng 1. Tæng quan tµi liÖu

1.1 Vi khuÈn ®Êt A. tumefaciens vµ ph¬ng ph¸p chuyÓn gen vµo c©y trång

1.1.1 A. tumefaciens vµ hiÖn tîng biÕn n¹p gen thùc vËt trong tù nhiªn

Nh÷ng n¨m ®Çu thÕ kû 20, Smith vµ Townsend ®· ph¸t hiÖn ë mét sè c©y hai l¸ mÇm xuÊt hiÖn nh÷ng khèi u vµ t¸c nh©n g©y bÖnh chÝnh lµ vi khuÈn ®Êt A. tumefaciens. §Õn cuèi nh÷ng n¨m 1960, mèi quan hÖ gi÷a khèi u vµ vËt liÖu di truyÒn cña loµi vi khuÈn nµy ®· ®îc Braun vµ Schilperoort kh¸m ph¸. A. tumefaciens cã kh¶ n¨ng x©m nhiÔm thùc vËt, kÝch thÝch t¹o khèi u ngay t¹i çc vÕt th¬ng cña c©y chñ. Trong tù nhiªn, A. tumefaciens chñ yÕu tÊn c«ng c©y hai l¸ mÇm, ®Æc biÖt lµ nhãm thùc vËt cã hoa. Mét vµi loµi c©y mét l¸ mÇm thuéc hä hµnh tái vµ thuû tiªn mÉn c¶m yÕu víi A. tumefaciens [34].

Hoµn toµn kh¸c víi m« vµ tÕ bµo thùc vËt b×nh thêng, khèi u do A. tumefaciens sinh ra ph¸t triÓn rÊt m¹nh ngay trong ®iÒu kiÖn thiÕu hoocmon sinh trëng (auxin vµ cytokinin). Së dÜ nh vËy v× A. tumefaciens ®· chuyÓn mét ®o¹n ADN (Transfer DNA - T-ADN) sang tÕ bµo thùc vËt vµ T-ADN ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh sinh tæng hîp çc hîp chÊt ®ã. Ngoµi ra, çc khèi u còng sinh tæng hîp opin lµ çc axit amin (amino acid - aa) ®Æc biÖt vµ çc dÉn xuÊt cña ®êng. D¹ng opin ®îc tæng hîp cã thÓ lµ nopalin, octopin, agrocinopin, mannozapin vµ agropin phô thuéc vµo tõng chñng Agrobacterium. Trong ®ã, octopin vµ nopalin lµ hai d¹ng opin phæ biÕn. Opin ®îc vi khuÈn sö dông thay cho nguån cacbon vµ nit¬

6

nhê ho¹t ®éng cña gen chuyÓn ho¸ opin trªn plasmit g©y khèi u thùc vËt (Tumour inducing plasmid - Ti-plasmit) [44], [109].

C¬ chÕ ph©n tö cña sù h×nh thµnh khèi u ®· ®îc quan t©m nghiªn cøu nh»m t×m ra ph¬ng thøc phßng trõ bÖnh cho c©y. Tuy nhiªn, khi ph¸t hiÖn ra Ti-plasmit vµ kh¶ n¨ng tù chuyÓn T-ADN vµo genom thùc vËt, ngêi ta ®· ®Æc biÖt chó ý vµ khai th¸c kh¶ n¨ng sö dông chóng nh mét vect¬ tù nhiªn ®Ó chuyÓn çc gen quan t©m vµo thùc vËt nh»m t¹o c©y trång mang nh÷ng tÝnh tr¹ng mong muèn [34], [37], [54].

1.1.1.1 CÊu tróc vµ chøc n¨ng cña Ti-plasmit

Zaenen & ®tg, §¹i häc Ghent (BØ) lµ nhãm t¸c gi¶ ®Çu tiªn ph¸t hiÖn A. tumefaciens mang mét cÊu tróc di truyÒn ngoµi nhiÔm s¾c thÓ chøa hÇu hÕt çc gen liªn quan ®Õn sù h×nh thµnh khèi u. Tuy nhiªn, hä nghÜ r»ng ®ã lµ b¶n sao cña mét lo¹i virut x©m nhiÔm vi khuÈn. Thùc tÕ, yÕu tè di truyÒn nµy chÝnh lµ mét plasmit khæng lå víi kÝch thíc kho¶ng 200 kb. Çc chñng vi khuÈn cã quan hÖ gÇn gòi, nh vi khuÈn t¹o nèt sÇn ë rÔ (Rhizobium trifolii) vµ ë l¸ (Phyllobacterium myrsinacearum) còng cã kh¶ n¨ng h×nh thµnh khèi u ë thùc vËt khi bÞ nhiÔm Ti-plasmit. §iÒu ®ã kh¼ng ®Þnh vai trß quan träng cña yÕu tè l©y nhiÔm n»m trªn Ti-plasmit ®èi víi sù h×nh thµnh khèi u ë c©y chñ [54].

Ti-plasmit (h×nh 1.1) ®îc t×m thÊy ë tÊt c¶ çc chñng A. tumefaciens g©y nhiÔm vµ tån t¹i bÒn v÷ng ë nhiÖt ®é díi 300C. §©y lµ mét ph©n tö ADN m¹ch vßng, sîi kÐp vµ tån t¹i trong tÕ bµo nh mét ®¬n vÞ sao chÐp ®éc lËp. Ph©n tÝch di truyÒn cho thÊy, Ti-plasmit d¹ng octopin vµ d¹ng nopalin lµ hai d¹ng phæ biÕn nhÊt, ®Òu cã 4 vïng t¬ng ®ång, trong ®ã vïng T-ADN vµ vïng g©y ®éc (Virulence Region - vïng VIR), liªn quan trùc tiÕp tíi sù

7

h×nh thµnh khèi u ë thùc vËt. Hai vïng cßn l¹i chøa gen m· ho¸ cho viÖc sao chÐp plasmit (Origin of replication) vµ chuyÓn n¹p (Conjugative transfer) [34].

Trªn Ti-plasmit, chØ cã vïng T-ADN ®îc chuyÓn tõ vi khuÈn sang genom cña c©y bÞ bÖnh vµ tån t¹i bÒn v÷ng ë ®ã [87]. Tuy nhiªn, vïng nµy l¹i kh«ng m· ho¸ nh÷ng s¶n phÈm lµm trung gian cho qu¸ tr×nh chuyÓn T-ADN mµ cÇn cã sù trî gióp ®Æc biÖt cña çc gen g©y khèi u n»m trªn vïng VIR vµ trªn nhiÔm s¾c thÓ vi khuÈn (chv genes). Vïng VIR dµi kho¶ng 40 kb ®¶m nhËn chøc n¨ng g©y nhiÔm. ë Ti-plasmit d¹ng octopin, vïng VIR chøa tíi 24 gen g©y ®éc. S¶n phÈm protein do çc gen nµy m· ho¸ ®· kÝch thÝch sù t¸ch biÖt T-ADN, bao bäc che chë vµ gióp chóng tiÕp cËn víi genom cña c©y chñ. Ngoµi çc gen vir, çc gen trªn nhiÔm s¾c thÓ cña A. tumefaciens (nh chvA vµ chvB) còng ®ãng vai trß quan träng trong qu¸ tr×nh x©m nhËp cña A. tumefaciens vµo thµnh tÕ bµo thùc vËt [34], [109].

H×nh 1.1. B¶n ®å Ti-plasmit d¹ng octopin

1.1.1.2 CÊu tróc vµ chøc n¨ng cña ®o¹n T-ADN

Trong genom cña c©y bÞ khèi u, sè lîng b¶n sao cña T-ADN dao ®éng tõ mét vµi ®Õn h¬n 10. Chóng cã thÓ n»m trªn cïng mét locut hoÆc t¸ch rêi vµ g¾n víi çc vïng kh¸c nhau trªn genom thùc vËt mét çch ngÉu nhiªn. ë cµ chua, 7 ®o¹n T-ADN ®· g¾n vµo 5 nhiÔm s¾c thÓ thùc vËt, trong khi ë Crepis capillaris, T-ADN chØ ®îc t×m thÊy trªn 3 nhiÔm s¾c thÓ [109].

KÕt qu¶ ph©n tÝch tr×nh tù gen trªn T-ADN ë çc Ti-plasmit kh¸c nhau cho thÊy, T-ADN ®îc giíi h¹n bëi mét ®o¹n tr×nh tù lÆp l¹i gÇn nh hoµn toµn tõ kho¶ng 25 bp vµ gäi lµ ®o¹n biªn. Chóng

8

lµ dÊu hiÖu nhËn biÕt cho qu¸ tr×nh chuyÓn vµ x©m nhËp cña T-ADN vµo tÕ bµo thùc vËt. ë ®o¹n biªn ph¶i (Right Border - RB) cã yÕu tè ®iÒu khiÓn cis cÇn cho qu¸ tr×nh chuyÓn T-ADN. §o¹n biªn tr¸i (Left Border - LB) gi¸n tiÕp tham gia vµo qu¸ tr×nh chuyÓn T-ADN vµ lµ dÊu hiÖu ®Ó qu¸ tr×nh nµy kÕt thóc b×nh thêng [147], [152]. ë Ti-plasmit d¹ng nopalin, T-ADN x©m nhËp vµo genom thùc vËt ë d¹ng mét ®o¹n liªn tôc dµi 22 kb. Trong khi, ë Ti-plasmit d¹ng octopin, ®o¹n T-ADN nµy chØ dµi 13 kb. ë mét sè m« thùc vËt, khèi u l¹i chøa mét ®o¹n ADN kÝch thíc 8 kb [208]. T-ADN mang rÊt nhiÒu gen nh: (1) Çc gen m· ho¸ nh÷ng enzym cÇn thiÕt cho qu¸ tr×nh sinh tæng hîp opin; (2) Çc gen g©y khèi u nh tms1, tms2, tmr m· ho¸ cho çc enzym liªn quan ®Õn qu¸ tr×nh sinh tæng hîp auxin vµ cytokinin [34], [109].

1.1.1.3 Qu¸ tr×nh chuyÓn T-ADN vµo tÕ bµo thùc vËt

Çc tÕ bµo c©y bÞ tæn th¬ng sÏ tiÕt ra çc hîp chÊt dÉn dô ho¸ häc vi khuÈn nh acetosyringon, α-hydroxy-acetosyringon. Díi t¸c dông cña çc hîp chÊt nµy, A. tumefaciens nhËn biÕt råi b¸m vµo thµnh tÕ bµo chñ vµ chuyÓn T-ADN vµo tÕ bµo thùc vËt. Qu¸ tr×nh nµy ®îc sù trî gióp ®Æc biÖt cña çc gen vir vµ ®o¹n biªn ph¶i, tr¸i [32], [34]. Còng chÝnh çc hîp chÊt nµy, víi vai trß c¶m øng, gióp cho çc gen vïng VIR ho¹t ®éng vµ t¨ng cêng biÓu hiÖn. Khi vi khuÈn x©m nhiÔm tÕ bµo thùc vËt qua vÕt th¬ng, s¶n phÈm gen virA sÏ nhËn biÕt sù cã mÆt vµ t¬ng t¸c víi çc ph©n tö acetosyringon råi truyÒn th«ng tin ngo¹i bµo nµy vµo trong tÕ bµo dÉn ®Õn sù ho¹t ®éng cña çc protein VirG. TiÕp theo, VirG l¹i kÝch ho¹t çc gen g©y ®éc kh¸c nh virB, virC, virD vµ virE còng nh t¨ng cêng møc ®é phiªn m· cña virG [34], [44], [144]. Sau ®ã, virD hç trî qu¸ tr×nh t¸ch T-ADN thµnh hai sîi ®¬n. Mét sîi sÏ

9

chuyÓn sang tÕ bµo thùc vËt víi ®Çu 5' ®i tríc. Sîi ®¬n cßn l¹i sÏ lµm khu«n ®Ó tæng hîp nªn sîi ADN bæ sung míi. Trong qu¸ tr×nh di chuyÓn, sîi ADN ®¬n ®îc g¾n víi protein VirE ®Ó chui qua rÊt nhiÒu mµng tríc khi vµo ®îc ®Õn nh©n tÕ bµo thùc vËt. Protein VirB n»m trªn mµng tÕ bµo vi khuÈn cã nhiÖm vô chuyÓn trùc tiÕp T-ADN sîi ®¬n sang tÕ bµo thùc vËt (h×nh 1.2) [209], [210]. Qu¸ tr×nh chuyÓn T-ADN nµy gÇn gièng víi qu¸ tr×nh tiÕp hîp ë vi khuÈn, trong ®ã protein VirB t¬ng ®¬ng víi yÕu tè F, ho¹t ®éng nh mét cÇu nèi chuyÓn gen. Sau khi T-ADN qua mµng tÕ bµo, chóng ®i th¼ng vµo nh©n vµ kÕt hîp víi genom thùc vËt ë nh÷ng vÞ trÝ ngÉu nhiªn. T¹i ®ã, çc gen trªn T-ADN, nhê sù ®iÒu khiÓn cña gen thùc vËt, b¾t ®Çu ho¹t ®éng vµ s¶n sinh ra auxin, cytokinin vµ opin g©y nªn sù ph¸t triÓn th¸i qu¸ cña hµng lo¹t tÕ bµo l©n cËn dÉn ®Õn sù h×nh thµnh khèi u.

H×nh 1.2. Qu¸ tr×nh chuyÓn T-ADN vµo tÕ bµo thùc vËt [208]

1.1.2C«ng nghÖ gen thùc vËt vµ kü thuËt chuyÓn gen nhê A. tumefaciens1.1.2.1 HÖ thèng chuyÓn gen nhê A. tumefaciens

Nh×n chung, hÖ thèng chuyÓn gen nµy bao gåm çc giai ®o¹n: (i) ChuyÓn vïng T-ADN vµo genom thùc vËt; (ii) BiÓu hiÖn gen quan t©m (Gene of Interest) trong tÕ bµo thùc vËt; (iii) T¸i sinh tÕ bµo thùc vËt thµnh c©y hoµn chØnh. Nh÷ng yÕu tè quan träng vµ cÇn thiÕt cho hÖ thèng chuyÓn gen nµy bao gåm: (1) Çc gen vir; (2) §o¹n biªn ph¶i vµ tr¸i; (3) Vïng T-ADN: ngoµi hai ®o¹n biªn, hÇu hÕt çc gen trªn T-ADN cã thÓ ®îc lo¹i bá vµ thay thÕ b»ng çc gen quan t©m ®Ó chuyÓn vµo c©y trång. §o¹n T-ADN

10

®îc c¶i biÕn di truyÒn nµy gäi lµ T-ADN bÞ v« hiÖu ho¸ (disarmed T-DNA), mÊt chøc n¨ng g©y khèi u; (4) Vïng mang çc yÕu tè ®iÒu khiÓn cis: nh ®o¹n khëi ®éng vµ ®o¹n kÕt thóc hç trî vµ ®iÒu khiÓn sù biÓu hiÖn çc gen; (5) Çc gen chØ thÞ chän läc [71].

Çc lo¹i vect¬ Ti-plasmit nh©n t¹o: Ti-plasmit tù nhiªn cã kÝch thíc qu¸ lín nªn rÊt khã ®Ó sao chÐp ë møc ph©n tö còng nh kh«ng ®¬n gi¶n ®Ó tiÕn hµnh chuyÓn gen. MÆt kh¸c, chóng l¹i chøa çc gen tæng hîp hoocmon sinh trëng thùc vËt vµ opin kh«ng cÇn thiÕt vµ g©y khèi u cho c©y bÞ x©m nhiÔm nªn kh«ng ®îc dïng trùc tiÕp lµm vect¬. Trªn c¬ së nµy, Ti-plasmit ®· ®îc nghiªn cøu c¶i biÕn nh c¾t bá çc gen kh«ng quan träng, l¾p thªm çc gen cÇn thiÕt vµo vïng t¹o dßng ®a n¨ng (Multi Cloning Site - MCS) t¹o hai hÖ thèng vect¬ chuyÓn gen hiÖu qu¶: vect¬ liªn hîp (co-integrate vector) vµ vect¬ hai nguån (binary vector) [197]. Nhê vËy, c©y trång ®îc biÕn n¹p Ti-plasmit c¶i biÕn võa mang gen quan t©m, võa cã kh¶ n¨ng t¸i sinh vµ ph¸t triÓn b×nh thêng [66], [90].

a) Vect¬ liªn hîp: ®îc x©y dùng trªn c¬ së sù t¸i tæ hîp gi÷a vïng t¬ng ®ång n»m trªn plasmit vi khuÈn (nh vect¬ cña E. coli) víi vïng T-ADN trªn Ti-plasmit cña A. tumefaciens. Trong ®ã, ngêi ta gi÷ l¹i vïng VIR, lo¹i bá vïng m· ho¸ chøc n¨ng g©y khèi u vµ thay thÕ b»ng nh÷ng ®o¹n ADN míi trong Ti-plasmit (h×nh 1.3). Nh vËy, cã ba lo¹i vect¬ tham gia vµo hÖ thèng vect¬ liªn hîp: (1) Ti-plasmit: çc gen g©y khèi u ®· bÞ v« hiÖu ho¸ b»ng çch thay thÕ vµo ®ã gen kh¸ng kanamycin cña vi khuÈn (HÖ thèng vect¬ SEV) hoÆc mét ®o¹n tr×nh tù cña vect¬ pBR322 (HÖ thèng vect¬ pGV); (2) Vect¬ trung gian: cã nguån gèc tõ pBR322 víi kÝch thíc

11

nhá vµ ®îc sö dông ®Ó bæ trî chøc n¨ng kh«ng u viÖt cña Ti-plasmit (kÝch thíc lín vµ thiÕu vïng MCS). Chóng ®îc nh©n lªn trong E. coli vµ chuyÓn sang A. tumefaciens nhê qu¸ tr×nh tiÕp hîp. Do kh«ng thÓ sao chÐp trong A. tumefaciens nªn chóng mang nh÷ng ®o¹n ADN t¬ng ®ång víi T-ADN. (3) Vect¬ trî gióp: tån t¹i trong E. coli, cã kÝch thíc nhá, chøa çc gen di ®éng (mobilization) vµ gen chuyÓn (transfer) gióp cho qu¸ tr×nh tiÕp hîp vµ chuyÓn gen vµo A. tumefaciens [197].

Khi tiÕp hîp, Ti-plasmit vµ vect¬ trung gian ®· x¶y ra qu¸ tr×nh t¸i tæ hîp, gen quan t©m ®îc chuyÓn tõ E. coli sang vïng T-ADN cña A. tumefaciens ®Ó t¹o ra cÊu tróc T-ADN liªn hîp. Nh vËy, vect¬ liªn hîp thêng bao gåm çc thµnh phÇn chÝnh: (1) Çc vÞ trÝ t¹o dßng thÝch hîp; (2) Çc gen vir; (3) §o¹n biªn ph¶i vµ tr¸i; (4) Gen quan t©m; (5) ChØ thÞ chän läc vi khuÈn ho¹t ®éng trong E. coli vµ A. tumefaciens; (6) ChØ thÞ chän läc thùc vËt; (7) Vïng sao chÐp trong E. coli [186]. Vect¬ pGV3850 lµ mét vect¬ liªn hîp ®iÓn h×nh do Zambryski & ®tg [207] thiÕt kÕ. Çc gen g©y khèi u trªn Ti-plasmit d¹ng nopalin (C58) ®· bÞ lo¹i bá vµ thay thÕ b»ng pBR322. Gen quan t©m ®îc t¹o dßng trong pBR322 vµ ®îc ®a vµo vïng T-ADN cña pGV3850 th«ng qua qu¸ tr×nh t¸i tæ hîp víi sù trî gióp cña pGJ28 vµ pR64drd11 trong tÕ bµo E. coli GJ28. Ngoµi pGV3850, hµng lo¹t vect¬ liªn hîp kh¸c còng ®· ®îc sö dông nh pMON200, pMON273, pGV831...

MÆc dï, vect¬ liªn hîp ®îc thiÕt kÕ cho phÐp sù t¸i tæ hîp ®Æc hiÖu vÞ trÝ dùa trªn hÖ thèng t¸i tæ hîp cña phag¬ P1 (nh thÕ hÖ wP1/ oxP-Cre), nhng vect¬ nµy Ýt ®îc sö dông, do:

(i) Nh÷ng tr×nh tù t¬ng ®ång rÊt dµi gi÷a Ti-plasmit vµ plasmit cña E. coli g©y khã kh¨n khi thao t¸c vµ sö dông;

12

(ii) HiÖu qu¶ chuyÓn gen thÊp víi sè lîng b¶n sao cña vect¬ rÊt Ýt [197].

H×nh 1.3. S¬ ®å vect¬ liªn hîpb) Vect¬ hai nguån: Trªn c¬ së ph¸t hiÖn vïng VIR kh«ng cÇn n»m trªn cïng mét plasmit víi vïng T-ADN mµ vÉn ®iÒu khiÓn ®îc sù chuyÓn vµ x©m nhËp cña T-ADN vµo genom thùc vËt, ngêi ta ®· nghiªn cøu vµ hoµn chØnh hÖ thèng chuyÓn gen thùc vËt nhê vect¬ hai nguån trong ®ã vïng T-ADN vµ vïng VIR n»m trªn hai plasmit kh¸c nhau nhng trong cïng mét chñng A. tumefaciens. Cã hai lo¹i vect¬ ®îc sö dông trong hÖ thèng vect¬ hai nguån: (1) Plasmit nhá cã kh¶ n¨ng tù sao chÐp vµ cã phæ vËt chñ réng chøa gen quan t©m trªn T-ADN, ®o¹n biªn ph¶i vµ tr¸i, chØ thÞ chän läc vµ sao chÐp trong E. coli vµ A. tumefaciens, chØ thÞ chän läc thùc vËt; (2) Ti-plasmit trî gióp: n»m trong A. tumefaciens, víi toµn bé vïng VIR ®îc gi÷ l¹i nhng lo¹i bá hoµn toµn vïng T-ADN vµ ®o¹n biªn ph¶i, tr¸i (h×nh 1.4) [104], [105].

H×nh 1.4. S¬ ®å vect¬ hai nguån

Nh×n chung, qu¸ tr×nh biÕn n¹p ë vect¬ hai nguån diÔn ra nh sau: (i) Plasmit nhá ®îc nh©n lªn trong E. coli, sau ®ã ®îc chuyÓn trùc tiÕp hoÆc qua qu¸ tr×nh tiÕp hîp vµo tÕ bµo A. tumefaciens chøa s½n Ti-plasmit trî gióp; (ii) TÕ bµo thùc vËt ®îc nu«i cÊy ®ång thêi víi A. tumefaciens ®Ó chuyÓn T-ADN vµo genom thùc vËt; (iii) Chän läc tÕ bµo thùc vËt trong nh÷ng ®iÒu kiÖn thÝch hîp [37].

Thùc tÕ cho thÊy, plasmit víi hai ®¬n vÞ sao chÐp cã thÓ kh«ng bÒn v÷ng trong E. coli khi c¶ hai vïng nµy cïng ho¹t ®éng. Tuy nhiªn, vect¬ hai nguån cã mét sè u ®iÓm nh: (i) Kh«ng x¶y ra

13

qu¸ tr×nh t¸i tæ hîp gi÷a çc plasmit; (ii) KÝch thíc vect¬ kh¸ nhá. Nhê vËy, hiÖu qu¶ qu¸ tr×nh chuyÓn gen tõ E. coli sang A. tumefaciens ®· t¨ng lªn. HiÖn nay, vect¬ hai nguån ®îc sö dông réng r·i víi rÊt nhiÒu lo¹i ®îc thiÕt kÕ phï hîp víi yªu cÇu cña qu¸ tr×nh chuyÓn gen nh:● ThÕ hÖ vect¬ pGA bao gåm: (1) Vïng sao chÐp trong E. coli vµ A. tumefaciens cã nguån gèc tõ RK2; (2) YÕu tè ®iÒu khiÓn cis cÇn cho qu¸ tr×nh tiÕp hîp; (3) §o¹n biªn ph¶i vµ tr¸i; (4) Gen m· ho¸ neomycin phosphotransferaza II (neomycin phosphotransferase II gene - nptII) kh¸ng kanamycin vµ G418 trong thùc vËt; (5) Vïng MCS. Mét sè vect¬ ®Æc biÖt trong thÕ hÖ pGA nh pGA580, pGA581-583 ®· ®îc thiÕt kÕ víi: (i) vïng sao chÐp ColE1 ho¹t ®éng trong E. coli (nguån gèc tõ pBR322), vµ mét ®o¹n tr×nh tù chøa vÞ trÝ cos cña phag¬ Lambda nh»m ph©n lËp çc ®o¹n cã kÝch thíc lín tíi 40kb; (ii) vïng MCS n»m kÒ gen m· ho¸ chloramphenicol acetyltransferaza (chloramphenicol acetyltransferase gene - cat) khuyÕt ®o¹n khëi ®éng t¹o ®iÒu kiÖn ®Ó nghiªn cøu cÊu tróc vµ chøc n¨ng cña ®o¹n khëi ®éng; (iii) Cã vïng MCS n»m gi÷a ®o¹n khëi ®éng thùc vËt vµ ®o¹n kÕt thóc ®Ó g¾n vµ biÓu hiÖn çc gen quan t©m [31].● HÖ thèng vect¬ pCG víi: (1) Vïng sao chÐp cã nguån gèc tõ pRiHRI cña A. rhizogenes gióp pCG bÒn v÷ng h¬n trong A. tumefaciens so víi vïng sao chÐp tõ RK2; (2) Vïng ColE1 ho¹t ®éng trong E. coli [140].● ThÕ hÖ vect¬ pCIT: cã chøa vïng MCS vµ chØ thÞ chän läc thùc vËt, nh gen m· ho¸ hygromycin phosphotransferaza (hygromycin phosphotransferase gene - hpt) kh¸ng hygromycin ë vect¬ pCIT30, hoÆc nptII ë vect¬ pCIT101-104. Çc vect¬ kh¸c cã vÞ trÝ Lambda cos cho phÐp ph©n lËp çc ®o¹n cã kÝch thíc lín tíi

14

46 kb vµ chøa çc vïng cÇn thiÕt ®Ó chuyÓn gen nhê A. tumefaciens [137].● pGPTV: chøa gen chän läc thùc vËt, nh nptII, hpt, gen m· ho¸ phosphinothricin acetyl transferaza (phosphinothricin acetyl transferase gene - bar) n»m kÒ vÞ trÝ LB nh»m t¨ng cêng kh¶ n¨ng chuyÓn gen quan t©m vµo tÕ bµo thùc vËt vµ biÓu hiÖn gen chØ thÞ chän läc [37].● pPZP: cã kÝch thíc nhá vµ rÊt ®a n¨ng víi çc ®Æc tÝnh: (1) Chøa ®o¹n biªn ph¶i vµ tr¸i cña pTiT37; (2) Çc vïng ColE1 vµ pVS1 ®Ó sao chÐp trong E. coli vµ A. tumefaciens; (3) ChØ thÞ chän läc vi khuÈn nh chloramphenicol (pPZP100) hoÆc Spectinomycin (pPZP200); (4) ChØ thÞ chän läc thùc vËt nh gen kh¸ng kanamycin, gentamycin; (5) Ngoµi ra, pPZP cßn chøa ®o¹n lacZ víi vïng MCS cña pUC18 n»m gi÷a ®o¹n biªn ph¶i vµ gen chän läc thùc vËt [90].● pBECK2000: cã chøa ®o¹n biªn ph¶i vµ tr¸i tæng hîp nh©n t¹o vµ gen bar. H¬n n÷a, chóng sö dông hÖ thèng t¸i tæ hîp ®Æc hiÖu vÞ trÝ phag¬ P1 Cre/ lox P cho phÐp qu¸ tr×nh chuyÓn vµ x©m nhËp gen chän läc vµ gen quan t©m vµo genom thùc vËt ®îc diÔn ra ®ång thêi (trªn cïng T-ADN) hoÆc trªn hai ®o¹n T-ADN kh¸c nhau cña A. tumefaciens. ThÕ hÖ vect¬ nµy còng cho phÐp c¾t bá gen chän läc khái genom thùc vËt ë nh÷ng vÞ trÝ ®Æc hiÖu sau khi chóng ®· ®îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo thùc vËt [142].● Vect¬ hai nguån BAC (Binary-BAC: BiBAC): rÊt phï hîp ®Ó chuyÓn çc ph©n tö ADN cã kÝch thíc lín tíi 150 kb vµo genom thùc vËt. BiBAC cã chøa vïng sao chÐp ®¬n trong E. coli vµ A. tumefaciens. Plasmit trî gióp mang nhiÒu b¶n sao cña çc gen vir gióp cho T-ADN kÝch thíc rÊt lín vÉn ®îc chuyÓn nguyªn vÑn vµo genom thùc vËt [93], [94].

15

● pGREEN: lµ plasmit kÝch thíc nhá víi: (1) Vïng sao chÐp cã phæ vËt chñ réng ORI pSa vµ vïng ColE1 cã nguån gèc tõ pUC; (2) Gen rep A m· ho¸ chøc n¨ng sao chÐp trong E. coli vµ A. tumefaciens n»m trªn plasmit t¬ng thÝch (pSoup) trong A. tumefaciens; (3) Vïng MCS tõ pBlueScript cho phÐp s¾p xÕp çc gen chän läc vµ gen quan t©m theo ý muèn [96], [97].

1.1.2.2 Thµnh tùu chuyÓn gen vµo c©y trång nhê A. tumefaciens

Mét trong nh÷ng thÝ nghiÖm chuyÓn gen ®Çu tiªn ®· sö dông A. tumefaciens ®Ó ®a gen kh¸ng kh¸ng sinh vµo c©y thuèc l¸ [99]. Sau ®ã, A. tumefaciens ®· ®îc chøng minh lµ mét ph¬ng tiÖn rÊt hiÖu qu¶ ®Ó ®a gen quan t©m vµo rÊt nhiÒu loµi c©y trång quan träng [57].

● ChuyÓn gen vµo c©y hai l¸ mÇm: §Õn nay, trªn ®èi tîng c©y hai l¸ mÇm, ph¬ng ph¸p chuyÓn gen nhê A. tumefaciens ®îc ®¸nh gi¸ lµ hiÖu qu¶ nhÊt vµ ®îc thùc hiÖn kh¸ ®¬n gi¶n víi sù hç trî cña çc chØ thÞ chän läc. §Çu nh÷ng n¨m 1980, çc c©y thuèc l¸ mang T-ADN víi gen m· ho¸ alcohol dehydrogenaza (alcohol dehydrogenase - Adh) cña nÊm men vµ nptII ®· ®îc t¸i sinh [110]. Firoozabady & ®tg còng ®· thu ®îc c©y b«ng chuyÓn gen khi sö dông nh÷ng m¶nh l¸ mÇm tõ h¹t n¶y mÇm 12 ngµy tuæi nu«i cÊy víi A. tumefaciens mang Ti-plasmit cã chøa gen nptII [78]. Tõ ®ã tíi nay, rÊt nhiÒu loµi c©y ®· ®îc chuyÓn gen thµnh c«ng, nh cµ chua, khoai t©y, c¶i, híng d¬ng, d-a hÊu, khoai lang [115], [202]. Trong nh÷ng ®iÒu kiÖn ®Æc biÖt, A. tumefaciens còng cã thÓ chuyÓn ®îc gen vµo genom cña ®Ëu t¬ng vµ nhiÒu loµi c©y hai l¸ mÇm kh¸c [155].

16

● ChuyÓn gen vµo c©y mét l¸ mÇm: Cho ®Õn nh÷ng n¨m gÇn ®©y, ph¬ng ph¸p nµy vÉn cßn Ýt thµnh c«ng trªn c©y mét l¸ mÇm. Nguyªn nh©n cã thÓ do c©y mét l¸ mÇm kh«ng mÉn c¶m víi sù x©m nhiÔm cña A. tumefaciens. HiÖu qu¶ chuyÓn gen thÊp còng cã thÓ do sù c¶n trë trong qu¸ tr×nh biÕn n¹p nh: sù dÉn dô ho¸ häc cña A. tumefaciens víi çc tÕ bµo thùc vËt bÞ tæn th¬ng, sù g¾n kÕt cña A. tumefaciens vµo tÕ bµo thùc vËt, sù c¶m øng cña nh÷ng ph©n tö nhËn biÕt ë thùc vËt víi çc gen vir, sù sao chÐp T-ADN, sù chuyÓn vµ x©m nhËp cña T-ADN vµo genom thùc vËt [192]. MÆc dï vËy, rÊt nhiÒu phßng thÝ nghiÖm trªn thÕ giíi ®· tiÕn hµnh nghiªn cøu vµ chuyÓn gen thµnh c«ng vµo ng«, lóa, lay-¬n, m¨ng t©y vµ çc loµi c©y kh¸c b»ng çch chän lùa nguyªn liÖu ban ®Çu, kü thuËt t¸i sinh c©y, ®iÒu kiÖn nu«i cÊy m«, vect¬ vµ chñng vi khuÈn sö dông thÝch hîp [49], [72], [147], [163]. Trªn ®èi tîng c©y ng«, kü thuËt t¸i sinh c©y sau biÕn n¹p ®· thµnh c«ng khi sö dông “siªu vect¬” hai nguån (super binary vector) trong ®ã ph«i ng« cha trëng thµnh cña çc dßng ng« lai nh A188, Hi II ®îc g©y nhiÔm bëi çc chñng A. tumefaciens mang thªm çc b¶n sao cña virB, virC, vµ virG [152]. Ishida & ®tg ®· ®a ra ph¬ng ph¸p nu«i cÊy Agrobacterium mang vect¬ hai nguån víi ph«i ng« cha trëng thµnh cho hiÖu qu¶ chuyÓn gen t¨ng tõ 5% lªn 30% [112]. N¨m 2002, sö dông hÖ thèng vect¬ hai nguån chuÈn, Frame & ®tg ®· hoµn chØnh quy tr×nh biÕn n¹p gen vµo ng« [80]. ë lóa, Hiei & ®tg ®· sö dông chñng A. tumefaciens g©y ®éc vµ vect¬ hai nguån ®Æc biÖt mang mét vµi gen vir. Trong sè rÊt nhiÒu c©y chuyÓn gen thu ®îc, cã kho¶ng 35% c©y mang 1 b¶n sao cña gen chuyÓn, cßn l¹i mang tõ 2 ®Õn 4 b¶n sao [102]. Vijayachandra & ®tg ®· tËp trung nghiªn cøu kh¶ n¨ng c¶m øng cña çc m« lóa víi çc gen vir nh»m t×m ra lo¹i m« thÝch hîp nhÊt ®Ó chuyÓn gen vµo lóa [192]. Riazuddin & ®tg ®·

17

sö dông vect¬ chøa gen cryIA(c) díi sù ®iÒu khiÓn cña Ubi-P vµ gen hpt ®Ó chuyÓn vµo lóa t¹o kh¶ n¨ng kh¸ng c«n trïng ¨n l¸ [166]. Komari & ®tg ®· sö dông vect¬ víi 2 ®o¹n tr×nh tù T-ADN mang 2 gen kh¸c nhau ®Ó chuyÓn vµo lóa vµ ®· thu ®îc rÊt nhiÒu thÓ biÕn n¹p, trong ®ã ®· chøng minh ®îc sù x©m nhiÔm vµ ph©n ly cña T-ADN ë thÕ hÖ R0 vµ R1 [124].

Nhê kü thuËt chuyÓn gen hiÖu qu¶ nµy, gen quan t©m cã thÓ dÔ dµng ®îc chuyÓn vµo genom thùc vËt vµ ®îc ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn ë nh÷ng m«, c¬ quan ®Æc biÖt trong nh÷ng giai ®o¹n ph¸t triÓn nhÊt ®Þnh. Sè lîng gen quan t©m ®îc t¹o dßng, ®a vµo vect¬ thÝch hîp ®Ó chuyÓn vµo c©y trång ngµy mét nhiÒu vµ s¶n phÈm cña qu¸ tr×nh chuyÓn gen lµ hµng lo¹t c©y trång mang nh÷ng tÝnh tr¹ng mong muèn.

1. 2 thiÕt kÕ vect¬ mang gen m· ho¸ protein cã ho¹t tÝnh diÖt c«n trïng ®Ó chuyÓn vµo c©y trång nhê a. tumefaciens

Hµng n¨m chi phÝ cho ho¸ chÊt n«ng nghiÖp toµn cÇu chiÕm kho¶ng 7,8 tû ®« la Mü [154]. H¬n n÷a, sö dông thuèc trõ s©u ho¸ häc cßn ¶nh hëng nghiªm träng ®Õn m«i trêng sinh th¸i. MÆc dï lîng ho¸ chÊt ®îc sö dông rÊt nhiÒu, thiÖt h¹i do c«n trïng g©y h¹i thùc vËt vÉn chiÕm h¬n 10% tæng s¶n lîng hµng n¨m [35]. Ngoµi ra, quÇn thÓ s©u h¹i cã kh¶ n¨ng kh¸ng thuèc trõ s©u ho¸ häc ®· t¨ng lªn h¬n 500 loµi [126]. V× vËy, híng chiÕn lîc thiÕt kÕ vect¬ mang gen kh¸ng c«n trïng ®· më ra triÓn väng míi trong c«ng nghÖ chuyÓn gen nh»m t¹o c©y trång tù kh¸ng s©u bÖnh. RÊt nhiÒu loµi c©y trång ®· nhËn ®îc gen kh¸ng c«n trïng vµ h×nh thµnh kh¶ n¨ng diÖt c«n trïng g©y h¹i.

1.2.1 Çc lo¹i vect¬ chÝnh

18

HiÖn nay cã kh¸ nhiÒu lo¹i vect¬, nh plasmit, cosmit, phag¬, nhiÔm s¾c thÓ nh©n t¹o cña vi khuÈn vµ nÊm men. Plasmit rÊt th«ng dông. Çc lo¹i vect¬ kh¸c thêng ®îc sö dông cho çc môc ®Ých ®Æc hiÖu h¬n. ViÖc nghiªn cøu, øng dông gen quan t©m còng nh çc gen kh¸ng c«n trïng thêng b¾t ®Çu b»ng kü thuËt thiÕt kÕ çc vect¬ plasmit nµy. TiÕn bé ®¸ng kÓ ®¹t ®îc khi hÖ thèng vect¬ chuyÓn gen thùc vËt thÕ hÖ míi ra ®êi gióp t¨ng n¨ng suÊt, chÊt lîng c©y trång vµ c¶i thiÖn m«i trêng sinh th¸i.

1.2.1.1 Vect¬ t¹o dßng

§©y lµ çc plasmit n»m ngoµi nhiÔm s¾c thÓ cã kÝch thíc nhá vµ chøa gen chän läc ®îc sö dông ®Ó t¹o dßng çc ®o¹n ADN. Chóng ®îc ph¸t hiÖn ®Çu tiªn ë vi khuÈn, sau ®ã kh«ng ngõng ®-îc c¶i tiÕn víi nhiÒu ®Æc tÝnh quý: (1) Plasmit thÕ hÖ thø nhÊt nh ColE1, pSC101 nguån gèc tù nhiªn cã rÊt Ýt çc ®Æc tÝnh cÇn thiÕt; (2) Plasmit thÕ hÖ thø hai nh pBR322 ®îc thiÕt kÕ nh©n t¹o trªn c¬ së tËp trung çc tÝnh tr¹ng quý cña plasmit tù nhiªn vµ ®îc sö dông ®Ó biÕn n¹p gen quan t©m vµo E. coli nh»m t¹o dßng vµ nh©n lªn víi lîng lín. Chóng thêng chøa vïng sao chÐp trong E. coli, chØ thÞ chän läc vi khuÈn vµ vïng MCS. Plasmit pBR322 vµ çc thÕ hÖ vect¬ biÓu hiÖn cã nguån gèc tõ pBR322 kh¸ bÒn, tån t¹i trong tÕ bµo chñ qua nhiÒu thÕ hÖ nu«i cÊy ngay trong ®iÒu kiÖn kh«ng cã kh¸ng sinh chän läc. Tuy nhiªn, trong mét vµi trêng hîp, plasmit cã thÓ kh«ng bÒn v÷ng khi protein t¸i tæ hîp cã ho¹t tÝnh ®éc ¶nh hëng ®Õn sinh trëng cña tÕ bµo chñ [27]; (3) Plasmit thÕ hÖ thø ba: nh pUC, pSP, pBluescript cã kÝch thíc nhá nªn sao chÐp rÊt nhanh trong tÕ bµo vi khuÈn.

1.2.1.2 Vect¬ biÓu hiÖn

19

§©y lµ ph¬ng tiÖn ®Ó biÓu hiÖn çc gen quan t©m ®· ®îc t¹o dßng. Mét trong nh÷ng hÖ thèng vect¬ m¹nh ®îc sö dông réng r·i ®Ó t¹o dßng vµ biÓu hiÖn çc protein t¸i tæ hîp trong tÕ bµo E. coli lµ hÖ thèng vect¬ pET [183]. Díi sù ®iÒu khiÓn cña çc tÝn hiÖu phiªn m· vµ dÞch m· cã nguån gèc tõ phag¬ T7, gen quan t©m ®îc t¹o dßng trong pET, sau ®ã ®îc chuyÓn sang hÖ thèng tÕ bµo biÓu hiÖn mang T7 ARN polymeraza (T7 RNA polymerase) díi sù ®iÒu khiÓn cña lacUV5 vµ sù biÓu hiÖn ®îc c¶m øng bëi Isopropylthio-β-D-galactosit (Isopropylthio-β-D-galactoside - IPTG). Trong giai ®o¹n t¹o dßng gen quan t©m, çc tÕ bµo chñ kh«ng chøa gen m· ho¸ T7 ARN polymeraza nªn kh¶ n¨ng s¶n xuÊt çc protein cã ho¹t tÝnh ®éc ®èi víi tÕ bµo chñ kh«ng x¶y ra. Nhê vËy, plasmit ®îc duy tr× bÒn v÷ng h¬n. §Æc biÖt, thÕ hÖ pET míi bao gåm vect¬ phiªn m· vµ dÞch m· do C«ng ty Novagen thiÕt kÕ víi nh÷ng ®Æc tÝnh t¨ng cêng cho qu¸ tr×nh t¹o dßng, biÓu hiÖn vµ tinh chÕ protein: (i) Vect¬ phiªn m· dïng ®Ó biÓu hiÖn gen quan t©m cña tÕ bµo nh©n s¬ ®· mang vÞ trÝ g¾n ribosom vµ m· khëi ®Çu ATG; (ii) Vect¬ dÞch m· mang vÞ trÝ g¾n ribosom hiÖu qu¶ cña protein vá phag¬ T7 ®Ó biÓu hiÖn gen quan t©m cña tÕ bµo nh©n thËt.

ë thùc vËt, vect¬ biÓu hiÖn ®îc thiÕt kÕ phï hîp víi ph¬ng ph¸p chuyÓn gen. Trªn c¬ së Ti-plasmit nh©n t¹o vµ ph¬ng ph¸p chuyÓn gen nhê A. tumefaciens, rÊt nhiÒu vect¬ biÓu hiÖn thùc vËt ®· ®îc thiÕt kÕ vµ ®a vµo øng dông. Bevan ®· t¹o ra vect¬ hai nguån mang vïng T-ADN c¶i biÕn víi ®o¹n biªn ph¶i, tr¸i, gen nptII vµ vïng MCS tõ M13mp19 gióp g¾n gen quan t©m dÔ dµng [39]. Velten & Schell ®· thiÕt kÕ hµng lo¹t vect¬ cã thÓ ho¹t ®éng trong nhiÒu ®èi tîng c©y trång víi ®Æc tÝnh võa mang gen chØ thÞ chän läc, võa mang ®o¹n khëi ®éng ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn

20

gen quan t©m [191]. An ®· thiÕt kÕ vect¬ biÓu hiÖn pGA492 mang gen cat khuyÕt ®o¹n khëi ®éng nh»m nghiªn cøu chøc n¨ng cña çc yÕu tè ®iÒu khiÓn trong tÕ bµo thùc vËt [30]. Cho tíi nay, rÊt nhiÒu Ti-plasmit thÕ hÖ míi ®îc thiÕt kÕ vµ sö dông víi çc u ®iÓm nh dÔ t¹o dßng gen quan t©m, dÔ chuyÓn tõ tÕ bµo E. coli sang A. tumefaciens vµ sang çc m« c©y bÞ tæn th¬ng.

1.2.2 Çc thµnh phÇn chÝnh cña vect¬

Çc vect¬ sö dông trong c«ng nghÖ gen thùc vËt thêng lµ çc plasmit ®¬n gi¶n víi mét sè ®Æc tÝnh nh: (1) Cã kh¶ n¨ng tù sao chÐp ®éc lËp vµ tÝch cùc trong tÕ bµo chñ; (2) Cã kÝch thíc nhá, dÔ nhËn gen quan t©m, dÔ x©m nhËp vµ dÔ ®îc sao chÐp; (3) Mang chØ thÞ chän läc gióp ph¸t hiÖn dÔ dµng tÕ bµo chøa plasmit; (4) Tån t¹i bÒn v÷ng trong tÕ bµo chñ; Çc ®Æc tÝnh nµy lµ c¬ së quyÕt ®Þnh çc thµnh phÇn chÝnh cña plasmit víi: (1) Gen quan t©m ®îc g¾n thªm ®o¹n khëi ®éng vµ ®o¹n kÕt thóc gen; (2) Gen chØ thÞ chän läc; (3) Çc thµnh phÇn kh¸c nh vïng khëi ®Çu sao chÐp vµ vïng MCS.

1.2.2.1 §o¹n khëi ®éng gen

Çc gen kh¸ng c«n trïng cã thÓ biÓu hiÖn ®îc thµnh protein cÇn ph¶i cã mÆt çc tÝn hiÖu ®iÒu khiÓn thÝch hîp ë nh÷ng vÞ trÝ nhÊt ®Þnh. Nh÷ng tÝn hiÖu tham gia tÝch cùc vµo qu¸ tr×nh ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn gen bao gåm ®o¹n khëi ®éng gen vµ ®o¹n kÕt thóc gen. Ngoµi ra, nh÷ng yÕu tè ®iÒu khiÓn phÝa trªn n»m tríc gen cÊu tróc còng tham gia vµo qu¸ tr×nh kiÓm so¸t biÓu hiÖn gen vÒ sè lîng, thêi gian vµ kh«ng gian. H¬n n÷a, çc tr×nh tù trªn gen cÊu tróc cÇn thiÕt cho qu¸ tr×nh xö lý ARN còng cã vai trß quan träng [130], [189], [194].

21

§o¹n khëi ®éng bao gåm tr×nh tù nucleotit phÝa trªn ®Çu 5’ cña gen cÊu tróc. Nã ®ãng vai trß ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh phiªn m· nhê kh¶ n¨ng ®¶m b¶o çc vÞ trÝ nhËn biÕt cho enzym ARN polymeraza, cho çc yÕu tè ho¹t ho¸ vµ khëi ®éng [25]. §o¹n khëi ®éng chøa nh÷ng tr×nh tù ADN ®Æc biÖt gäi lµ çc yÕu tè cis. ë çc ®o¹n khëi ®éng gen thùc vËt, çc yÕu tè cis cã thÓ chia lµm hai lo¹i: (1) Çc yÕu tè cis chuÈn quyÕt ®Þnh sù khëi ®Çu phiªn m· cña bÊt kú gen nµo, bao gåm hép CAAT, cung cÊp vÞ trÝ g¾n cho ARN polymeraza vµ hép TATA gióp cho qu¸ tr×nh g¾n ARN polymeraza chÝnh x¸c vµo vÞ trÝ khëi ®Çu phiªn m·. Çc hép TATA vµ CAAT rÊt b¶o thñ vµ n»m gÇn gen cÊu tróc; (2) Çc yÕu tè cis kh¸c cã liªn quan ®Õn sù ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn gen mang tÝnh ®Æc hiÖu [27], [167]. Nh vËy, çc ®o¹n khëi ®éng cã thÓ ®îc chia lµm hai lo¹i chÝnh: ®o¹n khëi ®éng kh«ng ®Æc hiÖu hay cßn gäi lµ ®o¹n khëi ®éng c¬ ®Þnh (constitutive promoter) vµ ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu víi çc yÕu tè cis chuyªn biÖt.

§o¹n khëi ®éng cã vai trß chÝnh trong qu¸ tr×nh biÓu hiÖn gen. Gen thiÕu ®o¹n khëi ®éng gièng nh « t« kh«ng cã ®éng c¬ [167]. GÇn ®©y, Laporte & ®tg ®· nghiªn cøu vµ chøng tá ¶nh h-ëng quan träng cña ®o¹n khëi ®éng khi biÓu hiÖn gen m· ho¸ sucroza phosphat synthaza (sucrose phosphate synthase) ë cµ chua. S¶n lîng cµ chua t¨ng tíi 80% khi sö dông ®o¹n khëi ®éng 35S t¸ch tõ virut kh¶m sóp l¬ (Cauliflower Mosaic Virus 35S Promoter - CaMV35S-P) ®Ó ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn gen nµy [129]. Trong çc nghiªn cøu chuyÓn gen thùc vËt, CaMV35S-P ®îc sö dông réng r·i nhê kh¶ n¨ng ho¹t ®éng m¹nh ë nhiÒu lo¹i m« c©y hai l¸ mÇm [29], [47], [139]. Trªn c¬ së CaMV35S-P, rÊt nhiÒu ®o¹n khëi ®éng lai hoÆc kÕt hîp cã kh¶ n¨ng t¨ng cêng møc ®é biÓu hiÖn gen ®· ®îc thiÕt kÕ nh ®o¹n khëi ®éng 35S kÐp, ®o¹n

22

khëi ®éng lai víi vïng trung t©m cña CaMV19S-P vµ vïng t¨ng c-êng phÝa trªn cña CaMV35S [122], [196]... Ngoµi CaMV35S-P, çc ®o¹n khëi ®éng chÝnh ho¹t ®éng trong thùc vËt bao gåm Adh-P, Ubi-P, ®o¹n khëi ®éng cña gen tæng hîp nopalin (nopaline synthase promoter - NOS-P)... [62], [143], [176]. §èi víi lóa, ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza (Rice sucrose synthase promoter - Rsuc-P) còng ®îc quan t©m nghiªn cøu vµ sö dông [163], [206].

1.2.2.2 §o¹n kÕt thóc gen

Çc ®o¹n kÕt thóc nµy thêng chøa ®u«i polyA nh AATTAA, hoÆc AACCAA gióp b¶o vÖ çc ph©n tö ARN th«ng tin ®îc bÒn v÷ng h¬n vµ tr¸nh khái sù ph©n huû. Hai ®o¹n kÕt thóc ®îc sö dông nhiÒu trong c«ng nghÖ gen thùc vËt lµ ®o¹n kÕt thóc cña CaMV35S (cã mÆt trong 7 s¶n phÈm chuyÓn gen hiÖn nay) vµ ®o¹n kÕt NOS (cã mÆt trong Ýt nhÊt 16-28 s¶n phÈm) [98].

1.2.2.3 Gen chØ thÞ

ViÖc thiÕt kÕ çc gen chØ thÞ cã thÓ ho¹t ®éng ®îc trong tÕ bµo thùc vËt ®· n©ng cao hiÖu qu¶ cña kü thuËt t¹o c©y trång chuyÓn gen. Nhê çc qu¸ tr×nh chän läc ë tÕ bµo vi khuÈn hoÆc sµng läc ë çc m« t¸i sinh, çc thÓ biÕn n¹p ®îc nhËn biÕt vµ chän läc dÔ dµng [195]. Çc chØ thÞ di truyÒn sö dông trong biÕn n¹p gen thùc vËt thêng cã nguån gèc tõ vi khuÈn hoÆc thùc vËt víi hai lo¹i chÝnh:

● ChØ thÞ chän läc (selectable markers) kh¸ng l¹i mét ¸p lùc chän läc nhÊt ®Þnh, cho phÐp chän läc çc tÕ bµo biÕn n¹p nhê kh¶ n¨ng sinh trëng ®îc trªn m«i trêng chøa chÊt kh¸ng sinh/ diÖt cá. Ngoµi ra, chóng lµ c¬ së ®Ó theo dâi sù di truyÒn qua çc thÕ

23

hÖ cña gen ngo¹i lai trong quÇn thÓ thùc vËt ®ang ph©n ly [202]. Mét trong nh÷ng chØ thÞ chän läc ®îc sö dông réng r·i lµ kÕt cÊu gen mang ®o¹n khëi ®éng NOS ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn gen nptII. Ngoµi gen nptII, çc gen kh¸ng kh¸ng sinh kh¸c nh β-lactamaza (β-lactamase - bla), nptIII còng cã mÆt trong genom cña mét sè c©y trång biÕn ®æi di truyÒn. Trong mét sè trêng hîp, çc gen nµy kh«ng ®îc thiÕt kÕ nh nh÷ng chØ thÞ chän läc thùc vËt mµ vÉn chÞu sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng vi khuÈn ban ®Çu [82], [83].

● ChØ thÞ sµng läc (screenable markers) m· ho¸ cho çc s¶n phÈm cña gen víi ho¹t tÝnh enzym rÊt dÔ ph©n tÝch. ChØ thÞ sµng läc kh«ng chØ gióp nhËn biÕt çc thÓ biÕn n¹p mµ cßn dù ®o¸n ®îc møc ®é biÓu hiÖn cña gen quan t©m trong m« thùc vËt ®îc chuyÓn gen. Çc chØ thÞ nh β-glucuronidaza (β-glucuronidase - GUS), β-galactosidaza cho phÐp sµng läc ho¹t tÝnh cña enzym dÔ dµng trªn c¬ së kü thuËt xÐt nghiÖm huúnh quang, nhuém ho¸ tÕ bµo. Chóng ®îc øng dông réng r·i trong nghiªn cøu ®Æc tÝnh cña tÕ bµo còng nh sù biÓu hiÖn cña çc gen ®iÒu chØnh [119], [175], [202].

Th«ng thêng, çc gen chØ thÞ ®îc g¾n víi nh÷ng ®o¹n khëi ®éng t¸ch tõ mÇm bÖnh thùc vËt hoÆc virut g©y bÖnh thùc vËt do çc nhµ thiÕt kÕ cho r»ng çc ®o¹n khëi ®éng nµy sÏ ho¹t ®éng tèt trong thùc vËt. Tuy nhiªn, ngµy cµng cã nhiÒu b»ng chøng cho thÊy møc ®é biÓu hiÖn cña gen ®îc ®iÒu khiÓn trùc tiÕp bëi çc ®o¹n khëi ®éng nµy cã thÓ ®îc ®iÒu chØnh t¨ng ®Õn mét møc ®é nµo ®ã nhê mét sè yÕu tè ph¸t triÓn ho¹t ®éng trong çc c©y nguyªn vÑn kh«ng bÞ bÖnh.

24

VÊn ®Ò cã an toµn hay kh«ng khi sö dông gen chØ thÞ trong chän läc çc thÓ biÕn n¹p cßn g©y nhiÒu tranh c·i. Nh÷ng ®iÓm chÝnh bao gåm vai trß quan träng cña kanamycin, neomycin... trong ch÷a trÞ çc bÖnh nhiÔm khuÈn ë ngêi vµ sù ph¸t triÓn réng kh¾p cña quÇn thÓ vi khuÈn kh¸ng chÊt kh¸ng sinh. Tuy nhiªn, sù an toµn cña çc gen kh¸ng kh¸ng sinh nh nptII díi sù ®iÒu khiÓn cña çc ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt cña Calgene ®· ®îc nghiªn cøu chøng minh vµ ®îc C¬ quan Qu¶n lý Thùc phÈm vµ Dîc phÈm Mü (US Food and Drug Administration - FDA) chÊp thuËn [82], [83]. Còng cÇn nhÊn m¹nh r»ng, së dÜ çc gen chän läc cã mÆt trong çc c©y trång chuyÓn gen lµ do: (i) Gen quan t©m ®Çu tiªn ®îc thiÕt kÕ trong vect¬ vi khuÈn (nh E. coli) cã chøa gen kh¸ng kh¸ng sinh, sau ®ã nhê çc ph¬ng ph¸p biÕn n¹p, vect¬ hoµn chØnh ®îc sö dông ®Ó ®a gen quan t©m vµo c©y trång; (ii) Gen kh¸ng kh¸ng sinh chän läc vi khuÈn n»m trong vïng T-ADN sÏ ®îc chuyÓn ®ång thêi vµo c©y nhê A. tumefaciens. Çc gen nµy râ rµng lµ kh«ng ®îc sö dông trùc tiÕp ®Ó chän läc c©y trång chuyÓn gen nªn kh«ng cÇn thiÕt ph¶i cã mÆt trong s¶n phÈm cuèi cïng, nhÊt lµ khi çc c©y trång ®îc sö dông lµm thùc phÈm [82]. Ngoµi ra, trong khi çc thÓ biÕn n¹p thu ®îc nhê kh¶ n¨ng sèng sãt vµ sinh trëng trªn m«i trêng cã chÊt chän läc nh kh¸ng sinh hoÆc thuèc diÖt cá, çc tÕ bµo kh«ng nhËn ®îc gen chuyÓn th× bÞ ¶nh hëng bëi t¸c ®éng cña çc chÊt øc chÕ sinh trëng nµy. Nh»m tr¸nh sö dông çc gen kh¸ng kh¸ng sinh chän läc trong vi khuÈn, ngêi ta ®· sö dông çc gen chØ thÞ chän läc thay thÕ nh hÖ thèng Cre/ lox cho phÐp lo¹i bá çc chØ thÞ chän läc sau biÕn n¹p vµo tÕ bµo thùc vËt [60], [132]. GÇn ®©y, C«ng ty Novartis (hiÖn nay lµ Syngenta) c«ng bè kh«ng sö dông çc gen kh¸ng kh¸ng sinh ®Ó chän läc. Ngoµi ra, mét híng chiÕn lîc kh¸c còng ®ang ®îc sö dông trong ph-

25

¬ng ph¸p chuyÓn gen nhê A. tumefaciens, ®ã lµ hÖ thèng biÕn n¹p ®ång thêi gen quan t©m vµ gen chän läc, sau ®ã tiÕn hµnh t¸ch riªng [82].

1.2.3 Vect¬ mang gen kh¸ng c«n trïng

Çc vect¬ nµy ®îc thiÕt kÕ ®Ó biÕn n¹p vµo c©y trång çc gen kh¸ng c«n trïng cã gi¸ trÞ ph©n lËp tõ ®éng vËt, thùc vËt, vi sinh vËt hoÆc tæng hîp nh©n t¹o.

1.2.3.1 Nguån gen kh¸ng c«n trïng

a) Gen cry m· ho¸ protein ®éc tè cña Bacillus thuringiensis

Trong nguån gen kh¸ng c«n trïng, gen cry m· ho¸ protein tinh thÓ ®éc cã ho¹t tÝnh diÖt c«n trïng (Insecticidal Crystal Proteins - ICPs) cña Bt ®îc sö dông phæ biÕn nhÊt ®Ó chuyÓn vµ biÓu hiÖn ë hµng lo¹t c©y trång quan träng.

● S¬ lîc vÒ Bt: Bt lµ vi khuÈn hiÕu khÝ, h×nh que, gram d¬ng, cã kh¶ n¨ng h×nh thµnh bµo tö trong ®iÒu kiÖn m«i trêng bÊt lîi vµ s¶n sinh protein tinh thÓ ®éc ë d¹ng ngo¹i bµo (α, β, γ exotoxin) vµ néi bµo (δ-endotoxin). Trong ®ã, δ-endotoxin lµ mét hä protein tinh thÓ ®éc chÝnh do h¬n 140 gen cry m· ho¸ ®îc s¶n sinh trong qu¸ tr×nh h×nh thµnh bµo tö. Chóng g©y ®éc hÖ tiªu ho¸ cña c«n trïng mÉn c¶m vµ thêng ®îc sö dông ®Ó khèng chÕ c«n trïng Bé Çnh v¶y (Lepidoptera), Hai çnh (Diptera), Çnh cøng (Coleoptera) vµ tuyÕn trïng (Nematoda) [23], [65]. ChÕ phÈm sinh häc Bt diÖt c«n trïng ®îc sö dông réng r·i nhÊt, chiÕm tíi 90% thÞ trêng thuèc trõ s©u sinh häc vµ 2% thÞ trêng thuèc trõ s©u toµn cÇu [4], [5], [121].

MÆc dï ®îc coi lµ thuèc trõ s©u vi sinh hiÖu qu¶, mét sè h¹n chÕ nhÊt ®Þnh vÒ ph¬ng diÖn sinh häc nh thêi gian ¶nh hëng

26

ng¾n, kh«ng tiÕp xóc ®îc víi c«n trïng Èn s©u díi l¸, ®Êt... ®· phÇn nµo gi¶m møc ®é sö dông chÕ phÈm Bt [126]. Nh÷ng ®iÓm bÊt lîi nµy hoµn toµn bÞ lo¹i trõ khi chuyÓn vµ biÓu hiÖn gen cry vµo c©y trång [169].

● CÊu tróc ph©n tö vµ c¬ chÕ ho¹t ®éng cña protein tinh thÓ ®éc: Protein tinh thÓ ®éc thêng tån t¹i ë d¹ng tiÒn ®éc tè víi cÊu tróc gåm hai phÇn: phÇn ®Çu N mang ®éc tÝnh vµ phÇn ®Çu C. C¬ chÕ t¸c dông cña tiÒn ®éc tè lªn c«n trïng ®Ých ®· ®îc nghiªn cøu kh¸ s©u. §Çu tiªn tinh thÓ x©m nhËp vµo c¬ thÓ c«n trïng theo thøc ¨n qua ®êng miÖng. Sau ®ã díi t¸c ®éng cña m«i trêng cã ®é pH > 10 ë ruét gi÷a cña s©u cïng víi sù ho¹t ®éng cña proteaza ruét s©u, t¬ng tù trypsin, çc tiÒn ®éc tè ®· ®îc ho¹t ho¸. TiÒn ®éc tè CryI vµ CryIV víi kÝch thíc 130-140 kDa khi ®îc ho¹t ho¸ ®· h×nh thµnh ®éc tè, kÝch thíc 65-75 kDa cã ho¹t tÝnh vµ bÒn v÷ng. Trong khi tiÒn ®éc tè CryII vµ III (70-75 kDa) sau qu¸ tr×nh biÕn ®æi ®· t¹o ra ®éc tè kÝch thíc 60-65 kDa. Sau khi ®îc ho¹t ho¸, protein tinh thÓ ®éc ®· liªn kÕt ¸i lùc m¹nh víi çc chÊt nhËn glycoprotein t¹i nh÷ng vÞ trÝ ®Æc hiÖu n»m trªn çc vi nhung mao cña tÕ bµo biÓu m« ruét gi÷a cña Êu trïng. ChÝnh mèi liªn kÕt cña çc ®éc tè víi çc chÊt nhËn ë vi nhung mao nµy ®· quyÕt ®Þnh tÝnh ®Æc hiÖu cña ®éc tè. ë nh÷ng c«n trïng kh«ng mÉn c¶m, mèi liªn kÕt nµy rÊt láng lÎo. HiÖn nay, ngêi ta ®· x¸c ®Þnh ®îc ba nhãm vÞ trÝ g¾n. Mét sè vÞ trÝ cã thÓ liªn kÕt víi mét lo¹i ®éc tè, mét sè vÞ trÝ kh¸c cã thÓ liªn kÕt víi hai hay nhiÒu lo¹i. Nh vËy, mét ®éc tè ®Æc thï cã thÓ liªn kÕt víi nhiÒu vÞ trÝ nhËn trong ruét cña c«n trïng. Sau khi g¾n kÕt, protein tinh thÓ ®éc tè ®Ýnh trªn bÒ mÆt tÕ bµo biÓu m« ruét gi÷a, g©y tæn th¬ng vµ ph¸ huû tÕ bµo, tiªu diÖt c«n trïng mÉn c¶m [123].

27

Protein tinh thÓ ®éc cã cÊu tróc ®Æc thï. Çc nghiªn cøu vÒ cÊu tróc cña chóng thêng b¾t ®Çu b»ng nh÷ng ®iÒu tra vÒ chøc n¨ng cña nh÷ng vïng cÊu tróc nµy. §Æc ®iÓm ®iÓn h×nh trong cÊu tróc cña protein tinh thÓ ®éc lµ cã çc vïng b¶o thñ n»m xen kÏ nh÷ng vïng biÕn ®æi. Çc vïng b¶o thñ nµy ®ãng vai trß quan träng vÒ mÆt cÊu tróc vµ chøc n¨ng. CÊu tróc cña δ-endotoxin vÉn cha ®îc lµm s¸ng tá cho ®Õn khi cÊu tróc tinh thÓ cña CryIIIA vµ CryIA(a) ®îc c«ng bè [89], [134]. KÕt qu¶ nghiªn cøu cÊu tróc cho thÊy protein tinh thÓ ®éc nhãm CryI vµ CryIII cã 3 vïng kh¸c biÖt: vïng ®Çu N b¶o thñ cao (chøa 28-282 aa), vïng siªu biÕn ë gi÷a (283-461 aa) vµ vïng ®Çu C b¶o thñ kh«ng hoµn toµn (462-610 aa). VÒ chøc n¨ng, vïng 1 cña CryIIIB2 vµ CryIA(c) liªn quan ®Õn ho¹t ®éng cña kªnh ion, bíc khëi ®Çu cña qu¸ tr×nh h×nh thµnh protein [198]. Vïng 2, 3 liªn quan ®Õn viÖc g¾n thô thÓ vµ quyÕt ®Þnh tÝnh ®Æc hiÖu c«n trïng [161]. Tuy nhiªn, ë mét sè ®éc tè, vïng 3 còng tham gia vµo ho¹t ®éng cña kªnh ion [200]. ● Gen m· ho¸ protein tinh thÓ ®éc: Gen cry tù nhiªn thêng n»m trªn plasmit cì lín kÝch thíc kho¶ng 3 kb, trong ®ã chØ cã ®o¹n kho¶ng 2 kb m· ho¸ protein tinh thÓ ®éc. Çc plasmit nµy cã mÆt trong hÇu hÕt çc chñng Bt víi sè lîng dao ®éng tõ 2 ®Õn 12 b¶n sao. Ngoµi ra, çc gen cry còng cã thÓ n»m trªn nhiÔm s¾c thÓ ë mét sè chñng Bt nh chñng kurstaki HD-1, entomocidus, aizawai 7.29... Mét chñng vi khuÈn cã thÓ mang ®ång thêi nhiÒu gen cry nh chñng aizawai vµ kurstaki HD-1 tù nhiªn chøa 5 gen cry n»m trªn çc vÞ trÝ t¸ch biÖt nhau; Chñng Bt var. israelensis cã 4 gen cry m· ho¸ protein diÖt ®Æc hiÖu c«n trïng Bé Hai çnh vµ mét gen m· ho¸ Cytolysin n»m trªn cïng mét plasmit [162].

28

● Ph©n lo¹i gen cry vµ protein tinh thÓ ®éc cña Bt: Dùa trªn kh¶ n¨ng diÖt c«n trïng ®Æc hiÖu vµ nh÷ng tr×nh tù t¬ng ®ång, gen cry vµ protein tinh thÓ ®éc ®îc chia thµnh 4 nhãm chÝnh: (1) Gen cryI m· ho¸ cho protein CryI 130-140 kDa ®éc ®èi víi c«n trïng Bé Çnh v¶y; (2) Gen cryII m· ho¸ cho protein CryII kÝch thíc 66 kDa ®éc ®èi víi c«n trïng Bé Çnh v¶y vµ Hai çnh; (3) Gen cryIII m· ho¸ protein CryIII 73 kDa ®éc ®èi víi c«n trïng Bé Çnh cøng; (4) Gen cryIV ®îc ph©n lËp tõ chñng israelensis m· ho¸ cho protein CryIV kÝch thíc 135, 128, 74 vµ 72 kDa ®éc ®èi víi c«n trïng Bé Hai çnh [107]. Dùa trªn ®é t¬ng ®ång cña çc tr×nh tù aa, protein tinh thÓ ®éc ®îc chia tiÕp thµnh çc nhãm phô. Tuy nhiªn, viÖc ph©n lo¹i nµy chØ lµ t¬ng ®èi. CryI chØ nhãm protein tinh thÓ ®éc cã ho¹t tÝnh diÖt c«n trïng Bé Çnh v¶y, nhng CryIAb l¹i ®îc c«ng bè cã kh¶ n¨ng kh¸ng l¹i Êu trïng muçi. CryII cã ho¹t tÝnh kÐp (diÖt ®ång thêi c«n trïng Bé Çnh v¶y vµ Hai çnh) trong khi CryIIB chØ diÖt c«n trïng Bé Çnh v¶y [156].

b) Çc gen m· ho¸ protein kh¸c cã ho¹t tÝnh diÖt c«n trïng

Mét sè loµi thùc vËt cã kh¶ n¨ng tù vÖ tríc sù tÊn c«ng cña c«n trïng nhê t¹o ra protein lµ çc chÊt øc chÕ t¸c ®éng vµo hÖ tiªu ho¸ cña c«n trïng. Khai th¸c tÝnh ®Æc hiÖu cña çc protein nµy ®· më ra kh¶ n¨ng rÊt hÊp dÉn trong chän t¹o gièng c©y trång. HiÖn nay, rÊt nhiÒu protein thùc vËt cã ®éc tÝnh ¶nh hëng ®Õn trao ®æi chÊt cña c«n trïng ®ang lµ ®èi tîng quan t©m cña çc nhµ c«ng nghÖ gen thùc vËt (b¶ng 1.1) [103], [178].

B¶ng 1.1. Protein cã ho¹t tÝnh diÖt c«n trïng vµ phæ ho¹t ®éng cña chóng

Protein ®éc tèC«n trïng

TuyÕn

29

trïng NÊm

§éng

vËt

Bé Çnh v¶y

Bé Çnh cøng

Bé Çnh nöa

Bé Çnh

th¼ng

ChÊt øc chÕ proteaza d¹ng serin

+ + - + +

ChÊt øc chÕ proteaza d¹ng cystein

- + - + -

Lectin: Mannoza sp NacGlu sp

++

++

++

+ + -+

ChÊt øc chÕ α -amylaza

+ + - +/ -

Enzym: Lipoxygenaza Acyl-hydrolaza Chitinaza

+++

++

+- +

+-+

Protein bÊt ho¹t ho¸ ribosom

+ + + +

Protein tinh thÓ ®éc: CryI

CryIII

+-

-+

--

--

--

--

30

● Çc chÊt øc chÕ proteaza (Protease Inhibitor): lµ çc proteaza ngo¹i bµo d¹ng tù do hoÆc g¾n mµng cã kh¶ n¨ng øc chÕ qu¸ tr×nh tiªu ho¸ protein cña c«n trïng nhê ng¨n c¶n sù ho¹t ®éng cña çc proteaza - nh÷ng enzym ph©n huû protein. HÇu hÕt chÊt øc chÕ proteaza cña thùc vËt kh«ng g©y ¶nh hëng ®Õn proteaza cña b¶n th©n chóng mµ chØ øc chÕ ho¹t ®éng proteaza cña vi khuÈn vµ ®éng vËt. RÊt cã thÓ ®©y lµ c¬ chÕ tù nhiªn cña thùc vËt nh»m b¶o vÖ m« tÕ bµo khái bÞ tæn th¬ng do c«n trïng g©y h¹i vµ mÇm bÖnh tÊn c«ng. Çc chÊt øc chÕ ®èi víi proteaza d¹ng serin vµ cystein cã rÊt nhiÒu trong h¹t vµ çc m« dù tr÷ cña thùc vËt. Chóng cã kh¶ n¨ng diÖt nhiÒu loµi s©u h¹i nh s©u ¨n rÔ ng« (Diabrotica spp.), tuyÕn trïng vµ mét sè loµi s©u kh«ng chÞu t¸c ®éng cña ®éc tè Bt [73], [165]. Mét trong nh÷ng chÊt øc chÕ proteaza d¹ng serin cã gi¸ trÞ ®Æc biÖt lµ chÊt øc chÕ trypsin cña c©y ®Ëu ®òa (Trypsin Inhibitor from Cowpea). Chóng kh«ng ®éc ®èi víi ®éng vËt vµ hoµn toµn kh«ng g©y h¹i c«n trïng cã Ých trong khi rÊt nhiÒu chÊt øc chÕ d¹ng serin g©y ®éc ong mËt (Apis mellifera) [138]. Çc thö nghiÖm sinh häc cho thÊy protein nµy ®· k×m h·m sinh trëng vµ lµm t¨ng tû lÖ tö vong cña s©u rãm ®ôc chåi thuèc l¸ (Heliothis virescens) còng nh s©u xanh h¹i b¾p ng« (Heliothis zea) [106]. Çc dßng lóa chuyÓn gen m· ho¸ chÊt øc chÕ proteaza cña c©y ®Ëu ®òa vµ c©y khoai t©y cã kh¶ n¨ng kh¸ng c«n trïng Bé Çnh v¶y râ rÖt [72], [203], d©u t©y biÓu hiÖn chÊt øc chÕ proteaza thÓ hiÖn ho¹t tÝnh kh¸ng mät h¹i nho [88]. Tuy nhiªn, kh«ng ph¶i tÊt c¶ chÊt øc chÕ proteaza ®Òu cã ho¹t tÝnh diÖt c«n trïng [84], [85]. Ngoµi ra, kh¸ nhiÒu b»ng chøng cho thÊy c«n trïng cã kh¶ n¨ng thÝch øng víi viÖc xuÊt hiÖn chÊt øc chÕ proteaza trong ®êng tiªu ho¸. C«n trïng Bé Çnh v¶y vµ Çnh cøng cã thÓ t¨ng cêng biÓu hiÖn çc proteaza hoÆc s¶n sinh enzym míi

31

kh«ng mÉn c¶m víi chÊt øc chÕ proteaza vµ gi¶m nh÷ng ¶nh hëng cã h¹i cña chÊt øc chÕ proteaza trong hÖ tiªu ho¸ cña chóng. Nh»m tr¸nh nh÷ng kh¶ n¨ng thÝch øng nµy, çc lo¹i chÊt øc chÕ proteaza cã thÓ ®îc biÓu hiÖn ®ång thêi hoÆc ®îc c¶i tiÕn cho phï hîp víi proteaza cña c«n trïng ®Ých [85], [146].

● Çc chÊt øc chÕ - amylaza (α - Amylase Inhibitor - -AI): nh»m vµo qu¸ tr×nh chuyÓn ho¸ hydrat cacbon cña s©u h¹i. Chóng cã mÆt trong h¹t c©y ®Ëu chi Phaseolus. §Æc biÖt, trong c©y ®Ëu c« ve (P. vulgaris) cã mét hä protein b¶o vÖ thùc vËt bao gåm chÊt øc chÕ -amylaza, arcelin vµ phytohemagglutinin ®Òu ®îc m· ho¸ bëi mét locut ®¬n trong genom vµ cïng b¶o vÖ h¹t tríc sù tÊn c«ng cña c«n trïng g©y h¹i nhng víi ph¬ng thøc ho¹t ®éng hoµn toµn kh¸c nhau [77]. Trong ®ã, chÊt øc chÕ -amylaza thêng cã t¸c dông øc chÕ -amylaza cña c«n trïng, bä çnh cøng mµ kh«ng øc chÕ -amylaza cña thùc vËt vµ vi sinh vËt [148].

● Lectin: lµ nhãm protein rÊt ®a d¹ng vÒ cÊu tróc vµ chøc n¨ng, ®îc t×m thÊy chñ yÕu ë thùc vËt. Chóng lµ nhãm protein liªn kÕt ®êng cã chøc n¨ng b¶o vÖ c©y trång chèng l¹i mét sè t¸c nh©n nhÊt ®Þnh, ®Æc biÖt lµ c«n trïng Bé Çnh gièng. C¬ chÕ thùc vËt tiÕt chÊt ®éc kh¸ng c«n trïng (vµ ®éng vËt bËc cao) vÉn cha râ rµng. Tuy nhiªn, ho¹t tÝnh cña lectin phô thuéc vµo kh¶ n¨ng g¾n víi chuçi bªn hydrat cacbon trªn glycoprotein, ®Æc biÖt lµ çc tÕ bµo n»m trong thµnh ruét. Sù g¾n kÕt nµy cã thÓ g©y ra nh÷ng ¶nh hëng ®Õn møc ®é thÊm, sù sinh trëng, ph¸t triÓn cña thµnh ruét vµ sau ®ã ¶nh hëng ®Õn toµn bé çc c¬ quan [85].

● Protein bÊt ho¹t ho¸ ribosom (Ribosome Inactivating Protein): s¶n sinh bëi nhiÒu loµi thùc vËt bËc cao. Dùa trªn cÊu tróc ph©n tö, protein nµy ®îc ph©n lo¹i thµnh hai nhãm: nhãm I

32

víi ®éc tÝnh t¬ng ®èi thÊp (gåm mét chuçi polypeptit A víi ph©n tö lîng kho¶ng 23-32 kDa) vµ nhãm II rÊt ®éc (gåm chuçi polypeptit A liªn kÕt víi chuçi polypeptit B qua çc cÇu nèi disulphit) [113]. Ngoµi ho¹t tÝnh kh¸ng nÊm, trong mét sè trêng hîp protein bÊt ho¹t ho¸ ribosom cã ho¹t tÝnh kh¸ng c«n trïng, nh Ricin vµ saporin-S6 g©y ®éc c«n trïng Bé Çnh cøng [35].

● Enzym: RÊt nhiÒu enzym ®· ®îc quan t©m khai th¸c nh»m n©ng cao tÝnh kh¸ng s©u bÖnh cña c©y trång. Cholesterol oxidaza lµ mét hä protein diÖt c«n trïng míi cã nguån gèc tõ çc chñng x¹ khuÈn Streptomyces víi ho¹t tÝnh ®éc rÊt cao. §©y lµ nguån nguyªn liÖu lý tëng ®Ó chuyÓn vµo b«ng [160].

● Protein ®éc tè cã nguån gèc vi sinh vËt: Ngoµi protein tinh thÓ ®éc cña Bt, mét sè vi sinh vËt cã kh¶ n¨ng tiÕt çc protein ®éc tè diÖt s©u h¹i. Bacillus cereus s¶n sinh protein Vip1 vµ Vip2 g©y ®éc s©u ¨n rÔ ng«. Mét sè chñng Bt s¶n sinh protein Vip3A g©y ®éc s©u rãm Agrotis vµ Spodoptera [75]. Ngoµi ra, protein Cyt (cytolytic) ®îc t×m thÊy ë çc chñng Bt ®Æc hiÖu c«n trïng Bé Hai çnh [53], [86]. Tuy nhiªn, cho ®Õn nay cha cã nh÷ng c«ng bè vÒ ho¹t tÝnh kh¸ng s©u cña çc c©y chuyÓn gen m· ho¸ çc ®éc tè nµy.

● Protein ®éc tè cã nguån gèc tõ ®éng vËt ¨n thÞt: Mét sè loµi c«n trïng ¨n thÞt nh nhÖn vµ bä c¹p s¶n sinh chuçi peptit cã ho¹t tÝnh g©y ®éc thÇn kinh cùc m¹nh ®èi víi c«n trïng. Nguån gen liªn quan ®Õn çc peptit nµy ®· ®îc chuyÓn vµo c©y trång. Tuy nhiªn, nghiªn cøu cña Barton & Miller cho thÊy ®éc tè cña bä c¹p trong c©y chuyÓn gen ®ång thêi g©y ®éc nhiÒu loµi c«n trïng cã Ých [36].

33

● ChÊt trao ®æi thø cÊp: Mét sè chÊt trao ®æi thø cÊp nh alkaloit, cyanogenic glycosit, glucosinolat, saponin còng cã ho¹t tÝnh kh¸ng s©u. Qu¸ tr×nh nghiªn cøu chuyÓn çc gen liªn quan vµo thùc vËt míi chØ b¾t ®Çu [91].

1.2.3.2 ThiÕt kÕ vect¬ mang gen kh¸ng c«n trïng thÕ hÖ míi

Vect¬ thÕ hÖ míi cã thÓ t¨ng cêng kh¶ n¨ng biÓu hiÖn cña gen quan t©m, n©ng cao chÊt lîng protein ngo¹i lai trong c©y trång. Th«ng thêng, çc c¶i biÕn tËp trung vµo tr×nh tù mang m· cña gen quan t©m, ®o¹n khëi ®éng, tr×nh tù t¨ng cêng, intron...

a) Sö dông ®o¹n khëi ®éng/ gen ®Æc hiÖu

T×m kiÕm vµ ph©n lËp gen còng nh ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu çc lo¹i m« vµ tÕ bµo (nh ®Æc hiÖu h¹t phÊn, bã m¹ch, vá, l¸) còng nh ®Æc hiÖu vÒ thêi gian biÓu hiÖn... lµ mét trong nh÷ng h-íng chÝnh trong t¹o gièng c©y trång biÕn ®æi di truyÒn. §èi víi gen kh¸ng c«n trïng, nh»m t¨ng kh¶ n¨ng biÓu hiÖn cña gen còng nh gi¶m ¶nh hëng cña protein ®éc tè ®Õn c«n trïng cã Ých, rÊt nhiÒu nghiªn cøu tËp trung t×m kiÕm nguån gen vµ ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu ®Ó thiÕt kÕ vect¬ [174]. Nhê çc ®o¹n khëi ®éng nµy, ®éc tè ®îc biÓu hiÖn ë nh÷ng lo¹i m« nhÊt ®Þnh, ë nh÷ng giai ®o¹n ph¸t triÓn nhÊt ®Þnh cña c©y, díi sù t¸c ®éng cña tõng ®iÒu kiÖn m«i trêng hoÆc chØ biÓu hiÖn ë n¬i bÞ tæn th¬ng khi c«n trïng tÊn c«ng. Ch¼ng h¹n, ngêi ta thêng sö dông ®o¹n khëi ®éng Ubi hoÆc Actin ®Ó ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn gen trong c©y mét l¸ mÇm [62], ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ®Ó ®iÒu khiÓn gen biÓu hiÖn ®Æc hiÖu bã m¹ch [204]. §Ó diÖt bä çnh cøng Colorado (Leptinotarsa

34

decemlineata) h¹i khoai t©y, ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu l¸ ®· ®îc sö dông thay ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu cñ [120]. HiÖn nay, ngoµi viÖc ph©n lËp gen quan t©m vµ t×m kiÕm ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu, çc nghiªn cøu ®iÒu khiÓn ho¹t ®éng gen th«ng qua çc ®o¹n khëi ®éng nµy còng lµ môc tiªu nghiªn cøu cña nhiÒu phßng thÝ nghiÖm trªn thÕ giíi. ë níc ta, nh÷ng vÊn ®Ò nµy còng ®ang b¾t ®Çu ®îc tiÕp cËn nghiªn cøu nh»m chuÈn bÞ nguyªn liÖu cho qu¸ tr×nh thiÕt kÕ vect¬ ®Ó chuyÓn vµo c©y trång [2], [9].

b) C¶i biÕn vïng mang m· cña gen kh¸ng c«n trïng nh»m t¨ng hiÖu qu¶ biÓu hiÖn trong thùc vËt

HÇu hÕt gen kh¸ng c«n trïng ®îc sö dông trong c«ng nghÖ gen thùc vËt cã nguån gèc tõ vi khuÈn. Thêi kú ®Çu chóng thêng ®îc ®a vµo c©y trång ë d¹ng nguyªn vÑn [181]. MÆc dï c©y trång biÕn ®æi di truyÒn cã kh¶ n¨ng kh¸ng c«n trïng ®Æc hiÖu, nhng ngay sau ®ã ngêi ta nhËn thÊy møc ®é biÓu hiÖn çc gen tù nhiªn cña vi khuÈn trong thùc vËt thêng rÊt thÊp, kh«ng ®ñ ®Ó b¶o vÖ c©y trång chèng l¹i mét sè loµi s©u h¹i chÝnh [25], [64]. Mét trong nh÷ng nguyªn nh©n lµ gen ë vi sinh vËt nãi chung vµ ë vi khuÈn Bt nãi riªng cã tØ lÖ Adenin/ Timin (Adenyl/ Thymin) kh¸ cao, trong khi m· giµu Adenin/ Timin rÊt hiÕm gÆp ë thùc vËt. Do vËy, thùc vËt kh«ng cã nhiÒu ARN vËn chuyÓn phï hîp víi m· di truyÒn cña gen vi khuÈn. Ngoµi ra, çc gen cry tù nhiªn cßn mang çc ®o¹n t¬ng tù ®u«i polyA trong vïng mang m·, dÊu hiÖu dõng ®èi víi ARN polymeraza II còng nh çc ®Æc tÝnh kh¸c nªn kh«ng thÝch hîp ®Ó biÓu hiÖn trong thùc vËt. Khi thùc vËt dÞch m· mét gen ngo¹i lai giµu Adenin/ Timin thêng x¶y ra hiÖn tîng ngõng trong bé m¸y ribosom lµm cho sinh tæng hîp protein bÞ kÕt thóc sím do vËy kh¶ n¨ng dÞch m· bÞ gi¶m [1], [64], [75], [174].

35

§Ó t¨ng cêng sù biÓu hiÖn cña gen kh¸ng c«n trïng, ngêi ta ®· sö dông ®o¹n khëi ®éng m¹nh ®Ó ®iÒu khiÓn gen, c¾t bít gen vµ biÕn ®æi m· di truyÒn cña chóng cho phï hîp víi m· thùc vËt. NhiÒu nhãm nghiªn cøu ®· tiÕn hµnh tæng hîp nh©n t¹o mét phÇn hoÆc toµn phÇn gen kh¸ng c«n trïng vµ sö dông çc m· di truyÒn phï hîp víi tõng loµi c©y trång nhÊt ®Þnh [25], [28], [64], [126], [158], [174], [185]. Ngoµi ra, çc tr×nh tù nh ®u«i polyA, tr×nh tù ATTTA, vïng giµu Adenin/ Timin nhiÒu khi còng ®îc lo¹i bá ®Ó t¨ng cêng biÓu hiÖn gen. Víi nh÷ng c¶i biÕn di truyÒn nµy, møc ®é biÓu hiÖn cña hµng lo¹t gen kh¸ng c«n trïng trong c©y chuyÓn gen ®· t¨ng lªn rÊt nhiÒu lÇn so víi gen tù nhiªn. Ho¹t tÝnh ®éc cña protein tinh thÓ ®éc c¶i biÕn cã thÓ cao gÊp 100 lÇn so víi ho¹t tÝnh cña protein tù nhiªn [52], [166], [201]. §iÓn h×nh cña híng nghiªn cøu c¶i biÕn gen tù nhiªn, Perlak & ®tg ®· tiÕn hµnh thay thÕ çc tr×nh tù Adenin/ Timin cña gen cryIA(b) vµ cryIA(c) b»ng çc tr×nh tù Guanin/ Xytonin (Guanin/ Cytonin) mµ vÉn gi÷ nguyªn tr×nh tù aa cña protein [157], [158]. Çc gen c¶i biÕn nµy, díi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng m¹nh, ®· ®îc chuyÓn vµo gièng b«ng Coker 312 víi møc ®é biÓu hiÖn protein t¨ng 100 lÇn [157]. T¬ng tù nh vËy, gen m· ho¸ CryIIIA ph©n lËp tõ chñng Bt tenebrionis ®îc chuyÓn vµo c©y khoai t©y t¹o kh¶ n¨ng kh¸ng bä çnh cøng Colorado gi¶m thiÖt h¹i ®¸ng kÓ do bÖnh nµy g©y ra. BiÓu hiÖn cña cryIIIA ®îc t¨ng cêng nhê tr×nh tù Guanin/ Xytonin tõ 36% ®îc n©ng lªn 44% [25]. Voisey & ®tg còng ®· thµnh c«ng trong viÖc biÕn ®æi gen cryIB t¨ng hµm lîng protein CryIB [193]. Nh÷ng thµnh c«ng nµy chñ yÕu thu ®îc trªn ®èi tîng c©y hai l¸ mÇm [180]. §èi víi c©y mét l¸ mÇm, Koziel & ®tg ®· tæng hîp nh©n t¹o ®o¹n gen cryIA(b) m· ho¸ tr×nh tù aa tõ 1-648 cña gen cryIA(b) nguyªn vÑn chñng Bt kurstaki HD-1. Gen nµy ®îc thiÕt kÕ

36

l¹i dùa trªn c¬ së mét sè m· di truyÒn cña vi khuÈn ®îc thay b»ng m· di truyÒn cña ng« víi tr×nh tù Guanin/ Xytonin t¨ng tõ 37 lªn 65%. Sau ®ã chóng ®îc chuyÓn vµo ng« vµ ®îc çc ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu kh¸c nhau ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn s¶n sinh protein CryIA(b) ë nh÷ng m« ®Æc hiÖu lµ nguån thøc ¨n cña s©u h¹i. Çc thö nghiÖm ®ång ruéng cho thÊy ng« chuyÓn gen cã kh¶ n¨ng tù vÖ ®èi víi sù tÊn c«ng cña s©u ®ôc th©n ng« Ch©u ¢u (Ostrinia nubilalis) ngay trong trêng hîp thö nghiÖm 2000 Êu trïng/ c©y [125]. Cheng & ®tg ®· thiÕt kÕ vect¬ mang gen cry c¶i biÕn hoµn toµn (cryIA(c) vµ cryIA(b)), gen hpt vµ gen gus ®Ó chän läc çc thÓ biÕn n¹p. Çc gen nµy ®îc ®iÒu khiÓn bëi CaMV35S-P, Ubi-P vµ cã hiÖu qu¶ biÓu hiÖn kh¸ cao [52]. Nayak & ®tg còng ®· tæng hîp gen cryIA(c), thiÕt kÕ kÕt cÊu gen Ubi1-P mang ®o¹n intron 1 - cryIA(c) - NOST ®Ó chuyÓn vµo ph«i gièng lóa Indica IR64 vµ thu ®îc 6 dßng lóa cã kh¶ n¨ng kh¸ng s©u ®ôc th©n Scirpophaga incertulas nhê chøa gen cryIA(c) tån t¹i bÒn v÷ng ë thÕ hÖ T2 [151].

c) G¾n intron t¨ng cêng vµo gen quan t©m

Ngoµi tr×nh tù m· ho¸ protein, ®o¹n khëi ®éng vµ ®o¹n kÕt thóc, çc intron còng lµ mét trong nh÷ng yÕu tè cã kh¶ n¨ng lµm t¨ng møc ®é biÓu hiÖn gen [42], [50], [159], [168]. Nghiªn cøu cña Last & Rose cho thÊy c©y trång ®îc chuyÓn kÕt cÊu gen gus mang intron cã phæ nhuém huúnh quang réng vµ ®Ëm h¬n so víi cÊu tróc thiÕu çc thµnh phÇn nµy [131]. Tuy nhiªn, çc ®o¹n intron chØ cã mÆt trong rÊt Ýt gen chØ thÞ nh»m nghiªn cøu chøc n¨ng biÓu hiÖn cña gen vµ trî gióp qu¸ tr×nh biÓu hiÖn mét sè gen nhÊt ®Þnh. Nghiªn cøu cña Callis & ®tg trªn çc vect¬ pACI1 I8,9A vµ pAI1 CI8,9A (trong ®ã A chØ Adh1, IX chØ çc intron sè X

37

vµ C chØ gen cat), cho thÊy vÞ trÝ cña ®o¹n intron 1 cña gen m· ho¸ Adh1 cña ng« trong gen cat cã ¶nh hëng quan träng ®Õn møc ®é biÓu hiÖn cña gen. NÕu intron 1 n»m ë phÝa tríc gen cat, møc ®é biÓu hiÖn t¨ng 110 lÇn so víi trêng hîp thiÕu intron 1 (ë vect¬ pACI8,9A), gÊp 21 lÇn so víi trêng hîp ®o¹n intron 1 n»m sau gen cat (ë vect¬ pACI1 I8,9 A) [46]. ë rÊt nhiÒu gen thùc vËt, intron ®· cã ¶nh hëng tÝch cùc ®Õn qu¸ tr×nh biÓu hiÖn gen nhê kh¶ n¨ng lµm t¨ng qu¸ tr×nh tÝch luü ARN th«ng tin [46], [70]. Tuy nhiªn, kh«ng ph¶i tÊt c¶ intron ®Òu cã kh¶ n¨ng nµy. Mét sè gen thùc vËt kh«ng thay ®æi møc ®é biÓu hiÖn khi cã hoÆc kh«ng cã mÆt intron. Trong mét sè trêng hîp, cÊu tróc vµ chiÒu dµi cña ®o¹n intron kh«ng ¶nh hëng ®Õn kh¶ n¨ng biÓu hiÖn gen [58].

MÆc dï rÊt nhiÒu vÝ dô cho thÊy intron t¨ng cêng qu¸ tr×nh biÓu hiÖn gen, ngêi ta vÉn cha râ c¬ chÕ cña qu¸ tr×nh t¨ng cêng nµy. Mét sè gi¶ thuyÕt ®· ®îc ®a ra: (i) Cã thÓ intron chøa yÕu tè t¨ng cêng tham gia vµo qu¸ tr×nh dÞch m·; (ii) HoÆc qu¸ tr×nh c¾t ARN cã thÓ ¶nh hëng ®Õn sù bÒn v÷ng cña ARN th«ng tin. Mét sè intron lµm t¨ng qu¸ tr×nh tÝch luü ARN th«ng tin nhê c¬ chÕ liªn quan ®Õn sù ph©n c¾t intron. Trong nh÷ng trêng hîp nµy, intron n»m trong vïng mang m· cña gen theo híng thÝch hîp gióp t¨ng qu¸ tr×nh biÓu hiÖn. Nghiªn cøu ®ét biÕn cho thÊy, trªn intron, nh÷ng tr×nh tù cÇn thiÕt cho qu¸ tr×nh ph©n c¾t gen vµ t¨ng cêng biÓu hiÖn gen ®Þnh vÞ trªn cïng mét vÞ trÝ [135], [136]. Çc tr×nh tù bªn trong intron cã thÓ thay ®æi mµ kh«ng ¶nh hëng ®Õn kh¶ n¨ng t¨ng cêng nµy chØ cÇn chóng ®îc duy tr× kh¶ n¨ng ph©n c¾t hiÖu qu¶. Nh×n chung, intron kh«ng ®îc sö dông phæ biÕn ®Ó biÓu hiÖn çc gen quan t©m do: (i) khã kh¨n trong viÖc ph©n lËp vµ chuyÓn intron tõ gen nµy vµo gen kia mµ kh«ng ®ång thêi ®a vµo çc tr×nh tù m· ho¸ cho çc aa kh«ng

38

mong muèn; (ii) intron lµm thay ®æi ®o¹n khëi ®éng ¶nh hëng ®Õn qu¸ tr×nh biÓu hiÖn gen; (iii) h¬n n÷a, intron cã mÆt trong gen kh«ng ®¶m b¶o gen ®ã ®îc t¨ng cêng biÓu hiÖn. HiÖn nay, vÊn ®Ò intron nµo sÏ t¨ng cêng tèi ®a møc ®é biÓu hiÖn cña tõng gen ®Æc biÖt trong nh÷ng loµi mong muèn vÉn ®ang tiÕp tôc ®-îc nghiªn cøu [81]. Ngoµi intron, çc yÕu tè t¨ng cêng thùc vËt kh¸c còng ®ãng vai trß quan träng trong biÓu hiÖn gen. Odell & ®tg ®· tiÕn hµnh ®a ®o¹n tr×nh tù 338 bp n»m tríc hép TATA ë CaMV35S-P vµo çc ®o¹n khëi ®éng yÕu t¨ng møc ®é biÓu hiÖn cña gen nh khi ®îc ®iÒu khiÓn b»ng CaMV35S-P nguyªn vÑn [153].

d) ThiÕt kÕ cÊu tróc gen kÐp

Ho¹t tÝnh kh¸ng c«n trïng nhiÒu khi ®· t¨ng lªn khi c©y ®îc chuyÓn ®ång thêi nhiÒu gen víi çc c¬ chÕ kh¸ng s©u kh¸c nhau. Thö nghiÖm çc dßng b«ng kh«ng chøa, chøa 1 hoÆc 2 gen cry cho thÊy, c©y b«ng cã ho¹t tÝnh ®éc m¹nh nhÊt ®èi víi s©u h¹i khi ®îc chuyÓn vµ biÓu hiÖn ®ång thêi gen cryIA(c) vµ cryIIA(b) [182]. KÕt qu¶ t¬ng tù nhËn ®îc khi biÓu hiÖn operon víi 3 gen m· ho¸ CryIIA trong lôc l¹p [63].

e) Sö dông hÖ thèng vect¬ chän läc tÝch cùc

HÖ thèng nµy hoµn toµn kh«ng sö dông çc gen kh¸ng kh¸ng sinh hoÆc thuèc diÖt cá, cho phÐp ph¸t hiÖn vµ chän läc dÔ dµng vµ hiÖu qu¶ çc tÕ bµo mang gen quan t©m mµ kh«ng g©y ¶nh hëng hoÆc tiªu diÖt çc tÕ bµo b×nh thêng. ë ®©y, gen ®¬n ®· ®îc sö dông ®ång thêi lµm gen chØ thÞ vµ chän läc. Nhê vËy, viÖc thiÕt kÕ vect¬ ®¬n gi¶n h¬n vµ cÊu tróc vect¬ æn ®Þnh h¬n víi gen quan t©m vµ mét tr×nh tù nucleotit kh¸c m· ho¸ cho protein liªn quan ®Õn sù trao ®æi chÊt cña mannoza hoÆc xyloza. Hai gen nµy ®îc ®a ®ång thêi vµo genom cña tÕ bµo. Do

39

vËy, khi tiÕn hµnh chän läc çc thÓ biÕn n¹p, m«i trêng nu«i cÊy cÇn ®îc bæ sung mannoza hoÆc xyloza. CÇn nhÊn m¹nh r»ng, protein liªn quan ®Ò cËp ë trªn cã thÓ lµ enzym chÞu tr¸ch nhiÖm trùc tiÕp hoÆc gi¸n tiÕp cho qu¸ tr×nh s¶n xuÊt hoÆc tæng hîp hîp chÊt ®a vµo m«i trêng [33], [68].

1.3 ChuyÓn gen kh¸ng c«n trïng vµo c©y trång1.3.1 T×nh h×nh nghiªn cøu ë níc ngoµi1.3.1.1 Thö nghiÖm çc c©y trång biÕn ®æi di truyÒn

N¨m 1984, c©y trång ®Çu tiªn trªn thÕ giíi ®· ®îc chuyÓn gen cry. §Õn nay, vÊn ®Ò c¶i biÕn gièng c©y trång ®· ph¸t triÓn vît bËc nhê sö dông kü thuËt hiÖn ®¹i nµy. Danh s¸ch çc c©y trång ®îc biÕn ®æi di truyÒn ngµy mét nhiÒu. Theo th«ng b¸o tãm t¾t cña Tæ chøc DÞch vô Quèc tÕ vÒ Thu thËp çc øng dông C«ng nghÖ Sinh häc N«ng nghiÖp (International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications - ISAAA), trong giai ®o¹n tõ 1986-1997 trªn toµn cÇu cã tíi 25000 çc thö nghiÖm ®ång ruéng ®èi víi çc c©y trång biÕn ®æi di truyÒn. Trong ®ã, 72% çc cuéc thö nghiÖm ®îc tiÕn hµnh ë Mü, tiÕp ®Õn lµ Canada, ch©u ¢u, ch©u Mü La tinh vµ ch©u ¸. Çc thö nghiÖm nµy tËp trung vµo 10 lo¹i tÝnh tr¹ng trªn ®èi tîng lµ 60 loµi c©y trång n«ng nghiÖp [115]. Trong hµng lo¹t çc tÝnh tr¹ng quan träng ®îc c¶i biÕn cña c©y trång, tÝnh tr¹ng kh¸ng c«n trïng ®îc ®Æc biÖt quan t©m (h×nh 1.5) [114].

H×nh 1.5. Çc nhãm tÝnh tr¹ng chÝnh ®îc thö nghiÖm chuyÓn gen trªn toµn cÇu giai ®o¹n 1986-1995

Nh÷ng nguån gen kh¸ng c«n trïng cã Ých ®îc nhiÒu nhµ khoa häc trªn thÕ giíi quan t©m nghiªn cøu khai th¸c vµ chuyÓn vµo thùc vËt. Trong ®ã, gen cry tù nhiªn còng nh c¶i biÕn ®îc chuyÓn

40

vµ biÓu hiÖn trong hµng lo¹t c©y trång: thuèc l¸, cµ chua (1987); ng« (1989); lóa (1990); khoai t©y (1992); ng« vµ c¶i b«ng (1993); c¶i dÇu vµ ®Ëu t¬ng (1994); th«ng vµ c©y d¬ng (1995); mÝa vµ t¸o (1996); l¹c, ®Ëu vµ cá linh l¨ng (1997) [79], [120], [177]. Ng«, b«ng mang gen cry lµ nh÷ng c©y chuyÓn gen ®Çu tiªn ®îc trång ®¹i trµ vµ th¬ng m¹i ho¸ ë Mü [127]. B¶ng 1.2 cho thÊy çc c©y trång chuyÓn gen cry cã ho¹t tÝnh diÖt c«n trïng.

B¶ng 1.2. ChuyÓn gen cry vµo c©y trång [26], [45], [120]

C©y trång

Gen Lo¹iC«n trïng ®Ých

Loµi Bé

Thuèc l¸cryIA(a), cryIA(b)

WT Manduca sexta L

cryIA(b), cryIA(c)

PM M. sexta L

cryIA(c) WT Heliothis virescens, H. zea, S. exigua

L

cryIC S Spodoptera littoralis LCµ chua cryIA(b) WT H. virescens LB«ng cryIA(b),

cryIA(c)S H. zea, H. virescens L

Khoai t©y

cryIA(b) WT Phthoimaea operculella

L

cryIIIA S Leptinotarsa decemlineata

C

C¶i cryIA(c) S Plutella xylostella, H. zea Trichoplusiani, S. exigua

L

§Ëu t-¬ng

cryIA(c) S H. zea, H. viresPsedoplusia includens

L

Ng« cryIA(b) S Ostrinia nubilabis, H. zea

L

Lóa cryIA(b), cryIA(c )

S Chilo suppreessali Scirpophaga

L

41

C©y trång

Gen Lo¹iC«n trïng ®Ých

Loµi Béincertulas,Snaphalocrosis medinalis

* L: Lepidoptera - Bé Çnh v¶y ; C: Coleoptera- Bé Çnh cøng; WT: Gen tù nhiªn (Native gene); PM: Gen biÕn ®æi mét phÇn (Partly modified); S: Gen tæng hîp nh©n t¹o (Synthesized gene).

Ngoµi gen cry, çc gen m· ho¸ protein kh¸ng s©u kh¸c ®· vµ ®ang ®îc chuyÓn vµo nhiÒu loµi c©y trång. Lectin liªn kÕt glucoza/ mannoza t¸ch tõ c©y ®Ëu Hµ Lan víi u ®iÓm kh«ng g©y ®éc ®èi víi ®éng vËt, mÆc dï cã ho¹t tÝnh diÖt c«n trïng t¬ng ®èi thÊp nhng vÉn ®îc chuyÓn vµo thuèc l¸ t¹o kh¶ n¨ng kh¸ng s©u rãm ®ôc chåi. Ngoµi ra, gen m· ho¸ cholesterol oxidaza tù nhiªn giµu Guanin/ Xytonin ®· ®îc chuyÓn vµo thuèc l¸ [75]. Gen m· ho¸ chitinaza cña M. sexta còng ®îc chuyÓn vµo thuèc l¸ gióp c©y kh¸ng l¹i c«n trïng thuéc Bé Çnh v¶y [69]. Tuy nhiªn trong hµng lo¹t çc thö nghiÖm ®ång ruéng nh»m biÓu hiÖn gen cry nãi riªng vµ çc gen kh¸ng c«n trïng nãi chung ®· tiÕn hµnh, mét sè thö nghiÖm kh«ng thu ®îc kÕt qu¶ mong muèn. ë óc, c©y b«ng ®îc chuyÓn gen cry kh«ng cã kh¶ n¨ng tiªu diÖt Bím ®ªm (Helicoverpa armigera). N¨m 1996, 2 triÖu mÉu Anh (chiÕm 13% tæng diÖn tÝch ®Êt trång b«ng ë Mü) ®îc gieo h¹t b«ng mang gen cry do c«ng ty Monsanto cung cÊp. KÕt qu¶, sè b«ng trång trªn diÖn tÝch kho¶ng 20.000 mÉu Anh ë bang Texas kh«ng cã kh¶ n¨ng diÖt s©u xanh [120]... Thö nghiÖm ®ång ruéng çc c©y trång biÕn ®æi di truyÒn ®ßi hái nh÷ng qu¸ tr×nh ®¸nh gi¸ rñi ro vµ kiÓm nghiÖm kü lìng.

1.3.1.2 Th¬ng m¹i ho¸ çc c©y trång biÕn ®æi di truyÒn

42

Giai ®o¹n 1996 - 2000, diÖn tÝch ®Êt trång c©y trång biÕn ®æi di truyÒn th¬ng m¹i trªn toµn cÇu ®· t¨ng tíi 25 lÇn, tõ 1,7 triÖu hecta (ha)/ 1996 lªn 44,2 triÖu ha/ 2000. Trong ®ã, 85% diÖn tÝch nµy tËp trung ë çc níc ph¸t triÓn. CÇn nhÊn m¹nh r»ng, diÖn tÝch ®Êt trång c©y chuyÓn gen ë çc níc ®ang ph¸t triÓn t¨ng 51% tõ 7,1 triÖu ha (1999) lªn 10,7 ha (2000). Trong khi, tû lÖ nµy chØ ®¹t 2% ë çc níc ph¸t triÓn: 32,8 triÖu ha lªn 33,5 triÖu ha. Tõ n¨m 2000 ®Õn 2001, diÖn tÝch ®Êt trång c©y chuyÓn gen t¨ng tíi 19% [117]. §Æc biÖt, còng ë giai ®o¹n 1996 - 2000, sè lîng quèc gia trång c©y chuyÓn gen ®· t¨ng h¬n hai lÇn: tõ 6 quèc gia (1996) lªn 9 quèc gia (1998), 12 (1999) vµ 13 quèc gia vµo n¨m 2000. Nh÷ng con sè nµy phÇn nµo kh¼ng ®Þnh sù quan t©m cña toµn cÇu ®Õn c«ng nghÖ gen nãi chung vµ c©y trång biÕn ®æi di truyÒn nãi riªng. Çc c©y trång biÕn ®æi di truyÒn cã mÆt ë c¶ 6 ch©u lôc (Nam Mü, ch©u Mü La Tinh, ch©u ¸, ch©u ¢u, ch©u Phi vµ ch©u §¹i D¬ng) vµ chñ yÕu bao gåm: ®Ëu t¬ng, b«ng, c¶i, ng« vµ khoai t©y. Còng theo thèng kª cña James, trong giai ®o¹n 1996 - 2000 c©y trång th¬ng m¹i chñ yÕu ®îc chuyÓn gen nh»m t¹o tÝnh kh¸ng chÊt diÖt cá vµ kh¸ng c«n trïng [116]. Çc loµi c©y trång cã ho¹t tÝnh diÖt c«n trïng bao gåm: thuèc l¸, cµ chua, khoai t©y, b«ng, ng«, ãc chã, mÝa vµ lóa [100]. N¨m 1995, nh÷ng c©y trång biÕn ®æi di truyÒn ®Çu tiªn nh ng« biÓu hiÖn gen cryIA(b) (Maximizer cña Novartis), b«ng s¶n sinh protein ®éc tè CryIA(c) (BollgardTM cña Monsanto) vµ khoai t©y biÓu hiÖn CryIIIA (NewleafTM cña Monsanto) ®îc ®a vµo thÞ trêng Mü. N¨m 1996, diÖn tÝch ®Êt trång c©y chuyÓn gen cry ë Mü chiÕm tíi 1,2 triÖu ha. HÇu hÕt çc gièng nµy còng ®îc trång ®¹i trµ ë çc quèc gia kh¸c nh Argentina vµ óc [127]. N¨m 2000, c©y b«ng mang gen cry ®îc trång trªn 6,8 triÖu ha ë 6 quèc gia, t-

43

¬ng øng 15% diÖn tÝch ®Êt trång c©y chuyÓn gen toµn cÇu. B¶ng 1.3 lµ diÖn tÝch ®Êt trång c©y chuyÓn gen cry theo c«ng nghÖ cña C«ng ty Monsanto. Th¬ng m¹i ho¸ c©y trång biÕn ®æi di truyÒn cã søc ®Ò kh¸ng sinh vËt g©y h¹i ®Æc biÖt lµ c«n trïng kh«ng chØ t¨ng n¨ng suÊt, gãp phÇn æn ®Þnh l¬ng thùc mµ cßn gi¶m viÖc sö dông thuèc trõ s©u ho¸ häc, tr¸nh « nhiÔm m«i tr-êng.

B¶ng 1.3. DiÖn tÝch ®Êt trång c©y chuyÓn gen cry theo c«ng nghÖ cña Monsanto (Ngh×n ha) [145]

Quèc gia N¨m B«ng Ng« Khoai t©y

Mü1996 7291997 1 000 + 1 300 + 10 1998 2 025 + 4 000 20

Canada 1997 4 21998 122 4

Trung Quèc

1998 53

Mexico 1997 151998 40,5

Argentina 1998 8óc 1997 60

1998 81Nam Phi 1998 12

+: Sè liÖu b«ng n¨m 1997, 1998 ë Mü gåm mét phÇn diÖn tÝch ®Êt trång b«ng kh¸ng thuèc diÖt cá.

1.3.2 T×nh h×nh nghiªn cøu trong níc

RÊt nhiÒu quèc gia ®· vµ ®ang tham gia m¹nh mÏ vµo lÜnh vùc t¹o vµ th¬ng m¹i ho¸ c©y trång biÕn ®æi di truyÒn. Mét sè n-íc §«ng Nam ¸ nh Th¸i Lan, Phi-lip-pin, Malaysia còng ®ang nhËp cuéc. ë ViÖt Nam, lÜnh vùc chuyÓn gen t¹o sinh vËt biÕn ®æi di truyÒn cßn rÊt chËm ph¸t triÓn so víi thÕ giíi. Do ®iÒu kiÖn cßn h¹n chÕ nªn çc c«ng tr×nh nghiªn cøu vÒ chuyÓn gen cßn Ýt.

44

GÇn ®©y, víi sù ®Çu t cña nhµ níc trong x©y dùng tiÒm lùc çn bé vµ phßng thÝ nghiÖm, chóng ta ®· lµm chñ ®îc çc kü thuËt c¬ b¶n vµ triÓn khai ®îc mét sè nghiªn cøu lµm c¬ së ®Ó t¹o sinh vËt biÕn ®æi di truyÒn.

Trong lÜnh vùc t¹o c©y trång biÕn ®æi di truyÒn, nghiªn cøu chuyÓn gen kh¸ng c«n trïng vµo c©y trång còng b¾t ®Çu víi mong muèn t¹o ra vµ ®a vµo øng dông çc gièng c©y trång lý t-ëng cã kh¶ n¨ng tù chèng chÞu s©u bÖnh. T¹i ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, nhiÒu gen quý nh gen m· ho¸ lectin vµ -AI ë ®Ëu c« ve ®· ®îc ph©n lËp vµ t¹o dßng [8], gen m· ho¸ protein bÊt ho¹t ho¸ ribosom còng ®îc ph©n lËp vµ biÓu hiÖn thµnh c«ng trong vi khuÈn, nÊm men [6], [7], [10]. Çc gen cã gi¸ trÞ nµy ®· vµ ®ang ®îc nghiªn cøu ®Ó chuyÓn vµo c©y trång. §Æc biÖt, ph¬ng ph¸p chuyÓn gen nhê Agrobacterium còng ®îc sö dông ë mét sè phßng thÝ nghiÖm vÒ c«ng nghÖ gen vµ thu ®îc nh÷ng kÕt qu¶ kh¶ quan trªn çc ®èi tîng c©y trång quan träng nh lóa, c¶i xanh, c¶i b¾p, b«ng, ®u ®ñ, khoai t©y, khoai lang...[3], [11], [15], [16], [17], [22], [24]. Tuy nhiªn, çc c«ng tr×nh chuyÓn gen thêng ®îc triÓn khai sö dông çc vect¬ mang gen chØ thÞ ®Ó hoµn thiÖn çc quy tr×nh chuyÓn gen vµo mét sè c©y trång quan träng lµm c¬ së cho bíc chuyÓn gen cã gi¸ trÞ vµo çc ®èi tîng c©y trång nµy.

1.3.3 Nh÷ng vÊn ®Ò nan gi¶i vµ gi¶i ph¸p cÇn thiÕt

1.3.3.1 KhÝa c¹nh së h÷u trÝ tuÖ

ThÕ giíi víi hµng triÖu ngêi bÞ ®ãi do thiÕu l¬ng thùc, gÇn 800 triÖu ngêi suy dinh dìng trë thµnh mèi quan t©m cña toµn nh©n lo¹i [76]. Lµm sao ®Ó t¨ng s¶n lîng vµ chÊt lîng l¬ng thùc khi c«ng nghÖ sinh häc c¶i biÕn c©y trång chØ tËp trung ë mét sè

45

c«ng ty chÝnh? Çc c«ng ty nµy ®Çu t kinh phÝ ®¸ng kÓ ®Ó nghiªn cøu, t¹o ra c«ng nghÖ vµ ®¨ng ký së h÷u trÝ tuÖ. RÊt nhiÒu s¸ng chÕ liªn quan ®Õn ph¬ng ph¸p biÕn n¹p gen, biÓu hiÖn gen, gen ®Æc hiÖu, chØ thÞ chän läc vµ ®o¹n khëi ®éng ®· ®îc c«ng nhËn [160]. HiÖn nay, çc c«ng nghÖ liªn quan ®Õn viÖc t¨ng hiÖu qu¶ trång trät, h¹n chÕ rñi ro, gi¶m ¶nh hëng cã h¹i cña m«i trêng ®èi víi s¶n xuÊt n«ng nghiÖp nh c«ng nghÖ t¹o gièng c©y trång cã kh¶ n¨ng sinh trëng nhanh, cho s¶n lîng cao vµ chèng chÞu ®îc ®iÒu kiÖn bÊt lîi; c«ng nghÖ t¹o thùc phÈm chÊt l-îng tèt... thêng do çc c«ng ty chÝnh n¾m quyÒn kiÓm so¸t (vÒ mÆt kü thuËt vµ së h÷u trÝ tuÖ)... Do vËy, hÇu hÕt çc c«ng nghÖ nµy kh«ng ®îc c«ng bè réng r·i vµ n«ng d©n nghÌo ë kh¾p n¬i trªn thÕ giíi thêng kh«ng ph¶i lµ ®èi tîng ®îc tiÕp nhËn c«ng nghÖ [100], [101]. ChØ mét sè Ýt c«ng ty ®· tù nguyÖn hç trî vµ chuyÓn giao c«ng nghÖ cho çc níc ®ang ph¸t triÓn. §Õn nay, mét sè c«ng nghÖ ®· ®îc tiÕp nhËn vµ ®a vµo øng dông.

1.3.3.2 KhÝa c¹nh kü thuËt

HiÖn nay, vÊn ®Ò mét sè loµi c«n trïng vµ s©u h¹i cã kh¶ n¨ng kh¸ng l¹i thuèc trõ s©u ho¸ häc còng nh protein ®éc tè lµ mét th¸ch thøc lín. Nghiªn cøu cña Tabashnik ®· kh¼ng ®Þnh sù h×nh thµnh quÇn thÓ s©u h¹i kh¸ng l¹i protein tinh thÓ ®éc ®ang ë møc b¸o ®éng [185]. §èi phã víi hiÖn tîng nµy, çc nhµ khoa häc ®· ®a ra mét gi¶i ph¸p h÷u hiÖu khi chuyÓn nhiÒu gen víi çc c¬ chÕ kh¸ng s©u kh¸c nhau vµo cïng mét ®èi tîng c©y trång [41], [51]. Chñng Bt chñ EG4923-4 thêng ®îc sö dông ®Ó chuyÓn çc gen cryIC tù nhiªn còng nh ®ét biÕn nh»m t¨ng hiÖu qu¶ diÖt c«n trïng. EG4923-4 ®îc thiÕt kÕ mang ®ång thêi 3 gen cryIA(c) vµ 1 gen cryIIA trªn çc plasmit tù nhiªn [171]. GÇn ®©y, ®éc tè

46

CryIA(c) vµ CryIF ®îc biÓu hiÖn ®ång thêi trong c©y trång nh»m t¨ng hiÖu qu¶ diÖt H. armigera [48]. Gen cryIA(b) vµ cryIA(c) ®îc chuyÓn vµo lóa t¹o protein cã ho¹t tÝnh ®éc m¹nh ®èi víi s©u ®ôc th©n bím hai chÊm vµ s©u ®ôc th©n n¨m v¹ch [52]. §Ó t¨ng kh¶ n¨ng kh¸ng Êu trïng s©u rãm ®ôc chåi thuèc l¸, gen m· ho¸ chÊt øc chÕ proteaza d¹ng serin vµ lectin t¸ch tõ ®Ëu ®· ®îc chuyÓn ®ång thêi vµo c©y thuèc l¸ [40]. Tuy vËy, møc ®é t¨ng c-êng kh«ng nhiÒu khi c¬ chÕ kh¸ng s©u cña çc gen nµy kh«ng t-¬ng hîp. Trong khi ®o¹n tr×nh tù nh©n t¹o m· ho¸ cho chÊt øc chÕ trypsin ë c©y bÝ dµi 29 aa ®îc chuyÓn cïng víi gen cryIA(c) c¶i biÕn vµo c©y thuèc l¸ l¹i lµm t¨ng ho¹t tÝnh diÖt Êu trïng H. virescens lªn 6 lÇn. KÕt qu¶ nhËn ®îc t¬ng tù khi biÓu hiÖn ®ång thêi protein tinh thÓ ®éc vµ näc ®éc bä c¹p trong cïng mét loµi c©y [36]. Ngoµi ra, hiÖn nay cã mét sè quan ®iÓm cho r»ng nh÷ng gen kh¸ng s©u bÖnh khi ®îc ®a vµo c©y trång còng cã thÓ tiªu diÖt c«n trïng cã Ých, g©y ®éc con ngêi, vËt nu«i hoÆc g©y dÞ øng cho nh÷ng ngêi mÉn c¶m do c©y trång biÕn ®æi di truyÒn cã kh¶ n¨ng s¶n t¹o ra protein kh¸ng s©u víi nång ®é cao. Tuy nhiªn, c©y trång biÕn ®æi di truyÒn thêng ®îc ®¸nh gi¸, kiÓm tra chÆt chÏ tríc khi s¶n xuÊt ®¹i trµ nh»m gi¶m tèi ®a nh÷ng ¶nh hëng bÊt lîi. Víi nh÷ng gi¸m s¸t nµy, trong 15 n¨m qua, thùc tÕ kh«ng cã mét trêng hîp nµo çc c©y trång nµy g©y h¹i ®éng vËt, søc khoÎ con ngêi, vµ ¶nh hëng m«i trêng. Theo kÕt qu¶ ®¸nh gi¸ cña C¬ quan KiÓm dÞch §éng Thùc vËt - Bé N«ng nghiÖp Mü (APHIS), c©y trång biÕn ®æi di truyÒn thËm chÝ cßn an toµn h¬n nh÷ng loµi c©y trång th«ng thêng vèn kh«ng ®îc çc nhµ qu¶n lý kiÓm nghiÖm kü lìng. Nh÷ng c©y trång chuyÓn gen cry kh«ng g©y ¶nh hëng bÊt lîi ®Õn m«i trêng trong h¬n 30 n¨m s¶n xuÊt ®¹i trµ [145]. Tranh c·i vÒ nh÷ng ®iÓm m¹nh yÕu cña c©y

47

trång biÕn ®æi di truyÒn còng nh c©y trång cã kh¶ n¨ng kh¸ng s©u vÉn cha kÕt thóc. Tuy nhiªn, doanh thu hµng n¨m tõ viÖc s¶n xuÊt, kinh doanh c©y trång tù kh¸ng s©u bÖnh vÉn t¨ng kh«ng ngõng. Theo sè liÖu gÇn ®©y, chØ tÝnh riªng ë Mü, c©y b«ng, ng« vµ khoai t©y mang gen cry ®îc ®a vµo s¶n xuÊt tõ 1995/ 1996 ®· ®em l¹i lîi nhuËn hµng tr¨m triÖu ®« la Mü mçi n¨m. Çc gen kh¸ng c«n trïng míi vÉn tiÕp tôc ®îc kh¸m ph¸ vµ øng dông nh»m më réng ph¹m vi ¶nh hëng cña protein ®éc tè ®Õn nh÷ng loµi c«n trïng g©y h¹i kh¸c, ®Æc biÖt ®èi víi nh÷ng loµi kh«ng mÉn c¶m víi çc lo¹i ®éc tè ®· biÕt.

§Õn nay, hµng lo¹t c©y trång cã kh¶ n¨ng kh¸ng c«n trïng ®· ®îc trång ®¹i trµ cho môc ®Ých th¬ng m¹i, mét sè kh¸c ®ang ®îc thö nghiÖm ë quy m« phßng thÝ nghiÖm hay ®ång ruéng. Çc c©y trång nµy cã mÆt ë kh¸ nhiÒu níc ph¸t triÓn, ®îc kiÓm tra, ph©n tÝch, thö nghiÖm vµ qu¶n lý kü lìng. Nhê sù hç trî vµ chuyÓn giao, mét sè níc ®ang ph¸t triÓn ®· nhËn ®îc nh÷ng c«ng nghÖ t¹o c©y trång biÕn ®æi di truyÒn. Víi nç lùc cña toµn nh©n lo¹i, t¬ng lai cña vÊn ®Ò phßng chèng s©u bÖnh cho c©y trång chøa ®ùng nhiÒu høa hÑn.

48

Ch¬ng 2. vËt liÖu vµ ph¬ng ph¸p2.1 vËt liÖu vµ ho¸ chÊt, thiÕt bÞ m¸y mãc

2.1.1 VËt liÖu

VËt liÖu thùc vËt: Chóng t«i ®· sö dông gièng lóa C71 vµ CR203 lµ s¶n phÈm nghiªn cøu cña ViÖn B¶o vÖ Thùc vËt, ®· vµ ®ang ®îc trång ®¹i trµ ë ViÖt Nam. Trong ®ã, CR203, gièng lóa kh¸ng rÇy, nhiÔm kh« v»n, b¹c l¸ vµ ®¹o «n, cã nguån gèc tõ ViÖn Nghiªn cøu Lóa Quèc tÕ, ®îc c«ng nhËn lµ gièng quèc gia tõ n¨m 1985; C71, lai gi÷a dßng C671177 vµ RP825-71-4-11, lµ gièng quèc gia tõ n¨m 1995. H¹t cña 2 gièng lóa nµy do Phßng C«ng nghÖ TÕ bµo thùc vËt, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc cung cÊp.

Çc plasmit vµ chñng vi khuÈn ®· sö dông ®îc tr×nh bµy trªn b¶ng 2.4 vµ 2.5.

B¶ng 2.4. Çc plasmit ®· sö dông trong nghiªn cøu

Plasmit KÝch thíc (bp)

§Æc tÝnh N¬i cung cÊp

pGEM4Z-Ubi-cryIA(c)

6846 Ubi- cryIA(c)-NOS

GS. I. Altosaar, §¹i häc Tæng hîp Ottawa, Canada

pCAMBIA1300 8958 Kmr, Hygromycinr

Trung t©m øng dông Sinh häc Ph©n tö vµo N«ng nghiÖp Quèc tÕ (CAMBIA), óc

pUC118 3200 Ampr, lacZ Takara, NhËt B¶npBluescript KS(-)

2961 Ampr, lacZ-P Stratagene, Mü

pET-21d 5440 Ampr, T7-P Novagen, MüpNOV2819 7599 Spectinomyci

nrSyngenta, Thuþ SÜ

49

Çc vËt liÖu kh¸c: (1) CÆp måi nh©n C71S-P do chóng t«i thiÕt kÕ ®îc ®Æt tæng hîp t¹i h·ng GENSET (Singapore Biotech Pte, Ltd.). (2) Kh¸ng thÓ kh¸ng CryIA(c) do GS. Supat Attathom, Trung t©m Kü thuËt Di truyÒn Thùc vËt, Trêng §¹i häc Kasetsart, Th¸i Lan cung cÊp. (3) Kh¸ng nguyªn CryIA(b), kh¸ng thÓ chuÈn kh¸ng CryIA(c) nhËn ®îc tõ TS. NguyÔn ThÞ Léc, Bé m«n Sinh th¸i C«n trïng vµ Phßng trõ Sinh häc, ViÖn Lóa ®ång b»ng s«ng Cöu Long; Kh¸ng nguyªn CryIA(c) do TS. Vâ ThÞ Thø, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc cung cÊp.

B¶ng 2.5. Çc chñng vi khuÈn

Loµi Chñng N¬i cung cÊp

E. coliBL21 (DE3)

TS. C. Fukazawa, ViÖn Nghiªn cøu L¬ng thùc Quèc gia NhËt B¶n

HB101DH5 H·ng Gibco BRL Life Technologies, Mü

A. tumefaciens

LBA4404 GS. K. Muntz, ViÖn Di truyÒn Thùc vËt vµ Nghiªn cøu c©y trång Gatersleben, §øcEHA105

2.1.2 Ho¸ chÊt vµ thiÕt bÞ m¸y mãc

Çc lo¹i ho¸ chÊt: ALFExpressTMAutoCycleTMSequencing Kit, ReproGelTMLong Read Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Thôy §iÓn); enzym h¹n chÕ (Restriction Enzymes), T4 ADN ligaza, thang ADN (New England Biolabs, Mü); Taq ADN polymeraza (Perkin Elmer Cetus, Mü); Agaroza (Gibco BRL Life Technologies, Mü); Tris base, EDTA (Amersham Pharmacia Biotech, Thôy §iÓn) vµ çc ho¸ chÊt th«ng dông kh¸c ®îc mua cña çc h·ng New England Biolabs, Perkin Elmer Cetus, Merk/ BDH Chemicals (§øc), Sigma (Mü).

50

Çc lo¹i thiÕt bÞ m¸y mãc: M¸y x¸c ®Þnh tr×nh tù nucleotit tù ®éng - ALF Express, m¸y chôp ¶nh (Amersham Pharmacia Biotech, Thôy §iÓn); M¸y quang phæ tö ngo¹i - Diode Array Spectrophotometer 8452 A (Hewlett Parkard, Mü); M¸y ly t©m AvantiTM30 (Beckman, Mü); M¸y ly t©m 5415 C (Eppendorf, §øc); M¸y PCR - PTC 100 (MJ Research- Mü); M¸y ®iÖn di Power Pac 300, m¸y biÕn n¹p xung ®iÖn Gene Pulser, m¸y soi ADN (Bio-Rad, Mü); M¸y ®o pH Meter Delta 320 (Mettler Toledo, Thuþ SÜ); M¸y hót ch©n kh«ng - Speed Vac Sc 110A (Savant, Mü).

2.2 Ph¬ng ph¸p

2.2.1 Nu«i cÊy vµ lu gi÷ çc chñng vi khuÈn

2.2.1.1 Nu«i cÊy vi khuÈn: ChuyÓn mét khuÈn l¹c tõ ®Üa m«i trêng th¹ch (cã kh¸ng sinh chän läc) sang 5 ml m«i trêng láng ®· bæ sung kh¸ng sinh t¬ng øng, nu«i cÊy l¾c 160 vßng/ phót (v/ p) tõ 8 - 16 giê ë 370C trªn m«i trêng LB (®èi víi E. coli), 20 - 48 giê ë 280C trªn m«i trêng YEP (®èi víi A. tumefaciens).2.2.1.2 CÊy ria t¹o khuÈn l¹c ®¬n: Nhóng que cÊy v« trïng vµo dÞch nu«i cÊy vi khuÈn, cÊy ria trªn ®Üa petri chøa m«i trêng th¹ch cã kh¸ng sinh, nu«i cÊy ë nhiÖt ®é vµ thêi gian thÝch hîp, sau ®ã gi÷ ë 40C vµ sö dông trong vßng mét th¸ng. 2.2.1.3 Gi÷ gièng: Bæ sung glyxerol v« trïng ®Õn nång ®é cuèi cïng 15% vµo 0,5 - 1 ml m«i trêng láng ®· nu«i cÊy vi khuÈn qua ®ªm vµ gi÷ ë -800C. Theo ph¬ng ph¸p nµy gièng cã thÓ duy tr× ®îc trong vµi n¨m. 2.2.1.4 M«i trêng chän läc vi khuÈn: Çc chÊt chän läc cÇn ®îc bæ sung vµo m«i trêng nu«i cÊy khi nhiÖt ®é m«i trêng kho¶ng 500C, gi÷ ®Üa ë 40C vµ sö dông trong vµi ngµy ®Õn vµi

51

tuÇn tuú vµo ®é bÒn cña çc chÊt chän läc. M«i trêng nu«i cÊy çc chñng vi khuÈn ®îc tr×nh bµy trªn b¶ng 2.6.

B¶ng 2. 6. M«i trêng nu«i cÊy [52], [71], [170]M«i tr-êng/ lÝt

pH Cao nÊm men

Pepton

Trypton

NaCl Th¹ch Ho¸ chÊt kh¸c

LB 7,0

5 g - 10 g 10 g 15 g -

YEP 7,0

10 g 10 g - 5 g 15 g Sacaroza: 5 g;MgSO4.7H2O: 2 mM

SOC 5 g 20 g 10 mM

KCl: 2,5 mM; MgSO4: 10 mM; MgCl2: 10 mM; Glucoza: 20 mM

TiÕp hîp 10 g 8 g 15 g

2.2.2 T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch ADN plasmit, ADN genom

2.2.2.1 T¸ch chiÕt ADN plasmit cña vi khuÈn E. coli vµ A. tumefaciens

TÕ bµo vi khuÈn ®îc nu«i cÊy vµ nh©n lªn ®Õn giai ®o¹n gi÷a pha log. Thµnh tÕ bµo ®îc ph¸ vì b»ng kiÒm vµ çc chÊt tÈy m¹nh cã trong dung dÞch I vµ dung dÞch II. ADN nhiÔm s¾c thÓ vµ protein trong tÕ bµo ®îc lo¹i ra nhê dung dÞch III vµ phenol, chloroform, isoamylalcohol. ADN plasmit ®îc kÕt tña b»ng ethanol vµ thu l¹i nhê ly t©m víi tèc ®é 14000 v/ p. ADN ®îc hßa trong TE (Tris.Cl + EDTA) vµ tiÕn hµnh lo¹i ARN. Ho¸ chÊt t¸ch chiÕt ADN plasmit bao gåm: (1) Dung dÞch I: 50 mM glucoza; 25 mM Tris.Cl pH 8,0; 10 mM EDTA pH 8,0. Khö trïng, gi÷ ë - 40C; (2) Dung dÞch II: 0,2 N NaOH; 1% SDS (Sodium dodecyl sulfate). Pha míi tríc khi sö dông; (3) Dung dÞch III: 60 ml axetat K 5 M; 11,5 ml axit axetic;

52

28,5 ml H2O; (4) Dung m«i lo¹i protein: phenol; hçn hîp phenol : chloroform : isoamylalcohol (25: 24:1); chloroform : isoamylalcohol (24:1); (5) 0,01M TE pH 8,0: 0,1 mM Tris.Cl pH 8,0; 0,01 mM EDTA pH 8,0.

● Quy tr×nh t¸ch chiÕt ADN plasmit cña E. coli: (1) Nu«i cÊy l¾c qua ®ªm tÕ bµo E. coli trong 3 ml m«i trêng LB víi kh¸ng sinh thÝch hîp ë 370C, 200 v/ p; (2) Ly t©m 1,5 ml dÞch nu«i cÊy trªn ë 6000 v/ p, 8 phót; (3) Hoµ cÆn tÕ bµo vi khuÈn trong 100 l dung dÞch I ®Ó l¹nh, gi÷ trong ®¸ 5 phót; (4) Bæ sung 200 l dung dÞch II pha míi, ®¶o ®Çu èng eppendorf nhÑ nhµng vµ gi÷ trªn ®¸ 10 phót; (5) Thªm 150 l dung dÞch III ®Ó l¹nh, ®¶o nhÑ vµ ñ trong ®¸ tõ 3-5 phót; (6) Thªm 550 l phenol : chloroform, ®¶o ®Çu èng eppendorf vµ ly t©m ë 14000 v/ p, 15 phót; Hót dÞch pha trªn sang èng eppendorf míi vµ chiÕt tiÕp b»ng chloroform : isoamylalcohol; (7) Bæ sung 1 ml cån tuyÖt ®èi vµ 10 l 3M axetat Na, ®Ó l¹nh -200C trong 3 giê vµ ly t©m 14000 v/ p, 8 phót thu ADN; (8) Röa cÆn b»ng 0,2 ml cån 70%, ly t©m 14000 v/p, 3 phót, lµm kh« vµ hoµ cÆn trong 40 l 0,01 M TE, gi÷ ë -20 0C; (9) Bæ sung RNaza vµo mÉu ADN ®Õn nång ®é cuèi cïng lµ 100 μg/ ml, ñ mÉu ë 370C trong 1 giê, chiÕt b»ng phenol : chloroform, chloroform : isoamylalcohol vµ tña l¹i ADN b»ng ethanol; (10) nång ®é vµ ®é s¹ch cña ADN ®îc x¸c ®Þnh b»ng phæ hÊp thô trªn m¸y quang phæ tö ngo¹i vµ ®iÖn di trªn gel agaroza 0,8% [170].

● T¸ch chiÕt ADN plasmit cña A. tumefaciens: (1) Nu«i cÊy l¾c tÕ bµo ë 280C, 36 giê trªn m«i trêng YEP cã bæ sung kh¸ng sinh; (2) Ly t©m 1,5 ml dÞch nu«i cÊy trªn ë 12000 v/ p trong 10 phót, hoµ cÆn tÕ bµo nhÑ nhµng trong 1 ml dung dÞch röa pH 8,0 (0,5 M NaCl; 50 mM Tris.Cl; 20 mM EDTA; 0,1 % sarcosyl), sau ®ã

53

ly t©m ë 12000 v/ p, 40C, trong 1 phót; (3) Hoµ cÆn trong 100 μl dung dÞch GTE (50 mM glucoza; 25 mM Tris.Cl; 10 mM EDTA pH 8,0), thªm 25 μl lysozym 40 mg/ ml pha trong GTE, trén ®Òu vµ ñ ë 370C trong 15 phót; (4) Bæ sung 200 μl dung dÞch II pha míi, ®¶o nhÑ ®Çu èng eppendorf, ñ 10 phót ë 370C. NÕu mÉu kh«ng trong, ñ ë 500C, 5 phót; (5) Bæ sung 150 μl dung dÞch 3M axetat Na pH 5,2; l¾c, gi÷ 10 phót ë nhiÖt ®é phßng; (6) Ly t©m ë 12000 v/ p trong 5 phót, chuyÓn dÞch pha trªn sang eppendorf míi, bæ sung 550 μl phenol : chloroform, ly t©m 15 phót vµ tiÕp tôc chuyÓn pha trªn sang eppendorf míi. Bæ sung 1 ml cån tuyÖt ®èi vµ gi÷ ë -200C trong 1-2 giê; (7) Ly t©m ë 12000 v/ p trong 5 phót ®Ó thu ADN/ ARN, röa cÆn b»ng cån 70% vµ hoµ cÆn trong 50 μl TE [197].

2.2.2.2 T¸ch chiÕt ADN genom thùc vËt

Ph¬ng ph¸p t¸ch chiÕt ADN genom tõ m« thùc vËt ®îc tiÕn hµnh theo Murray & Thompson [150] víi çc bíc: (1) NghiÒn 2g l¸ b»ng cèi chµy sø (®· v« trïng vµ ®îc gi÷ ë -700C) trong nit¬ láng ®Õn khi thµnh d¹ng bét mÞn; bäc cèi, chµy b»ng giÊy b¹c vµ gi÷ ë -200C trong 30 phót; (2) Hßa tan mÉu trong 15 ml dung dÞch ®Öm chiÕt CTAB cã thµnh phÇn: 700 mM NaCl, 50 mM Tris.Cl pH 8,0; 10 mM EDTA pH 8,0; 2-3% CTAB; (3) Ng©m mÉu trong bÓ æn nhiÖt ë 600C, 40-60 phót; (4) Thªm 10 ml chloroform : isoamylalcohol, l¾c nhÑ 5 phót ®Ó lo¹i protein vµ t¹p chÊt; (5) Ly t©m mÉu 10 phót, 4000 v/ p ë 40C, chuyÓn dÞch pha trªn sang èng ly t©m míi cã chøa s½n 5 ml isopropanol, thªm tõ tõ 10 ml isopropanol, gi÷ mÉu trong ®¸ tõ 20 - 40 phót; (6) Dïng mãc lÊy ADN cho vµo èng eppendorf chøa cån 70%, ly t©m 14000 v/ p, 5 phót ë 40C, lo¹i dÞch, lµm kh« mÉu vµ hßa tan ADN trong 0,01 M TE.

54

2.2.3 ThiÕt kÕ vµ tæng hîp ®o¹n måi

ThiÕt kÕ tr×nh tù çc ®o¹n måi ®Æc hiÖu ®Ó nh©n gen ®-îc tiÕn hµnh nhê ch¬ng tr×nh PC GENE víi mét sè ®iÓm chó ý: (1) Tr×nh tù måi liªn quan ®Õn hiÖu qu¶ cña qu¸ tr×nh nh©n gen; (2) Tr×nh tù Guanin/ Xytonin Ýt, tû lÖ Guanin : Xytonin c©n ®èi, kh«ng nªn cã ≥ 4 nucleotit cïng lo¹i liªn tiÕp; (3) NhiÖt ®é cña måi cÇn cao h¬n 500C ®Ó ®¶m b¶o tÝnh ®Æc hiÖu cña PCR [1].

2.2.4 Ph¶n øng d©y chuyÒn polymeraza (Polymerase Chain Reaction- PCR)

Nhê sù xóc t¸c cña enzym ADN polymeraza chÞu nhiÖt, çc ®o¹n ADN míi ®· ®îc tæng hîp tõ ADN khu«n trong m«i trêng d thõa çc deoxyribonucleotit (dNTP) vµ cÆp måi ®Æc hiÖu. PCR cho phÐp nh©n nhanh mét sè lîng lín kh«ng h¹n chÕ nguyªn b¶n mét ®o¹n ADN trong thêi gian ng¾n nhÊt. Çc thµnh phÇn tham gia PCR: ®o¹n ADN khu«n, hai ®o¹n måi ®Æc hiÖu cã chiÒu dµi 15 -30 nucleotit, bèn lo¹i dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), ADN polymeraza. PCR bao gåm çc giai ®o¹n: (1) Giai ®o¹n biÕn tÝnh ADN tõ d¹ng sîi kÐp sang d¹ng sîi ®¬n nhê n©ng nhiÖt ®é lªn 940C-950C trong vßng 30 gi©y ®Õn vµi phót; (2) Giai ®o¹n b¾t cÆp cña måi: Hai ®o¹n måi chuyªn biÖt sÏ g¾n víi ®o¹n ADN t¬ng ®ång ë hai ®Çu ®o¹n ADN cÇn nh©n theo nguyªn t¾c bæ sung khi h¹ nhiÖt ®é xuèng díi nhiÖt ®é Tm t¬ng øng cña çc ®o¹n måi (37 - 650C); (3) Giai ®o¹n kÐo dµi chuçi: Ph¶n øng tæng hîp ph©n tö ADN kÐo dµi tõ ®o¹n måi, thùc hiÖn ë 720C nh»m tr¸nh hiÖn tîng g¾n kh«ng ®Æc hiÖu.

Chu tr×nh nhiÖt ®Ó tiÕn hµnh PCR nh©n C71S-P: 950C - 30 gi©y, 950C - 1 phót, 540C - 1 phót, 720C - 1 phót 20 gi©y, 35 chu kú (tõ bíc 2 ®Õn bíc 4), 720C - 8 phót, kÕt thóc ë 40C. S¶n phÈm

55

PCR ®îc kiÓm tra b»ng ®iÖn di trªn gel agaroza, g¾n vµo vect¬ vµ biÕn n¹p vµo vi khuÈn ®Ó t¹o dßng vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù.

2.2.5 Ly t©m tinh chÕ ADN tõ b¶n gel agaroza

Ph¬ng ph¸p tinh chÕ ADN tõ b¶n gel agaroza ®îc tiÕn hµnh theo Sambrook & ®tg [170] víi mét vµi c¶i biÕn nhá cho phï hîp víi ®iÒu kiÖn phßng thÝ nghiÖm. Çc bíc tinh chÕ ADN: (1) §Æt lªn m¸y soi ADN b¶n gel ®· ®îc ®iÖn di vµ c¾t phÇn gel chøa ®o¹n ADN cÇn tinh chÕ b»ng mét phiÕn dao máng ®· khö trïng; (2) Dïng kim ch©m mét lç thñng ë ®¸y cña èng eppendorf 0,5 ml trong cã ®Æt mét Ýt b«ng kh«ng thÊm níc vµ ®Æt èng eppendorf nµy vµo trong mét èng eppendorf 1,5 ml ®· c¾t bá n¾p vµ ®em khö trïng; (3) TiÕn hµnh chuyÓn mÉu gel mang ADN vµo èng eppendorf 0,5 ml, c¾t l¸t chóng thµnh nhiÒu m¶nh nhá h¬n vµ ly t©m 5 phót ë 10000 v/ p; (4) Thªm mét lîng phenol : chloroform c©n b»ng víi thÓ tÝch mÉu vµ ly t©m 14000 v/ p, 15 phót; LÆp l¹i bíc chiÕt víi chloroform : isoamylalcohol; (5) Dïng 1/ 10 thÓ tÝch cña 3M axetat Na vµ 2 thÓ tÝch cña cån tuyÖt ®èi ®Ó tña ADN tõ dÞch ly t©m thu ®îc trong 3 giê ë -200C; (6) Ly t©m thu ADN ë 14000 v/ p, 5 phót vµ hoµ trong TE.

2.2.6 Ph¶n øng c¾t ADN víi enzym h¹n chÕ

Enzym h¹n chÕ lµ nucleaza néi bµo cã kh¶ n¨ng nhËn biÕt çc ®o¹n ADN víi çc tr×nh tù nucleotit nhÊt ®Þnh, b¸m vµo ®o¹n ADN ®ã vµ c¾t c¶ hai sîi cña ph©n tö ADN. Çc enzym h¹n chÕ thêng ®îc sö dông ®Ó c¾t ADN: (i) T¹o ®Çu b»ng, nh Sma I, EcoR V c¾t hai sîi ADN t¹i cïng mét ®iÓm t¹o hai ®Çu b»ng kh«ng cã kh¶ n¨ng tù b¾t cÆp trë l¹i; (ii) T¹o ®Çu dÝnh nh EcoR I, Sac I c¾t theo vÞ trÝ lÖch nhau trªn hai sîi t¹o çc ®Çu dÝnh bæ sung cã thÓ b¾t cÆp trë l¹i.

56

Ph¶n øng c¾t ADN víi enzym h¹n chÕ cã sù tham gia cña çc thµnh phÇn: 1 μl dung dÞch ®Öm; 2 μl ADN (~20 ng); 0,25 μl enzym h¹n chÕ; 6,75 μl H2O khö ion v« trïng. Hçn hîp ph¶n øng ®îc trén ®Òu, ñ ë nhiÖt ®é vµ thêi gian thÝch hîp (thêng ë 370C, 2 giê). S¶n phÈm ph¶n øng ®îc kiÓm tra b»ng ®iÖn di trªn gel agaroza ë nång ®é thÝch hîp.

2.2.7 §iÖn di

2.2.7.1 §iÖn di ADN trªn gel agaroza

Çc ®o¹n ADN cã khèi lîng vµ ®iÖn tÝch kh¸c nhau ®îc t¸ch ra khi di chuyÓn tõ cùc ©m sang cùc d¬ng cña m¸y ®iÖn di trong mét ®iÖn trêng cã ®iÖn thÕ vµ cêng ®é thÝch hîp. Ho¸ chÊt ®iÖn di: agaroza 0,8-1,4% (phô thuéc vµo kÝch thíc ph©n tö ADN), dung dÞch ®Öm TBE 5X (Tris base: 54 g, axit boric: 27,5 g, EDTA 0,5 M pH 8,0: 20 ml), bromit ethidium (ethidium bromide - EtBr): 10 mg/ ml, ®Öm tra mÉu (Loading buffer - 0,1 ml bromophenol blue 10%; 0,3 ml glyxerol 100% vµ dÉn b»ng níc ®Õn 1 ml). Quy tr×nh ®iÖn di nh sau:

(1) ChuÈn bÞ gel agaroza: cho 0,8 - 1 g agaroza vµo 100 ml dung dÞch TBE 1X, ®un cho agaroza tan hoµn toµn, ®Ó nguéi xuèng kho¶ng 50-600C, ®æ dung dÞch agaroza vµo khay gel ®iÖn di cã cµi s½n r¨ng lîc. Sau 30-60 phót, khi gel ®· ®«ng cøng, ®Æt vµo bÓ ®iÖn di, ®æ ®Öm TBE 1X ngËp çch mÆt gel tõ 1-2 mm, gì lîc ra.

(2) MÉu ADN ®îc trén víi 3 l ®Öm tra mÉu vµ ®îc tra vµo çc giÕng nhá trªn gel, ch¹y ®iÖn di (30-40 V, 60-80 mA) cïng chØ thÞ ph©n tö ADN chuÈn (b¶ng 2.7) ®Ó x¸c ®Þnh träng lîng ph©n tö, quan s¸t sù di chuyÓn mµu ®Ó ngõng qu¸ tr×nh ®iÖn di.

57

(3) B¶n gel ®îc lÊy nhÑ ra khái khu«n, ng©m 30 - 45 phót trong dung dÞch níc cã EtBr nång ®é 0,5 g/ ml trªn mét m¸y l¾c nhÑ, röa b»ng H2O, quan s¸t díi ¸nh s¸ng tö ngo¹i 254 nm trªn m¸y soi ADN vµ chôp ¶nh.

B¶ng 2.7. ChØ thÞ ph©n tö ADN chuÈn 1 kb vµ ADN/ EcoR I + Hind III

B¨ng

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

14

1 kb 10 8 6 5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,75 0,5

0,25

ADN 21,226

5,148

4,973

4,268

3,530

2,027

1,904

1,584

1,375

0,947

0,831

0,554

2.2.7.2 §iÖn di protein trªn gel polyacrylamit

§iÖn di ®îc tiÕn hµnh theo Laemmli [128] trªn bé ®iÖn di chuÈn cña h·ng Bio-Rad. Chóng t«i sö dông gel 4% (0,125M Tris, pH 6,8) ®Ó c« mÉu trong gel khi ch¹y ®iÖn di. Gel ph©n t¸ch protein (0,375M Tris, pH 8,8) ®îc sö dông ë nång ®é 7,5%, 10%, 12,5%, 15%, hoÆc 17,5% (b¶ng 2.8). Çc dung dÞch mÑ ®Ó chuÈn bÞ gel: acrylamit/ bis-acrylamit (100:3): 30%; 0,5M Tris.Cl pH 6,8; 1,5M Tris.Cl pH 8,8; 10% SDS; 10% APS (Ammonium persulfate); TEMED (N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine) nguyªn chÊt. §iÖn di ®îc tiÕn hµnh trong dung dÞch ®Öm Tris-Glycin cã chøa 1% SDS pH 8,3, ®iÖn ¸p 130-170V trong 1 giê. Sau ®iÖn di, gel ®îc cè ®Þnh b»ng dung dÞch 7% axit trichloroaxetic vµ nhuém b»ng Coomassie R-250. Bé protein khèi lîng chuÈn bao gåm: phosphorylase b (94 kDa); albumin (67 kDa); ovalbumin (43 kDa), carbonic anhydrase (30 kDa); trypsin inhibitor (20,1 kDa); -lactalbumin (14,4 kDa).

B¶ng 2.8. C«ng thøc pha dung dÞch gel polyacrylamit (5 ml)

58

Dung dÞch mÑ

7,5% 10% 12,5% 15% 17,5%

H2O 2,42 ml 1,975 ml 1,4 ml 1,17 ml 0,75 ml1,5M Tris 1,25 ml 1,25 ml 1,25 ml 1,25 ml 1,25 mlAcrylamit 1,25 ml 1,675 ml 2,25 ml 2,5 ml 2,92 ml10% SDS 50 l 50 l 50 l 50 l 50 l10% APS 25 l 25 l 25 l 25 l 25 lTEMED 2,5 l 2,5 l 2,5 l 2,5 l 2,5 l

2.2.8 Lo¹i bá nhãm 5' photphat cña vect¬

Nh»m tr¸nh hiÖn tîng tù ®ãng vßng, vect¬ sau khi c¾t hoµn toµn b»ng enzym h¹n chÕ thêng ®îc lo¹i nhãm photphat ë ®Çu 5' theo çc bíc: (1) ChiÕt b»ng phenol : chloroform mÉu ADN plasmit (10 - 20 g) vµ tña b»ng hai thÓ tÝch cån tuyÖt ®èi trong 15 phót ë 00C; (2) Ly t©m thu ADN ë 40C, 12000 v/ p, 10 phót; (3) Hoµ cÆn ADN trong 90 l 10 mM Tris.Cl (pH 8,3), ®iÖn di kiÓm tra vµ gi÷ mÉu cßn l¹i ë -20 0C; (4) Thªm 10 l dung dÞch ®Öm dïng cho CIP (enzym photphataza kiÒm ®îc t¸ch tõ ruét bª - calf intestinal alkaline phosphatase) cïng mét lîng enzym CIP thÝch hîp vµ ñ ë ®iÒu kiÖn t¬ng øng (Lîng enzym cÇn dïng vµ ®iÒu kiÖn ñ phô thuéc vµo ®o¹n c¾t ADN mang ®Çu dÝnh hay ®Çu b»ng); (5) Sau khi ñ, thªm SDS vµ EDTA (pH 8,0) vµo mÉu ®Õn nång ®é cuèi cïng t¬ng øng lµ 0,5 % vµ 5 mM, trén ®Òu vµ thªm proteinaza K 100 g/ ml, ñ 30 phót ë 560C. Proteinaza K dïng ®Ó hoµ tan vµ lo¹i CIP d thõa gióp cho qu¸ tr×nh g¾n ADN vµo vect¬ hiÖu qu¶ h¬n. CIP còng cã thÓ bÞ lµm bÊt ho¹t b»ng çch ñ 1 giê ë 650C hoÆc 750C trong 10 phót cïng víi 5 mM EDTA (pH 8,0); (6) Lµm nguéi ph¶n øng ë nhiÖt ®é phßng, chiÕt ADN b»ng phenol : chloroform, bæ sung 0,1 thÓ tÝch 3 M axetat Na pH 7,0 (nÕu pH =5,2 nh th«ng thêng th× EDTA trong dung dÞch sÏ bÞ kÕt tña khi nång ®é cña

59

chóng lín h¬n 5 - 10 mM), trén ®Òu vµ thªm 2 lÇn thÓ tÝch cån tuyÖt ®èi, ®¶o ®Çu èng eppendorf vµ gi÷ 15 phót ë 00C; (7) Ly t©m 12000 v/ p, 10 phót, 40C thu ADN, röa cÆn b»ng cån 70% ë 40C, lµm kh« ADN vµ hoµ trong TE (pH 7,6), gi÷ ë - 20 0C.

2.2.9 GhÐp nèi çc ®o¹n ADN

§©y lµ ph¶n øng g¾n ®o¹n ADN vµo vect¬ thÝch hîp nhê enzym T4 ADN ligaza xóc t¸c cho qu¸ tr×nh h×nh thµnh liªn kÕt nèi 2 ®o¹n ADN. Thµnh phÇn ph¶n øng gåm: 1l ®Öm ph¶n øng; 1 l T4 ADN ligaza; 1 l ATP; 1 l (50 ng) vect¬ ®· më vßng vµ lo¹i nhãm photphat; 4 l (50 - 100 ng) ADN tinh s¹ch; 2l H2O khö ion v« trïng. Hçn hîp ph¶n øng ®îc trén ®Òu vµ ñ 14 - 24 giê ë 160C. S¶n phÈm ph¶n øng ®îc biÕn n¹p vµo E. coli vµ chän läc trªn m«i trêng thÝch hîp. 2.2.10 ChuÈn bÞ tÕ bµo kh¶ biÕn

2.2.10.1 ChuÈn bÞ tÕ bµo kh¶ biÕn E. coli ®Ó biÕn n¹p b»ng sèc nhiÖt

(1) Chñng vi khuÈn ®îc cÊy ria trªn m«i trêng LB ®Æc vµ nu«i qua ®ªm ë 370C; (2) CÊy mét khuÈn l¹c ®¬n vµo 3 ml m«i tr-êng LB láng, l¾c qua ®ªm ë 370C, 200 v/ p; (3) ChuyÓn 0,5 ml dÞch nu«i trªn sang 50 ml m«i trêng LB láng, l¾c tiÕp kho¶ng 3 h ®Õn khi OD600nm ®¹t 0,6 - 0,8 th× chuyÓn dÞch nu«i cÊy sang èng ly t©m ®· gi÷ l¹nh trªn ®¸; (4) Ly t©m 6000 v/ p, 00C, 10 phót thu cÆn; (5) Hoµ tan cÆn nhÑ nhµng trong 20 - 30 ml 0,1 M CaCl2, gi÷ trong ®¸ 45 phót, ly t©m ë 6000 v/ p, 00C trong 10 phót thu cÆn vµ hoµ cÆn nhÑ nhµng trong 0,7 1,5 ml CaCl2; (6) Chia vµo mçi èng eppendorf 50 l dÞch tÕ bµo, bæ sung 50 l glyxerol 60%, lµm ®«ng l¹nh nhanh b»ng N2 láng vµ gi÷ ë -700C; (7) CÊy tr¶i mÉu trªn m«i trêng LB cã/ kh«ng cã kh¸ng sinh ®Ó kiÓm tra.

60

2.2.10.2 ChuÈn bÞ tÕ bµo kh¶ biÕn A. tumefaciens ®Ó biÕn n¹p b»ng xung ®iÖn

(1) Lµm míi gièng trªn m«i trêng th¹ch; (2) Nu«i cÊy l¾c vi khuÈn trong 2 ml m«i trêng YEP ë 280C, 6 giê; (3) LÊy 100 μl dÞch vi khuÈn trªn nu«i cÊy tiÕp ë 280C qua ®ªm trªn 100 ml m«i trêng YEP láng + 0,1% glucoza ®Õn khi OD660nm ®¹t 1-1,5; (4) Lµm l¹nh mÉu trong ®¸ 15 phót, ly t©m 5000 v/ p, 20 phót ®Ó thu cÆn tÕ bµo. Röa cÆn 3 lÇn trong 10 ml 1 mM HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-2-ethanesulfonic acid) pH 7,0; 1 lÇn trong 10 ml 10% glycerol; (5) CÆn hoµ l¹i trong 500-700 μl 10% glycerol; (6) Chia 45 μl dÞch tÕ bµo vµo mçi èng eppendorf, lµm l¹nh trong N2 láng vµ gi÷ ë -700C.

2.2.11 BiÕn n¹p ADN plasmit vµo tÕ bµo vi khuÈn

2.2.11.1 BiÕn n¹p ADN plasmit vµo tÕ bµo E. coli b»ng sèc nhiÖt

(1) Bæ sung 5 l ADN plasmit vµo èng eppendorf chøa 100 l tÕ bµo kh¶ biÕn, gi÷ trªn ®¸ 30 phót; (2) Sèc nhiÖt ë 420C trong 90 gi©y, ®Ó trªn ®¸ 5 phót; (3) Bæ sung 0,5 ml m«i trêng SOC, l¾c 200 v/ p ë 370C trong 1 giê; (4) CÊy tr¶i 50l dÞch tÕ bµo lªn ®Üa Petri chøa m«i trêng LB cã bæ sung çc chÊt chän läc thÝch hîp, nu«i ë 370C qua ®ªm [71]. 2.2.11.2 BiÕn n¹p Ti-plasmit vµo tÕ bµo A. tumefaciens

b»ng ph¬ng ph¸p xung ®iÖn (Electroporation method)

(1) Lµm tan tÕ bµo kh¶ biÕn A. tumefaciens trong ®¸; (2) Thªm 1-10 μl ADN Ti-plasmit t¸i tæ hîp vµo èng eppendorf chøa tÕ bµo kh¶ biÕn, trén ®Òu vµ ®Æt trªn ®¸; (3) Dïng pipet Pasteur chuyÓn hçn hîp sang cuvet dïng cho xung ®iÖn ®· ®îc lµm l¹nh tõ

61

tríc; (4) Xung ®iÖn ë 5 ms, 12,5 kV/ cm; (5) Bæ sung ngay 1 ml m«i trêng SOC vµo cuvet vµ chuyÓn vµo èng eppendorf, l¾c ë 280C trong 1 - 1,5 giê, sau ®ã cÊy tr¶i trªn m«i trêng chän läc [108], [141].

2.2.11.3 BiÕn n¹p Ti-plasmit vµo tÕ bµo A. tumefaciens b»ng ph¬ng ph¸p phèi ba bè mÑ (Tri-parental mating method)

Ph¬ng ph¸p nµy ®îc sö dông ®Ó chuyÓn Ti-plasmit, ®Æc biÖt lµ vect¬ liªn hîp, tõ tÕ bµo E. coli sang tÕ bµo A. tumefaciens víi çc bíc: (1) Nu«i cÊy ba chñng vi khuÈn bè mÑ (chñng E. coli trî gióp cã phæ vËt chñ réng, chñng E. coli chøa vect¬ chuyÓn gen thùc vËt vµ chñng A. tumefaciens nhËn) trªn ®Üa m«i trêng LB/ YEP cã bæ sung kh¸ng sinh chän läc ë nhiÖt ®é vµ thêi gian thÝch hîp; (2) Nu«i cÊy l¾c mét khuÈn l¹c cña mçi chñng vi khuÈn trªn trong 2 ml m«i trêng LB/ YEP láng cã bæ sung kh¸ng sinh vµ ë nhiÖt ®é thÝch hîp; (3) Ly t©m ë 1000 v/ p ®Ó thu cÆn tÕ bµo 3 chñng vi khuÈn, hoµ cÆn trong m«i trêng YEP láng kh«ng bæ sung kh¸ng sinh (lîng m«i trêng bæ sung phô thuéc vµo sù ph¸t triÓn cña tõng chñng vi khuÈn); (4) ChuyÓn 300 μl dÞch nu«i cÊy mçi chñng vi khuÈn nµy vµo 1 èng eppendorf, nu«i cÊy l¾c ë 28 0C trong 4 giê; (5) ChuyÓn 100 μl dÞch nu«i cÊy mçi chñng vµo mét ®Üa m«i trêng dïng cho tiÕp hîp (H-agar), dïng que cÊy g¹t ®Òu, phñ giÊy läc v« trïng vµ nu«i qua ®ªm ë 280C. MÉu ®èi chøng lµ çc chñng vi khuÈn ®îc nu«i cÊy riªng; (6) Bæ sung 3 ml 10 mM MgCl2 v« trïng vµo mçi ®Üa m«i trêng tiÕp hîp, dïng que thñy tinh trén ®Òu vµ g¹n chiÕt dÞch vi khuÈn vµo eppendorf v« trïng; (7) Pha lo·ng dÞch vi khuÈn b»ng 10 mM MgCl2 ë çc nång ®é 100, 10-

1, 10-2 vµ 10-3 (®èi víi mÉu thÝ nghiÖm), 100, 10-1 (cho mÉu ®èi

62

chøng); (8) CÊy g¹t 50 - 100 μl mçi mÉu pha lo·ng lªn ®Üa m«i tr-êng YEP cã chøa kh¸ng sinh thÝch hîp, ñ ë 280C tõ 2-3 ngµy [190].

2.2.12 T¹o dßng phô

Bao gåm çc bíc: (1) LËp b¶n ®å c¾t enzym h¹n chÕ víi çc enzym n»m trong vïng MCS cña vect¬ t¹o dßng th«ng dông; (2) C¾t ADN víi enzym h¹n chÕ, ®iÖn di vµ tinh chÕ çc ®o¹n ADN cÇn t¹o dßng; (3) Më vßng vect¬ sö dông enzym h¹n chÕ t¬ng øng; (4) TiÕn hµnh ph¶n øng ghÐp nèi, biÕn n¹p vµo tÕ bµo vi khuÈn vµ t¹o dßng [1].2.2.13 X¸c ®Þnh tr×nh tù nucleotit cña gen

Tr×nh tù ADN ®îc x¸c ®Þnh theo ph¬ng ph¸p cña Sanger & ®tg [172] trªn m¸y x¸c ®Þnh tr×nh tù ADN tù ®éng ALF Express sö dông çc ®o¹n måi g¾n huúnh quang vµ bé ho¸ chÊt chuÈn ®Ó nh©n gen b»ng PCR víi Taq ADN polymeaza cña H·ng Amersham Pharmacia Biotech. Chu tr×nh nhiÖt: 950C 2 phót, 950C 36 gi©y, 530C 36 gi©y, 720C 84 gi©y, lÆp l¹i 25 chu kú tõ bíc 2-4, kÕt thóc ë 40C. Sau ®ã, s¶n phÈm PCR ®îc biÕn tÝnh b»ng nhiÖt vµ ph©n tÝch trªn m¸y x¸c ®Þnh tr×nh tù ADN.2.2.14 Xö lý sè liÖu b»ng phÇn mÒm vi tÝnh chuyªn dông

HiÖn nay, cã nhiÒu phÇn mÒm thu nhËn vµ xö lý tr×nh tù ADN, protein nh ch¬ng tr×nh DNAStar (Mü), DNAsis & Genetyx (NhËt B¶n), PC GENE (Intelligenetics, Thôy SÜ). Trong ®ã, phÇn mÒm PC GENE cho phÐp thùc hiÖn h¬n 70 ch¬ng tr×nh ph©n tÝch tr×nh tù ADN vµ protein nh: ph©n tÝch cÊu tróc, so s¸nh çc tr×nh tù, ®iÓm c¾t enzym h¹n chÕ... PhÇn mÒm nµy còng cho phÐp dÔ dµng t×m çc d÷ liÖu tr×nh tù ADN ®· c«ng bè. Chóng t«i sö dông phÇn mÒm PC GENE ®Ó xö lý sè liÖu: (1) §Þnh d¹ng tr×nh tù ADN cÇn ph©n tÝch (ch¬ng tr×nh REFORM); (2) So s¸nh

63

çc tr×nh tù nucleotit (ch¬ng tr×nh NALIGN), t×m sù t¬ng ®ång gi÷a ®o¹n måi vµ khu«n ADN, so s¸nh ®Ó nèi l¹i tr×nh tù ADN khi tr×nh tù cÇn ®äc dµi h¬n 300 bp; (3) Gi¶i m· tr×nh tù ADN sang tr×nh tù protein t¬ng øng (ch¬ng tr×nh TRANSL); (4) X¸c ®Þnh çc ®iÓm c¾t enzym h¹n chÕ trªn ADN (ch¬ng tr×nh RESTRI); (5) So s¸nh tr×nh tù ADN víi tr×nh tù ®· biÕt trong Ng©n hµng tr×nh tù gen quèc tÕ (EMBL/ GENEBANK/ DDBJ).2.2.15 BiÓu hiÖn gen b»ng vi khuÈn E. coli

Kü thuËt biÓu hiÖn gen nhê E. coli ®îc thùc hiÖn theo çc b-íc: (1) G¾n gen quan t©m vµo vect¬ biÓu hiÖn (pET21d), chän dßng mang pET21d-gen quan t©m; (2) BiÕn n¹p pET21d, pET21d-gen quan t©m vµo tÕ bµo kh¶ biÕn BL21 (DE3), chän dßng tÕ bµo chøa pET21d, pET21d-gen quan t©m, t¸ch chiÕt vµ kiÓm tra; (3) CÊy 30 μl dÞch tÕ bµo pET21d, pET21d-gen quan t©m trong BL21(DE3) vµo 3 ml m«i trêng LB + Amp, nu«i 2 giê (OD ®¹t 0,6-0,8), lÊy 200 μl lµm ®èi chøng; (4) Bæ sung IPTG ®Õn nång ®é cuèi cïng 0,5 mM hoÆc 1 mM, thu s¶n phÈm t¹i çc thêi ®iÓm 1 giê, 2 giê, 3 giê (mçi lÇn 200 μl), ly t©m 5000 v/ p trong 5 phót, thu tña; (5) Sau ®ã cã thÓ bæ sung 10 μl 5 x ®Öm tra mÉu (SDS sample buffer), biÕn tÝnh 100C trong 10 phót vµ kiÓm tra b»ng ®iÖn di trªn gel polyacrylamit 10%. 2.2.16 T¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch protein t¸i tæ hîp

Protein ®îc t¸ch chiÕt vµ tinh s¹ch theo ph¬ng ph¸p cña Hames & Rickwood [92] theo çc bíc: (1) Ch¹y ®iÖn di protein, c¾t lÊy b¨ng quan t©m vµ chuyÓn vµo tói thÈm tÝch (tríc khi sö dông, tói thÈm tÝch ®îc ®un trong níc tõ 5-10 phót, ®un trong dÞch Na2CO3/ NaHCO3 20mM + 1mM EDTA tõ 5-10phót, röa trong H20 cÊt 2 lÇn, b¶o qu¶n 4C trong H2O v« trïng); (2) §Èy b¨ng protein

64

quan t©m ra khái gel trong ®iÖn trêng nhê ®iÖn di kho¶ng 6 - 8 giê ë cêng ®é dßng ®iÖn lµ 20 mA; (3) §¶o chiÒu dßng ®iÖn 30 gi©y-1 phót; (4) Hót dÞch trong tói thÈm tÝch vµo èng eppendorf, ly t©m 14000 v/ p trong 15 phót, thu dÞch phÝa trªn; (5) Ch¹y ®iÖn di protein trªn gel 12,5% ®Ó kiÓm tra.2.2.17 Kü thuËt lai miÔn dÞch (Western blot)

Dung dÞch vµ dông cô: (1) Kh¸ng thÓ kh¸ng protein t¸i tæ hîp (kh¸ng thÓ 1); (2) Mµng PVDF (Millipore); (3) Céng hîp kh¸ng thá g¾n HRP (Horseradish peroxidase) cña h·ng Bio-Rad (kh¸ng thÓ 2); (4) Dung dÞch chuyÓn protein sang mµng 10X: Tris 30 g; Glycine 144,13g; H20 1000 ml; (5) §Öm chuyÓn protein sang mµng (Blotting buffer) 1X: 100 ml ®Öm chuyÓn 10X + 200 ml metanol + H20 1000 ml; (6) Dung dÞch ®Öm TBS 2X: 50 mM Tris.Cl pH 7,5; 1 mM NaCl; (7) Dung dÞch ®Öm TTBS 1X: 250 ml 2X TBS; 250 ml H20; 250 l Tween 20; (8) Dung dÞch Ponceau: 50 mg Ponceau + 50 ml dung dÞch axit axetic 2%; (9) Dung dÞch Gelatin 2%: 1 g Gelatin + 50 ml TTBS 1X; (10) Dung dÞch Gelatin 1% (pha tõ dung dÞch Gelatin 2% tríc khi sö dông): ng©m dung dÞch gelatin 2% vµo bÓ çch thuû 37C cho tan råi trén víi ®Öm TTBS 1X theo tû lÖ 1 : 1; (11) Dung dÞch 5% BSA: 2,5 g BSA + 50 ml TBS 1X; (12) Dung dÞch hiÖn mµu: 5 ml metanol ®Ó trªn ®¸ + 15 mg chÊt hiÖn mµu (Bio-Rad); 25 ml TBS 1X + 15 l H202 30% (trén hai thµnh phÇn tríc khi hiÖn mµu).

Quy tr×nh: (1) §iÖn di trªn gel polyacrylamit 12,5 % ®Ó ph©n t¸ch protein; (2) ChuyÓn protein sang mµng PVDF sö dông thiÕt bÞ chuyÓn cña h·ng Bio-Rad víi ®Öm chuyÓn 1 X. Thø tù ®Æt nh sau: tÊm xèp + giÊy thÊm + gel + mµng + giÊy thÊm + tÊm xèp + kÑp. Trong ®ã, mµng PVDF ®îc ng©m trong dung

65

dÞch metanol 100%, 10 phót, tr¸ng l¹i b»ng ®Öm chuyÓn 1 X. Qu¸ tr×nh chuyÓn mµng thùc hiÖn ë 40C, trong 2 giê, hiÖu ®iÖn thÕ 100V. §Öm ch¹y ®Ó trong l¹nh 40C, ®iÒu hoµ nhiÖt ®é cña ®Öm b»ng khuÊy tõ, ®Öm ch¹y ®¶m b¶o khi cè ®Þnh hiÖu ®iÖn thÕ 100V, cêng ®é dßng ®iÖn dao ®éng 200 - 250 mA; (3) Th¸o bá vµ lÊy mµng ra nhuém t¹m thêi b»ng dung dÞch Ponceau 0,1% ®Ó ®¸nh dÊu chØ thÞ ph©n tö trªn mµng, sau ®ã röa mµng 2 lÇn b»ng níc khö ion; (4) L¾c mµng trong dung dÞch 5% BSA 1 giê ë nhiÖt ®é phßng thÝ nghiÖm ®Ó che ch¾n phÇn kh«ng g¾n protein, l¾c víi ®Öm TTBS 1X ®Ó röa mµng (ba lÇn, 5 phót/ lÇn); (5) Nhuém mµng víi kh¸ng thÓ 1 ®· pha lo·ng theo tû lÖ 1/ 1000 trong dung dÞch Gelatin 1%, l¾c ë nhiÖt ®é phßng trong 4 giê (8 ml TTBS 1X + 8 ml Gelatin 2% + 16 l kh¸ng thÓ 1); (6) TiÕp tôc röa mµng ba lÇn b»ng ®Öm TTBS 1X (5 phót/ lÇn); (7) Mµng ®îc nhuém tiÕp víi kh¸ng thÓ 2, pha lo·ng theo tû lÖ 1/ 1000 trong dung dÞch Gelatin 1%, l¾c ë nhiÖt ®é phßng 2 giê (8ml TTBS 1X + 8ml Gelatin 2% + 16 l kh¸ng thÓ 2); (8) L¾c víi ®Öm TTBS 1X vµ 2 lÇn víi ®Öm TBS 1X, mçi lÇn 5 phót ®Ó röa mµng; (9) HiÖn mµu víi dung dÞch hiÖn mµu trong ®iÒu kiÖn kh«ng cã ¸nh s¸ng kho¶ng 10 phót, tr¸ng mµng b»ng níc khö ion, chôp ¶nh b»ng m¸y soi vµ chôp ¶nh d÷ liÖu (Gel Doc) cña H·ng Pharmacia Biotech [61].2.2.18 Kü thuËt g©y miÔn dÞch s¶n xuÊt kh¸ng thÓ

Çc bíc g©y miÔn dÞch ®Ó s¶n xuÊt kh¸ng thÓ ë thá: (1) LÊy 1 ml protein t¸i tæ hîp ®· tinh chÕ nhò ho¸ víi 1 ml t¸ chÊt Freund toµn phÇn ®Ó g©y miÔn dÞch cho thá; (2) Tiªm bæ sung sau 5, 10, 30 ngµy; (3) Sau 10 ngµy tõ lÇn tiªm cuèi, lÊy m¸u thá ®Ó t¸ch huyÕt thanh: ®Æt mÉu m¸u vµo tñ Êm 370C trong 90 phót, sau ®ã gi÷ 90 phót ë 40C; (4) Ly t©m 2000 v/ p trong 10

66

phót, thu huyÕt thanh, b¶o qu¶n vµ kiÓm tra b»ng ph¬ng ph¸p lai miÔn dÞch [149].

67

Ch¬ng 3. KÕt qu¶ vµ th¶o luËn

3.1 ph©n lËp ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza tõ gièng lóa C71

Th«ng thêng, ®o¹n khëi ®éng kh«ng cã nguån gèc thùc vËt kh«ng ho¹t ®éng hoÆc ho¹t ®éng rÊt yÕu trong c©y trång chuyÓn gen [194]. Do vËy, çc ®o¹n khëi ®éng ®îc sö dông nhiÒu trong thiÕt kÕ vect¬ vµ çc nghiªn cøu chuyÓn gen vµo c©y trång thêng ph¶i cã nguån gèc tõ thùc vËt, hoÆc tõ virut vµ vi khuÈn (cã t¬ng t¸c víi thùc vËt), nh Ubi-P t¸ch tõ c©y ng«, CaMV35S-P t¸ch tõ virut kh¶m sóp l¬... §©y chñ yÕu lµ çc ®o¹n khëi ®éng c¬ ®Þnh cã kh¶ n¨ng ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn gen ë rÊt nhiÒu m« vµ c¬ quan kh¸c nhau [47], [55], [56].

GÇn ®©y, ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ë c©y lóa ®Æc biÖt ®îc quan t©m nghiªn cøu vµ øng dông do kh¶ n¨ng ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn gen ®Æc hiÖu trong bã m¹ch (phloem) [206]. VÝ dô ®iÓn h×nh, Rao & ®tg ®· sö dông ®o¹n khëi ®éng nµy ®Ó ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh biÓu hiÖn gen m· ho¸ lectin ë c©y hoa ®iÓm tuyÕt trong c©y lóa cho hiÖu qu¶ diÖt c«n trïng rÊt cao [163]. Nh»m môc ®Ých sö dông ®o¹n khëi ®éng nµy trong viÖc thiÕt kÕ çc vect¬ mang gen kh¸ng s©u ®ôc th©n, kh¸ng c«n trïng hót nhùa th©n lóa nh rÇy n©u, rÇy xanh... ®Ó chuyÓn vµo çc gièng lóa ViÖt Nam, chóng t«i ®· tiÕn hµnh nh©n ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ë gièng lóa C71, CR203. Sau ®ã t¹o dßng vµ ®äc tr×nh tù ®o¹n khëi ®éng nµy tõ gièng lóa C71.

68

3.1.1 ThiÕt kÕ cÆp måi ®Æc hiÖu ®Ó nh©n ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza ë c©y lóa

Sucroza synthaza (EC 2.4.1.13) lµ mét trong nh÷ng enzym quan träng tham gia vµo mäi ho¹t ®éng sèng cña tÕ bµo. Chóng xóc t¸c cho ph¶n øng thuËn nghÞch: sucroza + UDP ↔

fructoza + UDP-glucoza. Nhê qu¸ tr×nh chuyÓn ho¸ nµy, c¬ chÊt UDP-glucoza ®îc cung cÊp cho qu¸ tr×nh tæng hîp tinh bét vµ thµnh tÕ bµo. §Ó t×m hiÓu mét sè tr×nh tù cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ë c©y lóa, chóng t«i ®· tra cøu trong çc Ng©n hµng gen quèc tÕ EMBL, GENBANK vµ DDBJ. KÕt qu¶, ë c©y lóa hiÖn nay ngêi ta ®· t×m ra ®îc ba gen Rsuc1, Rsuc2, Rsuc3 cïng m· ho¸ sucroza synthaza [199], [206]. Nghiªn cøu cña Huang & ®tg vÒ møc ®é biÓu hiÖn cña çc gen nµy trong çc m« nh: rÔ, chåi, m« sÑo, h¹t cho thÊy gen Rsuc2 cã tÝnh ®Æc hiÖu m« kh«ng cao, gen Rsuc3 ®Æc hiÖu cao ë h¹t, chØ cã Rsuc1 ®Æc hiÖu bã m¹ch, rÔ, mÇm [111].

Nh»m nghiªn cøu vµ sö dông ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza phôc vô cho viÖc chuyÓn gen ®Æc hiÖu bã m¹ch vµo c©y lóa, chóng t«i ®· thiÕt kÕ cÆp måi ®Æc hiÖu ®Ó nh©n ®o¹n khëi ®éng nµy. KÝch thíc cña gen Rsuc1 lµ 8167 bp, trong ®ã kÝch thíc cña vïng 5’ t¬ng ®èi lín, chiÕm kho¶ng 3 kb [199]. Tuy nhiªn, çc vïng tr×nh tù ®Æc biÖt cÇn thiÕt cho chøc n¨ng ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng thêng n»m ë gÇn víi vïng khëi ®Çu phiªn m·. Vïng n»m xa vÞ trÝ khëi ®Çu phiªn m· (vÒ phÝa bªn trªn cña ®o¹n khëi ®éng) thêng chøa mét vµi ®o¹n t¨ng cêng [133].

Th«ng thêng, mét gen ®Æc hiÖu thùc vËt bao gåm ®ñ çc yÕu tè ®iÒu khiÓn cÇn thiÕt n»m trong ph¹m vi 1 - 2 kb tÝnh tõ

69

vÞ trÝ khëi ®Çu phiªn m· vÒ phÝa ®Çu 5’. Do vËy, trªn c¬ së tr×nh tù cña gen Rsuc1 ®· c«ng bè, chóng t«i ®· thiÕt kÕ cÆp måi ®Æc hiÖu ®Ó nh©n ®o¹n khëi ®éng víi kÝch thíc kho¶ng 2 kb. Trong ®ã, måi 1 (SUC-S) kÝch thíc 31 bp, måi 2 (SUC-B) kÝch thíc 34 bp. §Æc biÖt ë trong tr×nh tù cña ®o¹n måi SUC-B, chóng t«i ®· thiÕt kÕ thªm tr×nh tù cña hai enzym h¹n chÕ lµ Nco I vµ BamH I vµ trong tr×nh tù ®o¹n måi SUC-S, vÞ trÝ nhËn biÕt enzym Sac I còng ®îc bæ sung vµo nh»m chuÈn bÞ cho bíc thiÕt kÕ vect¬ chøa ®o¹n khëi ®éng sau nµy. Tr×nh tù cña cÆp måi nh sau:

SUC-S: 5’-GGAGCTCGGTCGGTCTGGTAATCAAATCACC-3’ Sac I

SUC-B: 5’-GCCATGGATCCCATGACTCAATTTCAGGAACTGC-3’ BamH I

Nco I

3.1.2 Ph©n lËp ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza tõ ADN genom cña gièng lóa C71 vµ CR203

T¸ch chiÕt ADN genom lµ bíc khëi ®Çu ®Ó tiÕn hµnh çc thÝ nghiÖm tiÕp theo. §Õn nay cã kh¸ nhiÒu ph¬ng ph¸p t¸ch chiÕt ADN tæng sè hiÖu qu¶ tõ m« thùc vËt ®· ®îc nghiªn cøu, c¶i biÕn vµ øng dông tuú thuéc vµo ®èi tîng vµ ®iÒu kiÖn nghiªn cøu [38], [74], [150]. §Ó t¸ch chiÕt ADN genom tõ 2 gièng lóa CR203 vµ C71, chóng t«i ®· sö dông ph¬ng ph¸p CTAB (Cetylmethylammonium bromide) cña Murray & Thompson [150].

H¹t hai gièng lóa C71 vµ CR203 ®îc bãc vá trÊu, chän läc (h¹t kh«ng ®en, non, vì) vµ khö trïng b»ng ethanol, níc giaven 60%, níc cÊt v« trïng, sau ®ã cÊy trªn m«i trêng MS (Murashige-Skoog) tõ

70

10 ngµy ®Õn 2 tuÇn, thu l¸ m¹, gi÷ ë -200C ®Ó t¸ch chiÕt ADN. Kho¶ng 2 g l¸ lóa ®îc nghiÒn b»ng cèi vµ chµy sø trong nit¬ láng thµnh d¹ng bét mÞn. Nh»m h¹n chÕ sù ph©n huû ADN, cèi chµy sø cÇn ®îc gi÷ l¹nh -850C tríc khi tiÕn hµnh thÝ nghiÖm. Sau khi nghiÒn, mÉu ®îc hoµ trong dung dÞch ®Öm chiÕt CTAB (víi çc thµnh phÇn NaCl, Tris.Cl, EDTA, CTAB), ñ tõ 40-60 phót ë 600C. §Ó ®¶m b¶o protein vµ t¹p chÊt bÞ lo¹i khái mÉu, chóng t«i ®· xö lý dÞch chiÕt nhËn ®îc b»ng hçn hîp dung dÞch chloroform : isoamylalcohol (24 : 1). Sau khi kÕt tña b»ng b»ng isopropanol trong ®¸ tõ 20 - 40 phót, röa vµ xö lý mÉu, chóng t«i ®· thu ®îc ADN genom.

§é s¹ch s¶n phÈm ADN genom ®îc kiÓm tra b»ng phæ hÊp thô tö ngo¹i vµ ®iÖn di trªn gel agaroza 0,8 %. H×nh 3.6 lµ kÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm t¸ch chiÕt ADN genom tõ gièng lóa CR203 vµ C71. Trong ®ã, cét 2, 4 lµ çc mÉu ADN genom cßn lÉn ARN; cét 3, 5 lµ hai mÉu ADN ®· xö lý RNaza ®Ó lo¹i ARN. ADN chiÕt ®-îc tõ 2 gièng lóa C71, CR203 ®Òu kh¸ s¹ch vµ kh«ng bÞ ph©n huû vµ kh«ng lÉn ARN. KÕt qu¶ kiÓm tra trªn m¸y ®o quang phæ còng cho thÊy ADN genom t¸ch chiÕt ®îc cã ®é tinh s¹ch cao (A260/ 280 tõ 1,67 - 1,91) vµ cã thÓ sö dông lµm khu«n ®Ó nh©n ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza. Nh vËy, sö dông ph¬ng ph¸p CTAB, qu¸ tr×nh t¸ch chiÕt ADN võa nhanh, Ýt tèn kÐm ho¸ chÊt vµ hiÖu qu¶ ®¹t ®îc t¬ng ®èi cao.

71

H×nh 3.6. ADN genom cña 2 gièng lóa ViÖt Nam

1. ADN / Hind III + EcoR I 2. ADN CR203 (+ARN) 3. ADN CR203 (-ARN)4. ADN C71 (+ARN)

Tõ ADN genom cña hai gièng lóa, sö dông cÆp måi SUC-S/ SUC-B vµ Taq ADN polymeraza, chóng t«i ®· tiÕn hµnh PCR nh©n ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza. Trong çc thµnh phÇn tham gia PCR, nång ®é ®o¹n måi cã ¶nh hëng rÊt lín ®Õn chÊt lîng ph¶n øng. Nång ®é måi cao lµ mét trong nh÷ng nguyªn nh©n x¶y ra sù g¾n måi kh«ng ®Æc hiÖu, c¬ së xuÊt hiÖn nh÷ng tr×nh tù kh«ng mong muèn trong s¶n phÈm cuèi cïng. Trong khi, nång ®é måi kh«ng ®ñ sÏ lµm gi¶m hiÖu qu¶ cña ph¶n øng. §èi víi ADN khu«n, lîng mÉu sö dông ®Ó PCR còng cÇn ®îc ®iÒu chØnh thÝch hîp. HiÖu qu¶ PCR cã thÓ gi¶m nÕu nång ®é ADN khu«n qu¸ cao do protein vµ çc chÊt cã trong ADN khu«n øc chÕ ho¹t ®éng cña ADN polymeraza [170]. V× vËy, trong qu¸ tr×nh tiÕn hµnh ph¶n øng, chóng t«i ®· ®iÒu chØnh nång ®é çc ®o¹n måi, MgCl2, còng nh ADN genom khu«n ®Ó t×m lîng tèi thiÓu vµ tèi u ho¸. Ngoµi ra, nhiÖt ®é g¾n måi còng ®îc chóng t«i h¹ xuèng 540C. Nh÷ng ®iÒu chØnh nµy nh»m ®¶m b¶o cho PCR x¶y ra ®Æc hiÖu nhÊt.

Trªn c¬ së hµm lîng tæng sè cña mçi ®o¹n måi, chóng t«i ®· pha dung dÞch gèc víi nång ®é cuèi cïng lµ 0,5 nmoles/l vµ dung dÞch måi ®Ó tiÕn hµnh PCR (nång ®é 10 pmoles/l). Sau çc ph¶n øng thö nghiÖm vµ tèi u ho¸, s¶n phÈm PCR chóng t«i thu ®îc rÊt ®Æc hiÖu. KÕt qu¶ ®iÖn di trªn h×nh 3.7 cho thÊy, ë hai gièng lóa, s¶n phÈm PCR lµ mét b¨ng chÝnh cã kÝch thíc kho¶ng 2 kb t-¬ng ®¬ng víi tÝnh to¸n lý thuyÕt. Chóng t«i ký hiÖu s¶n phÈm PCR ë gièng lóa CR203 lµ CR203S-P vµ ë gièng lóa C71 lµ C71S-P.

72

Sau ®ã, trªn c¬ së tr×nh tù ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ë lóa (Rsuc1-P) ®· ®îc Wang & ®tg [199] c«ng bè, chóng t«i ®· tiÕn hµnh kiÓm tra b¶n ®å enzym h¹n chÕ cña s¶n phÈm PCR. Sö dông ch¬ng tr×nh PC GENE, chóng t«i ®· ph©n tÝch çc vÞ trÝ c¾t cña çc enzym h¹n chÕ th«ng dông trªn toµn bé chiÒu dµi cña gen Rsuc1. KÕt qu¶ ph©n tÝch cho thÊy, trong vïng tr×nh tù ®o¹n khëi ®éng (tõ vÞ trÝ 961 ®Õn 2902 cña gen Rsuc1), cã mét ®iÓm nhËn biÕt cña EcoR I (vÞ trÝ 1622), mét ®iÓm nhËn biÕt cña Hind III (vÞ trÝ 1165) vµ hai ®iÓm nhËn biÕt cña Pst I (vÞ trÝ 1136 vµ 1964). Chóng t«i ®· sö dông c¶ ba enzym nµy ®Ó xö lý C71S-P. KÕt qu¶ cho thÊy, s¶n phÈm c¾t bëi EcoR I vµ Pst I hoµn toµn phï hîp víi tÝnh to¸n lý thuyÕt (cét 4, 5, h×nh 3.7): hai b¨ng (kÝch thíc kho¶ng 1,3 kb vµ 700 bp) khi xö lý mÉu b»ng EcoR I vµ ba b¨ng (kho¶ng 0,95 kb; 0,85 kb vµ 200 bp) khi xö lý mÉu b»ng Pst I. Trong khi, Hind III hoµn toµn kh«ng c¾t s¶n phÈm PCR nµy. Chóng t«i dù ®o¸n lµ cã sù kh¸c biÖt vÒ tr×nh tù nucleotit gi÷a Rsuc1-P víi C71S-P ë vïng nhËn biÕt cña enzym nµy.

Qua çc kÕt qu¶ trªn, chóng t«i s¬ bé kÕt luËn lµ ®· nh©n ®îc s¶n phÈm PCR víi kÝch thíc ph©n tö vµ tr×nh tù t¹i mét sè ®iÓm c¾t phï hîp víi ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza

73

H×nh 3.7. S¶n phÈm PCR nh©n ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ë 2 gièng lóa ViÖt Nam vµ

kÕt qu¶ ph©n tÝch enzym h¹n chÕ cña ®o¹n khëi ®éng nµy ë gièng lóa C71

1. ChØ thÞ ph©n tö 1 kb 4. C71S-P/ EcoR I

2. CR203S-P 5. C71S-P/

synthaza. §Ó ®a ra kÕt luËn chÝnh x¸c, chóng t«i cÇn t¹o dßng vµ ®äc tr×nh tù nucleotit cña s¶n phÈm PCR nhËn ®îc.

3.1.3T¹o dßng ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ë gièng lóa C71

S¶n phÈm PCR thu ®îc tõ gièng lóa C71 ®îc g¾n trùc tiÕp vµo vect¬ pUC118 (tríc ®ã ®· ®îc më vßng b»ng Hinc II) vµ biÕn n¹p vµo E. coli chñng DH5. Vect¬ pUC118 cã mét ®iÓm c¾t cña BamH I n»m bªn tr¸i vÞ trÝ nhËn biÕt Hinc II. Nh ®· tr×nh bµy, trong tr×nh tù cña ®o¹n måi SUC-B, chóng t«i cã thiÕt kÕ thªm mét ®iÓm c¾t cña enzym nµy. NÕu nh s¶n phÈm PCR ®îc g¾n xu«i chiÒu th× khi xö lý b»ng BamH I sÏ xuÊt hiÖn mét b¨ng kÝch thíc b»ng C71S-P (cét 2, h×nh 3.8). KÕt qu¶ ®iÖn di sau khi c¾t dßng pUC118-C71S-P b»ng BamH I cho thÊy plasmit t¸i tæ hîp nµy cã mang ®o¹n ADN cã kÝch thíc ph©n tö t¬ng ®¬ng víi s¶n phÈm PCR (cét 4, h×nh 3.8).

§Ó kiÓm tra cÊu tróc cña plasmit t¸i tæ hîp pUC118-C71S-P, chóng t«i còng ®· tiÕn hµnh ph©n tÝch b¶n ®å enzym h¹n chÕ cña plasmit nµy. Vect¬ pUC118 cã mét ®iÓm c¾t cña EcoR I n»m bªn tr¸i vÞ trÝ nhËn biÕt cña Hinc II (n¬i s¶n phÈm PCR ®îc g¾n vµo). Trong C71S-P còng cã mét ®iÓm c¾t cña enzym nµy. Tuú thuéc vµo chiÒu g¾n cña C71S-P vµo vect¬, s¶n phÈm c¾t sÏ lµ

74

H×nh 3.8. T¹o dßng ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ë gièng lóa C71

1. ADN / Hind III + EcoR I 2. C71S-P 3. C71S-P/ BamH I 4. pUC118-C71-P/ BamH I

hai b¨ng cã kÝch thíc kho¶ng 0,65 kb, 4,5 kb (trêng hîp 1), hoÆc 1,3 kb, 3,85 kb (trêng hîp 2 - khi C71S-P g¾n theo chiÒu ngîc l¹i). KÕt qu¶ nhËn ®îc cho thÊy, EcoR I ®· c¾t plasmit thµnh hai b¨ng ®óng nh trêng hîp 1. Khi xö lý plasmit t¸i tæ hîp b»ng Pst I vµ Pvu II, chóng t«i còng nhËn ®îc kÕt qu¶ t¬ng tù víi tÝnh to¸n lý thuyÕt (c¶ hai enzym nµy ®Òu c¾t plasmit thµnh ba ®o¹n cã kÝch thíc phï hîp nh trªn). Trªn c¬ së nh÷ng ph©n tÝch nµy chóng t«i kh¼ng ®Þnh ®· t¹o dßng ®îc C71S-P tõ gièng lóa C71. Chóng t«i ®· tiÕn hµnh t¸ch chiÕt vµ tinh chÕ mét lîng lín vect¬ nµy ®Ó t¹o çc dßng phô vµ ®äc tr×nh tù nucleotit cña C71S-P.

3.1.4 T¹o çc dßng phô mang çc ®o¹n ADN cña ®o¹n khëi ®éng gen m· ho¸ sucroza synthaza ë gièng lóa C71

Víi kÝch thíc cña ®o¹n C71S-P kho¶ng 2 kb, trong khi çc m¸y ®äc tr×nh tù ADN tù ®éng th«ng thêng chØ ®äc ®îc çc ®o¹n cã kÝch thíc kho¶ng 500 - 800 nucleotit nªn ®Ó x¸c ®Þnh ®-îc toµn bé tr×nh tù vµ nghiªn cøu cÊu tróc cña C71S-P cÇn ph¶i tiÕn hµnh t¹o çc dßng phô mang çc ®o¹n ADN ng¾n cña C71S-P. Tríc hÕt, dßng ban ®Çu ®îc xö lý b»ng çc enzym h¹n chÕ thÝch hîp nh»m t¹o ra nh÷ng ®o¹n ng¾n, sau ®ã vïng gel cã chøa b¨ng ADN ®îc c¾t ra, ADN ®îc ®Èy ra khái gel, lµm s¹ch vµ ghÐp vµo vect¬ [1], [12].

S¶n phÈm PCR (C71S-P) trong plasmit t¸i tæ hîp pUC118-C71S-P ®îc chóng t«i ph©n c¾t thµnh çc ®o¹n ng¾n vµ ®a vµo trong vect¬ pBluescript KS-. Nh trªn ®· tr×nh bµy, Pst I c¾t plasmit pUC118-C71S-P thµnh ba ®o¹n kÝch thíc kho¶ng 0,85 kb, 0,95 kb vµ 3,35 kb. Do vËy, chóng t«i ®· sö dông enzym nµy ®Ó

75

t¹o 2 ®o¹n ng¾n (kho¶ng 0,85 kb vµ 0,95 kb), sau ®ã g¾n vµo vect¬ pBluescript KS(-) ®Ó x¸c ®Þnh tr×nh tù. Çc dßng mang plasmit t¸i tæ hîp ký hiÖu pBS-P1pBS-P10 (chøa ®o¹n kho¶ng 0,95 kb), pBS-P11pBS-P20 (chøa ®o¹n kho¶ng 0,85 kb), pBS-P21 (kh«ng chøa b¨ng quan t©m) (h×nh 3.9).

Ngoµi ra, chóng t«i còng xö lý pUC118-C71S-P b»ng EcoR I ®Ó lo¹i bá ®o¹n cã ph©n tö lîng kho¶ng 0,65 kb, sau ®ã g¾n l¹i b»ng T4 ADN ligaza. KÕt qu¶ ®· t¹o thªm ®îc çc dßng phô pUC-E1pUC-E5 (chøa ®o¹n kho¶ng 1,3 kb). Chóng t«i ®· tiÕn hµnh ®äc tr×nh tù tõ hai ®Çu cña dßng ban ®Çu vµ ba lo¹i dßng phô nµy.

3.1.5 §äc tr×nh tù nucleotit ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ë gièng lóa C71

Tr×nh tù cña C71S-P ®îc x¸c ®Þnh theo ph¬ng ph¸p cña Sanger & ®tg [172]. Chóng t«i ®· x¸c ®Þnh tr×nh tù tõ hai chiÒu cña tÊt c¶ çc ®o¹n ADN cã trong çc plasmit t¸i tæ hîp cña çc dßng ban ®Çu vµ dßng phô nhËn ®îc sö dông ®o¹n måi ®äc xu«i vµ ®äc ngîc. B¶ng 3.9 tr×nh bµy çc plasmit chóng t«i ®· sö dông

76

H×nh 3.9. T¹o çc dßng phô mang çc ®o¹n c¾t nhá cña C71S-P

1. ADN / Hind III + EcoR I 2. pBS/ Pst I 3. pUC118-C71S-P/ Ps tI4. pBS-P11/ Pst I 5. pBS-P16. pBS-P1/ Pst I7. pBS-P2/ Pst I8. pUC-E1 9. pUC-E1/ EcoR I

®Ó lµm ph¶n øng ®äc tr×nh tù vµ sè lîng nucleotit ®· x¸c ®Þnh ®îc tõ hai chiÒu cña mçi ®o¹n ADN.

B¶ng 3.9. KÕt qu¶ ®äc tr×nh tù çc plasmit t¸i tæ hîp cã g¾n çc ®o¹n hîp thµnh ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸

sucroza synthaza ë gièng lóa C71

Plasmit ChiÒu dµi tr×nh tù ®· ®äc (sè nucleotit)

ChiÒu xu«i ChiÒu ngîc

pBS-P1 799 764

pBS-P11 605 775

pUC-E1 899 -

pUC118-C71S-P 619 658

Nh vËy, tõ plasmit pBS-P1 chóng t«i ®· ®äc ®îc hai ®o¹n ADN: ®o¹n xu«i chiÒu dµi 799 nucleotit vµ ®o¹n ngîc chiÒu dµi 764 nucleotit. T¬ng tù, hai tr×nh tù ®äc ®îc tõ hai chiÒu cña plasmit pBS-P11 dµi 605 vµ 775 nucleotit. §èi víi plasmit cña dßng ban ®Çu pUC118-C71S-P, ®o¹n xu«i chiÒu ®· ®äc ®îc lµ 619 nucleotit vµ ®o¹n ngîc chiÒu dµi 658 nucleotit. S¬ ®å qu¸ tr×nh ®äc tr×nh tù çc plasmit t¸i tæ hîp cã g¾n çc ®o¹n hîp thµnh C71S-P vµ kÕt qu¶ ®îc tr×nh bµy trªn h×nh 3.10.

Râ rµng, çc ®o¹n ADN chóng t«i ®äc ®îc ®· bao trïm toµn bé chiÒu dµi cña C71S-P vµ mét sè ®o¹n ADN ®· ®îc ®äc lÆp l¹i. Sau khi ghÐp çc ®o¹n tr×nh tù ®· ®äc vµ xö lý qua ch¬ng tr×nh PC GENE, chóng t«i ®· nhËn ®îc tr×nh tù cña C71S-P hoµn chØnh.

77

Sau ®ã, chóng t«i ®· tiÕn hµnh so s¸nh tr×nh tù toµn bé ®o¹n C71S-P dµi 1954 bp víi tr×nh tù cña Rsuc1-P ®· c«ng bè t¹i çc ng©n hµng EMBL/ GENBANK/ DDBJ [199]. KÕt qu¶ so s¸nh ®îc tr×nh bµy trªn h×nh 3.11.

Tõ çc ph©n tÝch trªn, chóng t«i ®· ph¸t hiÖn thÊy mét ®iÓm ®¸ng chó ý lµ C71S-P cã thªm mét ®o¹n chÌn vµo phÝa trªn cña ®o¹n khëi ®éng víi tr×nh tù dµi 13 nucleotit (vÞ trÝ tõ -1681 ®Õn -1669 trªn h×nh 3.11). Th«ng thêng çc ®o¹n tr×nh tù n»m ë vïng ®Çu nµy lµ nh÷ng vïng t¨ng cêng, cã ¶nh hëng ®Õn qu¸ tr×nh biÓn hiÖn gen. Do vËy, ®o¹n tr×nh tù chÌn vµo C71S-P cã thÓ ®ãng vai trß nhÊt ®Þnh trong qu¸ tr×nh ®iÒu khiÓn gen biÓu hiÖn. Ngoµi ra, trªn toµn bé chiÒu dµi 1954 bp, chóng t«i cßn quan s¸t thÊy 14 vÞ trÝ nucleotit kh¸c nhau gi÷a 2 tr×nh tù nµy. Çc vÞ trÝ kh¸c biÖt nµy ®îc chóng t«i thèng kª trªn b¶ng 3.10.

Rsuc1-P - ATCTGATGGTCGGTCTGGTAATCAAATCACCAGATCCTGAAATCCACCAAATCAAACCGTGAGATTTTTGCAGAG -75

||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - ATCTGATGGTCGGTCTGGTAATCAAATCACCGGATCCTGAAATCCACCAAATCAAACCGTGAGATTTTTGCAGAG -75

-1982

Rsuc1-P - GCAAAACAAGAAAAGCATCTGCTTTATTTCTCTCTTGCTTTCTTTTCATCCCCAACCAGTCCTTTTTTCTTCTGT -150

||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - ACAAAACAAGAAAAGCATCTGCTTTATTTCCCTCTTGCTTTCTTTTCATCCCCAACCAGTCCTTTTTTCTTCTGT -150

-1876 -1846

78

H×nh 3.10. S¬ ®å ®äc tr×nh tù çc ®o¹n ADN cña ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ë

gièng lóa C71

Pst I Hind IIIRsuc1-P - TTATTTGTAGAAGTCTACCACCTGCAGTCTATTATTCTACAGAGAAAAAGATTGAA G CTT TTTTTCTCCAAAGCT -225

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||C71S-P - TTATTTGTAGAAGTCTACCACCTGCAGTCTATTATTCTACAGAGAAAAAGATTGAACCTTTTTTTCTCCAAAGCT -225

-1745

Rsuc1-P - GACAATGGTGCCGGCATATGCTAATAGGATACTCCCTTCGTCTAG-------------GAAAAAACCAACCCACT -287 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||C71S-P - GACAATGGTGCCGGCATATGCTAATAGGATACTCCCTTCGTCTAGTCCCTTCGTCTAGGAAAAAACCAACCCACT -300 -1681......-1669

Rsuc1-P - ACAATTTTGAATATATATTTATTCAGATTTGTTATGCTTCCTACTCCTTCTCAGGTATGGTGAGATATTTCATAG -362 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||C71S-P - ACAATTTTGAATATATATTTATTCAGATTTGTTATGCTTCCTACTCCTTCTCAGTTATGGTGAGATATTTCATAG -375 -1597

Rsuc1-P - TATAATGAATTTGGACATATATTTGTCCAAATTCATCGCATTATGAAATGTCTCGTTCGATCTATGTTGTTATAT -437 |||||||| ||| |||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||C71S-P - TATAATGACTTTCGACATATATTTGCCCAAATTCATCGCATTATGAAATGTCTCGTTCGATCTAGGTTGTTATAT -450 -1568 -1564 -1551 -1512

Rsuc1-P - TAT-AGACGGAGATAGTAGATTCGGTTATTTTTGGACAGAGAAAGTACTCGCCTGTGCTAGTGACATGATTAGTG -511 ||| ||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - TATGAGACGGAGAGAGTAGATTCGGTTATTTTTGGACAGAGAAAGTACTCGCCTGTGCTAGTGACATGATTAGTG -525 -1498 -1488

Rsuc1-P - ACACCATCAGATTAAAAAAACATATGTTTTGATTAAAAAAATGGGGAATTTGGGGGGAGCAATAATTTGGGGTTA -586 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - ACACCATCAGATTAAAAAAACATATGTTTTGATTAAAAAAATGGGGAATTTGGGGGGAGCAATAATTTGGGGTTA -600

79

Hép CAATRsuc1-P - TCCATTGCTGTTTCATCATGTCAGCTGAAAGGCCCTACCACTAAACCAATATCTGTACTATTCTACCACCTATCA -661 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P -

TCCATTGCTGTTTCATCATGTCAGCTGAAAGGCCCTACCACTAAACCAATATCTGTACTATTCTACCACCTATCA -675 -1306..-1300

80

EcoR I Hép ASL Hép TATA Rsuc1-P - GAATTCAGAGCACTGGGGTTTTGCAACTATTTATTGGTCCTTCTGGATCTCGGAGAAACCCTCCATTCGTTTGCT -736 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - GAATTCAGAGCACTGGGGTTTTGCAACTATTTATTGGTCCTTCTGGATCTCGGAGAAACCCTCCATTCGTTTGCT -750 -1267.......-1252-1249..-1242

Rsuc1-P - CGTCTCTGACCACCATTGGGTATGTTGCTTCCATTGCCAAACTGTTCCCTTTTACCCATAGGCTGATTGATCTTG -811 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - CGTCTCTGACCACCATTGGGTATGTTGCTTCCATTGCCAAACTGTTCCCTTTTACCCATAGGCTGATTGATCTTG -825

Rsuc1-P - GCTGTGTGATTTTTTGCTTGGGTTTTTGAGCTGATTCAGCGGCGCTTGCAGCCTCTTGATCGTGGTCTTGGCTCG -886 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - GCTGTGTGATTTTTTGCTTGGGTTTTTGAGCTGATTCAGCGGCGCTTGCAGCCTCTTGATCGTGGTCTTGGCTCG -900

Rsuc1-P - CCCATTTCTTGCGATTCTTTGGTGGGTCGTCAGCTGAATCTTGCAGGAGTTTTTGCTGACATGTTCTTGGGTTTA -961 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - CCCATTTCTTGCGATTCTTTGGTGGGTCGTCAGCTGAATCTTGCAGGAGTTTTTGCTGACATGTTCTTGGGTTTA -975

Pst IRsuc1-P - CTGCTTTCGGTAAATCTGAACCAAGAGGGGGGTTTCTGCTGCAGTTTAGTGGGTTTACTATGAGCGGATTCGGGG -1036 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - CTGCTTTCGGTAAATCTGAACCAAGAGGGGGGTTTCTGCTGCAGTTTAGTGGGTTTACTATGAGCGGATTCGGGG -1050

Hép IIRsuc1-P - TTTCGAGGAAAACCGGCAAAAAACCTCAAATCCTCGACCTTTAGTTTTGCTGCCACGTTGCTCCGCCCCATTGCA -1111 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - TTTCGAGGAAAACCGGCAAAAAACCTCAAATCCTCGACCTTTAGTTTTGCTGCCACGTTGCTCCGCCCCATTGCA -1125 -849......................

81

Rsuc1-P - GAGTTCTTTTTGCCCCCAAATTTTTTTTTACTTGGTGCAGTAAGAATCGCGCCTCAGTGATTTTCTCGACTCGTA -1186 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - GAGTTCTTTTTGCCCCCAAATTTTTTTTTACTTGGTGCAGTAAGAATCGCGCCTCAGTGATTTTCTCGACTCGTA -1200 ..-825

Rsuc1-P - GTCCGTTGATACTGTGTCTTGCTTATCACTTGTTCTGCTTAATCTTTTTTGCTTCCTGAGGAATGTCTTGGTGCC -1261 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - GTCCGTTGATACTGTGTCTTGCTTATCACTTGTTCTGCTTAATCTTTTTTGCTTCCTGAGGAATGTCTTGGTGCC -1275

Rsuc1-P - TGTCGGTGGATGGCGAACCAAAAATGAAGGGTTTTTTTTTTTTGAACTGAGAAAAATCTTTGGGTTTTTGGTTGG -1336 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - TGTCGGTGGATGGCGAACCAAAAATGAAGGGTTTTTTTTTTTTGAACTGAGAAAAATCTTTGGGTTTTTGGTTGG –1350

Rsuc1-P - ATTCTTTCATGGAGTCGCGACCTTCCGTATTCTTCTCTTTGATCTCCCCGTTGCGGATTCATAATATTCGGAACC -1411 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||C71S-P - ATTCTTTCATGGAGTCGCGACCTTCCGTATTCTTCTCTTTGATCTCCCCGTTGCGGATTCATAATATCCGGAACC -1425 -534

Rsuc1-P - TTCATGTTGGCTCTGCTTAATCTGTAGCCAAATCTTCATATCTCCAGGGATCTTTCGCTCTGTCCTATCGGATTT -1486 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - TTCATGTTGGCTCTGCTTAATCTGTAGCCAAATCTTCATATCTCCAGGGATCTTTCGCTCTGTCCTATCGGATTT -1500

Rsuc1-P - AGGAATTAGGATCTAACTGGTGCTAATACTAAAGGGTAATTTGGAACCATCCATTATAATTTTGCAAAGTTTGAG -1561 |||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P -

AGGAATTAGGGTCTAACTGGTGCTAATACTAAAGGGTAATTTGGAACCATCCATTATAATTTTGCAAAGTTTGAG -1575 -441

82

Hép GATARsuc1-P - GATATGCCATCGGTATCTCAATGATACTTACTAAAACCCAACAAATCCATTTGATAAAGCTGGTTCTTTTATCCC -1636 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - GATATGCCATCGGTATCTCAATGATACTTACTAAAACCCAACAAATCCATTTGATAAAGCTGGTTCTTTTATCCC -1650 -328...-321

Rsuc1-P - TTTGAAAACATTGTCAGAGTATATTGGTTCAGGTTGATTTATTTTGAATCAGTACTCGCACTCTGCTTCGTAAAC -1711 ||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - TTTGAAAACATTGTCAGAGCATATTGGTTCAGGTTGATTTATTTTGAATCAGTACTCGCACTCTGCTTCGTAAAC -1725 -282

Rsuc1-P - CATAGATGCTTTCAGTTGTGTAGATGAAACAGCTGTTTTTAGTTATGTTTTGATCTTCCAATGCTTTTGTGTGAT -1786 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - CATAGATGCTTTCAGTTGTGTAGATGAAACAGCTGTTTTTAGTTATGTTTTGATCTTCCAATGCTTTTGTGTGAT -1800

Rsuc1-P - GTTATTAGTGTTGATTTAGCATGGCTTTCCTGTTCAGAGATAGTCTTGCAATGCTTAGTGATGGCTGTTGACTAA -1861 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - GTTATTAGTGTTGATTTAGCATGGCTTTCCTGTTCAGAGATAGTCTTGCAATGCTTAGTGATGGCTGTTGACTAA -1875

Rsuc1-P - TTATTCTTGTGCAAGTGAGTGGTTTTGGTACGTGTTGCTAAGTGTAACCTTTCTTTGCAGTTCCTGAAATTGAGT -1936 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||C71S-P - TTATTCTTGTGCAAGTGAGTGGTTTTGGTACGTGTTGCTAAGTGTAACCTTTCTTTGCAGTTCCTGAAATTGAGT -1950

Rsuc1-P – CATG -1940 |||| C71S-P - CATG –1954

-1

83

H×nh 3.11. So s¸nh tr×nh tù nucleotit vµ çc yÕu tè quan träng trªn

®o¹n khëi ®éng Rsuc1-P vµ C71S-P

B¶ng 3.10. Çc vÞ trÝ nucleotit kh¸c biÖt gi÷a Rsuc1-P vµ C71S-P

STT VÞ trÝ(tÝnh tõ m· khëi ®Çu cña

C71S-P)

Rsuc1-P

C71S-P

1 -282 T C2 -441 A G3 -534 T C4 -1488 T G5 -1498 - G6 -1512 T G7 -1551 T C8 -1564 G C9 -1568 A C10 -1597 G T11 -1681 … -1669 - TCCCTTCGTCTAG12 -1745 G C13 -1846 T C14 -1876 G A15 -1982 A G

Trong 14 vÞ trÝ nucleotit kh¸c biÖt gi÷a hai ®o¹n tr×nh tù kÓ trªn, sù kh¸c biÖt x¶y ra t¹i vÞ trÝ -1745 trªn C71S-P (nucleotit C trªn C71S-P thay b»ng nucleotit G trªn Rsuc1-P) ®· lµm thay ®æi tr×nh tù nhËn biÕt cña enzym Hind III trªn Rsuc1-P. KÕt qu¶ nµy hoµn toµn phï hîp víi thÝ nghiÖm kiÓm tra s¬ bé s¶n phÈm PCR nh©n ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ë gièng lóa C71 b»ng Hind III (chóng t«i ®· tr×nh bµy ë môc 3.1.2).

84

H¬n n÷a, trong tr×nh tù cña C71S-P chóng t«i ®· quan s¸t thÊy çc tr×nh tù ADN b¶o thñ thêng cã mÆt ë hÇu hÕt çc ®o¹n khëi ®éng nh hép TATA (tr×nh tù TATA) n»m ë vÞ trÝ tõ (-1249) ®Õn (-1242), hép CAAT (tr×nh tù CCAAT) ë vÞ trÝ tõ (-1306) ®Õn (-1300). Cho tíi nay, ®èi víi ®o¹n khëi ®éng thùc vËt cßn rÊt Ýt çc nghiªn cøu chøng minh vai trß quan träng cña tõng yÕu tè nµy [133]. Tuy nhiªn, ®ét biÕn çc hép nµy ®· g©y ¶nh hëng ®Õn hiÖu qu¶ qu¸ tr×nh phiªn m· ra ARN th«ng tin. Râ rµng, çc tr×nh tù b¶o thñ trªn t¸c ®éng trùc tiÕp vµ ®ãng mét vai trß quan träng trong qu¸ tr×nh biÓu hiÖn gen [27].

§Æc biÖt, C71S-P cßn mang çc tr×nh tù ®¸ng chó ý kh¸c nh: hép ASL n»m ë vÞ trÝ tõ (-1267) ®Õn (-1252), hép GATA ë vÞ trÝ tõ (-328) ®Õn (-321) (b¶ng 3.11). VÒ chøc n¨ng, çc tr×nh tù nµy ®· ®îc chøng minh lµ cã liªn quan ®Õn biÓu hiÖn gen ®Æc hiÖu bã m¹ch [205]. B¶ng 3.11 lµ çc tr×nh tù trong C71S-P t¬ng øng víi çc yÕu tè ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn ®Æc hiÖu bã m¹ch [43], [95], [205].

B¶ng 3.11. Çc tr×nh tù trong C71S-P t¬ng øng víi çc yÕu tè ®iÒu khiÓn gen biÓu hiÖn ®Æc hiÖu bã m¹ch

YÕu tè Tr×nh tù b¶o thñ

§o¹n khëi ®éng VÞ trÝ trong C71S-P (tÝnh

tõ m· khëi ®Çu)

Hép ASL GCA(N)6-12GCA

Virut g©y bÖnh tungro h¹i lóa (Rice tungro bacilliform virus); Gen m· ho¸ sucroza synthaza cña c©y ng« Sh1;

-1267…. -1252

85

Gen invCD111 vµ invCD141 cña khoai t©y

Hép GATA

A(N)3GATAVirut g©y bÖnh tungro; Gen invCD111 vµ invCD141; Gen GSA3 cña c©y ®Ëu Hµ Lan

-328…. -321

Hép II CCA…GCCCC Virut g©y bÖnh tungro

-849…. -825

Râ rµng, ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ë gièng lóa C71 mµ chóng t«i ph©n lËp ®îc mang ®Çy ®ñ nh÷ng ®o¹n tr×nh tù b¶o thñ cã mÆt ë hÇu hÕt ®o¹n khëi ®éng vµ çc ®o¹n tr×nh tù ®· ®îc chøng minh lµ çc yÕu tè ®iÒu khiÓn gen biÓu hiÖn ®Æc hiÖu bã m¹ch. Çc ®o¹n khëi ®éng ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn gen ®Æc hiÖu kh«ng gian vµ thêi gian nh C71S-P ®ang ®îc rÊt nhiÒu phßng thÝ nghiÖm trªn thÕ giíi t×m kiÕm, ph©n lËp, nghiªn cøu vµ ®a vµo øng dông [118]. §Ó nghiªn cøu sù ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn ®Æc hiÖu gen cña C71S-P, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thiÕt kÕ vect¬ mang gen kh¸ng c«n trïng díi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng nµy.

3.2 ThiÕt kÕ çc vect¬ Ti-plasmit mang gen kh¸ng c«n trïng díi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng c¬ ®Þnh/ ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt trong tÕ bµo E. coli

Nh×n chung hiÖn nay, çc nhãm nghiªn cøu ë ViÖt Nam th-êng sö dông çc plasmit t¸i tæ hîp ®· ®îc thiÕt kÕ s½n ®Ó thùc hiÖn çc thÝ nghiÖm chuyÓn gen vµo c©y trång [3], [13], [18], [20], [21], [22]. Trªn c¬ së çc nguån gen m· ho¸ protein cã ho¹t tÝnh diÖt c«n trïng, vÊn ®Ò thiÕt kÕ vect¬ vµ nghiªn cøu chuyÓn

86

gen kh¸ng s©u vµo tÕ bµo thùc vËt sö dông vect¬ Ti-plasmit cña A. tumefaciens cã kh¶ n¨ng thùc hiÖn trong ®iÒu kiÖn ViÖt Nam. Víi çc nguyªn liÖu su tËp vµ ph©n lËp ®îc, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thiÕt kÕ mét sè plasmit t¸i tæ hîp ®Ó chuyÓn vµo c©y trång. S¬ ®å thÝ nghiÖm ®îc chóng t«i tr×nh bµy trªn h×nh 3.12.

3.2.1 ThiÕt kÕ Ti-plasmit t¸i tæ hîp chøa gen cryIA(c) díi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng Ubiquitin

Nguån gen cryIA c¶i biÕn vµ tæng hîp ho¸ häc chóng t«i nhËn ®îc tõ Trêng §¹i häc Tæng hîp Ottawa, Canada lµ nguyªn liÖu chÝnh sö dông ®Ó thiÕt kÕ çc Ti-plasmit t¸i tæ hîp. Nh÷ng lý do chÝnh ®Ó chóng t«i sö dông gen cry tæng hîp nh©n t¹o nµy: (1) gen cry cã kh¶ n¨ng kh¸ng c«n trïng ®Æc hiÖu víi nång ®é ®éc tè thÊp vµ kh«ng ¶nh hëng ®Õn m«i trêng sinh th¸i; (2) th«ng thêng çc gen cry tù nhiªn cã hiÖu qu¶ biÓu hiÖn trong thùc vËt kh«ng cao [32]; (3) gen cry chóng t«i sö dông ®· ®îc nhãm nghiªn cøu cña Altosaar c¶i biÕn dùa trªn tr×nh tù ®· biÕt cña gen cry nh»m t¨ng cêng qu¸ tr×nh sinh tæng hîp ARN th«ng tin vµ protein: thay ®æi tèi ®a çc m· di truyÒn theo híng t¨ng hµm lîng Guanin/ Xytonin, c¾t bít gen, chØ biÓu hiÖn vïng gen cry liªn quan ®Õn tÝnh ®éc cña protein…[67], [173]; (4) çc nghiªn cøu chuyÓn gen thùc vËt sö dông gen cry tæng hîp ho¸ häc ®· ®îc tèi u ho¸ vÒ m· di truyÒn ®· lµm t¨ng tÝnh ®éc cña protein tinh thÓ ®éc lªn nhiÒu lÇn [52], [166], [173].

Sau khi thiÕt kÕ, çc cÊu tróc gen ®îc chóng t«i chuyÓn vµo tÕ bµo vi khuÈn E. coli, môc ®Ých ®Ó nh©n Ti-plasmit t¸i tæ hîp

87

H×nh 3.12. S¬ ®å thÝ nghiÖm thiÕt kÕ vect¬

víi lîng lín phôc vô thÝ nghiÖm chuyÓn çc plasmit nµy vµo tÕ bµo vi khuÈn A. tumefaciens.

Chñng E. coli chøa plasmit pGEM4Z mang nguån gen cryIA(c) dµi 1845 bp díi sù ®iÒu khiÓn cña Ubi-P ®îc nu«i cÊy l¾c trªn m«i trêng LB láng ë 370C. M«i trêng chän läc cã bæ sung thªm 50 g/ ml Amp. §Ó thu nhËn ®îc toµn bé kÕt cÊu gen cry (Ubi-cryIA(c)-NOST), ®Çu tiªn chóng t«i ®· tiÕn hµnh t¸ch chiÕt ADN plasmit cña chñng vi khuÈn nµy. Sau ®ã dùa trªn kÕt qu¶ cña b¶n ®å enzym h¹n chÕ, mét lîng lín ADN plasmit ®· ®îc xö lý b»ng enzym Hind III t¹o s¶n phÈm lµ hai b¨ng kÝch thíc kho¶ng 4,1 kb vµ 2,7 kb. Trong ®ã, b¨ng 2,7 kb t¬ng øng víi vect¬ pGEM4Z, b¨ng 4,1 kb chÝnh lµ kÕt cÊu gen Ubi-cryIA(c).

Híng thiÕt kÕ vect¬ nµy cña chóng t«i còng phï hîp víi c«ng bè gÇn ®©y nhÊt cña Cheng & ®tg khi nghiªn cøu chuyÓn gen cry vµo lóa th«ng qua A. tumefaciens. Trong c«ng tr×nh nµy, çc t¸c gi¶ còng tiÕn hµnh l¾p r¸p Ubi-cryIA(b) vµ Ubi-cryIA(c) vµo Ti-plasmit t¹i ®iÓm c¾t cña enzym Hind III [52]. Toµn bé kÕt cÊu gen Ubi-cryIA(c) ®îc chóng t«i thu håi b»ng ph¬ng ph¸p ®iÖn di ®Èy ra khái gel trong tói thÈm tÝch nhê ®iÖn trêng vµ dïng lµm nguyªn liÖu cho ph¶n øng g¾n vµo Ti-plasmit.

Ti-plasmit chóng t«i sö dông ®Ó thiÕt kÕ vect¬ mang kÕt cÊu gen Ubi-cryIA(c) lµ pCAMBIA1300 (h×nh 3.13). Vect¬ nµy cã kÝch thíc ph©n tö 8958 bp vµ ®îc c¶i tiÕn víi mét sè ®Æc tÝnh: (1) Vïng MCS n»m gÇn ®o¹n biªn ph¶i cã nguån gèc tõ vect¬ pUC18 thuËn lîi cho qu¸ tr×nh ®a gen quan t©m vµo vect¬; (2) Mang chØ thÞ sµng läc xanh tr¾ng nhê biÓu hiÖn hoÆc kh«ng biÓu hiÖn β-galactosidaza; (3) DÔ dµng nh©n trong E. coli víi sè l-îng b¶n sao lín; (4) Cã thÓ sö dông ph¬ng ph¸p phèi ba bè mÑ ®Ó

88

chuyÓn vect¬ nµy vµo tÕ bµo A. tumefaciens; (5) Nhê sù cã mÆt cña vïng rep vµ sta cã nguån gèc tõ vect¬ pVS1, pCAMBIA1300 cã thÓ tån t¹i trong tÕ bµo A. tumefaciens trªn m«i trêng kh«ng chän läc [66]; (6) Mang gen kh¸ng kanamycin dïng cho chän läc vi khuÈn vµ gen kh¸ng hygromycin dïng cho chän läc thùc vËt.

Víi çc ®Æc tÝnh trªn, pCAMBIA1300 ®îc sö dông réng r·i ®Ó chuyÓn gen vµo thùc vËt ®Æc biÖt lµ lóa vµ mét sè c©y trång quan träng kh¸c.

Vect¬ pCAMBIA1300 ®îc göi ®Õn tõ óc ë d¹ng thÊm kh« trªn giÊy läc. Sau khi ng©m giÊy läc trong ®Öm TE, vect¬ ®îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo E. coli (chñng DH5) theo ph¬ng ph¸p sèc nhiÖt víi sù chän läc trªn m«i trêng LB cã chøa 50 g/ ml Km, 40 g/ ml X-gal, 40 g/ ml IPTG. Ph¬ng ph¸p biÕn n¹p nµy kh¸ ®¬n gi¶n nhng cho hiÖu suÊt t¬ng ®èi cao nªn rÊt phï hîp víi ®iÒu kiÖn thÝ nghiÖm ë níc ta. KÕt qu¶, trªn ®Üa m«i trêng LB ®· xuÊt hiÖn nh÷ng khuÈn l¹c mµu xanh do pCAMBIA1300 mang gen lacZ m· ho¸ enzym -galactosidaza. Trªn m«i trêng cã IPTG - chÊt c¶m øng cña -galactosidaza vµ 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D(-)-galactopyranosit (X-gal) - c¬ chÊt cña -galactosidaza, X-gal sÏ bÞ -galactosidaza (s¶n phÈm dÞch m· cña gen lacZ) xóc t¸c chuyÓn thµnh s¶n phÈm mµu xanh [71]. Tõ çc khuÈn l¹c sau biÕn n¹p, chóng t«i ®· tiÕn hµnh t¸ch chiÕt, tinh chÕ Ti-plasmit vµ kiÓm tra mét sè vÞ trÝ enzym h¹n chÕ. §iÖn di ®å cho thÊy ADN t¸ch chiÕt ®îc cã ®é tinh s¹ch rÊt cao, chÊt lîng ®¶m b¶o cho çc thao t¸c thiÕt kÕ vect¬ cÇn thiÕt (h×nh 3.14).

89

H×nh 3.14. KiÓm tra vect¬ pCAMBIA1300 tinh s¹ch b»ng ph©n tÝch enzym h¹n chÕ

1. ADN / Hind III + EcoR I 3. pCAMBIA1300/ Hind III

2. pCAMBIA1300 4. pCAMBIA1300/ Xho I

H×nh 3.13. Vïng T-ADN (2728 bp) cña vect¬ pCAMBIA1300

KÕt qu¶ xö lý vect¬ b»ng Hind III lµ plasmit ë d¹ng m¹ch th¼ng (cét 3, h×nh 3.14). Cßn ®èi víi Xho I, s¶n phÈm c¾t lµ hai b¨ng kho¶ng 8 kb vµ 1 kb. B¨ng cã kÝch thíc 1 kb t¬ng øng víi ®é dµi cña gen kh¸ng hygromycin vµ b¨ng kÝch thíc 8 kb t¬ng øng víi phÇn cßn l¹i cña vect¬ (cét 4, h×nh 3.14). Vect¬ pCAMBIA1300 sau ®ã còng ®îc xö lý mét lîng lín b»ng Hind III, lo¹i bá nhãm photphat vµ sö dông lµm vect¬.

KÕt cÊu gen Ubi-cryIA(c) (50 ng - 8l) ®îc g¾n vµo vect¬ pCAMBIA1300 vµ biÕn n¹p vµo tÕ bµo E. coli (chñng HB101). Chóng t«i chän chñng E. coli chñ lµ HB101 (thay v× DH5α th«ng thêng) ®Ó chuÈn bÞ cho bíc ®a plasmit t¸i tæ hîp vµo A. tumefaciens tiÕp theo. Trªn m«i trêng th¹ch LB chøa 50 g/ ml Km, 40 g/ ml X-gal, 40 g/ ml IPTG, chóng t«i ®· chän läc çc dßng vi khuÈn cã mµu tr¾ng. Mµu tr¾ng xuÊt hiÖn do gen lacZ bÞ bÊt ho¹t khi ®o¹n ADN ngo¹i lai (trong trêng hîp nµy lµ kÕt cÊu gen cry) chÌn vµo. Sau ®ã, chóng t«i ®· t¸ch chiÕt ADN plasmit tõ çc khuÈn l¹c riªng rÏ mµu tr¾ng b»ng ph¬ng ph¸p vi ®iÒu chÕ vµ tuyÓn chän trªn ®iÖn di gel agaroza 1%.

Ph©n tÝch b¶n ®å enzym h¹n chÕ, chóng t«i nhËn thÊy, nÕu kÕt cÊu gen Ubi-cryIA(c)-NOST ®· g¾n ®îc vµo vect¬ pCAMBIA1300 th× khi xö lý plasmit t¸i tæ hîp vµ pGEM-4Z-Ubi-cryIA(c) ban ®Çu b»ng çc enzym Hind III vµ BamH I, s¶n phÈm sÏ lµ çc ®o¹n ADN t-¬ng ®ång hoÆc t¬ng øng víi toµn bé kÕt cÊu gen, hay t¬ng øng víi ®o¹n khëi ®éng Ubiquitin, hoÆc vïng mang m· cña gen cry. Trªn c¬

90

së nµy, chóng t«i ®· kiÓm tra cÊu tróc cña çc plasmit cã kÝch thíc lín h¬n b»ng çch c¾t ®¬n víi enzym Hind III, BamH I vµ c¾t kÐp víi Hind III + BamH I. Sau ®ã ®iÖn di ®ång thêi víi mÉu plasmit pGEM-4Z-Ubi-cryIA(c) còng c¾t b»ng çc enzym nµy (h×nh 3.15).

KÕt qu¶ trªn h×nh 3.15 cho thÊy, çc s¶n phÈm c¾t enzym h¹n chÕ cña pGEM4Z-Ubi-cryIA(c) vµ Ti-plasmit t¸i tæ hîp cã sù t-¬ng ®ång:

Trêng hîp c¾t bëi Hind III, ®Òu xuÊt hiÖn mét b¨ng cã kÝch thíc kho¶ng 4,1 kb (cét 2, 3). §©y chÝnh lµ kÕt cÊu gen Ubi-cryIA(c).

S¶n phÈm khi xö lý BamH I lµ mét b¨ng kÝch thíc kho¶ng 2 kb t-¬ng øng víi ®o¹n khëi ®éng Ubiquitin (cét 4, 5).

Hai b¨ng t¬ng ®ång khi c¾t bëi Hind III vµ BamH I cã kÝch thíc kho¶ng 2 kb vµ 2,1 kb (cét 6, 7).

Nh÷ng kÕt qu¶ trªn kh¼ng ®Þnh chóng t«i ®· ®a ®îc kÕt cÊu gen Ubi-cryIA(c)-NOST vµo Ti-plasmit vµ t¹o ®îc Ti-plasmit t¸i tæ hîp pC1300-Ubi-cryIA(c) (h×nh 3.16) trong tÕ bµo E. coli

91

H×nh 3.15. KiÓm tra cÊu tróc cña plasmit t¸i tæ hîp pC1300-Ubi-cryIA(c)

1. ADN / Hind III + EcoR I 2. pGEM4Z-Ubi-cryIA(c)/ Hind III3. pC1300-Ubi-cryIA(c)/ Hind III4. pGEM4Z-Ubi-cryIA(c)/ BamH I5. pC1300-Ubi-cryIA(c)/ BamH I6. pGEM4Z-Ubi-cryIA(c)/ Hind III + BamH I7. pC1300-Ubi-cryIA(c)/ Hind III + BamH I

H×nh 3.16. Plasmit t¸i tæ hîp pC1300-Ubi-cryIA(c)

(chñng HB101). Dßng çc tÕ bµo E. coli chøa pC1300-Ubi-cryIA(c) ®îc chóng t«i b¶o qu¶n trong glycerol, ë -750C vµ sö dông lµm nguyªn liÖu ®Ó chuyÓn plasmit nµy vµo A. tumefaciens.

3.2.2 ThiÕt kÕ Ti-plasmit t¸i tæ hîp chøa gen cryIA(c) khuyÕt ®o¹n khëi ®éng

§o¹n khëi ®éng Ubiquitin trong cÊu tróc Ubi-cryIA(c) lµ ®o¹n khëi ®éng t¸ch tõ c©y ng«, ho¹t ®éng rÊt m¹nh trong c©y mét l¸ mÇm. Trong çc nghiªn cøu chuyÓn gen trªn ®èi tîng c©y mét l¸ mÇm, Ubi-P ®îc sö dông nhiÒu h¬n CaMV35S-P [55]. Tuy nhiªn, chóng ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn gen ë rÊt nhiÒu m« lóa kh¸c nhau [59]. Nh»m khèng chÕ ph¹m vi ¶nh hëng cña protein tinh thÓ ®éc tè lªn nh÷ng loµi c«n trïng cã Ých, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thÝ nghiÖm t¸ch ®o¹n khëi ®éng nµy khái vect¬ pC1300-Ubi-cryIA(c) t¹o c¬ së ®Ó thiÕt kÕ vect¬ mang gen cryIA(c) díi sù ®iÒu khiÓn cña çc lo¹i ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu nh C71S-P do chóng t«i ph©n lËp ®îc. Nh»m t¨ng cêng kh¶ n¨ng biÓu hiÖn gen còng nh gi¶m çc ¶nh hëng bÊt lîi, gen kh¸ng c«n trïng cÇn ®îc biÓu hiÖn ë nh÷ng m« thùc vËt lµ nguån thøc ¨n cña c«n trïng g©y h¹i díi sù ®iÒu khiÓn cña çc ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu thùc vËt [173].

Chñng E. coli HB101 chøa plasmit pC1300-Ubi-cryIA(c) mang nguån gen cry ®îc nu«i cÊy l¾c ë 370C trªn m«i trêng chän läc LB cã bæ sung 50 g/ ml Km ®Ó tiÕn hµnh t¸ch chiÕt ADN plasmit. B¶n ®å enzym h¹n chÕ cña pC1300-Ubi-cryIA(c) cho thÊy Ubi-P, kÝch thíc 2020 bp, cã thÓ bÞ c¾t ra khi ADN plasmit ®îc xö lý b»ng BamH I. Dùa trªn kÕt qu¶ ph©n tÝch nµy, chóng t«i ®· t¸ch chiÕt lîng lín ADN plasmit vµ sö dông BamH I ®Ó lo¹i Ubi-P. §iÖn di

92

s¶n phÈm ADN plasmit sau khi xö lý enzym, thu håi ph©n ®o¹n ADN bao gåm vect¬ pCAMBIA1300 khuyÕt Ubi-P b»ng ph¬ng ph¸p ®iÖn di ®Èy ra khái gel trong tói thÈm tÝch nhê ®iÖn trêng ®Ó tiÕn hµnh ghÐp nèi trë l¹i vµ biÕn n¹p vµo tÕ bµo E. coli. Trªn m«i trêng LB + Km chän läc, chóng t«i ®· thu ®îc kh¸ nhiÒu khuÈn l¹c vµ ®· tiÕn hµnh t¸ch chiÕt ADN plasmit cña çc khuÈn l¹c nµy.

Sau ®ã, chóng t«i ®· c¾t plasmit t¸i tæ hîp b»ng hai enzym lµ Hind III vµ BamH I. Theo tÝnh to¸n lý thuyÕt, nÕu ®o¹n khëi ®éng Ubiquitin ®· bÞ lo¹i, s¶n phÈm ®iÖn di chØ xuÊt hiÖn hai b¨ng: b¨ng 8958 bp t¬ng øng víi vect¬ pCAMBIA1300 vµ b¨ng 2125 bp t¬ng øng víi kÕt cÊu gen cryIA(c) khuyÕt Ubi-P. KÕt qu¶ ph©n tÝch enzym h¹n chÕ cña çc Ti-plasmit pC1300-cryIA(c) dßng sè 1, 2 vµ 3 ®îc tr×nh bµy trªn h×nh 3.17.

Kªnh 2, 4 vµ 5 ngoµi b¨ng t¬ng øng víi vect¬ pCAMBIA1300 (kÝch thíc kho¶ng 9 kb), chØ cßn l¹i mét b¨ng duy nhÊt kho¶ng 2,1 kb bao gåm ®o¹n gen cÊu tróc cryIA(c) vµ ®o¹n kÕt thóc NOS. Nh vËy, chóng t«i ®· thµnh c«ng trong viÖc c¾t Ubi-P ra khái vect¬ pCAMBIA1300 chøa kÕt cÊu gen cryIA(c). Chóng t«i ®· tiÕn hµnh t¸ch chiÕt ADN plasmit lîng lín ®Ó chuÈn bÞ cho bíc thiÕt kÕ vect¬ míi mang C71S-P.

93

H×nh 3.17. ThiÕt kÕ Ti-plasmit t¸i tæ hîp mang gen cry khuyÕt ®o¹n khëi ®éng

1. ADN / Hind III + EcoR I2. pC1300-Ubi-cryIA(c)3. pC1300-cryIA(c) 1/ Hind III + BamH I4. pC1300-cryIA(c) 25. pC1300-cryIA(c) 2/ Hind III + BamH I6. pC1300-cryIA(c) 3/ Hind III + BamH I

3.2.3ThiÕt kÕ Ti-plasmit t¸i tæ hîp chøa gen cryIA(c) díi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ë gièng lóa C71

Víi môc ®Ých sö dông ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza ®Æc hiÖu bã m¹ch cña c©y mét l¸ mÇm ®Ó ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn gen cryIA(c), chóng t«i ®· tiÕn hµnh thiÕt kÕ vect¬ vµ t¹o chñng E. coli mang C71S-P ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn gen nµy.

3.2.3.1 ThiÕt kÕ vect¬ pCAMBIA1300 chøa kÕt cÊu gen C71S-P-cryIA(c)

Rao & ®tg [163] ®· dïng Rsuc1-P ®Ó ®iÒu khiÓn qu¸ tr×nh biÓu hiÖn gen lectin cña c©y hoa ®iÓm tuyÕt ë lóa. Sö dông kü thuËt ®Þnh vÞ miÔn dÞch huúnh quang protein (immunohistochemical localization), nhãm nghiªn cøu trªn ®· kh¼ng ®Þnh r»ng ®o¹n khëi ®éng nµy ®· ®iÒu khiÓn sù biÓu hiÖn ®Æc hiÖu cña GNA bã m¹ch cña c©y lóa chuyÓn gen mµ kh«ng biÓu hiÖn ë nh÷ng n¬i kh¸c. KÕt qu¶ t¬ng tù nhËn ®îc khi Sudhakar & ®tg sö dông Rsuc1-P ®Ó ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn gen trong mét sè gièng lóa ch©u ¸ [184]. ¦u ®iÓm cña Rsuc1-P lµ c¬ së ®Ó chóng t«i thiÕt kÕ kÕt cÊu gen C71S-P-cryIA(c) vµ chuyÓn vµo lóa nh»m t¹o c©y lóa cã kh¶ n¨ng kh¸ng s©u ®ôc th©n chØ khu tró t¹i m« c©y bÞ h¹i.

C71S-P n»m trong vect¬ t¹o dßng pUC118. C71S-P ®îc g¾n trùc tiÕp vµo pUC118 t¹i vÞ trÝ Hinc II. Bªn tr¸i vÞ trÝ nhËn biÕt nµy trong vect¬ pUC118 cã mét ®iÓm c¾t cña BamH I. Trong tr×nh tù cña ®o¹n måi dïng ®Ó nh©n C71S-P, chóng t«i còng ®· thiÕt kÕ thªm mét ®iÓm c¾t cña BamH I. Do vËy, toµn bé ®o¹n khëi ®éng nµy sÏ ®îc t¸ch ra khái vect¬ t¹o dßng khi xö lý pUC118-C71S-P b»ng enzym BamH I.

94

S¶n phÈm c¾t cña pUC118-C71S-P/ BamH I ®îc ®iÖn di trªn gel agaroza nång ®é thÊp 0,7% nh»m t¸ch rêi b¨ng chøa C71S-P vµ b¨ng chøa pUC118. Sau ®ã, chóng t«i thu håi C71S-P vµ dïng lµm nguyªn liÖu cho ph¶n øng g¾n vµo Ti-plasmit pCAMBIA1300-cryIA(c) tríc ®ã ®· ®îc xö lý víi mét lîng lín còng b»ng BamH I vµ lo¹i bá nhãm phosphat.

S¶n phÈm g¾n nèi pC1300-C71S-P-cryIA(c) ®îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo E. coli (chñng DH5) theo ph¬ng ph¸p sèc nhiÖt víi sù chän läc trªn m«i trêng LB cã chøa 50 g/ ml Km. Môc ®Ých cña qu¸ tr×nh biÕn n¹p nµy nh»m chän läc vµ nh©n plasmit lªn trong E. coli t¹o lîng lín ®Ó chuyÓn vµo vi khuÈn A. tumefaciens. KÕt qu¶ cho thÊy cã 50 khuÈn l¹c xuÊt hiÖn trªn hai ®Üa petri chøa m«i tr-êng LB + Km (chóng t«i ký hiÖu çc khuÈn l¹c nµy lµ TiC71S1TiC71S50). Tõ çc khuÈn l¹c thu ®îc, chóng t«i ®· t¸ch chiÕt Ti-plasmit vµ c¾t kiÓm tra b»ng enzym h¹n chÕ. H×nh 3.23 lµ kÕt qu¶ ph©n tÝch b»ng BamH I cña ADN plasmit t¸ch tõ mét sè khuÈn l¹c. ë çc khuÈn l¹c TiC71S15, TiC71S16, TiC71S20, TiC71S31, TiC71S32 (kªnh 4, 5, 7, 11, 12, h×nh 3.18) kh«ng cã sù ghÐp nèi cña C71S-P vµo vect¬. Trong khi ®ã, râ rµng lµ çc s¶n

95

H×nh 3.18. Çc dßng plasmit t¸i tæ hîp pC1300-C71S-cryIA(c)

1. ADN / Hind III + EcoR I 7. pTiC71S20/ BamH I

2. pC1300-cryIA(c)/ BamH I 8. pTiC71S24/ BamH I

3. C71S-P 9. pTiC71S27/ BamH I

phÈm c¾t cña pTiC71S17, pTiC71S24, pTiC71S27 vµ pTiC71S30 (kªnh 6, 8, 9, 10, h×nh 3.18) gåm hai b¨ng cã kÝch thíc kho¶ng 11 kb vµ 2 kb t¬ng øng víi plasmit pC1300-cryIA(c) ë d¹ng m¹ch th¼ng vµ ®o¹n C71S-P ®óng nh tÝnh to¸n lý thuyÕt. Chóng t«i ®· sö dông çc khuÈn l¹c mang vect¬ pC1300-C71S-cryIA(c) ®Ó kiÓm tra chiÒu g¾n cña ®o¹n khëi ®éng nµy trong vect¬.

3.2.3.2 KiÓm tra chiÒu g¾n cña ®o¹n khëi ®éng C71S-P trong Ti-plasmit t¸i tæ hîp pC1300-C71S-cryIA(c)

Çc Ti-plasmit cã chøa C71S-P nh pTiC71S17, pTiC71S24, pTiC71S27 vµ pTiC71S30 tiÕp tôc ®îc kiÓm tra b»ng çch xö lý víi Pst I. Vect¬ pCAMBIA1300 kh«ng cã ®iÓm nhËn biÕt cña Pst I. Tuy nhiªn, trong tr×nh tù ®o¹n C71S-P cã hai vÞ trÝ c¾t cña Pst I vµ trong tr×nh tù gen cryIA(c) còng cã hai vÞ trÝ c¾t cña enzym nµy. S¶n phÈm c¾t theo tÝnh to¸n lý thuyÕt ®îc tr×nh bµy trªn h×nh 3.19.

Tr êng hîp g¾n xu«i chiÒu (h×nh 3.19a):

S¶n phÈm c¾t bëi Pst I cña pC1300-C71S-cryIA(c) sÏ lµ bèn b¨ng víi çc kÝch thíc nh sau:

1. 938 bp: B¨ng t¬ng øng víi ®o¹n tr×nh tù n»m trong C71S-P.

2. 2262 bp (828 bp + 1434 bp): B¨ng t¬ng øng víi mét phÇn ®o¹n C71S-P (828 bp) vµ mét phÇn ®o¹n gen cryIA(c) (1434 bp)

3. 360 bp: §©y lµ mét phÇn cña gen cÊu tróc cryIA(c).

96

4. 9433 bp (8958 bp +175 bp + 300 bp): Bao gåm toµn bé vect¬ pCAMBIA1300 (8958 bp), phÇn cßn l¹i cña C71S-P (175 bp) vµ phÇn kÕt thóc cña gen cryIA(c) (~300 bp).

Tr êng hîp g¾n ng îc chiÒu (h×nh 3.19b):

S¶n phÈm c¾t bëi Pst I cña pC1300-C71S-cryIA(c) còng sÏ lµ bèn b¨ng nhng víi çc kÝch thíc nh sau:

1. 938 bp: B¨ng t¬ng øng víi ®o¹n tr×nh tù n»m trong C71S-P.

2. 1609 bp (175 bp + 1434 bp): B¨ng t¬ng øng víi mét phÇn ®o¹n C71S-P (175 bp) vµ mét phÇn ®o¹n gen cryIA(c) (1434 bp).

3. 360 bp: §©y lµ mét phÇn cña gen cÊu tróc cryIA(c).

4. 10086 bp (8958 bp +828 bp + 300 bp): Bao gåm toµn bé vect¬ pCAMBIA1300 (8958 bp), mét phÇn cña C71S-P (828 bp) vµ phÇn kÕt thóc cña gen cryIA(c) (~300 bp).

97

H×nh 3.20. KiÓm tra chiÒu g¾n cña C71S-P trong pC1300-C71S-cryIA(c)

1. ChØ thÞ ph©n tö 1 kb 4. pTiC71S8/ Pst I

H×nh 3.19. S¬ ®å x¸c ®Þnh chiÒu g¾n cña C71S-P trong pC1300-C71S-cryIA(c)

a. C71S-P g¾n xu«i chiÒu so víi cryIA(c)b. C71S-P g¾n ngîc chiÒu so víi cryIA(c)

Râ rµng, sù kh¸c biÖt gi÷a hai çch g¾n chñ yÕu ®îc nhËn biÕt th«ng qua sù xuÊt hiÖn cña b¨ng ADN cã kÝch thíc kho¶ng 2,3 kb (çch g¾n xu«i chiÒu) vµ b¨ng kho¶ng 1,6 kb (çch g¾n ngîc chiÒu). KÕt qu¶ thÝ nghiÖm trªn h×nh 3.20 cho thÊy, ë çc plasmit t¸i tæ hîp pTiC71S8 (cét 4) vµ pTiC71S24 (cét 6), C71S-P ®· ®îc g¾n vµo trong vect¬ pC1300-cryIA(c) theo kiÓu xu«i chiÒu so víi gen cryIA(c). Trong khi, ë çc plasmit t¸i tæ hîp pTiC71S17 (cét 3), pTiC71S23 (cét 5), pTiC71S24 (cét 6), ®o¹n khëi ®éng nµy ®· ®îc g¾n theo kiÓu ngîc chiÒu.

Nh vËy, chóng t«i ®· thiÕt kÕ ®îc Ti-plasmit t¸i tæ hîp pC1300-C71S-cryIA(c). Çc dßng tÕ bµo E. coli t¸i tæ hîp nµy còng ®îc chóng t«i gi÷ trong glycerol, ë -750C ®Ó lµm nguyªn liÖu chuyÓn plasmit nµy vµo vi khuÈn A. tumefaciens.

Còng cÇn nhÊn m¹nh r»ng, khi chóng t«i tiÕn hµnh thiÕt kÕ çc vect¬ Ti-plasmit mang gen cry, t¹i ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp nhãm nghiªn cøu cña §Æng Träng L¬ng còng ®· tiÕn hµnh ®a gen cryIA(c) vµo vect¬ hai nguån pART27 vµ chuyÓn vµo chñng A. tumefaciens GV2260. Trong ®ã, gen cry ®îc ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn bëi ®o¹n khëi ®éng CaMV35S t¸ch tõ vect¬ pART7 [14], [15]. CaMV35S-P lµ ®o¹n khëi ®éng d¹ng c¬ ®Þnh ho¹t ®éng m¹nh trong c©y hai l¸ mÇm vµ thêng ®îc sö dông trong çc nghiªn cøu chuyÓn gen vµo c©y hai l¸ mÇm. Trong c©y mét l¸ mÇm, CaMV35S-P còng ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn gen nhng víi møc ®é ho¹t ®éng kÐm h¬n [59]. Nghiªn cøu cña Datta & ®tg cho thÊy, møc ®é biÓu hiÖn cña protein CryIA(b) ë l¸ vµ th©n díi sù ®iÒu khiÓn cña CaMV35S-P vµ ®o¹n khëi ®éng cña gen actin1 (actin1-P) ë lóa kh¸c nhau kh«ng ®¸ng kÓ [62], [143]. Chóng ®Òu ®iÒu khiÓn gusA biÓu hiÖn kh¸ m¹nh ë nhiÒu

98

lo¹i m« nh rÔ, l¸ vµ h¹t (b¶ng 3.12) [179]. Nh vËy, sö dông çc ®o¹n khëi ®éng nµy cã thÓ t¹o ra protein t¸i tæ hîp kh«ng ®Þnh híng. Trong mét sè trêng hîp khi ®o¹n khëi ®éng c¬ ®Þnh ®iÒu khiÓn s¶n sinh protein ®éc tè Cry ë nh÷ng bé phËn cña thùc vËt, n¬i kh«ng bÞ s©u h¹i tÊn c«ng, cã thÓ g©y h¹i ®Õn quÇn thÓ c«n trïng cã Ých.

B¶ng 3.12. Møc ®é biÓu hiÖn cña CaMV35S-P - gusA vµ Adh1-P - gusA

ë m« lóa chuyÓn gen [179]

M« CaMV35S-P - gusA

Adh1-P - gusA

RÔ + + + + + L¸ + + + +

HoaBao phÊn _ + +Vßi nhÞ _ + + +

PhÊn hoa _ + +BÇu nhuþ _ _

H¹t Ph«i + + + + +Néi nhò + + + +

ë ViÖt Nam, ngoµi §Æng Träng L¬ng & ®tg, nhãm nghiªn cøu cña NguyÔn V¨n UyÓn t¹i ViÖn Sinh häc NhiÖt §íi, Thµnh phè Hå ChÝ Minh còng ®· t¹o ®îc çc c©y thuèc l¸, ®Ëu xanh, c¶i b«ng, c¶i xanh vµ c©y cµ tÝm b»ng ph¬ng ph¸p chuyÓn gen sö dông vi khuÈn A. tumefaciens chñng EHA105 [19], [20], [21], [22], [24]. HÇu hÕt, çc c©y trång biÕn ®æi di truyÒn nµy mang gen bar, gen cryIA(c) vµ gen chØ thÞ gusA cã nguån gèc tõ plasmit pITB2 ®· ®îc thiÕt kÕ s½n. Ti-plasmit t¸i tæ hîp nh pITB2 mang

99

®ång thêi hai gen chØ thÞ (gen bar kh¸ng chÊt diÖt cá vµ gen gusA) thêng chØ ®îc sö dông trong çc nghiªn cøu ban ®Çu nh»m hoµn thiÖn ph¬ng ph¸p chuyÓn gen cho tõng ®èi tîng c©y trång nhÊt ®Þnh. Nh vËy, nh÷ng kÕt qu¶ t¹o Ti-plasmit t¸i tæ hîp ®îc tr×nh bµy trong c«ng tr×nh nµy lµ nh÷ng kÕt qu¶ míi, rÊt cã ý nghÜa vÒ mÆt khoa häc vµ thùc tiÔn s¶n xuÊt, phôc vô cho çc nghiªn cøu s©u h¬n vÒ chuyÓn gen thùc vËt ë níc ta.

MÆt kh¸c, trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y, gen m· ho¸ protein tinh thÓ ®éc tè cña Bt víi rÊt nhiÒu u ®iÓm ®· ®îc nghiªn cøu vµ chuyÓn thµnh c«ng vµo rÊt nhiÒu loµi c©y trång. Thö nghiÖm ®ång ruéng ®Çu tiªn cña cµ chua chuyÓn gen cry ®· ®îc C«ng ty Monsanto, Sandoz vµ Agrogenetics tiÕn hµnh ë Mü vµo n¨m 1988. Sau ®ã, Crop Genetics International, Agracetus, Calgen…tiÕp tôc çc thö nghiÖm ®ång ruéng trªn ng«, thuèc l¸, khoai t©y. Nhê kh¶ n¨ng kh¸ng c«n trïng ®Æc hiÖu, tõ n¨m 1996 c©y b«ng chuyÓn gen cryIA(c) cña Bt ®· ®îc ®a vµo s¶n xuÊt ®¹i trµ [182]. Nh vËy, víi ®o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu bã m¹ch lÇn ®Çu tiªn ®îc ph©n lËp vµ ®a vµo sö dông ë ViÖt Nam, kh¶ n¨ng t¹o ra lóa vµ çc c©y trång kh¸c mang gen kh¸ng s©u nh cry ®îc biÓu hiÖn ®Æc hiÖu ë nh÷ng vÞ trÝ mong muèn cã thÓ trë thµnh hiÖn thùc.

3.2.4 ThiÕt kÕ vect¬ chän läc tÝch cùc mang kÕt cÊu gen Ubi-cryIA(c)

ViÖc chän läc/ sµng läc çc thÓ t¸i tæ hîp th«ng thêng cÇn sù cã mÆt cña çc gen chØ thÞ nh çc gen kh¸ng kh¸ng sinh, chÊt diÖt cá.... Nh»m tr¸nh sö dông çc gen kh¸ng kh¸ng sinh nµy, hÖ thèng chØ thÞ chän läc tÝch cùc “Positech” rÊt míi cña C«ng ty Syngenta ®· dùa trªn gen m· ho¸ phosphomannoza isomeraza

100

(PMI) lµm chØ thÞ vµ chän läc çc thÓ sau biÕn n¹p nhê kh¶ n¨ng sinh trëng trªn m«i trêng chøa mannoza [33].

Trªn c¬ së Ubi-cryIA(c)-NOST vµ vect¬ chän läc tÝch cùc pNOV2819 nhËn ®îc tõ C«ng ty Syngenta, chóng t«i ®· tiÕn hµnh thiÕt kÕ plasmit t¸i tæ hîp mang gen cry. Vect¬ pNOV2819 víi nhiÒu vÞ trÝ c¾t duy nhÊt cña enzym h¹n chÕ gióp dÔ dµng ®a çc gen quan t©m vµo. Chóng chøa chØ thÞ chän läc vi khuÈn lµ gen kh¸ng Spectinomycin 50 μg/ ml n»m ngoµi ®o¹n biªn ph¶i vµ tr¸i. §èi víi chØ thÞ chän läc thùc vËt, gen m· ho¸ PMI kÝch thíc 514 bp ®îc ®o¹n khëi ®éng d¹ng c¬ ®Þnh CMPS (Cestrium Yellow Leaf Curling Virus) ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn m¹nh ë çc c©y trång thö nghiÖm nh: ng«, lóa, lóa mú, ®Ëu t¬ng, thuèc l¸, cµ chua, h-íng d¬ng vµ c©y cµ. Víi cÆp måi ®Æc hiÖu ®Ó tiÕn hµnh PCR x¸c ®Þnh sù cã mÆt cña gen m· ho¸ PMI: PMI-1 5’-ACAGCCACTCTCCATTCA-3’, PMI-2 5’-GTTTGCCATCACTTCCAG-3’, plasmit t¸i tæ hîp dÔ dµng ®îc ph¸t hiÖn trong çc thÓ t¸i tæ hîp. Vïng MCS cña pNOV2819 cã vÞ trÝ c¾t cña enzym Hind III, do vËy, toµn bé kÕt cÊu gen Ubi-cryIA(c)-NOST cã nguån gèc tõ plasmit pC1300-Ubi-cryIA(c) ®îc chóng t«i ®a vµo vect¬ pNOV2819 díi d¹ng ®o¹n Hind III, kÝch thíc 4,1 kb. S¬ ®å thÝ nghiÖm ®îc tr×nh bµy trªn h×nh 3.21.

101

H×nh 3.22. KÕt qu¶ thiÕt kÕ vect¬ chän läc tÝch cùc pNOV-Ubi-cryIA(c)

1. pC1300-Ubi-cryIA(c)/ Hind III2. pNOV-Ubi-cryIA(c)/ Hind III3. ChØ thÞ ph©n tö 1 kb4. pNOV-Ubi-cryIA(c)/ EcoR I

H×nh 3.21. S¬ ®å thiÕt kÕ vect¬ chän läc tÝch cùc pNOV-Ubi-cryIA(c)

Plasmit t¸i tæ hîp sau khi thiÕt kÕ ®îc biÕn n¹p vµo chñng E. coli DH5α. Trªn m«i trêng LB cã bæ sung Spectinomycin, chóng t«i ®· thu ®îc kh¸ nhiÒu khuÈn l¹c vµ ®· tiÕn hµnh t¸ch chiÕt ADN plasmit cña çc khuÈn l¹c nµy. Sau khi s¬ bé sµng läc çc dßng mang plasmit kÝch thíc lín h¬n pNOV2819, chóng t«i ®· xö lý enzym h¹n chÕ. MÉu ®èi chøng lµ plasmit pC1300-Ubi-cryIA(c) c¾t bëi çc enzym t¬ng øng. Theo tÝnh to¸n lý thuyÕt, b¨ng t¬ng øng xuÊt hiÖn ®ång thêi ë mÉu ®èi chøng vµ thÝ nghiÖm khi xö lý b»ng EcoR I cã kÝch thíc kho¶ng 2,2 kb (bao gåm kÝch thíc cña gen cryIA(c) vµ mét phÇn cña ®o¹n khëi ®éng Ubiquitin). S¶n phÈm c¾t t¬ng øng bëi Hind III cã kÝch thíc kho¶ng 4,1kb (kÝch thíc cña kÕt cÊu gen Ubi-cryIA(c)-NOST). KÕt qu¶ trªn h×nh 3.22 hoµn toµn phï hîp víi tÝnh to¸n lý thuyÕt, chøng tá chóng t«i ®· ®-a ®îc kÕt cÊu gen cry vµo vect¬ pNOV2819 vµ t¹o ®îc plasmit t¸i tæ hîp pNOV-Ubi-cryIA(c).

3.3 T¹o çc chñng A. tumefaciens mang çc vect¬ Ti-plasmit chøa gen kh¸ng c«n trïng ®Ó chuyÓn vµo c©y trång

Ph¬ng ph¸p chuyÓn gen th«ng qua vi khuÈn A. tumefaciens võa cho hiÖu qu¶ cao, ®¬n gi¶n, Ýt tèn kÐm nªn ®îc chóng t«i chän lùa ®Ó chuyÓn çc kÕt cÊu gen thiÕt kÕ ®îc vµo lóa, ng« vµ mét sè c©y trång kh¸c. Nh chóng ta ®· biÕt, Ti-plasmit t¸i tæ hîp cã thÓ ®îc chuyÓn vµo A. tumefaciens b»ng ph¬ng ph¸p trùc tiÕp

102

nhê sèc nhiÖt sö dông CaCl2 hoÆc xung ®iÖn hay b»ng ph¬ng ph¸p gi¸n tiÕp nh ph¬ng ph¸p phèi ba bè mÑ [71]. HiÖu qu¶ chuyÓn gen vµo tÕ bµo A. tumefaciens kh¸ thÊp so víi tÕ bµo E. coli khi sö dông cïng mét ph¬ng ph¸p biÕn n¹p. ChØ khi ph¬ng ph¸p xung ®iÖn ®îc ®a vµo øng dông, hiÖu qu¶ chuyÓn Ti-plasmit vµo tÕ bµo A. tumefaciens ®· t¨ng lªn nhiÒu lÇn [141], [197]. Trong c«ng tr×nh nµy, nh»m môc ®Ých chuyÓn çc Ti-plasmit vµo chñng A. tumefaciens chñ, chóng t«i ®· tiÕn hµnh ®ång thêi ph¬ng ph¸p phèi ba bè mÑ vµ ph¬ng ph¸p xung ®iÖn nh»m ®¸nh gi¸ vµ chän lùa ph¬ng ph¸p phï hîp víi ®iÒu kiÖn nghiªn cøu vµ øng dông cña ViÖt Nam.

3.3.1 T¹o chñng A. tumefaciens mang çc Ti-plasmit t¸i tæ hîp pC1300-Ubi-cryIA(c)/ pC1300-C71S-cryIA(c) b»ng ph¬ng ph¸p xung ®iÖn

Ph¬ng ph¸p chuyÓn gen trùc tiÕp vµo tÕ bµo A. tumefaciens qua xung ®iÖn hay sèc nhiÖt ®Òu cÇn t¹o tÕ bµo kh¶ biÕn. MÆc dï ph¬ng ph¸p sèc nhiÖt tiÕn hµnh kh¸ ®¬n gi¶n nhng hiÖu qu¶ t-¬ng ®èi thÊp nªn víi çc thiÕt bÞ cña Phßng m¸y chung cña ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, chóng t«i ®· sö dông ph¬ng ph¸p xung ®iÖn ®Ó chuyÓn Ti-plasmit mang çc kÕt cÊu gen thiÕt kÕ ®îc vµo tÕ bµo A. tumefaciens.

§Ó cã tÕ bµo kh¶ biÕn A. tumefaciens, chóng t«i ®· tiÕn hµnh nu«i cÊy l¹i çc chñng vi khuÈn trªn m«i trêng th¹ch ®Æc YEP tríc khi cÊy chuyÓn liªn tiÕp hai lÇn sang m«i trêng láng cã bæ sung 0,1 % glucoza.

Sau khi xö lý b»ng xung ®iÖn (ë ®iÒu kiÖn 25 F; 400 ; 2,42 kV; 8-10 ms), mÉu thÝ nghiÖm vµ ®èi chøng ®Òu ®îc phôc

103

håi ngay trong m«i trêng t¨ng cêng. Trªn çc m«i trêng chän läc (YEP + Km cho chñng EHA105 vµ YEP + Km + Rifampicin (Rf) + Carbenicillin (Cb) cho chñng LBA4404) sau hai ngµy nu«i cÊy, chóng t«i ®· thu ®îc kh¸ nhiÒu khuÈn l¹c. H×nh 3. 23 lµ kÕt qu¶ xung ®iÖn chuyÓn Ti-plasmit t¸i tæ hîp pC1300-Ubi-cryIA(c) vµo tÕ bµo A. tumefaciens chñng EHA105.

H×nh 3.23. KÕt qu¶ xung ®iÖn t¹o chñng A. tumefaciens EHA105

chøa pC1300-Ubi-cryIA(c)

Çc khuÈn l¹c A. tumefaciens t¹o ®îc nhê xung ®iÖn cã chøa Ti-plasmit t¸i tæ hîp ®îc ph¸t hiÖn b»ng ph¬ng ph¸p chän läc trªn m«i trêng ®Æc hiÖu, t¸ch chiÕt ADN plasmit, biÕn n¹p trë l¹i tÕ bµo E. coli vµ tiÕn hµnh çc thÝ nghiÖm ph©n tÝch ph©n tö tiÕp theo. Së dÜ cÇn ph¶i thùc hiÖn bíc biÕn n¹p trë l¹i ADN plasmit vµo trong tÕ bµo vi khuÈn E. coli v× sè lîng b¶n sao cña plasmit t¸i tæ hîp nµy trong tÕ bµo Agrobacterium rÊt Ýt, kh«ng ®ñ ®Ó tiÕn hµnh çc thÝ nghiÖm kiÓm tra sù cã mÆt cña çc kÕt cÊu gen ®a vµo. ChØ trong mét sè trêng hîp, lîng ADN plasmit trong tÕ bµo A. tumefaciens ®ñ ®Ó c¾t enzym h¹n chÕ vµ ®iÖn di sö dông çc kü thuËt sinh häc ph©n tö th«ng thêng cña Sambrook & ®tg [197].

Ngoµi ra, chóng t«i còng tiÕn hµnh PCR. §©y lµ ph¬ng ph¸p ®¬n gi¶n cho phÐp kh¼ng ®Þnh vµ x¸c ®Þnh chÝnh x¸c cÊu tróc cña plasmit t¸i tæ hîp ®îc biÕn n¹p vµo A. tumefaciens. Gièng nh çc PCR th«ng thêng, hiÖu qu¶ ph¶n øng phô thuéc vµo rÊt nhiÒu yÕu tè: tr×nh tù måi, nång ®é Mg+, nhiÖt ®é vµ thêi gian cña çc

104

chu kú ph¶n øng… Theo Walkerpeach & Velten, cÆp måi ®Ó nh©n CaMV35S-P vµ NOST chøng minh sù cã mÆt cña plasmit t¸i tæ hîp trong Agrobacterium vµ tÕ bµo thùc vËt chuyÓn gen lµ cÆp måi ®îc sö dông nhiÒu vµ cho hiÖu qu¶ rÊt cao [197].

CaMV35SP: 5’- TCTGTCACTTCATCAAAAGGACAG-3’

NOST: 5’- GAATCCTGTTGCCGTCTTG-3’

Víi cÆp måi nh©n C71S-P cã s½n, chóng t«i ®· tiÕn hµnh nh©n ®o¹n khëi ®éng nµy ë cÊu tróc gen míi thiÕt kÕ ®îc sö dông ADN khu«n lµ plasmit t¸i tæ hîp t¸ch chiÕt tõ tÕ bµo A. tumefaciens. KÕt qu¶ PCR trªn h×nh 3. 24 cho thÊy, chóng t«i ®· ®a ®îc plasmit t¸i tæ hîp pC1300-C71S-cryIA(c) vµo trong tÕ bµo A. tumefaciens. Çc dßng sau biÕn n¹p ®îc chóng t«i lu gi÷ dïng lµm nguyªn liÖu ®Ó chuyÓn vµo c©y trång.

Nh vËy, chóng t«i ®· nhËn ®îc çc dßng vi khuÈn A. tumefaciens chñng EHA105 vµ LBA4404 cã chøa plasmit t¸i tæ hîp pC1300-Ubi-cryIA(c)/ pC1300-C71S-cryIA(c) dïng lµm nguyªn liÖu ®Ó chuyÓn gen cry vµo lóa.

3.3.2T¹o chñng A. tumefaciens mang Ti-plasmit t¸i tæ hîp pC1300-Ubi-cryIA(c)/ pC1300-C71S-P-cryIA(c) b»ng ph-¬ng ph¸p phèi ba bè mÑ

105

H×nh 3.24. KiÓm tra sù cã mÆt cña Ti-plasmit t¸i tæ hîp

pC1300-C71S-cryIA(c) trong tÕ bµo A. tumefaciens

Ph¬ng ph¸p phèi ba bè mÑ thêng ®îc sö dông ®Ó chuyÓn çc vect¬ Ti-plasmit, ®Æc biÖt lµ vect¬ liªn hîp, tõ tÕ bµo E. coli sang tÕ bµo A. tumefaciens. Chóng t«i ®· sö dông quy tr×nh phèi ba bè mÑ theo m« t¶ cña Van Haute & ®tg [190] víi mét vµi c¶i biÕn nhá ®Ó chuyÓn çc Ti-plasmit t¸i tæ hîp tõ tÕ bµo E. coli sang tÕ bµo A. tumefaciens. Trong trêng hîp chuyÓn pC1300-Ubi-cryIA(c), ba chñng vi khuÈn chóng t«i sö dông trong tiÕp hîp lµ:

(1)Chñng E. coli HB101 mang plasmit pRK2013 ®¶m nhËn chøc n¨ng trî gióp;

(2)Chñng E. coli HB101 mang vect¬ pC1300-Ubi-cryIA(c);

(3)Chñng A. tumefaciens nhËn: LBA4404 (pGA3850) hoÆc EHA105. Trong trêng hîp nµy, chóng t«i kh«ng sö dông chñng EHA101 ®Ó tiÕp hîp do chóng mang chØ thÞ chän läc (gen kh¸ng Km) t¬ng ®ång víi chØ thÞ chän läc cña pC1300-Ubi-cryIA(c). TÝnh kh¸ng Km trïng nhau nªn kh«ng thÓ chän läc ®îc çc dßng A. tumefaciens EHA101 t¸i tæ hîp.

Ba chñng vi khuÈn bè mÑ ®îc nu«i cÊy trªn ®Üa m«i trêng LB/ YEP cã bæ sung kh¸ng sinh chän läc ë nhiÖt ®é vµ thêi gian thÝch hîp. Sau ®ã, chóng t«i nu«i cÊy l¾c mét khuÈn l¹c cña mçi chñng vi khuÈn trong 2 ml m«i trêng LB/ YEP láng cã bæ sung kh¸ng sinh ë nhiÖt ®é vµ thêi gian thÝch hîp ®Ó chuÈn bÞ mÉu tiÕp hîp. Nh»m t¨ng hiÖu qu¶ cña qu¸ tr×nh tiÕp hîp, chóng t«i ®· chuyÓn 300 μl dÞch nu«i cÊy mçi chñng vi khuÈn nµy vµo chung mét èng eppendorf, nu«i cÊy l¾c ë 280C trong 4 giê. Trªn ®Üa m«i trêng dïng cho tiÕp hîp (H-agar), 100 μl dÞch nu«i cÊy ba chñng vi khuÈn bè mÑ ®îc g¹t ®Òu b»ng que g¹t vµ phñ giÊy läc v« trïng, nu«i qua ®ªm ë 280C. Sau qu¸ tr×nh tiÕp hîp, chóng t«i ®· tiÕn

106

hµnh chän läc çc dßng tÕ bµo A. tumefaciens mang plasmit t¸i tæ hîp [190].

V× tÕ bµo A. tumefaciens cã tèc ®é sinh trëng chËm h¬n tÕ bµo E. coli nªn trong çc bíc nu«i cÊy vi khuÈn chóng t«i thêng nu«i A. tumefaciens tríc mét ngµy. Chóng t«i còng lu«n bæ sung kh¸ng sinh chän läc thÝch hîp vµo m«i trêng LB/ YEP (láng, ®Æc) nh»m duy tr× sù tån t¹i cña tÊt c¶ çc plasmit trong tÕ bµo E. coli vµ Agrobacterium. M«i trêng LB + Km ®Ó nu«i cÊy hai chñng E. coli, m«i trêng YEP + Rif + Cb ®Ó nu«i cÊy chñng A. tumefaciens nhËn LBA4404, m«i trêng YEP ®Ó nu«i cÊy EHA105. Tuy nhiªn trong mét sè lÇn thÝ nghiÖm, tríc khi tiÕn hµnh tiÕp hîp, chóng t«i ly t©m dÞch nu«i cÊy cña ba chñng vi khuÈn ®Ó thu cÆn tÕ bµo, sau ®ã hoµ l¹i trong m«i trêng YEP láng kh«ng chøa kh¸ng sinh nh»m t¨ng kh¶ n¨ng sinh trëng vµ tiÕp hîp cña çc chñng vi khuÈn. Tuú thuéc vµo sù ph¸t triÓn cña tõng chñng vi khuÈn, chóng t«i tÝnh to¸n lîng m«i trêng cho phï hîp ®Ó hoµ cÆn tÕ bµo.

Bªn c¹nh mÉu thÝ nghiÖm (trén 0,1ml dÞch nu«i cÊy ba chñng vi khuÈn vµo ®Üa m«i trêng tiÕp hîp), chóng t«i còng tiÕn hµnh bè trÝ mÉu ®èi chøng (g¹t riªng rÏ tõng chñng vi khuÈn). Sau khi nu«i cÊy, çc ®Üa thÝ nghiÖm vµ ®èi chøng ®Òu ®îc bæ sung 3 ml dung dÞch MgCl2 10mM, g¹n dÞch vi khuÈn vµ pha lo·ng ë çc nång ®é, cÊy tr¶i trªn çc ®Üa m«i trêng kh«ng chøa/ chøa kh¸ng sinh chän läc vect¬ pC1300-Ubi-cryIA(c). VÝ dô, khi sö dông chñng LBA4404 lµm chñng nhËn, ngoµi kh¸ng sinh Rf vµ Cb cña chñng gèc, m«i trêng chän läc çc thÓ sau tiÕp hîp cßn bæ sung Km. MÉu sÏ ®îc cÊy tr¶i trªn çc ®Üa m«i trêng: (1) YEP + Rf + Cb + Km; (2) YEP + Km; (3) YEP + Rf + Cb. T¬ng tù, ®èi víi chñng EHA105, m«i trêng sau tiÕp hîp bao gåm: (1) YEP; (2) YEP +

107

Km. KÕt qu¶, chóng t«i ®· nhËn thÊy sù xuÊt hiÖn cña çc khuÈn l¹c sau tiÕp hîp.

§èi víi trêng hîp sö dông EHA105 lµm chñng nhËn: do hai chñng E. coli (chñng trî gióp vµ chñng mang vect¬ t¸i tæ hîp) ®Òu kh¸ng Km, b¶n th©n chñng EHA105 l¹i kh«ng chøa gen chØ thÞ chän läc. V× vËy, çc dßng vi khuÈn sau tiÕp hîp chóng t«i quan s¸t thÊy c¶ çc dßng E. coli. Trong khi ë trêng hîp sö dông LBA4404, c¶ hai chñng E. coli ®Òu kh«ng kh¸ng Rf vµ Cb nªn çc khuÈn l¹c mäc ®îc trªn m«i trêng chän läc cã ®ñ kh¸ng sinh Rf + Cb + Km lµ vi khuÈn Agrobacterium t¸i tæ hîp. Çc dßng E. coli nhiÔm sau qu¸ tr×nh phèi ba bè mÑ ®îc chóng t«i lo¹i bá nhê quan s¸t vÒ mÆt h×nh th¸i ®ång thêi cÊy ria trªn çc m«i trêng chän läc, nu«i ë nhiÖt ®é thÊp (280C)/ cao (370C). C¬ së cña thÝ nghiÖm kiÓm tra nµy dùa trªn çc ®Æc tÝnh kh¸c biÖt cña vi khuÈn A. tumefaciens so víi vi khuÈn E. coli. KhuÈn l¹c A. tumefaciens cã h×nh th¸i kh¸ ®Æc biÖt: tr¬n, bãng vµ nh« cao khái mÆt th¹ch.... H¬n n÷a, chóng sinh trëng rÊt yÕu, thËm chÝ kh«ng ph¸t triÓn ®îc khi nu«i cÊy ë nhiÖt ®é cao. Sau khi s¬ bé chän läc qua h×nh th¸i khuÈn l¹c, dßng çc tÕ bµo A. tumefaciens ®îc chóng t«i nu«i cÊy vµ kiÓm tra sù cã mÆt cña vect¬ vµ cÊu tróc gen quan t©m theo çc ph¬ng ph¸p cña Walkerpeach & Velten [197] (h×nh 3.25).

Cét 1 (h×nh 3.25) lµ ADN plasmit t¸ch chiÕt ®îc tõ chñng A. tumefaciens LBA4404 (pGV3850), cét 3 lµ ADN plasmit sau khi ®îc biÕn n¹p trë l¹i trong E. coli. S¶n phÈm xö lý ADN plasmit nµy b»ng Hind III (cét 4) ®· xuÊt hiÖn mét b¨ng cã kÝch thíc kho¶ng 4,1 kb t¬ng øng víi kÕt cÊu gen Ubi-cryIA(c)-NOST vµ kÕt qu¶ c¾t bëi

108

BamH I (cét 5) lµ mét b¨ng kÝch thíc kho¶ng 2 kb t¬ng øng víi ®o¹n khëi ®éng Ubiquitin.

Chóng t«i còng thÝ nghiÖm kh¶ n¨ng chuyÓn plasmit vµo tÕ bµo A. tumefaciens theo hai bíc phèi ®«i (two bi-parental matings). §Çu tiªn, chñng vi khuÈn E. coli cho vµ chñng E. coli trî gióp ®îc tiÕp hîp trªn ®Üa m«i trêng chøa kh¸ng sinh chän läc cho tÊt c¶ çc plasmit cã mÆt. Dßng vi khuÈn E. coli sau bíc tiÕp hîp nµy ®îc sö dông ®Ó tiÕp hîp víi chñng A. tumefaciens nhËn.

Râ rµng, ph¬ng ph¸p xung ®iÖn cã u ®iÓm: (i) thêi gian thÝ nghiÖm ng¾n (tõ 2-3 ngµy); (ii) çc thÓ sau biÕn n¹p hoµn toµn kh«ng cã kh¶ n¨ng bÞ nhiÔm çc tÕ bµo E. coli. Trong khi, ph¬ng ph¸p phèi ba bè mÑ tuy kh«ng cÇn çc thiÕt bÞ thÝ nghiÖm ®¾t tiÒn (tñ l¹nh -850C, m¸y xung ®iÖn víi ®iÖn thÕ cao) vµ cã thÓ tiÕn hµnh ë mäi phßng thÝ nghiÖm nghiªn cøu vÒ vi sinh vËt nhng víi mét sè nhîc ®iÓm nh ph¶i duy tr× çc chñng vi sinh, thêi gian biÕn n¹p t¬ng ®èi dµi (4-7 ngµy) vµ dÔ nhiÔm nªn kh«ng ®îc sö dông réng r·i. Trong ®iÒu kiÖn ViÖt Nam, ph¬ng ph¸p phèi ba bè mÑ víi nh÷ng u ®iÓm trªn, còng ®· ®îc ¸p dông ®Ó ®a Ti-plasmit vµo tÕ bµo Agrobacterium [15]. Nh vËy, trªn c¬ së çc ph-¬ng ph¸p chuyÓn Ti-plasmit tõ tÕ bµo E. coli vµo tÕ bµo A. tumefaciens ®· ®îc chóng t«i hoµn thiÖn, vÊn ®Ò t¹o chñng A.

109

H×nh 3.25. KiÓm tra sù cã mÆt cña Ti-plasmit t¸i tæ hîp pC1300-Ubi-cryIA(c) trong tÕ bµo A. tumefaciens

1. pC1300-Ubi-cryIA(c) trong LBA44042. ChØ thÞ ph©n tö 1 kb3. pC1300-Ubi-cryIA(c) trong E. coli4. pC1300-Ubi-cryIA(c) trong E. coli/ HindIII5. pC1300-Ubi-cryIA(c) trong E. coli/ BamH I

tumefaciens mang Ti-plasmit t¸i tæ hîp cã thÓ ®îc thùc hiÖn dÔ dµng trong ®iÒu kiÖn ViÖt Nam.

3.3.3Quy tr×nh b¶o qu¶n gièng vi khuÈn E. coli vµ A. tumefaciens t¸i tæ hîp

Nu«i cÊy vµ lu gi÷ çc chñng vi khuÈn lµ mét trong nh÷ng b-íc quan träng cña kü thuËt thiÕt kÕ vect¬ chuyÓn gen thùc vËt. Çc chñng vi khuÈn t¸i tæ hîp cÇn ®îc kiÓm tra ®Þnh kú nh»m ®¶m b¶o plasmit ®îc duy tr× vµ gi¶m kh¶ n¨ng nhiÔm çc loµi vi sinh vËt kh¸c. Çc chÊt kh¸ng sinh thÝch hîp cÇn ®îc bæ sung vµo m«i trêng nu«i cÊy nh»m t¹o ¸p lùc chän läc ®Ó lo¹i bá çc tÕ bµo kh«ng mang vect¬ trong qu¸ tr×nh ph©n chia. C¨n cø vµo lo¹i plasmit mµ vi khuÈn mang, çc chñng vi khuÈn mang çc vect¬ t¸i tæ hîp sau thiÕt kÕ ®îc chóng t«i nu«i cÊy trªn çc m«i trêng chän läc cã bæ sung kh¸ng sinh ë nhiÖt ®é vµ thêi gian thÝch hîp, sau ®ã gi÷ ë -750C phôc vô cho çc thÝ nghiÖm chuyÓn gen vµo c©y trång. §èi víi çc chñng A. tumefaciens t¸i tæ hîp, v× tèc ®é sinh trëng chËm vµ chÞu sù chän läc cña nhiÒu lo¹i kh¸ng sinh, nªn ®Ó phôc håi nhanh chãng çc tÕ bµo ®ang lu gi÷ ë -750C, chóng t«i thêng tiÕn hµnh lµm míi l¹i gièng b»ng çch cÊy l¾c trªn m«i trêng láng tríc khi chän läc çc khuÈn l¹c ®¬n. Trong mét sè Ýt trêng hîp, nÕu bíc phôc håi nµy kh«ng hiÖu qu¶ th× A. tumefaciens cÇn ®îc cÊy tiÕp sang m«i trêng láng vµ l¾c trong kho¶ng 2 ngµy ë 280C. M«i trêng nu«i cÊy vµ chän läc çc chñng vi khuÈn t¸i tæ hîp ®· t¹o ®îc tãm t¾t trªn b¶ng 3.13.

Çc chñng vi khuÈn A. tumefaciens t¸i tæ hîp míi ®îc chóng t«i chuyÓn giao cho Phßng C«ng nghÖ TÕ bµo Thùc vËt, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc nh»m chuyÓn cã ®Þnh híng vµo çc gièng c©y trång quan träng cña ViÖt Nam. Hµng lo¹t dßng lóa mang gen

110

cry ®· ®îc kiÓm tra sù cã mÆt cña gen cry vµ trång thö nghiÖm ë quy m« phßng thÝ nghiÖm. Bªn c¹nh ®ã, trong khu«n khæ hîp t¸c víi ViÖn Nghiªn cøu Ng« (thuéc BNN & PTNN), plasmit pC1300-Ubi-cryIA(c) còng ®· ®îc çc çn bé nghiªn cøu Phßng C«ng nghÖ Sinh häc chuyÓn vµo mét sè gièng ng« ViÖt Nam [Hîp ®ång chuyÓn giao nguyªn liÖu, phô lôc 1]. Çc dßng ng« t¸i tæ hîp nµy ®ang ®-îc kiÓm tra, t¸i sinh thµnh c©y hoµn chØnh vµ nghiªn cøu kh¶ n¨ng kh¸ng s©u h¹i.

B¶ng 3.13. M«i trêng nu«i cÊy vµ chän läc çc chñng vi khuÈn

mang çc plasmit t¸i tæ hîp

Chñng M«i tr-êng

Nång ®é kh¸ng sinh chän läc (μg/ ml)

Amp

Km Cb Rf

DH5α(pC1300- cryIA(c))/

(pC1300- C71S-cryIA(c))/

(pNOV- Ubi-cryIA(c))

LB + Km - 50 - -

HB101(pC1300-Ubi-cryIA(c))

LB + Km - 50 - -

LBA4404(pC1300-Ubi-

cryIA(c))/(pC1300-C71S-

cryIA(c))

YEP + Km + Rf + Cb

- 50 100 100

EHA105(pC1300-Ubi-

cryIA(c))/(pC1300-C71S-

cryIA(c))

YEP + Km - 50 - -

111

3.4 biÓu hiÖn gen cryIA(c) TrONG VI KhuÈn e. coli

ë ViÖt Nam, çc nghiªn cøu chuyÓn gen thùc vËt, bao gåm gen Bt vµ mét sè gen kh¸c míi ®îc b¾t ®Çu vµi n¨m gÇn ®©y [9], [13], [18], [21]. Kü thuËt PCR thêng ®îc sö dông ®Ó ®¸nh gi¸ s¬ bé sù cã mÆt cña GOI nãi chung vµ gen cry nãi riªng trong c©y trång. Tuy nhiªn, kÕt qu¶ cuèi cïng cÇn ph¶i kh¼ng ®Þnh lµ çc c©y ®îc chuyÓn gen cã kh¶ n¨ng biÓu hiÖn gen chuyÓn thµnh s¶n phÈm protein cã tÝnh kh¸ng s©u nhê kü thuËt lai miÔn dÞch protein cña c©y chuyÓn gen vµ kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu cho protein Cry cña lo¹i gen ®îc chuyÓn vµo c©y. V× vËy, chóng t«i ®Æt vÊn ®Ò thiÕt kÕ vect¬ vµ biÓu hiÖn gen cryIA(c) trong E. coli víi môc ®Ých t¹o vµ tinh chÕ protein CryIA(c) t¸i tæ hîp ®Ó s¶n xuÊt kh¸ng thÓ kh¸ng CryIA(c) nh»m sö dông ®Ó kiÓm tra sù cã mÆt cña protein cryIA(c) ë çc c©y trång ®îc chuyÓn gen.

3.4.1 ThiÕt kÕ vect¬ biÓu hiÖn gen cryIA(c)

Nhãm gen cryI, m· ho¸ cho çc protein cã tÝnh ®éc ®èi víi c«n trïng Bé Çnh v¶y, cã ph©n tö lîng tõ 130 - 140 kDa vµ bao gåm 8 nhãm phô ký hiÖu tõ cryIA ®Õn cryIH. Trong ®ã cryIA ®îc ph©n thµnh 3 nhãm nhá lµ cryIA(a), cryIA(b), cryIA(c) [182]. Protein ®éc tè m· ho¸ bëi mçi nhãm cryI ®Æc hiÖu víi nh÷ng loµi c«n trïng thuéc bé çnh v¶y nhÊt ®Þnh. Nhãm CryIA víi cÊu tróc t-¬ng ®ång cã phæ ho¹t ®éng trªn çc loµi c«n trïng kh¸ gièng nhau [107]. Çc gen cry tù nhiªn nh: cryIA(a), cryIA(c), cryIA(b), cryIF vµ cryIIA ®· ®îc t¹o dßng vµ biÓu hiÖn trong E. coli, sö dông nhiÒu hÖ vect¬ biÓu hiÖn kh¸c nhau ®Ó nghiªn cøu cÊu tróc ph©n tö cña gen cry vµ ho¹t tÝnh kh¸ng c«n trïng cña ®éc tè [48]. Trong khi ®ã, çc gen cry ®îc tæng hîp b»ng con ®êng ho¸ häc cha ®îc nghiªn cøu biÓu hiÖn trong E. coli.

112

§Ó cã thÓ biÓu hiÖn ®îc gen cryIA(c) trong E. coli, tr×nh tù nucleotit cña gen trong qu¸ tr×nh thiÕt kÕ l¾p r¸p vµo vect¬ ph¶i ®¶m b¶o cã m· khëi ®Çu (ATG) vµ m· kÕt thóc (UAA, UAG, UGA). Do ®ã, chóng t«i sö dông hai enzym h¹n chÕ lµ Nco I vµ BamH I ®Ó t¹o m· khëi ®Çu vµ m· kÕt thóc trong gen cryIA(c) (h×nh 3.26).

Bíc ®Çu tiªn, chóng t«i ®· tiÕn hµnh t¸ch chiÕt ®o¹n gen cryIA(c)-NOST kÝch thíc kho¶ng 2,1kb tõ vect¬ pGEM-4Z b»ng çch xö lý víi hai enzym h¹n chÕ lµ Nco I vµ BamH I. Sau ®ã tinh chÕ ®o¹n gen cryIA(c) sö dông ph¬ng ph¸p chiÕt b»ng ®iÖn di trong tói thÈm tÝch vµ g¾n vµo vect¬ biÓu hiÖn pET21d ®· ®îc më vßng tríc ®ã còng b»ng hai enzym nµy (h×nh 3.27). TiÕp theo, s¶n phÈm lai ®îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo E. coli chñng DH5 vµ ®îc nu«i cÊy trªn m«i trêng chøa Amp. T¸ch chiÕt plasmit çc khuÈn l¹c sau biÕn n¹p vµ kiÓm tra s¬ bé b»ng ®iÖn di trªn gel agaroza 0,8%. Çc plasmit cã kÝch thíc lín h¬n pET21d (mÉu ®èi chøng) ®îc sö dông ®Ó c¾t kiÓm tra b»ng Nco I vµ BamH I.

113

H×nh 3.26. KiÓm tra nguyªn liÖu ®Ó thiÕt kÕ vect¬ biÓu hiÖn pET21d-cryIA(c)

1. ADN / EcoR I + Hind III2. pET21d3. pGEM-4Z-cryIA(c)4. pET21d/ Nco I + BamH I5. pGEM-4Z- cryIA(c)/ Nco I + BamH I

S¶n phÈm theo tÝnh to¸n lý thuyÕt cña plasmit t¸i tæ hîp cã mang gen cryIA(c) c¾t bëi Nco I vµ BamH I lµ hai ®o¹n gen. §o¹n 1 cã kÝch thíc ~ 5,4 kb - t¬ng øng víi kÝch thíc cña vect¬ pET21d vµ ®o¹n 2 cã kÝch thíc ~2,1 kb - t¬ng øng víi kÝch thíc cña gen cryIA(c).

KÕt qu¶ trªn h×nh 3.27 cho thÊy dßng plasmit chóng t«i dù ®o¸n chøa gen cryIA(c) sau khi c¾t b»ng Nco I vµ BamH I ®· t¹o ra çc ®o¹n cã kÝch thíc ®óng theo tÝnh to¸n lý thuyÕt: ®o¹n 1 dµi kho¶ng 5,4 kb; ®o¹n 2 kÝch thíc kho¶ng 2,1 kb. Chóng t«i ký hiÖu plasmit t¸i tæ hîp lµ pET21d-cryIA(c).

3.4.2 T¹o protein CryIA(c) t¸i tæ hîp trong vi khuÈn E. coli

HÖ thèng biÓu hiÖn gen nhê vi khuÈn E. coli lµ hÖ thèng lý t-ëng ®îc sö dông ®Ó biÓu hiÖn rÊt nhiÒu lo¹i protein. E. coli dÔ dµng ®îc nu«i cÊy vµ nh©n lªn trong m«i trêng th«ng dông.

Mét sè ph¬ng ph¸p truyÒn thèng thêng ®îc sö dông ®Ó nghiªn cøu sù biÓu hiÖn gen m· ho¸ protein tinh thÓ ®éc tè cña Bt lµ ph¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel polyacrylamit vµ ph¬ng ph¸p lai miÔn dÞch víi kh¸ng thÓ ®a dßng kh¸ng çc lo¹i protein tinh thÓ ®éc tè.

Theo nh÷ng híng nghiªn cøu nµy, chóng t«i ®· tiÕn hµnh biÕn n¹p vect¬ pET21d-cryIA(c) vµo tÕ bµo E. coli chñng BL21(DE3) (chñng cã kh¶ n¨ng biÓu hiÖn cao) vµ biÓu hiÖn protein t¸i tæ hîp trong m«i trêng nu«i cÊy cã bæ sung chÊt c¶m øng 1mM IPTG. Sinh khèi tÕ bµo sau 3 giê nu«i cÊy ®îc ph¸ vì b»ng siªu ©m trong dung dÞch lysozyme cã chøa 0.1mM PMSF

114

(phenyl metasulphonyl fluoride). Qu¸ tr×nh biÓu hiÖn gen ®îc x¸c ®Þnh qua viÖc xuÊt hiÖn ph©n tö protein míi ë cÆn tÕ bµo trªn gel ®iÖn di SDS-PAGE. Protein CryIA(c) t¸i tæ hîp ®îc tinh chÕ b»ng ph¬ng ph¸p ®iÖn di ®Èy ra khái gel trong tói thÈm tÝch nhê ®iÖn trêng.

Çc nghiªn cøu cho thÊy nh÷ng ph©n tö protein ®éc tè do nhãm gen cryIA m· ho¸ thêng tån t¹i ë d¹ng tiÒn ®éc tè vµ chøa tíi h¬n 80% tr×nh tù t¬ng ®ång. TiÒn ®éc tè CryIA cã kÝch thíc ph©n tö kho¶ng 130-140kDa vµ bao gåm hai phÇn: phÇn ®Çu N mang ®éc tÝnh víi kÝch thíc kho¶ng 60-70 kDa vµ phÇn ®Çu C kÝch thíc kho¶ng 60-70 kDa giµu cystein liªn quan ®Õn qu¸ tr×nh kÕt tinh cña ®éc tè [107], [188]. Gen cryIA(c) chóng t«i sö dông ®· ®îc c¶i biÕn c¾t bít phÇn gen m· ho¸ cho ®Çu C chØ gi÷ l¹i phÇn gen m· ho¸ cho protein ®éc tè cã kÝch thíc theo tÝnh to¸n lý thuyÕt lµ 68,635 kDa (kh«ng kÓ methionin thêng bÞ lo¹i bá sau dÞch m·). Nh vËy, b¨ng protein míi xuÊt hiÖn ®Ëm nÐt trªn gel SDS-PAGE cã kÝch thíc kho¶ng 68 kDa t¬ng øng víi kÝch thíc cña ®o¹n mang tÝnh ®éc (cét 4, 6, h×nh 3.28).

115

H×nh 3.28. KÕt qu¶ kiÓm tra sù biÓu hiÖn gen cryIA(c) vµ tinh chÕ protein CryIA(c) t¸i tæ hîp

1. ChØ thÞ ph©n tö chuÈn2. Protein tæng sè cña E. coli (®èi chøng)3. Protein tæng sè chñng E. coli mang gen cryIA(c)4. CÆn tÕ bµo sau khi xö lý b»ng lysozym5. DÞch næi tÕ bµo sau khi xö lý b»ng lysozym6. Protein CryIA(c) t¸i tæ hîp sau khi tinh chÕ

3.5 Lai miÔn dÞch vµ s¶n xuÊt kh¸ng thÓ kh¸ng CryIA(c)

3.5.1 Lai miÔn dÞch

RÊt nhiÒu chñng Bt tù nhiªn ®· ®îc x¸c ®Þnh chøa nhiÒu protein tinh thÓ ®éc tè nhê ph¬ng ph¸p lai miÔn dÞch víi kh¸ng thÓ ®a dßng. §Ó kh¼ng ®Þnh chÝnh x¸c b¨ng protein míi xuÊt hiÖn lµ CryIA(c), chóng t«i ®· tiÕn hµnh lµm ph¶n øng lai miÔn dÞch sö dông kh¸ng thÓ kh¸ng CryIA(c) chuÈn do GS. Supat, Th¸i Lan cung cÊp.

KÕt qu¶ lai d¬ng tÝnh trªn h×nh 3.29 cho thÊy, gen c¶i biÕn cryIA(c) ®· ®îc biÓu hiÖn m¹nh ë E. coli chñng BL21 (DE3) víi hÖ vect¬ pET21d, protein t¸i tæ hîp kh¸ æn ®Þnh vµ kh«ng bÞ ph©n huû. B¨ng protein chÝnh xuÊt hiÖn trªn cét 3 cã kÝch thíc ph©n tö phï hîp víi kÝch thíc ph©n tö cña CryIA(c) theo tÝnh to¸n lý thuyÕt. §Æc biÖt, CryIA(c) t¸i tæ hîp sau khi tinh chÕ ®· lai rÊt ®Æc hiÖu víi kh¸ng thÓ lµ protein t¸i tæ hîp chóng t«i sö dông ®Ó ph¸t hiÖn CryIA(c). S¶n phÈm lai chØ xuÊt hiÖn mét b¨ng duy nhÊt (cét 2).

ViÖc biÓu hiÖn thµnh c«ng gen cry trong E. coli cã mét ý nghÜa v« cïng quan träng. §Æc biÖt khi vect¬ Ti-plasmit mang kÕt cÊu gen Ubi-cryIA(c) do chóng t«i thiÕt kÕ ®· vµ ®ang ®îc chuyÓn vµo lóa vµ çc lo¹i c©y trång kh¸c. Ngoµi ra, çc nghiªn

116

H×nh 3.29. Lai miÔn dÞch protein CryIA(c) t¸i tæ hîp

víi kh¸ng thÓ kh¸ng CryIA(c)

1. ChØ thÞ ph©n tö chuÈn 2. Lai miÔn dÞch protein CryIA(c) t¸i tæ hîp sau

khi tinh chÕ

cøu chuyÓn gen cry trªn ®èi tîng c©y ng« ®· ®îc triÓn khai trong ch¬ng tr×nh hîp t¸c víi ViÖn Nghiªn cøu Ng«. Ph¬ng ph¸p ph¸t hiÖn protein tinh thÓ ®éc tè trong çc c©y lóa, ng«…chuyÓn gen cry cÇn ph¶i cã kh¸ng thÓ (s¶n xuÊt trªn c¬ së protein Cry t¸i tæ hîp). Nh vËy, protein Cry t¸i tæ hîp sÏ ®îc sö dông ®Ó kiÓm tra çc c©y trång chuyÓn gen nµy. H¬n n÷a, Cry t¸i tæ hîp còng cã thÓ dïng trong m« h×nh thö nghiÖm ë quy m« phßng thÝ nghiÖm nghiªn cøu t¸c ®éng cña protein tinh thÓ ®éc tè lªn çc loµi c«n trïng kh¸c nhau. Qua kÕt qu¶ lai miÔn dÞch nµy, cã thÓ kh¼ng ®Þnh chóng t«i ®· thµnh c«ng trong viÖc biÓu hiÖn gen cryIA(c) ë vi khuÈn E. coli.

3.5.2 S¶n xuÊt kh¸ng thÓ

S¶n phÈm protein CryIA(c) t¸i tæ hîp sau khi tinh chÕ vµ kiÓm tra ®· ®îc chóng t«i sö dông ®Ó g©y miÔn dÞch s¶n xuÊt kh¸ng thÓ kh¸ng CryIA(c) dïng trong kiÓm tra çc c©y chuyÓn gen. §Çu tiªn, protein Cry ®îc trén víi t¸ chÊt Freund toµn phÇn víi tØ lÖ 1:1 (1ml dung dÞch chøa kho¶ng 200 g protein CryIA(c) tinh chÕ + 1ml t¸ chÊt Freund toµn phÇn) vµ tiªm díi da ë hai bªn h«ng gÇn sèng lng thá. Sau ®ã tiÕn hµnh tiªm nh¾c l¹i vµo çc ngµy thø 5, 10 vµ 30. §Õn ngµy thø 10 tÝnh tõ lÇn tiªm cuèi cïng, chóng t«i ®· tiÕn hµnh lÊy m¸u thá vµ thu huyÕt thanh. CÇn chó ý khi thu huyÕt thanh cÇn lÊy m¸u ë ®éng m¹ch, thao t¸c nhÑ nhµng tr¸nh lµm vì hång cÇu.

§Ó kiÓm tra chÊt lîng kh¸ng thÓ thu ®îc, chóng t«i còng ®· tiÕn hµnh lai miÔn dÞch víi 3 lo¹i kh¸ng nguyªn: i) Kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp CryIA(c) do chóng t«i tinh chÕ; ii) Kh¸ng nguyªn CryIA(b) (nhËn ®îc tõ TS. NguyÔn ThÞ Léc); iii) Protein CryIA(c) (nhËn ®îc

117

tõ TS. Vâ ThÞ Thø – ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc). KÕt qu¶ lai ë c¶ ba mÉu thÝ nghiÖm trªn (h×nh 3.30 - cét 1, 2, 3) ®Òu xuÊt hiÖn mét b¨ng protein cã kÝch thíc kho¶ng 68 kDa.

Chóng t«i còng ®ång thêi tiÕn hµnh thÝ nghiÖm kiÓm tra chÊt lîng kh¸ng nguyªn CryIA(c) chóng t«i tinh chÕ ®îc b»ng çch lai miÔn dÞch víi kh¸ng thÓ chuÈn kh¸ng CryIA(c) (do TS. NguyÔn ThÞ Léc cung cÊp). S¶n phÈm lai (h×nh 3.30, cét 4) xuÊt hiÖn mét b¨ng cã kÝch thíc kho¶ng 68 kDa. KÕt qu¶ d¬ng tÝnh nµy mét lÇn n÷a kh¼ng ®Þnh chóng t«i ®· tinh chÕ ®îc protein CryIA(c) t¸i tæ hîp.

Nh÷ng kÕt qu¶ trªn cho thÊy kh¸ng thÓ chóng t«i s¶n xuÊt ®îc cã chÊt lîng tèt vµ cã thÓ sö dông ®Ó ph©n tÝch çc c©y trång ®îc chuyÓn gen cryIA(c). Nh vËy, nh÷ng c©y trång ®· chuyÓn gen cry ngoµi viÖc ®îc ®¸nh gi¸ s¬ bé b»ng kü thuËt PCR (Polymerase Chain Reaction), kü thuËt lai miÔn dÞch protein cña c©y chuyÓn gen vµ kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu cho protein Cry cña lo¹i gen ®îc chuyÓn vµo c©y nhê sö dông kh¸ng thÓ chóng t«i s¶n xuÊt ®îc ®· kh¼ng ®Þnh ë bíc cao h¬n, ®ã lµ kh¶ n¨ng biÓu hiÖn gen chuyÓn thµnh s¶n phÈm protein cã ho¹t tÝnh kh¸ng s©u.

118

H×nh 3.30. Lai miÔn dÞch çc protein Cry t¸i tæ hîp víi kh¸ng thÓ kh¸ng CryIA(c) vµ kh¸ng thÓ chuÈn

1. Protein CryIA(c) (VCNSH) vµ kh¸ng thÓ kh¸ng CryIA(c) (VCNSH)

2. Protein CryIA(b) (VL§BSCL) vµ kh¸ng thÓ kh¸ng CryIA(c) (VCNSH)

kÕt luËn vµ ®Ò nghÞ

kÕt luËn

1) §· ph©n lËp, t¹o dßng ph©n tö vµ ®äc tr×nh tù nucleotit ®îc ®o¹n khëi ®éng cña gen m· ho¸ sucroza synthaza (sucrose synthase) ë gièng lóa ViÖt Nam C71 (C71S-P) víi kÝch thíc ph©n tö 1954 bp. Ph©n tÝch tr×nh tù cho thÊy C71S-P mang çc yÕu tè ®iÒu khiÓn biÓu hiÖn gen ®Æc hiÖu bã m¹ch (phloem) nh hép ASL, hép II, hép GATA. Ngoµi ra, C71S-P cßn chøa 1 ®o¹n tr×nh tù míi dµi 13 nucleotit cïng víi sù kh¸c biÖt ë 14 vÞ trÝ nucleotit, so víi ®o¹n khëi ®éng Rsuc1 do çc t¸c gi¶ níc ngoµi c«ng bè. Tr×nh tù C71S-P ®· ®îc ®¨ng ký t¹i çc Ng©n hµng gen quèc tÕ EMBL/ GENBANK/ DDBJ ngµy 3 th¸ng 7 n¨m 2000 víi m· sè AJ401233.

2) §· thiÕt kÕ ®îc 4 Ti-plasmit t¸i tæ hîp míi, mang çc kÕt cÊu gen nh sau: i) §o¹n khëi ®éng c¬ ®Þnh Ubiquitin + Gen cryIA(c) tæng hîp ho¸ häc + ®o¹n kÕt thóc NOS trong vect¬ pCAMBIA1300 (ký hiÖu: pC1300-Ubi-cryIA(c)); ii) Gen cryIA(c) tæng hîp ho¸ häc + ®o¹n kÕt thóc NOS khuyÕt ®o¹n khëi ®éng trong vect¬ pCAMBIA1300 (pC1300-cryIA(c)) dïng cho nghiªn cøu chøc n¨ng cña çc ®o¹n khëi ®éng míi; iii) §o¹n khëi ®éng ®Æc hiÖu bã m¹ch C71S-P + Gen cryIA(c) tæng hîp ho¸ häc + NOS trong vect¬ pCAMBIA1300 (pC1300-C71S-cryIA(c)); (iv) §o¹n khëi ®éng c¬ ®Þnh Ubiquitin + Gen cryIA(c) tæng hîp ho¸ häc + ®o¹n kÕt thóc NOS trong vect¬ chän läc tÝch cùc pNOV2819 (pNOV-Ubi-cryIA(c)).

3) §· c¶i tiÕn, hoµn thiÖn vµ sö dông ph¬ng ph¸p xung ®iÖn vµ ph¬ng ph¸p phèi ba bè mÑ ®Ó t¹o ®îc 4 chñng A. tumefaciens

119

míi trªn c¬ së LBA4404 (pGA3850) vµ EHA105, mang 2 Ti-plasmit t¸i tæ hîp míi chøa gen kh¸ng c«n trïng (pC1300-Ubi-cryIA(c) vµ pC1300-C71S-cryIA(c)) ®Ó chuyÓn vµo c©y trång.

4) §· thµnh c«ng trong viÖc thiÕt kÕ vect¬ biÓu hiÖn gen cryIA(c) tæng hîp ho¸ häc trong vi khuÈn E. coli. KÕt qu¶ lai miÔn dÞch kh¼ng ®Þnh çc protein CryIA(c) t¸i tæ hîp cã ph¶n øng ®Æc hiÖu víi kh¸ng thÓ kh¸ng CryIA(c). §· tinh chÕ protein CryIA(c) t¸i tæ hîp vµ ®· sö dông ®Ó s¶n xuÊt kh¸ng thÓ kh¸ng CryIA(c) phôc vô cho viÖc kiÓm tra sù cã mÆt cña protein CryIA(c) ë çc c©y trång chuyÓn gen.

5) §· chuyÓn giao 4 chñng A. tumefaciens míi t¹o ®îc cho Phßng C«ng nghÖ TÕ bµo Thùc vËt, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc vµ Phßng C«ng nghÖ Sinh häc, ViÖn Nghiªn cøu Ng« ®Ó chuyÓn vµo çc gièng lóa vµ ng« nh»m t¹o nguyªn liÖu khëi ®Çu cho chän gièng kh¸ng s©u.

®Ò nghÞ

1) TiÕp tôc nghiªn cøu thiÕt kÕ çc tæ hîp gen kh¸c nhau trªn c¬ së çc vect¬ Ti-plasmit míi t¹o ®îc còng nh mét sè nguån gen ®· su tËp vµ ph©n lËp ®îc.

2) Më réng triÓn khai øng dông çc chñng A. tumefaciens vµ kh¸ng thÓ t¹o ®îc vµo nghiªn cøu chuyÓn gen ë çc c©y trång kh¸c nhau.

120

Nh÷ng c«ng tr×nh cña t¸c gi¶ ®· c«ng bè liªn quan ®Õn ®Ò tµi luËn ¸n

1. Lª ThÞ Thu HiÒn , §inh Duy Kh¸ng, Lª TrÇn B×nh, N«ng V¨n H¶i (1999). Gen kh¸ng c«n trïng vµ øng dông trong c«ng nghÖ chuyÓn gen thùc vËt. Kû yÕu 1998, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, Trung t©m Khoa häc Tù nhiªn vµ C«ng nghÖ Quèc Gia. Nhµ xuÊt b¶n Khoa häc vµ Kü thuËt, tr. 31-42.

2. Lª ThÞ Thu HiÒn , Lª TrÇn B×nh, §inh Duy Kh¸ng, N«ng V¨n H¶i (2000). Ph©n tÝch tr×nh tù cña ®o¹n ®iÒu khiÓn cña gien tæng hîp ®êng (RSUC1-PROMOTER) tõ gièng lóa C71. T¹p chÝ Sinh häc, tËp 23 (2), tr. 45-50.

3. Le Thi Thu H. , Dinh Duy K., Nong Van H., Le Tran B (2000). Nucleotide sequence of sucrose synthase promoter from rice C71 cultivar. EMBL Nucleotide Sequence Database, Accession Number AJ401233.

4. Lª ThÞ Thu HiÒn , TrÞnh C«ng Sù, TrÇn ThÞ Ph¬ng Liªn, Ph¹m BÝch Ngäc, §inh Duy Kh¸ng, N«ng V¨n H¶i, Lª TrÇn B×nh (2002). ThiÕt kÕ vect¬ vµ biÓu hiÖn gen m· ho¸ protein ®éc tè cryIA(c) cã nguån gèc tõ vi khuÈn Bacillus thuringiensis b»ng vi khuÈn Escherichia coli. T¹p chÝ Sinh häc, tËp 24(3), tr. 39-46.

5. Lª ThÞ Thu HiÒn, §inh Duy Kh¸ng, Lª TrÇn B×nh, N«ng V¨n H¶i (2002). ThiÕt kÕ vect¬ mang gien ®éc tè cryIA(c) díi sù ®iÒu khiÓn cña ®o¹n khëi ®éng cña gien tæng hîp ®êng (Rsuc1 promoter) ph©n lËp tõ gièng lóa C71. T¹p chÝ Khoa häc vµ C«ng nghÖ, tËp 40, sè §B, tr. 135-141.

121

6. Le Thi Thu Hien , Lam Dai Nhan, Kieu Huu Anh, Nong Van Hai, Le Tran Binh (2002). Construction of Agrobacterium tumefaciens strains carrying Bt pesticidal genes. Advances in Natural Sciences 3(2), pp. 175-180.

122

Tµi liÖu tham kh¶oTµi liÖu tiÕng ViÖt

1. Lª TrÇn B×nh, Lª ThÞ Muéi (1998), Ph©n lËp gen vµ chän dßng chèng chÞu ngo¹i c¶nh bÊt lîi ë c©y lóa, Nhµ XuÊt B¶n §¹i häc Quèc gia Hµ Néi.

2. Lª TrÇn B×nh (1999), “T×nh h×nh ph¸t triÓn c«ng nghÖ gene ë ViÖt Nam”, B¸o ço khoa häc, Héi nghÞ C«ng nghÖ Sinh häc toµn quèc, Hµ Néi, tr. 71-75.

3. NguyÔn ThÞ Liªn Chi, NguyÔn H÷u Hæ, NguyÔn V¨n UyÓn (1994), “ChuyÓn gen kh¸ng kanamycin vµo c©y thuèc l¸ Nicotiana Tabacum vµ m« l¸ c©y cµ óc S. laciniatum b»ng vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens”, Di truyÒn häc vµ øng dông 1, tr. 23-28.

4. T¹ Kim ChØnh (1996), TuyÓn chän mét sè chñng vi nÊm diÖt c«n trïng g©y h¹i ë ViÖt Nam vµ kh¶ n¨ng sö dông, LuËn ¸n Phã TiÕn sÜ Khoa häc Sinh häc, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, Hµ Néi.

5. NguyÔn L©n Dòng (1981), Sö dông vi sinh vËt ®Ó phßng trõ s©u h¹i c©y trång, Nhµ XuÊt b¶n Khoa häc Kü thuËt Hµ Néi.

6. NguyÔn V¨n §¹t, NguyÔn Thanh Thuû, NguyÔn Huy Hoµng, N«ng V¨n H¶i, Lª TrÇn B×nh, Tr¬ng Nam H¶i (2000), “BiÓu hiÖn gen m· ho¸ cho protein bÊt ho¹t ribosome cña míp ®¾ng trong nÊm men Pichia pastoris”, Nh÷ng vÊn ®Ò Nghiªn cøu C¬ b¶n trong C«ng nghÖ Sinh häc, B¸o ço Khoa häc Héi nghÞ Sinh häc Quèc gia, Nhµ XuÊt B¶n §¹i häc Quèc gia Hµ Néi, tr. 44-47.

123

7. NguyÔn Thuý Hµ, Hoµng Quèc Trêng, Tèng Quúnh Mai, NguyÔn ThÞ Tþ, NguyÔn H÷u HiÕn, Phan Quèc Kinh, Lª TrÇn B×nh, Phan V¨n Chi (1999), “T¸ch dßng vµ biÓu hiÖn gen m· ho¸ cho protein bÊt ho¹t ribosome nhãm 1 ë E. coli”, B¸o ço Khoa häc Héi nghÞ C«ng nghÖ Sinh häc Toµn quèc, Hµ Néi, tr. 1121-1128.

8. Lª ThÞ Thu HiÒn, §µo ThÞ Hång V©n, §Æng ThÞ Thu, N«ng V¨n H¶i (1999), “Ph©n lËp gen m· ho¸ lectin vµ protein k×m h·m α-amylase ë h¹t ®Ëu c« ve (Phaseolus vulgaris)”, Kû yÕu ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, Nhµ XuÊt B¶n Khoa häc vµ Kü thuËt, tr. 116-120.

9. Lª ThÞ Thu HiÒn, §inh Duy Kh¸ng, Lª TrÇn B×nh, N«ng V¨n H¶i (2000), “Gen kh¸ng c«n trïng vµ øng dông trong c«ng nghÖ chuyÓn gen thùc vËt”, Kû yÕu ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, Nhµ XuÊt B¶n Khoa häc vµ Kü thuËt, tr. 31-39.

10. NguyÔn Huy Hoµng, §µo Duy Phong, Nghiªm Ngäc Minh, Lª TrÇn B×nh, N«ng V¨n H¶i (2000), “Ph©n lËp vµ ®äc tr×nh tù gen m· ho¸ protein bÊt ho¹t ribosome tõ c©y míp ®¾ng (Momordica charantia)”, Nh÷ng vÊn ®Ò Nghiªn cøu C¬ b¶n trong C«ng nghÖ Sinh häc, B¸o ço Khoa häc Héi nghÞ Sinh häc Quèc gia, Nhµ XuÊt B¶n §¹i häc Quèc gia Hµ Néi, tr. 84-88.

11.TrÇn BÝch Lan, NguyÔn Lan Hoa, NguyÔn §øc Doanh, TrÇn Duy Quý (1998), “KÕt qu¶ bíc ®Çu sö dông Agrobacterium tumefaciens trong nghiªn cøu chuyÓn gen vµo lóa”, Héi nghÞ Toµn quèc lÇn thø nhÊt vÒ C«ng nghÖ Sinh häc c©y lóa, HuÕ, tr. 98-101.

124

12.TrÇn ThÞ Ph¬ng Liªn (1999), Nghiªn cøu ®Æc tÝnh ho¸ sinh vµ sinh häc ph©n tö cña mét sè gièng ®Ëu t¬ng cã kh¶ n¨ng chÞu nãng, chÞu h¹n ë ViÖt Nam, LuËn ¸n TiÕn sÜ Sinh häc, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, Hµ Néi.

13. TrÇn ThÞ Ph¬ng Liªn, N«ng V¨n H¶i (1997), “ChuyÓn tæ hîp gen GUS-BNG vµo c©y thuèc l¸”, T¹p chÝ Khoa häc vµ C«ng nghÖ, 2, tr. 23-27.

14.§Æng Träng L¬ng, R. Offringa, Vò §øc Quang, NguyÔn H÷u §èng, TrÇn Duy Quý, W. Dolf, Pau J.J. Hooykaas (1999), “ThiÕt kÕ l¹i cÊu tróc gen Bt (Bacillus thuringensis) ®Ó chuyÓn vµo c©y hai l¸ mÇm”, B¸o ço Khoa häc Héi nghÞ Sinh häc Toµn quèc, Nhµ XuÊt b¶n Khoa häc kü thuËt Hµ Néi, tr. 1371-1376.

15.§Æng Träng L¬ng (2001), Nghiªn cøu ¸p dông kü thuËt chuyÓn gen nhê vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens nh»m gãp phÇn t¹o vËt liÖu chän gièng c¶i b¾p kh¸ng s©u ë ViÖt Nam, LuËn ¸n TiÕn sÜ N«ng nghiÖp, ViÖn Khoa häc Kü thuËt N«ng nghiÖp ViÖt Nam, Hµ Néi.

16.§Æng Träng L¬ng, NguyÔn §øc Doanh, Vò §øc Quang, NguyÔn H÷u §èng, TrÇn Duy Quý (2001), “Nghiªn cøu chuyÓn gen cryIA(c) kh¸ng s©u vµo mét sè gièng c¶i b¾p ( Brassica oleracea var capitata) qua Agrobacterium”, KÕt qu¶ nghiªn cøu khoa häc 1999- 2000 ViÖn Di truyÒn N«ng nghiÖp, Nhµ XuÊt b¶n N«ng nghiÖp Hµ Néi, tr 120- 128.

17.Hoµng Kim Oanh, Lª V¨n S¬n, L©m §¹i Nh©n, §inh ThÞ Phßng, Lª ThÞ Muéi, Lª TrÇn B×nh (1998), “KÕt qu¶ nghiªn cøu t¹o c©y chuyÓn gen”, Tãm t¾t B¸o ço Héi nghÞ toµn quèc lÇn thø nhÊt vÒ C«ng nghÖ Sinh häc c©y lóa, tr. 44-45.

125

18.Phan Tè Phîng, Ph¹m Thu H»ng, Vò §øc Quang, TrÇn Duy Quý, Lili C., Zhang S., Fauquet C.M., Beachy R.N. (1998), “ChuyÓn gen kh¸ng hygromycin, gen gus vµ gen kh¸ng bÖnh b¹c l¸ vµo lóa b»ng sóng b¾n gen”, T¹p chÝ N«ng nghiÖp vµ C«ng nghiÖp thùc phÈm 2, tr. 56-57.

19.NguyÔn H÷u Phæ, Lª TÊn §øc, NguyÔn ThÞ Thanh, NguyÔnV¨n UyÓn (1999), “T¹o c©y thuèc l¸ (Nicotiana tabacum L.) kh¸ng thuèc trõ cá basta b»ng chuyÓn gen th«ng qua vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens”, B¸o ço Khoa häc Héi nghÞ Sinh häc Toµn quèc, Nhµ XuÊt b¶n Khoa häc kü thuËt Hµ Néi, tr. 1297-1304.

20.NguyÔn H÷u T©m, Lª TÊn §øc, NguyÔn ThÞ Thanh, NguyÔn V¨n UyÓn (1998), “Sö dông vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens ®Ó chuyÓn gen kh¸ng hygromycin vµ gen gusA vµo lóa indica (Ozyra sativa L.)”, Tãm t¾t B¸o ço Héi nghÞ toµn quèc lÇn thø nhÊt vÒ C«ng nghÖ Sinh häc c©y lóa, tr. 48-49.

21.NguyÔn ThÞ Thanh, Lª TÊn §øc, NguyÔn H÷u Phæ, NguyÔn V¨n UyÓn (1998), “T¹o c©y cµ tÝm (Solanum melongena L.) mang gen Bt, gen bar vµ gen gusA dïng ph¬ng ph¸p chuyÓn gen gi¸n tiÕp nhê vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens”, Tãm t¾t B¸o ço Héi nghÞ toµn quèc lÇn thø nhÊt vÒ C«ng nghÖ Sinh häc c©y lóa, tr. 82-83.

22. NguyÔn ThÞ Thanh, Lª TÊn §øc, NguyÔn V¨n UyÓn (1999), “T¹o c©y c¶i b«ng (Brassica oleracea var botrycis) vµ c©y c¶i xanh (Brassica juncea) mang gen kh¸ng s©u cryIA(c) vµ gen bar kh¸ng thuèc cá d¹i th«ng qua Agrobacterium

126

tumefaciens”, B¸o ço Khoa häc Héi nghÞ C«ng nghÖ Sinh häc Toµn quèc, Hµ Néi, tr. 1287-1295.

23. Vâ ThÞ Thø (1996), Nghiªn cøu ®Æc ®iÓm sinh häc vµ kh¶ n¨ng øng dông cña mét sè chñng vi khuÈn thuéc chi Bacillus, LuËn ¸n Phã TiÕn sÜ Khoa häc Sinh häc, ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc, Hµ Néi.

24. Mai Trêng, NguyÔn H÷u Hæ, Lª TÊn §øc, NguyÔn ThÞ Thanh, NguyÔn V¨n UyÓn (1998), “Bíc ®Çu chuyÓn gen bar, gen gusA vµ gen cryIA(c) vµo c©y ®Ëu xanh (Vigna radiata L.) nhê vi khuÈn Agrobacterium tumefaciens”, Héi nghÞ Toµn quèc lÇn thø nhÊt vÒ C«ng nghÖ Sinh häc c©y lóa, HuÕ, tr. 86-87.

Tµi liÖu tiÕng Anh

25. Adang M.J., Brody M.S., Cardineau G., Eagan N., Roush R.T., Shewmaker C.K., Jones A., Oakes J.V., McBride K.E. (1993), “The reconstruction and expression of a Bacillus thuringiensis cryIIIA gene in protoplasts and potato plants”, Plant Molecular Biology 21, pp. 1131-1145.

26. Alam M.F., Datta K., Abrigo E., Oliva N., Tu J., Virmani S.S., Datta S.K. (1999), “Transgenic insect-resistant maintainer line (IR68899B) for improvement of hybrid line”, Plant Cell Reports 18, pp. 572-575.

27. Alasdair D.I., Bruun R.T. (2000), “Promoter”, Patent WO0078975.

28. Altosaar I., Sardana R., Dukiandjiev S., Giband M., Cheng X. (1997), “Synthetic Bacillus thuringiensis (Bt) toxin genes for insect resistance and their rapid bioassay using maize

127

endosperm suspension cultures”, Rice Genetics III, pp. 737-742.

29. Alves A.C., Quecini V.M., Vieira M.L.C. (1999), “Plant transformation: Advances and perspectives”, Scientia Agricola 56(1), pp. 1-12.

30. An G. (1986), “Development of plant promoter expression vectors and their use for analysis of differential activity of nopaline synthase promoter in transformed tobacco cells”, Plant Physiology 81, pp.86-91.

31. An G., Ebert P.R., Mitra A., Ha S.B. (1988), “Binary vectors”, In: Plant molecular biology manual A3, Gelvin S.B., Schilperoort R., and Verma D. P. (Eds.), pp. 1-19.

32. Angenon G., Van Montagu M. (1992), “Transgenic plants: Agrobacterium-mediated transformation and its application in plant molecular biology research and biotechnology”. In: Biotechnology and crop improvement in Asia, pp. 181-199.

33. Anon (2000), “Novartis pins hopes for GM seeds on new marker system”, Nature 406, pp. 924.

34. Armitage P., Walden R., Draper J. (1988), “Vectors for the transformation of plant cells using Agrobacterium”, In: Plant genetic transformation and gene expression, A laboratory manual, Draper J., Scott R., Armitage P., (Eds.), Blackwell Scientific Publications, pp. 3-64.

35. Barbieri L., Battelli M.G., Stirpe F. (1993), “Ribosome-inactivating proteins from plants”, Biochimica et Biophysica Acta 1154, pp. 237-282.

128

36. Barton K.A., Miller M.J. (1991), “Insecticidal toxins in plants”, EPA 0431829 A1 910612.

37. Becker D., Kemper E., Schell J., Masterson R. (1992), “New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left T-DNA border”, Plant Molecular Biology 20, pp. 1195-1197.

38. Becker C., Shutov A.D., Nong V.H., Senyuk .L., Jung R., Horstmann C., Fircher J., Nielsen N.C., Muntz K. (1995), “Purification, cDNA cloning and characterization of proteinase B, an asparagine – specific endopeptidase”, European Journal of Biochemistry 228, pp. 456-462.

39. Bevan M. (1984), “Binary Agrobacterium vectors for plant transformation”, Nucleic Acids Research 12, pp. 8711-8721.

40. Boulter D., Edwards G.A., Gatehouse A.M.R., Gatehouse J.A., Hilder V.A. (1990), “Additive protective effects of incorporating two different higher plant derived insect resistance genes in transgenic tobaco plants”, Journal of Crop Protection 9, pp. 351-354.

41. Boulter D. (1993), “Insect pest control by copying nature using genetically engineered crops”, Phytochemistry 34, pp. 1453-1466.

42. Bourdon V., Harvey A., Lonsdale D.M. (2001), “ Introns and their positions affect the translational activity of mRNA in plant cells”, EMBO Reports 2, pp. 394-398.

43. Brears T., Walker E.L., Coruzzi G.M. (1991), “A promoter sequence involved in cell-specific expression of the pea glutamine synthetase GS3A gene in organs of transgenic tobacco and alfalfa”, The Plant Journal 1, pp. 235-244.

129

44. Brock T.D., Madigan M.T. (1991), Biology of microorganisms, Prentice-Hall International Editions, pp. 301-302, 663-666.

45. Burkness E.C., Hutchison W.D., Bolin P.C., Bartels D.W., Warnock D.F., Davis D.W. (2001), “Field efficacy of sweet corn hybrids expressing a Bacillus thuringiensis toxin for management of Octrinia nubilalis (Lepidoptera: Crambidae) and Helicoverpa zea (Lepidoptera: Noctuidae)”, Journal of Economic Entomology 94(1), pp. 197-203.

46. Callis J., Fromm M., Walbot V. (1987), “Introns increase gene expression in cultured maize cells”, Gene and Development 1(10), pp. 1183-1200.

47. Carozzi N.B., Warren G.W., Desai N., Jayne S.M., Lotstein R., Rice D.A., Evola S., Koziel M.G. (1992), “Expression of a chimeric CaMV35S Bacillus thuringiensis insecticidal protein gene in transgenic tobacco”, Plant Molecular Biology 20, pp. 539-548.

48. Chakrabarti S.K., Mandaokar A.D., Kumar A.P., Sharma R.P. (1998), “Synergistic effect of CryIAc and CryIF δ-endotoxons of Bacillus thuringiensis on cotton bollworm, Helicoverpa armigera”, Current Science 75 (7), pp. 663-664.

49. Chan M.T., Lee T.M., Chang H.H. (1992), “Transformation of indica rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens”, Plant Cell Physiology 33, pp. 577-583.

50. Chaubet-Gigot N., Kapros T., Flenet M., Kahn K., Gigot C., Waterborg J.H. (2001), “Tissue-specific enhancement of transgene expression by introns of replacement histone H3 genes of Arabidopsis”, Plant Molecular Biology 45, pp. 17-30.

130

51. Chen L., Marmey P., Taylor N.J., Brizard J., Espinoza C., D’Cruz P., Huet H., Zhang S., de Kocho A., Beachy R.N., Fauquet C.M. (1998), “Expression and inheritance of multiple transgenes in rice plants”, Nature Biotechnology 16, pp. 1060-1064.

52. Cheng X., Sardana R., Kaplan H., Altosaar I. (1998), “Agrobacterium - transformed rice plants expressing synthetic cryIA(b) and cryIA(c) genes are highly toxic to striped stem borer and yellow stem borer”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 95, pp. 2767-2772.

53. Cheong H., Gill S.S. (1997), “Cloning and characterization of a cytolytic and mosquitocidal δ-endotoxin from Bacillus thuringiensis subsp. jegathesan”, Applied and Environmental Microbiology 63 (8), pp. 3254-3260.

54. Chilton M.D. (2001), “Agrobacterium. A Memoir”, Plant Physiology 125, pp. 9-14.

55. Christensen A.H., Sharrock R.A., Quail P.H. (1992), “Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation”, Plant Molecular Biology 18, pp. 675-689.

56. Christensen A.H., Quail P.H. (1996), “Ubiquitin promoter - based vectors for high-level expression of selectable and/ or screenable marker genes in monocotyledonous plants”, Transgenic Research 5, pp. 213-218.

57. Christou P. (1996), “Transformation technology”, Trends in Plant Science 1 (12), pp.423-431.

131

58. Clancy M., Hannah L.C. (2002), “Splicing of the maize Sh1 first intron is essential for enhancement of gene expression, and a T-rich motif increases expression without affecting splicing”, Plant Physiology 130, pp. 918-929.

59. Cornejo M.J., Luth D., Blankenship K.M., Anderson O.D., Blechl A.E. (1993), “Activity of a maize ubiquitin promoter in transgenic rice”, Plant Molecular Biology 23 (3), pp. 567-581.

60. Dale E.C., Ow D.W. (1991), “Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 88, pp. 10558-10562.

61. Daniel M. B., Michael D. R., Edelstein S. J. (1996), Protein methods, 2d Ed Wiley-Liss, Inc.

62. Datta K., Vasquez A., Tu J., Torrizo L., Alam M.F., Oliva N., Abrigo E., Khush G.S., Datta S.K. (1998), “’Constitutive and tissue-specific differential expression of the cryIA(b) gene in transgenic rice plants conferring resistance to rice insect pest”, Theoretical Applied Genetics 97, pp.20-30.

63. De Cosa B., Moar W., Lee S-B., Miller M., Daniell H. (2000), “Overexpression of the Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal crystals”, Nature Biotechnology 19, pp. 71-74.

64. De la Riva G.A., Adang M.J. (1996), “Expression of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin genes in transgenic plants”, Biotechnologia Aplicada 13(4), pp. 169-174.

65. Dean D.H., Adang M.J. (1992), “Protein engineering of Bacillus thuringiensis δ-endotoxins and genetic manipulation for

132

plant protection”, In: Plant Protein Engineering, Shewry P.R., Gutteridge S. (Eds.), Cambridge University Press, Cambridge, UK, pp. 293-311.

66. Deblaere R., Reynaerts A., Hofte H., Hernalsteens J.D., Leemans J., Van Montagu M. (1987), “Vector for cloning in plant cells”, Methods in Enzymology 153, pp. 277-292.

67. Diehn S.H., Chiu W.L., De Rocher E.J., Green P.J. (1998), “Premature polyadenylation at multiple sites within a Bt toxin gene-coding region”, Plant Physiology 117, pp. 1433-1443.

68. Dina K.J., Thyge O.F., Guldager p.S., Kirsten B., Anna H., Morten J., John N., Iain D. (1998), “Mannozase or xylose based positive selection”, Patent US5767378.

69. Ding X., Gopalakrishnan B., Johnson L.B., White F.F., Wang X., Morgan T.D., Kramer K.J., Muthucrishnan S. (1998), “Insect resistance of transgenic tobacco expressing an insect chitinase gene”, Transgenic Research 7, pp. 77-84.

70. Douglas C.J., Hauffe K.D., Ites-Morales M.E., Ellard M., Paszkowski U., Hahlbrock K., Dangl J.L. (1991), “Exonic sequences are required for elicitor and light activation of a plant defense gene, but promoter sequences are sufficient for tissue specific expression”, The EMBO Journal 10(7), pp. 1767-1775.

71. Draper J., Scott R., Armitage P. (1988), Plant genetic transformation and gene expression: A laboratory manual, Blackwell Scientific Publications, pp. 3-160.

72. Duan X., Li X., Xue Q.Z., Abo-El-Saad M., Xu D., Wu R. (1996), “Transgenic rice plants harboring an introduced potato

133

proteinase inhibitor II gene are insect resistant”, Nature Biotechnology 14, pp. 494-498.

73. Edmonds H.S., Gatehouse L.N., Hilder V.A., Gatehouse J.A. (1996), “The inhibitory effects of the cysteine protease inhibitors, oryzacystatin, on digestive proteases and on larval survival and development of the southern corn rootworm (Diabrotica undecimpunctata howard)”, Entomologia Experimentalis et Applicata 78, pp. 83-94.

74. Edwards K., Johnstone C. (1991), “A simple rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR”, Nucleic Acids Research 19, pp. 1349.

75. Estruch J.J., Carozzi N.B., Desai N., Duck N.B., Warren G.W., Koziel M.G. (1997), “Transgenic plants: an emerging approach to pest control”, Nature Biotechnology 15, pp. 137-141.

76. Fedoroff N.V., Cohen J.E. (1999), “Plants and population: Is there time?”, Proceedings of the National Academy Sciences of the USA 96, pp. 5903-5907.

77. Finardi-Filho F., Mirkov T.E., Chrispeels M.J. (1996), “A putative precursor protein in the evolution of the bean α-amylase inhibitor”, Phytochemistry 43(1), pp. 57-62.

78. Firoozabady E., DeBoer D.L., Merlo D.J., Halk E.L. (1987), “Transformation of cotton (Gossypium hirsutum L.) by Agrobacterium tumefaciens and regeneration of transgenic plants”, Plant Molecular Biology 10, pp. 105-116.

79. Fischoff D.A., Bowdis K.S. (1987), “Insect tolerant transgenic tomato plant”, Biotechnology 5, pp. 807.

134

80. Frame B.R., Shou H., Chikwamba R.K., Zhang Z., Xiang C., Fonger T.M., Pegg S.E.K., Li B., Nettleton D.S., Pei D., Wang K. (2002), “Agrobacterium tumefaciens - mediated transformation of maize embryos using a standart binary vector system”, Plant Physiology 129, pp. 13-22.

81. Gallie D.R., Young T.E. (1994), “The regulation of gene expression in transformed maize aleurone and endosperm protoplasts. Analysis of promoter activity, intron enhancement, and mRNA untranslated regions on expression”, Plant Physiology 106(3), pp. 929-939.

82. Gasson M.J. (2000), “Gene transfer from genetically modified food”, Current Opinion in Biotechnology 11, pp. 505-508.

83. Gasson M., Burke D. (2001), “Scientific perspectives on regulating the safety of genetically modified foods”, Nature Reviews Genetics, pp. 217-222.

84. Gatehouse A.M.R., Hilder V.A., Powell K.S., Wang M., Davison G.M., Gatehouse L.N., Down R.E., Edmonds H.S., Boulter D., Newell C.A., Merryweather A., Hamilton W.D.O, Gatehouse J.A. (1994), “Insect-resistance transgenic plants: Choosing the gene to do the ‘job’ ”, Biochemical Society Transactions 22, pp. 944-949.

85. Gatehouse A.M.R., Bown D.P., Wilkinson H.S., Down R.E., Ford L., Gatehouse J.A. (1998), “The use of transgenic plants for the control of insect pests”, BCPC Symposium Proceedings 71: Biotechnology in crop protection: Facts and fallacies, pp. 25-32.

135

86. Gill S.S., Cowles E.A., Pietrantonio P.V. (1992), “The mode of action of Bacillus thuringiensis endotoxins”, Annual Review of Entomology 37, pp. 615-636.

87. Gordon M.P. (1998), “Discovery of the T-DNA of Agrobacterium tumefaciens”, In: Discoveries in plant biology I, Kung S-D., Yang S-F. (Eds.), World Scientific Publishing, Singapore, New Yersey, London, Hong Kong, pp. 111-113.

88. Graham J., Gordon S.C., McNicol R.J. (1997), “The effect of the CpTI gene in strawberry against attack by vine weevil (Otiorhynchus sulcatus F. Coleoptera: Curculionidae)”, Annals Applied Biology 131, pp. 133-139.

89. Grochulski P., Masson L., Borisova S., Pusztai - Carey M., Schwartz J.L., Brousseau R., Cygler M. (1995), “Bt CryIA(a) insecticidal toxin: crystal structure and channel formation”, Journal of Molecular Biology 254, pp. 447-464.

90. Hajdukiewicz P., Svab Z., Maliga P. (1994), “The small, versatile pPZP familly of Agrobacterium binary vectors for plant transformation”, Plant Molecular Biology 25, pp 989-994.

91. Hallahan D.L., Pickett J.A., Wadham L.J., Wallsgrove R.M., Woodcock C.M. (1992), “Potential of secondary metabolites in genetic engineering of crops for resistance”, In: Plant Genetic Manipulation for Crop Protection, Gatehouse A.M.R., Hilder V.A., boulter D. (Eds.), CAB International, Wallingford, pp. 215-248.

92. Hames B.D., Rickwood D. (1989), Gel electrophoresis of protein: A practical apporoach, 2 end IRL, Press, Oxford.

136

93. Hamilton C.M., Frary A., Lewis C., Tanksley S.D. (1996), “Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 93, pp. 9975-9979.

94. Hamilton C.M. (1997), “A binary - BAC system for plant transformation with high-molecular - weight DNA”, Gene 200, pp. 107-116.

95. Hedley P.E., Maddison A.L., Davidson D., Machray G.C. (2000), “Differential expression of invertase genes in internal and external phloem tissues of potato (Solanum tuberosum L.), Journal of Experimental Botany 51(345), pp. 817-821.

96. Hellens R. (2000), “pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation”, Plant Molecular Biology 42, pp. 819-832.

97. Hellens R., Mullineaux P. (2000), “A guide to Agrobacterium binary Ti-vectors”, Trends in Plant Science 5, pp. 446-451.

98. Hemmer W. (1997), “Foods derived from genetically modified organisms and detection methods”, Http:/www.bats.ch/abstr/297intro.htm.

99. Herrera-Estrella L., Depicker A., Van Montagu M., Schell J. (1983), “Expression of chimeric genes transferred into plant cells using a Ti plasmid-derived vector”, Nature 303, pp. 209-213.

100. Herrera-Estrella L. (2000), “Genetic modified crops and developing countries”, Plant Physiology 124, pp. 923-925.

137

101. Herrera-Estrella L., Alvarez-Morales A. (2001), “Genetically modified crops: hope for developing countries?”, EMBO Reports 2(4), pp. 256-258.

102. Hiei Y., Ohta S., Komari T., Kumasho T. (1994), “Efficient transformation of rice (Oryza sativa L.) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA”, The Plant Journal 6, pp. 271-282.

103. Hilder V.A., Boulter D. (1999), “Genetic engineering of crop plants for insect resistance - a critical review”, Crop Protection 18, pp. 177-191.

104. Hoekema A., Hirsch P.R., Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A. (1983), “A binary plant vector strategy based on separation of vir and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid”, Nature 303, pp. 179-180.

105. Hoekema A., Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A. (1984), Transfer or the octopine T-DNA segment to plant cells mediated by different types of Agrobacterium tumor- or root-inducing plasmids: Generality of virulence systems, Journal of Bacteriology 158, pp. 383-385.

106. Hoffmann M.P., Zalom F.G., Wilson L.T., Smilanick J.M., Malyj L.D., Kiser J., Hilder J.A., Barnes W.M. (1992), “Field evaluation of transgenic tobacco containing genes encoding Bacillus thuringiensis δ-endotoxin or cowpea trypsin inhibitor: Efficacy against Heliocoverpa zea (Lepidopteran: Noctuidae)”, Journal of Economic Entomology 6, pp. 2516-2522.

138

107. Hofte H., Whiteley H.R. (1989), “Insecticidal proteins of Bacillus thuringiensis”, Microbiology Review 53 (2), pp. 242-255.

108. Holster M., De Waele D., Depicker A., Messens E., Van Montagu M., Schell J. (1987), “Transfection and transformation of A. tumefaciens”, Molecular and General Genetics 163, pp. 181-187.

109. Hooykaas P.J.J., Schilperoort R.A. (1992), “Agrobacterium and plant genetic engineering”, Plant Molecular Biology 19, pp. 15-38.

110. Horsch R.B., Fraley R.T., Rogers S.G., Sanders P.R., Lloyd A., Hoffmann N. (1984), “Inheritance of functional foreign genes in plants”, Science 223, pp. 496-498.

111. Huang J.W., Chen J.T., Yu W.P., Shyur L.F., Wang A.Y., Sung H.Y., Lee P.D., Su J.C. (1996), “Complete structures of three rice sucrose synthase isogenes and differential regulation of their expressions”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 60, pp. 233-239.

112. Ishida Y., Saito H., Ohta S., Hiei Y., Komari T., Kumashiro T. (1996), “High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens”, Nature Biotechnology 14, pp. 745-750.

113. Ishimoto M., Chrispeels M.J. (1996), “Protective mechanism of the Mexican bean weevil against high levels of α-amylase inhibitor in the common bean”, Plant Physiology 111, pp. 393-401.

114. James C., Krattiger A.F. (1996), “Global review of the field testing and commercialization of transgenic plants, 1986 to

139

1995: The first decade of crop biotechnology”, ISAAA Briefs 1, pp. 1-31.

115. James C. (1997), “Global status of transgenic crops in 1997”, ISAAA Briefs 5, pp. 1-27.

116. James C. (2000), “Preview: Global review of commercialized transgenic crops: 2000”, ISAAA Briefs 21, pp. 1-15.

117. James C. (2001), “Preview: Global review of commercialized transgenic crops: 2001”, ISAAA Briefs 24, pp. 1-20.

118. Jang I.C., Choi W.B., Lee K.H., Song S.I., Nahm B.H., Kim J.K. (2002), “High level and ubiquitous expression of the rice cytochrome c gene OsCc1 and its promoter activity in transgenic plants provides a useful promoter for transgenesis of monocots”, Plant Physiology 129, pp. 1473-1481.

119. Jefferson R.A., Kavanagh T.A., Bevan M.W. (1987), “GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants”, The EMBO Journal 6, pp. 3901-3907.

120. Jouanin L., BonadÐ-Bottino M., Giard C., Morrot G., Giband M. (1998), “Transgenic plant for insect resistance”, Plant Science 131(1), pp. 1-11.

121. Kaur S. (2000), “Molecular approaches towards development of novel Bacillus thuringiensis biopesticides”, World Journal of Microbiology and Biotechnology 16, pp. 781-793.

140

122. Kay R., Chan A., Daly M., McPherson J. (1987), “Duplication of CaMV 35S promoter sequences creates a strong enhancer for plant genes”, Science 236, pp.1299-1302.

123. Knowles B.H., Dow J.A.T. (1993), “The crystal δ-endotoxin gene of Bacillus thuringiensis: Modes of action on the insect gut”, BioEssays 15, pp. 469-476.

124. Komari T., Hiei Y., Saito Y., Murai N., Kumashiro T. (1996), ”Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers”, The Plant Journal 10(1), pp.165-174.

125. Koziel M.G., Beland G.L., Bowman C., Carozzi N.B., Crenshaw R., Crossland L., Dawson J., Desai N., Hill M., Dadwell S., Lewis K., Maddox D., McPherson K., Meghji R., Merlin E., Rhodes R., Warren G.W., Wright M., Evola S.V. (1993a), “Field performance of elite transgenic maize plant expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis”, Bio/Technology 11, pp. 194-200.

126. Koziel M.G., Caozi N.B., Curier T.C., Warren G.W., Evola S.V. (1993b), “The insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis: Past, present and future use”, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 11, pp. 171-228.

127. Krattiger A.F. (1997), “Insect resistance in crops: A case study of Bacillus thuringiensis and its transfer to developing countries”, ISAAA Briefs 2, pp. 1-42.

128. Laemmli U.K. (1970), “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4”, Nature 227, pp. 680-685.

141

129. Laporte M.M., Galagan J.A., Prasch A.L., Vanderveer P.J., Hanson D.T., Shewmaker C.K., Sharkey T.D. (2001), “Promoter strength and tissue specificity effects on growth of tomato plants transformed with maize sucrose-phosphate synthase”, Planta 212(5-6), pp. 817-822.

130. Larkin J.C., Oppenheimer D.G., Pollock S., Marks M.D. (1993), “Arabidopsis Glabrous1 gene requires downstream sequences for function”, The Plant Cell 5, pp. 1739-1748.

131. Last R.L., Rose A.B. (1999), “Methods & compositions for enhancing the expression of genes in plants”, Patent US5861277.

132. Lazzeri P.A. (1998), “Techniques for the development of transgenic crops in crop protection”, BCPC Symposium proceedings 71: Biotechnology in crop protection: Facts and fallacies, pp. 3-9.

133. Lewin B. (1997), Genes VI, Oxford University Press, Oxford-New York- Tokyo.

134. Li J., Caroll J., Ellar D.J. (1991), “Crystal structure of insecticidal -endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5∑ resolution”, Nature 353, pp. 815-821.

135. Luehrsen K.R., Walbot V., (1991), “Intron enhancement of gene expression and the splicing efficiency of introns in maize cells”, Molecular and General Genetics 225, pp, 81-93.

136. Luehrsen K.R., Walbot V., (1994), “Addition of A-and U-rich sequence increases the splicing efficiency of a deleted form of a maize intron”, Plant Molecular Biology 24, pp. 449-463.

142

137. Ma H., Yanofsky M.F., Klee H.J., Bowman J.L., Meyerowitz E.M. (1992), “Vectors for plant transformation and cosmid libraries”, Gene 117, pp. 161-167.

138. Malone L.A., Giacon H.A., Burgess E.P.J., Maxwell J.Z., Christeller J.T., Laing W.A. (1995), “Toxicity of trypsin endopeptidase inhibitors to honey bees (Hymenoptera: Apodae)”, Journal of Economic Entomology 88, pp. 46-50.

139. Mascarenhas J.P., Hamilton D.A. (1992), “Artifacts in the localization of GUS activitiy in anthers of petunia transformed with CaMV 35S- GUS construct”, The Plant Journal 2(3), pp 405-408.

140. McBride K.E., Summerfelt K.R. (1990), “Improved binary vectors for Agrobacterium - mediated plant transformation”, Plant Molecular Biology 14, pp. 269-276.

141. McCormac A.C., Elliott M.C., Chen D.F. (1998), “A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation”, Molecular Biotechnology 9 (2), pp. 155-159.

142. McCormac A.C., Elliot M.C., Chen D.F. (1999), “pBECKS2000: a novel plasmid series for the facile creation of complex binary vectors, which incorporates "clean-gene" facilities”, Molecular and General Genetics 261, pp. 226-235.

143. McElroy D., Zhang W., Cao J., Wu R. (1990), “Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation”, The Plant Cell 2, pp. 163-171.

144. McLean B.G., Greene E.A., Zambryski P.C. (1994), “Mutants of Agrobacterium VirA that active vir gene expression in the

143

absence of the inducer acetosyringone”, The Journal of Biological Chemistry 269 (4), pp. 2645-2651.

145. Merritt C.R. (1998), “The commercialization of transgenic crops-the Bt experience”, BCPC Symposium Proceedings 71: Biotechnology in crop protection: Facts and fallacies, pp. 79-86.

146. Michaud D. (1997), “Avoiding protease-mediated resistance in herbivorous pests”, Trends in Biotechnology 15, pp. 4-6.

147. Mooney P.A., Goodwin P.B., Dennis E.S., Liewellyn D.J. (1991), “Agrobacterium tumefaciens-gene transfer into wheat tissues”, The Journal of Plant Cell Tissue and Organ Culture 25, pp.209-218.

148. Moreno J., Altabella T., Chrispeels M.J. (1990), “Characterization of α-amylase- inhibitor, a lectin-like protein in the seeds of Phaseolus vulgaris”, Plant Physiology 92, pp. 703-709.

149. Muramatsu M., Fukazawa C. (1993), “A high-order structure of plant storage proprotein allows its second conversion by an asparagine-specific cysteine protease, a novel proteolytic enzyme”, European Journal of Biochemistry 215, pp. 123-132.

150. Murray M.G., Thompson W.F. (1980), “Rapid isolation of high molecular weight plant DNA”, Nucleic Acids Research 8, pp. 4321-4325.

151. Nayak P., Basu D., Das S., Basu A., Ghosh D., Ramakrishnan N.A., Ghosh M., Sen S. K. (1997), “Transgenic elite indica rice plants expressing CryIAc -endotoxin of Bacillus thurigiensis are resistant against yellow stem borer

144

(Scirpophaga incertular)”, Agricultural Sciences 94, pp. 2111-2116.

152. Negrotto D., Jolley M., Beer S., Wench A.R., Hansen G. (2000), “The use of phosphomannozase-isomerase as a selectable marker to recover transgenic maize plants (Zea mays L.) via Agrobacterium transformation”, Plant Cell Reports 19, pp. 798-803.

153. Odell J.T., Knowlton S., Lin W., Mauvais C.J. (1988), “Properties of an isolated transcription stimulating sequence derived from the cauliflower mosaic virus 35S promoter”, Plant Molecular Biology 10, pp. 263-272.

154. Oerke E.C., Dehne H.W., Schonbeck F., Weber A. (1994), Crop production and crop protection: Estimated losses in major food and cash crops, Elsevier, Amsterdam.

155. Olhoft P.M., Somers D.A. (2001), “L-cysteine increases Agrobacterium-mediated T-DNA delivery into soybean cotyledonary-node cells”, Plant Cell Reports 20, pp. 706-711.

156. Panbangred W., Panjaisee S., Tantimavanich S. (2000), “Expression of the mosquitocidal cryIVB gene under the control of different promoters in Bacillus sphaericus 2362 and acrystalliferous Bacillus thuringiensis subsp. israelensis c4Q2-72”, World Journal of Microbiology and Biotechnology 16, pp. 163-169.

157. Perlak F.J., Deaton R.W., Amstrong T.A., Fuchs R.L., Sims S.R., Greenplate J.T., Fischhoff D.A. (1990), “Insect resistant cotton plants”, Bio/Technology 8, pp. 939-943.

145

158. Perlak F.J., Fuchs R.L., Dean D.A., McPherson S.L., Fischhoff D.A. (1991), “Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 88, pp. 3324-3328.

159. Plesse B., Criqui M-C., Durr A., Parmentier Y., Fleck J., Genschik P. (2001), “Effects of the polyubiquitin gene Ubi.U4 leader intron and first ubiquitin monomer on reporter gene expression in Nicotiana tabacum”, Plant Molecular Biology 45, pp. 655-667.

160. Purcell J.P., Greenplate J.T., Jennings M.G., Ryers J.S., Pershing J.C., Sims S.R., Prinsen M.J., Corbin D.R., Tran M., Sammons R.D., Stonard R.J. (1993), “Cholesterol oxidase: A potent insecticidal protein active against bollweevil larvae, Biochemical and Biophysical Research Communications 196, pp. 1406-1413”.

161. Rajamohan F., Cotrill J.A., Gould F., Dean D.H. (1996), “Role of domain II, loop 2 residues of Bt CryIAb δ-endotoxin in reversible and irreversible binding to Manduca sexta and Heliothis virescens”, Journal of Biological Chemistry 271, pp. 2390-2397.

162. Rajamohan F., Dean D.H. (1996), “Chapter 7. Molecular biology of bacteria on biologicial control of insects”, In: Molecular biology of the biological control of pests and diseases of plants, Gunasekaran M., Weber D.J. (Eds.),CRC Press, Boca Raton, Florida, pp. 105-122.

163. Rao K.V., Rathore K.S., Hodges T.K., Fu X., Stoger E., Sudhakar D., Williams S., Christou P., Bharathi M., Bown

146

D.P., Powell K.S., Spence J., Gatehouse A.M., Gatehouse J.A. (1998), “Expression of snowdrop lectin (GNA) in transgenic rice plants confers resistance to rice brown planthopper”, Plant Jounal 15(4), pp. 469-477.

164. Rasul N.M., Mohammad K., Islam M.R., Seraj Z.I. (1997), “Tranformation of an indica rice cultivar Binnatoa with Agrobacterium tumefaciens”, Plant Tissue Culture 7(2), pp. 71-80.

165. Reeck G.R., Kramer K.J., Baker J.E., Kanost M.R., Fabrick J.A., Behnke C.A. (1997), “Proteinase inhibitors and resistance of transgenic plants to insect. In: Advance in insect control: The role of transgenic plant, Carozzi N., Koziel M. (Eds.), Taylor and Francis, London, pp. 157-183.

166.Riazuddin S., Husnain T., Khan E., Karim S., Khanum M., Altosaar I. (1996), “Transformation of indica rice with Bt pesticidal genes”, In: Rice Gentics III, pp. 730-734.

167. Robert L. (1998), “Flower-specific promoters”, PBI Bulletin, Http://www.pbi.nrc.ca/cgi-bin/bulletin/may98.sh?promoters.html.

168. Rose A.B., Beliakoff J.A. (2000), “Intron-mediated enhancement of gene expression independent of unique intron sequence and splicing”, Plant Physiology 122, pp. 535-542.

169. Roush R.T. (1994), “Managing pests and their resistance to Bacillus thuringiensis: Can transgenic crops be better than sprays?” Biocontrol Science and Technology 4, pp. 501-516.

147

170. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. (1989), Molecular cloning I, III: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, I (1.21-1.67), III (Appendix A, B).

171. Sanchis V.D., Lereclus G., Menou G., Chaufaux J., Lecadeet M.-M. (1988), “Multiplicity of delta-endotoxin genes with different insecticidal specificities in Bacillus thuringiensis aizawai 7.29”, Molecular Microbiology 2, pp. 393-404.

172. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. (1977), “DNA sequencing with chain termination inhibitors”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 74, pp. 5463-5467.

173. Sardana R., Altosaar I. (1996), “Identification and use of specific promoters and synthetic Bacillus thuringiensis toxin genes in rice biotechnology”, In: Rice Genetics III, pp. 723-729.

174. Sardana R., Dukiandjiev S., Giband M., Cheng X., Cowan K., Sauder C., Altosaar I. (1996), “Construction and rapid testing of synthetic and modified toxin gene sequences CryIA (b&c) by expression in maize endosperm culture”, Plant Cell Reports 15, pp. 677-681.

175. Sarma K.S., Sunilkumar G., Balamani V., Veluthambi K. (1995), “GUS activity and generation of transformed shoot buds are highly correlated in Agrobacterium- transformed tobacco”, Plant Molecular Biology Reporter 13(3), pp. 377-382.

176. Schledzewski K., Mendel R. (1994), “Quantitative transient gene expression: Comparison of the promoters for maize polyubiquitin 1, rice actin 1, maize derived Emu and CaMV

148

35S in cells of barley, maize and tobacco”, Transgenic Research 3, pp. 249-255.

177. Schnepf H.E., Whitely H.R (1981), “Cloning and expression of the Bacillus thuringiensis crystal protein gene in Escherichia coli”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 78, pp. 2893-2897.

178. Shewry P.S., Lucas J.A. (1997), “Plant proteins that confer resistance to pests and pathogens”, Advances in Botanical Research 26, pp. 1351-1392.

179. Shimamoto K. (1991), “Transgenic rice plants”, In: Molecular approachs to crop improvement, Dennis E.S., Llewellyn D.J. (Eds.), Springer- Verlag, Wien, NewYork, pp. 1-15.

180. Smith R.H., Hood E.E.(1995), “Agrobacterium tumefaciens transformation of monocotyledons”, Crop Science 35(2), pp. 301-309.

181. Stewart C.N., Adang M.J., All J.N., Boerma H.R., Cardineau G., Tucker D., Parrott W.A. (1996), “Genetic transformation, recovery, and characterization of fertile soybean transgenic for a synthetic Bacillus thuringiensis cryIA(c) gene”, Plant Physiology 112, pp. 121-129.

182. Stewart S.D., Adamczyk J.J., Knighten K.S., Davis F.M. (2001), “Impact of Bt cottons expressing one or two insecticidal proteins of Bacillus thuringensis Berliner on growth and survival of noctuid (Lepidoptera) larvae”, Journal of Economic Entomology 94(3), pp. 752- 760.

183. Studier F.W., Rosenberg A.H., Dunn J.J., Dubendorff J.W. (1990), “Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes”, Methods in Enzymology 185, pp. 60-89.

149

184. Sudhakar D., Fu X., Stoger E., Williams S., Spence J., Brown D.P., Bharathi M., Gatehouse J.A., Christou P. (1998), “Expression and immunolocalisation of the snowdrop lectin, GNA in transgenic rice plants”, Transgenic Research 7, pp. 371-378.

185. Sutton D.W., Havstad P.K., Kemp J.D. (1992), “Synthetic cryIIIA gene from Bacillus thurigiensis improved for high expression in plants”, Transgenic Research 1, pp. 228-236.

186. Tabashnik B.E. (1994), “Evolution of resistance to Bacillus thuringiensis”, Annual Review of Entomology 39, pp. 47-79.

187. TempÐ J., Goldmann A. (1992), “Occurrence and biosynthesis of opine”, Molecular Biology of Plant Tumors, pp. 427-449.

188. Udayasuriyan Y., Nakamura A., Mori H., Masaki H., Uozumi T. (1994), “Cloning of a new cryIA(a) gene from Bacillus thuringiensis strain FU-2-7 and analysis of chimaric CryIA(a) protein for toxicity”, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 58(5), pp. 830-835.

189. Ulmasov B., Folk W. (1995), “Analysis of the role of 5’ and 3’ flanking sequence elements upon in vivo expression of the plant tRNATrp genes”, The Plant Cell 7(10), pp. 1723-1734.

190. Van Haute E., Joos H., Maes M., Warren G., Van Montagu M., Schell J. (1983), “Intergenic transfer and exchange recombination of restriction fragments cloned in pBR322: A novel strategy for the reversed genetics of Ti-plasmids of Agrobacterium tumefaciens”, The EMBO Journal 2, pp. 411-417.

150

191. Velten J., Schell J. (1985), “Selection-expression plasmid vectors for use in genetic transformation of higher plants”, Nucleic Acids Research 13 (19), pp. 6981-6999.

192. Vijayachandra K., Palanichelvam K., Veluthambi K. (1995), “Rice scutellum induces Agrobacterium tumefaciens vir genes and T-strand generation”, Plant Molecular Biology 29, pp. 125-133.

193. Voisey C.R., White D.W., Wigley P.J., Chilcott C.N., McGregor P.G., Woodfield D.R. (1994), “Release of transgenic white clover plants expressing Bacillus thuringiensis genes: An ecological perspective”, Biocontrol Science and Technology 4, pp. 475-481.

151

194. Walden R., Koncz C., Schell J. (1990), “The use of gene vectors in plant molecular biology”, Methods in Molecular and Cellular Biology 1(516), pp. 175-194.

195. Walden R. (1993), “Cell culture, transformation and gene technology”, In: Plant Biochemistry and Molecular Biology, Lea P.J., Leegood R.C. (Eds.), pp. 276-295.

196. Walden R., Wingender R. (1995), “Gene - transfer and plant - regeneration techniques”, Trends in Biotechnology 13, pp. 324-331.

197. Walkerpeach C.R., Velten J. (1994), “Agrobacterium - mediated gene transfer to plant cells: cointegrate and binary vector systems”, Plant Molecular Biology, Manual B1, pp. 1-19.

198. Walter F.S., Slatin S.L., Kulesza C.A., English L.H. (1993), “Ion channel activity of N-terminal fragments from CryIA(c) delta-endotoxin”, Biochemical and Biophysical Research Communications 196 (2), pp. 921-926.

199. Wang M.B., Boulter D., Gatehouse J.A. (1992), “A complete sequence of the rice sucrose synthase-1 (RSs1) gene”, Plant Molecular Biology 19(5), pp. 881-885.

200. Wolfersberger. (1996), “Site-directed mutations in the third domain of Bacillus thuringiensis delta-endotoxin CryIAa affect its ability to increase the permeability of Bombyx mori midgut brush border membrane vesicles”, Applied and Environmental Microbiology 62 (1), pp. 279-282.

152

201. Wong E.Y., Hironaka C.M., Fischhoff D.A. (1992), “Arabidopsis thaliana small subunit leader and transit peptide enhance expression of Bacillus thuringiensis proteins in transgenic plants”, Plant Molecular Biology 20, pp. 81-93.

202. Wu R. (1998), “Chapter 9. Discovery of transgenic plants”, In: Discoveries in plant biology, Kung S.D., Yang S.F. (Eds.), World Scientific Publishing Co., Singapore, New Yersey, London, Hong Kong, pp. 115-129.

203. Xu D.P., Xue Q.Z., McElroy D., Mawal Y., Hilder V.A., Wu R. (1996), “Constitutive expression of a cowpea trypsin-inhibitor gene, CpTI, in transgenic rice plants confers resistance to 2 major rice insect pests”, Molecular Breeding 2, pp. 167-173.

204. Yang N.S., Russell D. (1990), “Maize sucrose synthase-1 promoter directs phloem cell-specific expression of GUS gene in transgenic tobacco plants”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 87, pp. 4144-4148.

205. Yin Y., Chen L., Beachy R. (1997), “Promoter elements required for phloem-specific gene expression from the RTBV promoter in rice”, The Plant Journal 12, pp. 1179-1188.

206. Yu W.P., Wang A.Y., Yuang R.H., Sung H.Y., Su J.C. (1992), “ Isolation and sequences of rice sucrose synthase cDNA and genomic DNA”, Plant Molecular Biology 18(1), pp. 139-142.

153

207. Zambryski P., Joos H., Genetello C., Leemans J., Van Montagu M., Schell J. (1983), “Ti plasmid vector for the introduction of DNA into plant cells without alteration of their normal regeneration capacity”, The EMBO Journal 2, pp. 2143-2150.

208. Zhu J., Oger P.M., Schrammeijer B., Hooykaas P.J., Farrand S.K., Winans S.C. (2000), “The bases of crown gall tumorigenesis”, Journal of Bacteriology 182 (14), pp. 3885-3895.

209. Zupan J., Zambryski P. (1995), “Transfer of T-DNA from Agrobacterium to the plant cell”, Plant Physiology 107, pp. 1041-1047.

210. Zupan J., Muth T.R., Draper O., Zambryski P. (2000), “The transfer of DNA from Agrobacterium tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights”, The Plant Journal 23, pp. 11-28.

154

Documents

Më ®Çui.vietnamdoc.net/data/file/2015/Thang03/16/tao-chung-vi... · Web viewDo vậy, một yêu cầu cấp bách đặt ra là chúng ta phải tự thiết kế được các