Macrotetrolide Biosynthesis:

A Novel Polyketide Synthase

(beyond type I, II, III paradigm)

명지대학교 생명과학과 권 형 진

개 요

Polyketide의 생합성은 polyketide synthase (PKS)에 의하여 이루어지며, 현재까지 3가지

타입의 PKS가 미생물에서 알려져 있다. 이러한 배경에서 macrotetrolide 생합성 유전자 연구

는 다음과 같은 특이적인 사항을 밝히게 되었다. Macrotetroldie PKS는 다섯 개의 개별적인

ketoacyl synthase (KS), 네 개의 개별적인 ketoreductase (KR)로 구성되어있으나, acyl

carrier protein (ACP)는 포함하지 않는다. Macrotetrolide 생합성에서의 각 KS 와 KR 들의

기능은 이들을 coding 하는 유전자들에 대한 개별적인 유전자 불활성화 작업과 그에 따른 돌

연변이 균주들에 대한 전구체 (nonactic acid)의 투여 실험을 통하여 검증하였다. 또한

Streptomyces lividans에서의 이종 발현을 활용하여 macrotetroldide PKS의 기능을 연구하였

다. 이상의 결과에 근거하여 macrotetrolide 생합성은 ACP의 관련없이, acyl-CoA 에 직접

작용하며, 연속적으로 (noniteratively) 작용하여 C-C 결합과 C-O 결합 모두를 생성하는 새

로운 형태의 PKS 임을 확인하였다. 이러한 발견은 복잡한 천연 물질을 생합성하는 자연계의

다재다능함을 재확인하여주는 것으로서, PKS engineering을 통하여 제작할 수 있는

polyketide 구조의 범위를 확장할 수 있는 새로운 전략을 제시하여준다. 또한 macrotetrolide

PKS는 combinatorial biosynthesis에 이용될 새로운 PKS 유전자원의 탐색에 새로운 이론적

근거를 제시하여줄 것이다.

1. Polyketide 생합성 유전자 연구

Polyketide는 acetate unit의 연속적인 축합에 의하여 생성되는 일련의 천연물질을 통칭하

여 미생물, 곰팡이, 식물에서 두루 발견되어지며, 임상에서 유용하게 이용되어지고 있는 항생

제 (erythromycin, tetracycline, rifamycin), 항진균제 (amphotericin B), 항암제

(daunorubicin, epothiolone), 면역억제제 (FK-506, rapamycin), 고지혈치료제 (lovastatin)

뿐 아니라 가축용이나 농업에 이용되는 생장촉진제 (monensin등의 polyethers), 살충제

(spinosin), 구충제 (avermectin) 등 다양한 구조의 생리 활성 물질들을 포함한다.

미생물에서 특정 대사에 관련된 모든 유전자들이 일반적으로 ‘cluster’를 이루어 유전체

상의 특정 부위에 모여서 존재한다는 사실은 특정 대사물의 생합성 및 그 조절에 관련하는

모든 유전자들을 하나의 연속적인 DNA clone으로서 확보할 수 있다는 장점을 부여하여 준

다. 이에 따라 생합성 유전자군 (biosynthetic gene cluster)의 DNA 정보는 특정 천연 대사물

의 생합성에 관련하는 모든 효소 반응에 대한 설계도를 제공하여 준다는 점에서 그 생합성에

대한 분자유전학적, 생화학적 이해를 진일보시키는 역할을 담당하여 왔다. 일례로서 위에 예

시된 중요 polyketide 화합물은 예외 없이 그 생합성 유전자군이 규명되어져 있다. 그러나 다

양한 고전적 천연물 생합성 연구 기법들이 유전자군의 분리 및 기능 해석에 결정적인 단서들

을 제공하여 주고 있음을 간과하지 말아야 할 것이다.

2. Bacterial polyketide synthase (PKS)

Polyketide는 그 구조적 다양성에도 불구하고 동일한 생합성 기작에 의하여 그 골격이 합

성되어지며, 이 경로를 polyketide pathway라 일컫는다 [1,2]. Polyketide의 탄소 골격은

acyl-thioester 전구체 (일반적으로 malonyl-thioester 또는 methylmalonyl-thioester, 드문 경

우 hydroxymalonyl-thioester; 본 고에서는 단순화를 위하여 hydroxymalonyl-thioester 관련

사항은 다루지 않기로 한다.)의 연속적인 ‘탈탄산화 축합 반응’ (decarboxylative Claisen

condensation)에 의하여 생성된다. 이와 같은 polyketide synthase (PKS)의 축합 반응은 지

방산 생합성 효소 (fatty acid synthase; FAS)의 그것과 동일한 것으로서, 이들 두 효소는 구

조적으로도 매우 유사하다 [3-9]. 현재 진행되어지고 있는 polyketide 생합성에 관한 연구는

대부분 다음의 두 가지 경우에서 그 타당성을 찾고 있다. 첫째는 PKS의 놀라운 특성들 (단백

질 구조 및 작용 기작 등)이 기초 연구 분야에서 효소의 기질 인식, 반응 기작 및 단백질 상

호 작용을 이해할 수 있는 탁월한 소재를 제공하여 주기 때문이다. 둘째는 기존의 유기합성

방법으로 만들 수 없는 복잡한 화학구조들을 유전자 공학을 통한 combinatorial biosynthesis

로서 만들 수 있는 가능성에서 찾는다. 다음에는 현재까지 알려진 bacterial PKS 들의 작용

기작과 그 구조에 대하여 간략히 살펴보기로 하겠다. 우선 알려진 전형적인 PKS에 대하여 살

펴본 후, 이러한 전형에 부합하지 않는 macrotetrolide PKS에 대하여 자세히 논하기로 하겠

다.

가. Type I-PKS

PKS는 효소의 구조적 특성에 따라 세 가지로 구분 되어진다 (figure 1) [5-7,10,11].

Type I-PKS는 연속적으로 (processively 또는 noniteratively) 작용하는 일련의 활성 부위를

갖는 다기능성 (multifunctional) 단백질로 구성되어져 있다. 이때 개별적인 활성 부위를

domain 이라고 하며, 한 주기의 polyketide 골격 연장 과정 (두개의 탄소 단위 연장)을 지정

하는 일련의 domain 집합을 하나의 module 이라고 지칭한다. 그러나 반복적으로 작용하는

type I-PKS도 존재하며, 기실 type I-FAS와 같이 fungal PKS는 반복적으로 작용하는 type

I-PKS이지만 본 고 에서는 bacterial PKS에 국한하여 기술하기로 한다. Iterative bacterial

type I-PKS의 존재가 보고된 것은 1997년도이지만 [12], 그 중요성이 부각되어진 것은 최근

이들이 중요 생리활성물질의 생합성을 지정한다는 것이 밝혀지면서라 하겠다. 이의 대표적인

예가 eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5ω3) 또는 docosahexaenoic acid (DHA, 22:6ω3)의

생합성을 지정하는 type I PKS [13-16] 와 enediyne 생합성을 지정하는 type I PKS이다

[17,18]. 그러나 효소학적인 측면에서 보면 이들 두 특이 type I PKS의 작용 기작에 관하여

서는 어떠한 실험적 증명도 제시된 바 없다. 최근에는 stigmatellin, borrelin 생합성 유전자군

에서와 같이 type I PKS에서 특정 module이 반복적으로 작용하는 경우도 보고되어져 있어

type I PKS의 구조적, 기능적 다양성을 실증하여 주고 있다 [19,20].

전형적인 module의 최소한의 구성은 extender unit (malonyl-CoA or

methylmalonyl-CoA을 선별․전이하는 acyltransferase (AT) domain, extender unit이 AT에 의

하여 전이되어 결합되는 acyl carrier protein (ACP) domain, 그리고 ketoacylsynthase (KS)

domain 이다. KS는 polyketide 골격의 연장을 위하여 활성 부위에 결합된 두 개의 acyl

thioester들 (KS의 catalytic residue인 cysteine-sulfhydryl에 결합된 acyl 잔기와 ACP의

serine-phophopantetheinyl-sulfhydryl에 결합된 malonyl 또는 methylmalonyl) 상호간의 축합

을 지정하는 핵심 활성 부위이다. Type I PKS 에 있어 첫 acyl-CoA (starter unit)에 대하여

서는 loading domain이라하는 특수화된 활성 부위가 존재하며 (figure 1A), loading domain

을 포함하는 'priming' module의 일반적인 구조는 AT/ACP 또는 A (adenylation

domain)/ACP 이다 [21]. Adenylation domain은 CoA-ligase 와 유사한 활성을 수행하여 특

정 carboxylate 구조를 acyl-AMP 로 활성화하여 ACP의 활성 부위에 acyl-thioester를 형성

한다 (CoA-ligase의 경우 ACP 대신 CoA-sulfhydryl에 acyl-thioester가 형성된다).

Adenylation domain은 non-ribosomal peptide synthase에서 type I PKS의 AT에 해당하는

활성부위이다 [21,22].

이외에도 각 module에는 β-hydroxyl 작용기 형성을 위한 ketoreductase (KR), alkene 작

용기 형성을 위한 KR/dehydratase (DH), alkane 작용기 형성을 위한 KR/DH/enoyl

reductase (ER), α-위치의 탄소에 methyl 가지를 형성하는 methyltransferase (MT) domain

등이 선택적으로 존재한다 [5,6] (figure 1BC). Type I-PKS에 의하여 생합성 되는

Polyketide 골격 구조의 다양성은 1) 다양한 starter unit에 대한 선택성 (대표적으로

erythromycin의 isopropyl-CoA, rifamycin의 aminohydroxybenzoyl-CoA) 2) AT의 선택성

(malonyl 또는 methylmalonyl), 3) KS 또는 KS/KR의 입체화학 선택성 (methylmalonyl에서

유래하는 α-탄소 위치의 입체화학 결정), 4) 각 module 에 포함되는 KR/DH/ER 에의 선택

성, 5) KR domain의 입체화학 선택성, 6) module 숫자에 따른 골격 길이의 선택성, 7) 골격

완성 후 최종 ACP로부터 해리되어지는 과정에서의 선택성 (intramolecular lactonization,

intramolecular lactamization, reductive cleavage 등 그리고 intramolecular cyclizations에서

의 ring size에 대한 선택성) 등의 다양한 선택을 통하여 이루어진다. Type I PKS에 있어서

module 의 구성 및 그 순서 (작용 순서를 뜻하며 유전자 배열 순서와는 다를 수 있다.)가 결

국 생산되는 polyketide의 구조를 결정함은 module 전체 또는 module 내의 domain 들을 변

형하여 새로운 구조의 polyketide 구조 생산을 유도하는 combinatorial biosynthesis를 가능

하게 하였다. 이와 같은 module theory에 근거하여 PKS 유전자를 인위적으로 조작 (module

또는 domain의 치환, 삭제, 첨가, 위치 변겅, 선택적인 mutation 도입을 통한 domain의 화

학적 특이성 변형 등)을 통하여 원하는 polyketide 생산을 유도한 많은 예가 이미 보고되어져

있다 [4-6,23-26]. 이와 같은 유전자의 combination 작업의 괄목할만한 발전은 각 module

간의 상호 인지 기작에 대한 분자 수준에서의 이해 (linker theory)에서 그 이론적 뒷받침을

받고 있다 [27].

나. Type II-PKS

Type II-PKS는 하나의 생화학적 반응을 지정하는 다수 효소들의 complex이며, 각 효소

기능들은 FAS (type I과 type II 모두 해당)에서와 같이 각 decarboxylative Claisen

condensation 주기 마다 반복적으로 (iteratively) 작용한다. Type II-PKS는 단기능성

(monofunctional) 효소들로 구성되어있고 type I-PKS는 다기능성 효소들로 이루어져 있다는

것이 가장 근본적인 구분 기준이 되겠다.

전형적인 type II-PKS는 KSα, KSβ 와 ACP로 구성되어져있다. KSβ의 존재가 type

II-PKS와 type II-FAS의 가장 두드러진 구조적 차이점이라 하겠다. KSβ는 기실 KS의

catalytic residue인 cysteine이 존재하지 않으며 따라서 Claisen condensation을 매개할 수

없다. 대신 'chain length factor' [28] 또는 'chain initiation factor' [29]로서 작용하는 것으

로 알려져 있다. 전자의 경우 KSα와의 heterodimer 형성을 통하여 ‘substrate-binding

pocket’의 크기 및 모양을 결정하여 polyketide 골격 길이의 한계를 지정한다는 가설이며, 후

자는 cysteine을 대치하는 glutamine의 역할에 기초하여 starting unit로서 도입된 malonyl 잔

기의 탈탄산화 (decarboxylation)을 촉진함으로써 starting unit이 acetate로 되도록 하는 기

능이다. ACP가 그 자체로서 malonyl-CoA를 기질로 이용하여 malonyl-thioester를 형성하는

self-malonylation이 in vitro에서 관찰된 보고가 있으나, 일반적으로는 ACP의

malonyl-thioester 형성은 이를 지정하는 특정 효소, malonyl-CoA:ACP transferase (MCAT)

의 기능에 의존한다고 믿어지고 있다 [30-33]. MCAT 기능은 지방산 생합성에도 필수적인

것으로서 하나의 세포 내에서는 FAS와 PKS가 하나의 MCAT를 공유한다는 것이 일반적인 이

론이다 (또는 FAS가 생명 유지에 필수적인 효소임을 고려하여, ‘PKS가 FAS의 MCAT를 빌려

사용한다.’ 라는 개념으로도 표현되기도 한다.).

MCAT에 의하여 형성된 malonyl-ACP는 KSβ에 의하여 탈탄산화 된 후 KSα의 catalytic

residue인 cysteine로 전이되어 반복적인 축합 반응에 들어가게 된다 (figure 1A). 이상과 같

은 기본적인 효소들 (KSα, KSβ, ACP, MCAT)에 의한 기본 골격 형성 이후, 여러 효소 작용

들에 대하여 전형적인 type II-PKS 생성물인 다환 방향족 (polycyclic aromatic)골격이 다양

한 형태로 생성되게 된다. Post-chain assembly modification이라 지칭되기도 하는 이 변환

과정에는 KR (type II-PKS에 존재하는 KR은 측쇄 골격 형성 즉, chain-assembly 종료 후

에 작용하며, 높은 기질 특이성, 위치 특이성 및 입체 화학 특이성을 갖고 있음에 있어 type

II-FAS와 type I-PKS의 그것과는 상이한 것으로 간주되어야 할 것이다.), cyclase,

aromatase 등이 관여하게 된다. 그러나 어떻게 type II-PKS가 polyketide 골격 형성 상의 구

조적 다양성을 조절하는 지에 대한 분자 수준의 이해는 매우 부족한 상태이다. 그럼에도 불

구하고 시행 착오 및 직관에 의한 type II-PKS의 교합 (mixing and matching)을 통하여 새

로운 다환 방향족 골격들의 생성을 유도한 많은 예가 보고되어있다 [4,7,17,34,35].

Type II-PKS KSα/KSβ의 구조적 해석은 그 단백질 결정이 얻어지지 않아 오랜 동안 type

II-FAS KS의 것을 차용하여 왔으나 [36], 2004년도에 드디어 KSα/KSβ heterodimer에 대한

단백질 구조 해석이 보고되었다 [37]. 이를 통하여, type II-FAS의 substrate-binding tunnel

이 전적으로 소수성인 아미노산으로 구성되어진 반면 type II-PKS KSα/KSβ의 그것은 양수성

(amphipathic) 임을 확인할 수 있었다. 이는 polyketide 골격의 poly-ketone 이라는 화학적

성격과 일치하는 특성이라 할 수 있다. 또한 규정된 type II-PKS KSα/KSβ

substrate-binding tunnel의 구조로서 polyketide 골격의 길이가 조절될 뿐 아니라 첫 번째

cyclization 반응도 지정되는 것으로 제안되었다.

Type I-PKS 와 같이 type II-PKS 에도 acetate이외의 starter unit의 도입 (unusual

priming)을 지정하는 기작이 존재하며 [21], 이의 전형적인 예가 KAS-III (β-ketoacyl-ACP

synthase-III)와 AT 이다. KAS-III (FabH)는 type II-FAS에도 존재하며, 지방산 생합성의 첫

단계로서 acetyl-CoA와 malonyl-ACP간의 축합을 매개한다. 구조적으로 KAS-III 는 type

III-PKS와 유사하지만 기능상 malonyl-ACP를 기질로 사용한다는 것이 type III-PKS와의 명

확한 구분을 가능하게 한다 (KAS-III가 ACP를 필요로 하지 않는다고 잘못 알고 있는 연구자

들이 많으나, ACP를 필요로 하지 않는 효소는 정의상 KAS-III 라 할 수 없겠다.). Type

II-PKS에서 KAS-III와 AT의 존재는 daunorubicin/doxorubicin의 생합성에서 연구되기 시작하

였다 [38-41]. Daunorubicin/doxorubicin의 생합성에서 KAS-III (DpsC)는 propionyl-CoA를

starter unit로서 지정하는 데 관여하지만 이의 역할이 절대적인 것은 아닌 것으로 여겨지고

있다. 비록 보조적 역할이라 잠정적으로 규정할 수 있겠지만, DpsC의 기능에 대하여서는

FAS의 KAS-III의 그것에 견주어 유추하는 데에 무리가 없다. 반면 Daunorubicin/doxorubicin

의 생합성에서 AT의 기능에 대하여서는 적당한 역할 기작을 제안할 수가 없었다. 이와 같은

type II-PKS의 KAS-III/AT 는 R1128의 생합성에서 보다 심도 있게 연구되었다. R1128의 생

합성 (A에서 D까지 네 가지의 유사체)에서는 acetyl-CoA 이외에 propionyl, iso-butyryl,

butyryl-CoA 들이 starter unit로 두루 사용되어 R1128은 type II-PKS의 unusual primining

기작에 대한 좋은 연구 소재라 할 수 있다 [42]. R1128의 PKS에는 KAS-III (ZhuH), 이에

특이적인 ACP (ZhuG) 그리고 AT (ZhuC) 가 존재한다. Kholsa group은 생합성 유전자군 분

리 후 이들 priming 관련 단백질들에 대한 in vitro 연구를 통하여 ZhuG가 ZhuH에 특이적인

ACP 임을 검증하고 [43], ZhuC는 R1128-KSα/KSβ/ACP에 결합된 acetyl 잔기를 제거하는

기능을 수행하는 것으로 제안하였다 [44]. 즉, KSα/KSβ/ACP의 기본적인 성질이 acetyl 잔기

로의 priming 인데, R1128-KSα/KSβ/ACP 또한 이런 기본적인 성질을 갖고 있으며, ZhuC가

이를 최소함으로써 ZhuH/ZhuG에 의한 unusual priming의 기회를 증가시킨다는 개념이다.

이러한 기작은 type I PKS에서 제안된 type II thioesterase 의 editing 기능과 매우 유사하게

여겨진다 [45]. Type I PKS에서 ACP에 부착된 malonyl 잔기가 탈탄산화를 거쳐 acetyl 로

전환될 수 있는데, 이 경우 축합 반응이 이루어질 수 없게되어 (KS의 acyl-thioester를 공격

할 nucleophile인 carboanion을 생성할 수 없다.), polyketide 골격 형성 과정이 정지하게 된

다. 이를 최소화하기 위하여 잘못 형성된 acetyl-ACP에서 acetyl을 제거하여 malonyl 잔기가

새로이 결합될 수 있는 ACP를 만들어주는 것이 type II thioesterase의 기능이라는 제안이다.

이는 nonribosomal peptide synthase (NRPS)에서 보다 명확하게 규정된 기능이다 [46].

다. Type III-PKS

Type III-PKS는 chalcone synthase-like PKS로도 알려져 있으며 (chalcone은 식물체에

특이적인 이차대사산물이다.), 식물체에서 주로 분포되어져있으나 [2], 최근 미생물에서도 그

존재가 확인되었다 [8,9]. 기본적으로 type III-PKS는 단일 축합 효소로서 그 구조나 작용 기

작에 있어 위의 두 가지 형태와 매우 상이하다. Type III-PKS 또한 catalytic residue인

cysteine을 갖고 있으나 전체적인 아미노산 서열은 type I 과 type II에 존재하는 KS (이들은

구체적로 β-ketoacyl-ACP synthase로서 KAS라 지칭하는 것이 보다 명확할 것이다.)와 매우

상이하다. 그러나 이들의 아미노산 서열과 단백질 구조 분석 정보를 잘 살펴보면 KAS의

cysteine-histidine-histidine catalytic triad와 유사하게 cysteine-histidine-asparagine

catalytic triad가 type III-PKS에 존재함을 알 수 있다. 언급하였듯이 type III-PKS는 문자 그

대로 단일 효소이며, ACP가 관여하지 않는다. Type III-PKS는 KAS-III 와 구조적으로 매우

유사하지만, 그 근본적인 차이점이 ACP의 관련성 여부이다. Type III-PKS는 우선 특이적인

starting unit (chalcone synthase의 경우 p-coumaroyl-CoA; 2-pyrone synthase의 경우

acetyl-CoA; bacterial 1,3,6,8-tetrahydroxynaphthalene synthase, THNS 경우

malonyl-CoA)를 선택하여 acyl-thioester를 형성한 후 malonyl-CoA 와의 축합을 통하여

acyl-CoA을 형성한다. 생성된 acyl 잔기는 cysteine active site로 다시 전이되어 다음 축합

반응을 반복하게 되고 측쇄 골격이 어느 수준에 이르면 cyclization과 함께 효소의 active

site에서 해리되게 된다.

그 구조적 단순성에 기인하여 type III-PKS 단백질 구조 연구는 상대적으로 매우 용이하

게 이루어졌다. 최근에 bacterial THNS의 단백질 구조 결정 해석이 보고되었지만 [47], 그

분자 수준의 이해는 식물 유래의 type III-PKS에서 먼저 진전되었다. Chalcone synthase

(Medicago sativa; alfalfa)가 1999년에, 2-pyrone synthase (Gerbera hybrida; daisy)가

2000년에 Noel group에 의하여 그 구조 해석 결과가 발표되었다 [10,11,48]. 이에 상관하여

이루어진 Noel group의 업적은 처음으로 monofunctional KS에서 ‘substrate-binding

pocket’의 크기가 생성되는 polyketide 구조를 결정한다는 가설을 실증하였다는 데에 있다

[11,48]. 실례로 chalcone synthase의 ‘substrate-binding pocket’의 크기를 결정하는 데 주

요한 세 개의 아미노산을 동정하여 이들을 2-pyrone synthase의 그것으로 치환함으로써

(‘substrate-binding pocket’의 크기를 줄임으로써) chalcone synthase를 성공적으로

2-pyrone synthase로 전환하였다 [11].

3. Macrotetrolide PKS

가. Macrotetrolide (nonactin)의 생합성 경로

Macrotetrolide는 항세균, 항진균, 항암 및 면역억제 등 다양한 생리 활성을 보이는 일련

의 cyclic polyether들을 지칭한다 [49-52]. 구조적으로 네 개의 거울상 (enantiomeric)

nonactic acid/homononactic acid 가 (+)-(-)-(+)-(-)-ester 결합으로 연결되어있어, 여타

다른 천연물에서는 보고된 바 없는 독특한 입체 화학적 구성을 갖고 있다 (figure 2A, figure

4B) [53-55]. Nonactin을 포함한 macrotetrolide들은 동일한 생합성 경로에 의하여 생성되어

지지만 많은 초기 연구가 nonactin을 model compound로 삼았으며, 차 후 거론될 많은 연

구 결과들이 ‘macrotetrolide’ 보다는 ‘nonactin’ 이라는 용어를 사용하고 있다. 독자의 혼동

을 막기 위하여 저자는 nonactin 생합성을 macrotetrolide 생합성으로 간주하여도 하등의

문제가 없음을 명시한다.

Robinson group은 방사능 표지 (13C-, 2H-, 18O-) 전구체 (acetate, propionate,

succinate, acetoacetate)를 Streptomyces griseus DSM40695 (ETHA7796) 투여하여

nonactin (2) (실질적으로는 nonactic acid; 1)의 방사능 표지 양상을 조사함으로써

macrotetolide가 polyketide pathway에 의하여 생성됨을 확인하였다 [56-60]. 이상의 결과에

서 nonactic acid (1)는 두 분자의 acetate, 각 한 분자의 succinate와 propoinate에서 생성

됨이 확립되었다 (figure 2B). Nonactic acid (1)가 nonactin (2)의 전구체임은 다음의 두 가

지 실험적 관찰에서 유추되었다. 첫째로 S. griseus DSM40695에 투여된 (±)-nonactic acid

는 효율적으로 nonactin (2)으로 전환됨을 확인하였으며 [61], 둘째로 S. griseus DSM40695

에서 (+)-nonactic acid, (-)-nonactic acid 와 이들의 dimer, (+)-nonactic

acid-(-)-nonactic acid 또는 (-)-nonactic acid-(+)-nonactic acid (광학활성이 없음을 제

시하였음)의 존재를 확인하였다 [62,63]. 기실 nonactic acid가 nonactin 으로 전환되는 것

은 검증된 사실이지만, nonactic acid가 nonactin의 de novo polyketide pathway의 전구체

는 아니다. nonactic acid가 nonactin (2)로 전환될 수 있는 것은 이를 salvage pathway로서

재활용하기 위한 CoA-ligase (NonL: nonactic acid에서 1; nonactyl-CoA를 합성)가 존재하

기 때문이며, 실질적인 전구체는 그림 2C와 같이 CoA-thioester 형태의 nonactic acid (1;

nonactyl-CoA) 이다. 다음 문단들에서는 설명을 용이하게 하기 위하여 free nonactic acid도

1로 지칭하겠다.

이상의 실험 결과로서 Robinson group은 (+)-1 과 (-)-1 이 한 쌍의 거울상 생합성 경

로에 의하여 생성됨을 제안하였다. Robinson group은 거울상 화합물 (6R,8R)-3

(2-methyl-6,8-dihydroxynon-2E-enoic acid)과 (6S,8S)-3을 동위원소 표지로 합성하여 이

들이 특이적으로 각기 (+)-1과 (-)-1로 전환됨을 확인하여 거울상 생합성 경로가 존재함을

실증하였다 [59]. 이상의 실험에서 (6R,8R)-3과 (6S,8S)-3이 개별적으로 생합성 되어지며

이들 각각을 (+)-1과 (-)-1로 전환하는 거울상 경로 (효소)가 존재한다는 것을 확인하였다고

할 수 있다. 13C, 18O 로 표지된 전구체 투여 실험을 통하여 3에서 1로의 전환이 3의 C6

hydroxyl group이 enone (C2-C3)에 연결되는 intramolecular Michael addition에 의하여 이

루어짐이 검증되었으며 [58], Priestley group은 in vitro 전환 실험 (nonS가 발현된

Streptomyces lividans를 이용한 cell-free conversion)을 통하여 NonS 가 3에서 1로의 전환

을 매개하는 효소임을 규명하였고 nonactate synthase라 명명하였다 [64,65]. Shen group

은 S. griseus DSM40695에서 nonS의 유전자 불활성화와 이를 활용한 (±)-1의 생체 전환

실험을 통하여 nonS는 (-)-1 (nonactic acid: R, -CH3; (-)-homononactic acid: R,

-CH2CH3; bishomononactic acid: R, -CH2CH2CH3) 생합성을 지정함을 증명하였다 [66].

이와 같은 Shen group의 성과는 거울상 경로가 존재함을 유전자 수준에서 검증한 성과이며,

이후 전개되는 macrotetrolide 생합성 유전자 연구에 중요한 지침이 되었다.

이와 같이 3의 생성 이후의 생합성 경로는 상당 수준의 규명이 이루어진 반면, 3의 생성

이전의 생합성 경로는 오랜 동안 논쟁의 대상이었다. 초기에 기존의 polyketide paradigm에

맞추어 acetoacetate의 형성 (acteyl-thioester와 malonyl-thioester 간의 축합)이 첫 축합 반

응인 것으로 제안되었었다. Robinson group은 [1,2,3,4-13C4]acetoacetate 투여 실험을 통

하여 acetoacetate가 직접 nonactic acid로 전환되는 것은 아님을 제시하였다 [57]. 그러나

polyketide paradigm에 맞추어도 acetoacetyl-ACP가 전구체가 될 수 있을지언정

acetoacetate는 전구체가 아니다. 따라서 Robinson group의 1985년도 실험 [57]은

acetoacetyl-thioetser의 관련성을 명확히 배제하지는 못하였다. 최근 Priestley group은

acetoacetate의 N-acyl cysteamine (SNAC) thioester유도체의 투여 실험을 통하여

acetoacetyl-thioester의 관련성을 반증하는 보다 명확한 결과를 제시하였다 [67]. SNAC유도

체는 생체 내의 acyl-thioester (acyl-CoA 또는 acyl-ACP)와 유사한 역할을 수행할 수 있음

이 많은 PKS 연구에서 이미 검증된 바 있다. 이와 같이 acetoacetyl-thioester의 관련성을

배제한 후 동일 논문에서 3-ketoadipyl-SNAC을 이용하여 succinyl-thioester와 malonyl-

thioetser의 축합에 의한 3-ketoadipyl-thioester의 형성이 nonactic acid 생합성의 첫 단계임

을 증명하였다 (figure 2C에서 step a).

이상의 macrotetrolide 생합성 연구는 macrotetrolide-PKS의 KS반응은 다음과 같은 흥미

로운 화학적 특성을 갖고 있을 것으로 암시해준다. 첫째, succinyl-CoA를 starter unit으로 이

용하며, 둘째, succinate의 4개 탄소 모두가 손실 없이 nonactic acid로 전환되며, 셋째, 다

양한 nactic acid (nonactic acid, homononactic acid, bishomononactic acid)를 만들기 위

하여 다양한 extender unit들(malonyl-CoA, methylmalonyl-CoA, ethylmalonyl-CoA)을 사용

하는 점, 넷째, 3-ketoadipyl-thioester의 생성에 사용된 acetate unit의 carbonyl 탄소가

nonactic acid 구조에서는 소실된다는 점 등이다. 이와 같은 KS의 축합이외에도 (-)-3과

(+)-3의 생성 기작, 그리고 macrotetroldie 상의 (-)-(+)-(-)-(+)의 연결이 이루어지는 기작

등 macrotetrolide의 생합성은 기존의 polyketide 생합성에서는 전례를 찾아볼 수 없는 화학

적 특성을 보유하고 있다. 이와 같은 macrotetrolide 생합성에 존재하는 새로운 화학적 특성

을 밝히기 위하여 macrotetrolide의 생합성 유전자 연구가 시작되었다 하겠다.

나. CoA-유도체를 전구체로 직접 사용하는 5개의 KS로 구성된 type II-PKS

Macrotetrolide의 생합성 유전자 연구는 Robinson group에 의하여 시작되었다 [68].

Macrotetrolide의 자가 내성 유전자를 cloning 하기 위하여 S. griseus DSM40695 유전체의

DNA 단편들을 이용하여 무작위적으로 S. lividans를 형질전환한 후 tetranactin (figure 2A 참

조)에 대한 내성을 보이는 형질전환균주를 선별하였다. 이 균주로부터 S. griseus DSM40695

유래의 DNA를 분리하여 macrotetrolide 내성 유전자인 nonR을 동정하게 되었다.

일반적으로 항생제의 대한 자가 내성 유전자가 그 생합성 유전자군 내에 존재한다는 점에

착안하여, nonR 유전자를 이용하여 Priestley group과 Shen group이 독립적으로

macrotetrolide 생합성 유전자군을 cloning하는 데에 성공하였다 (figure 3) [66,69,70]. 이

유전자 내에 존재하는 nonS 유전자에 대한 유전자 불활성화를 통하여, 언급하였듯이, 거울상

경로의 존재를 유전자 수준에서 검증할 수 있었다 [66]. Shen group은 본 연구에서 nonS가

불활성화 되었을 시에 macrotetrolide의 생합성이 소멸됨을 관찰하여 이 유전자군이

macrotetrolide 생합성 유전자군임을 확립하였다. 이 후 전체 유전자군을 대상으로 체계적인

불활성화 작업을 통하여 orf3와 orf27은 macrotetrolide 생합성에 상관하지 않음을 확인하고

macrotetrolide 생합성 유전자군의 영역을 nonX-nonH의 25-kb DNA로 지정하였다.

규정된 macrotetrolide 생합성 유전자군 내에는 5 개의 독립적인 KS 유전자 (nonU,

nonQ, nonP, nonJ, nonK)가 존재한다. 이들 중 NonQ 와 NonP는 KAS-III 유사체이며,

NonU, NonJ, NonK는 type II-PKS의 KSα의 유사체이다. 일차적으로 나타나는

macrotetrolide PKS의 특징은 독립적인 KS 효소들로 구성되어 있음에도−일견 type II-PKS

라 할 수 있음에도−, KSβ가 존재하지 않으며 (KSα/KSβ의 구성이 존재하지 않는다.), ACP가

존재하지 않는다는 점이다. 위에 언급하였듯이 type III-PKS를 제외한 모든 PKS는 ACP를 필

수 구성 성분으로 포함한다. 이상의 macrotetrolide PKS의 특성이 유례없이 독특함을 감안할

때, 이례적으로 ACP 유전자가 생합성 유전자군 영역 밖에 존재할 가능성을 배제할 수는 없

겠다. 이를 일차적으로 검증하기 위하여 nonX-nonH의 25-kb 영역을 S. lividans에 도입하여

macrotetrolide의 생합성을 조사하였으며, nonX-nonH의 23 개가 발현된 S. lividans가

macrotetrolide를 생산함을 확인하였다 [70]. 이 결과는 macrotetrolide PKS가 ACP를 필요

로 하지 않는 KS들로 이루어져 있음을 암시하여 주고 있다. 유추하면 이들 KS들은 type

III-PKS와 같이 acyl-CoA들을 직접 기질로 사용하는 효소들인 것이다. 이를 지지하는 또 한

가지 정보는 NonQ와 NonP 서열 분석에서 찾을 수 있다. 컴퓨터 분석을 이용한 FabH

(KAS-III) 와 ACP의 상호 작용 연구 (docking study)를 통하여 FabH에 존재하는

249-arginine이 이 상호 작용에 주요한 역할을 수행함이 추론되었으며, 이는 FabH[R249A]

를 이용한 실험을 통하여 검증되었다 [71]. Type II-PKS에서 발견되어진 KAS-III, DpsC와

ZhuH 역시 이 위치에 arginine을 갖고 있는 반면 NonQ와 NonP의 경우 이 위치가 각각

glutamine, asparagine으로 치환되어있다. 이러한 특성은 NonQ와 NonP 가 기존의 FabH와

는 상이한 작용 기작을 갖고 있을 가능성에 힘을 실어준다 하겠다.

ACP를 포함하지 않는 type II-PKS 유전자군 자체는 전례가 없는 것으로 그 의미를 의심

할 바 없으나, macrotetrolide PKS-KS들이 acyl-CoA들에 직접 작용하는 효소들인지에 대하

여서는 이견이 있을 수 있다. 이는 S. griseus DSM40695 나 S. lividans 에 존재하는 지방산

생합성 (Fab)의 ACP를 macrotetrolide PKS-KS들이 빌려 사용할 가능성을 배제할 수 없기

때문이다. Type II PKS의 ACP를 Fab-ACP 대치하였을 때 극미량이지만 polyketide의 생합성

이 이루어졌다는 보고가 있으며 [72,73], 최근에는 peptide계 항생제인 triostin의 NRPS에서

Fab-ACP가 starting unit인 quinoxaline-2-carboxylic acid에 대한 carrier 단백질로서 효율

적으로 기능함을 in vitro 연구를 통하여 증명하였다 [74]. 따라서 macrotetrolide PKS-KS들

이 acyl-CoA에 직접 작용하는 KS임을 증명하기 위하여서는 in vitro 실험을 통하여,

acyl-CoA가 축합 반응에 이용되고, 이에 따라 새로운 acyl-CoA가 생성됨을 검증하는 것이

필수적이라 하겠다.

체계적인 유전자의 불활성화 작업을 통하여 nonU, nonJ, nonK가 개별적으로 불활성화된

S. griseus DSM40695 돌연변이주를 제조하는 데에 성공하였다. 반면 계속적인 시도에도 불

구하고 nonQ와 nonP의 불활성화는 성공하지 못하였다. 이를 달성하기 위하여 S. lividans

(nonX-nonH)에서 유전자 불활성화 작업을 진행하여 nonQP가 동시에 불활성화된 균주를 제

조하는 데에 성공하였다. 얻어진 돌연변이주에 nonQ와 nonP를 개별적으로 재도입하여

nonQ 및 nonP가 개별적으로 소멸된 macrotetroldie 생합성 경로를 구축하였다. 다섯 가지의

돌연변이균주를 이용하여 macrotetrolide 생합성 능력과 macrotetromerization (figure 2C의

step g)을 점검하였다. Macrotetromerization 경우, (±)-1을 돌연변이균주에 투여 후

nonactin의 축적을 조사하여 점검하였다. 이들 다섯 균주 모두에서 macrotetrolide 생합성 능

력은 완전히 소멸된 반면 macrotetromerization은 정상일 것으로 예상되었다. 그러나 nonQ,

nonP 돌연변이 균주들만이 그 예상에 일치하는 결과를 보여주었다. 놀라웁게도 nonJ 와

nonK 돌연변이에서 macrotetrolide 생합성 능력과 더불어 macrotetromerization 또한 소멸됨

을 관찰하였다. 이는 NonJ/NonK가 macrotetromerization에 관여함을 암시하는 결과이며,

macrotetromerization이 ester결합의 형성임을 감안할 때 KS의 관여는 전혀 예상하지 못하였

던 현상이다. NonJ/NonK에 대한 이후의 연구 결과는 다음 장에 자세히 다루기로 하겠다.

nonJ와 nonK 돌연변이주에서 얻어진 예상 밖의 결과와 더불어 nonU 돌연변이주에서도 예상

밖의 현상을 관찰하였다. 이는 nonU 돌연변이주에서 소량이지만 (야생균주의 1/100 수준)

macroterolide의 생산이 관찰된 것이다.

NonJ/NonK가 3의 생성에 관여하지 않는다는 연구 결과는 3 개의 KS, NonU/NonQ/NonP

가 3의 생성을 지정함을 암시하여 준다. 이는 3의 생성에 3 번의 개별적인 축합 반응이 관여

할 것이라는 제안과 일치하는 것이다. 각 KS의 축합반응을 규명하기 위하여, 이들 3 개의

KS들을 개별적으로 Escherichia coli에서 발현하여 효소의 순수 분리를 시도하였다. NonU의

발현․분리에는 실패하였지만 NonQ와 NonP는 recombinant 효소를 얻는 데에 성공하였다.

NonQ와 NonP가 type II-FAS, type II-PKS에 존재하는 KAS-III와 유사하다는 점은 이들 중

하나가 첫 단계 축합 반응을 지정할 것으로 예측을 유도하였다. 그러나 succinyl-CoA,

malonyl-CoA, acetyl-CoA, methylmalonyl-CoA를 사용한 효소 반응에서 어떠한 변화도 찾

을 수 없었다. 위에 언급하였듯이 근래 Priestley group이 3-ketoadipyl-thioester의 생성이

nonactic acid 생합성의 첫 축합 반응이라는 연구 결과를 발표하였다 [67]. 흥미로운 점은

3-ketoadipyl-CoA가 미생물에 광범위하게 존재하는 β-ketoadipate 경로 (protocatechuic

acid 분해 경로)의 주요 중간체라는 것이다 [75,76]. 이 경우 3-ketoadipyl-CoA는

3-ketoadipate에서 생성된다 (3-ketoadipate:succinate CoA transferase). 이에 착안하여 저

자는 NonU가 3-ketoadipyl-CoA생합성을 지정하는 KS임을 제안함으로써 (figure 3C의 step

a), nonU 돌연변이주에서 macrotetrolide가 생성되는 현상 (β-ketoadipate에서 생성되는

3-ketoadipyl-CoA가 NonQ 또는 NonP의 기질로 쓰임)을 설명할 수 있었다. Macrptetrolide

생합성 유전자군에서는 nonU 유전자 바로 하단에 CoA transferase 유전자, nonT가 존재한

다. NonT의 존재는 3-ketoadipyl-CoA로부터 3 (2-methyl-6,8-dihydroxynon-2E-enoic

acid)의 생성에 이르는 polyketide pathway를 휼륭하게 설명하여 준다.

즉, 3-ketoadipyl-CoA는 NonT에 의한 CoA transfer에 의하여 4-ketoadipyl-CoA로 전환되

며 (figure 3C에서 4, 5 단계), 이 후 4-ketoadipyl-CoA의 6번 탄소의 탄산은 step b 축합

을 거치면서 소멸되게 된다. NonQ와 NonP는 step b와 step C를 매게하여 단계 6에 이르게

된다.

다. Macrotetromerization: NonJ/NonK에 의한 C-O 결합 형성

위에 언급되었듯이 S. griseus DSM40695에서의 유전자 불활성화 작업을 통하여 nonJ와

nonK 유전자가 macrotetromerization 에 관여함을 확인하였다. Figure 4B에 나타나듯이

macrotetromerization은 C-O (탄소-산소) 결합 형성을 통한 ‘입체화학 특이적인 ester-bond

형성’ 으로서 기존의 KS 기작과는 상이한 것이다. 따라서 유전자 불활성화 실험이

nonJ/nonK의 관련성을 확인하여 주었음에도 불구하고 이들 KS들이 C-O 결합 형성을 매개

하는 것으로 규정하기에는 실증 결과가 부족하였다. 이를 보완하기 위하여 S. lividans에서

체계적인 이종 발현 실험을 진해하였다. 즉 규정된 macortetrolide 생합성 유전자군 내의 단

편들을 S. lividans 에 도입한 후 얻어진 형질 전환 균주들의 macrotetromerization 능력을

(±)-nonactic acid 투여를 통하여 조사하였다. 이를 통하여 S. griseus DSM40695에서의 유

전자 불활성화 결과와 일치되어 nonJ/nonK 발현 균주에서 macrotetromerization

[(±)-nonactic acid→nonactin] 활성이 관찰되었다 [77]. 그러나 S. lividans (nonJ/nonK)에

서의 macrotetromerization활성은 매우 미비하여 또 다른 효소를 필요로 하는 것으로 판단되

었다. Figure 2에 보여 지듯이 (±)-nonactic acid 자체는 macrotetromerization의 기질이라

할 수 없으며, 대신 (±)-nonactyl-CoA (1)가 실질적인 기질이라 하겠다. 따라서

(±)-nonactic acid의 투여가 nonactin으로 이어지기 위하여서는 macrotetromerization을 지

정하는 효소 이외에 (±)-nonactyl-CoA 생성을 매개하는 효소가 필요하다 할 수 있다. 이와

일치하여 macrotetrolide 생합성 유전자군 내에는 하나의 CoA-ligase 유전자 (nonL)이 존재

한다. 따라서 NonL이 (±)-nonactic acid을 (±)-nonactyl-CoA로 전환하는 효소일 것으로 가

정하고, S. lividans (nonJ/nonK/nonL)의 macrotetromerization 활성을 검사하여 이 형질 전

환 균주가 효율적인 macrotetromerization 활성을 보임을 확인하였다. NonJ와 NonK에 존재

하는 cysteine, catalytic residue를 glycine으로 치환하여 제조된 S. lividans (nonJ[C118G]

/nonK/nonL)와 S. lividans (nonJ/nonK[C139G]/nonL) 에서는 macrotetromerization 활성이

전혀 관찰되지 않았다. 또한 순수 분리된 NonL (E. coli에서 얻어진 재조합 단백질)을 이용하

여 (±)-nonactyl-CoA (1)의 생성을 확인하였다. 이상의 실험을 통하여 NonJ/NonK는

(±)-nonactyl-CoA (1)를 기질로 사용하여 C-O 결합 형성을 매개하는 새로운 KS 임을 확인

하였다.

지금까지 알려진 모든 FAS 및 PKS의 KS는 cysteine-histidine-histidine (type I and

type II systems) 또는 cysteine-histidine-asparagine (type III-PKS and KAS-III in type II

system) 로 구성된 catalytic triad를 갖고 있다 [36,78,79]. 이들 중 histidine-histidine 또

는 histidine-asparagine 은 탈탄산화 (이에는 약간의 이견이 있으나 type II system 의 경우,

이들 중 하나는 acyl-carbonyl 잔기를 안정화하고 나머지 하나만이 decarboxylation 에 직접

적으로 작용하는 것으로 보는 것이 정설이다.)를 통한 carbon anion을 생성을 매개하고,

cysteine 잔기는 얻어진 carbon anion과 acyl-thioester와의 축합을 통하여 C-C (탄소-탄소)

결합 형성을 매개한다. 그 특수한 기능 (탈탄산화가 필요 없음)과 일치하여 NonJ와 NonK는

각각 cysteine-histidine-histidine 대신 cysteine-tyrosine-histidine와 cysteine-glycine-

histidine을 갖고 있다. 향 후 NonJ 와 NonK 에서 C-O 결합 형성을 위한 oxygen anion 형

성을 매개하는 특이 아미노산 잔기를 찾는 것이 흥미로운 연구 과제일 것이다.

이후 S. lividans (nonJ/nonK)을 이용한 cell-free conversion 실험에서 (±)-nonactyl-CoA

(1)가 효율적으로 nonactin (2)으로 전환됨을 확인하였다. S. lividans (nonJ/nonK)을 이용한

cell-free conversion의 성공을 바탕으로 NonJ와 NonK 각각의 기능 규명을 진행하였다. 이

들 각각을 개별적으로 발현하여 S. lividans (nonJ)와 S. lividans (nonK)를 준비하였다. 이들

형질전환 균주로 cell-free conversion 을 실시하여 (±)-nonactyl-CoA가 NonJ에 의하여

nonactyl-nonactyl-CoA로 전환되며 nonactyl-nonactyl-CoA은 NonK에 의하여 nonactin으

로 전환됨을 확인하였다. 후자의 경우 NonK 단독으로는 미비하였던 활성이 NonJ의 첨가로서

극적으로 향상됨을 관찰하였다. 따라서 NonJ 는 단독적으로 dimer, nonactyl-nonactyl-CoA

의 형성을 촉매 하는 반면 nonactyl-nonactyl-CoA가 nonactin으로 전환되기 위하여서는

NonJ와 NonK가 필요함을 제안할 수 있었다. NonJ의 입체 화학 특이성을 규정하기 위하여

NonL와 enantiomeric nonactic acid, CoA 또는 2’-dephospho-CoA (dpCoA)를 이용하여

(-)-nonactyl-CoA, (+)-nonactyl-CoA, (-)-nonactyl-dpCoA; (+)-nonactyl-dpCoA를 준비

하였다. 실질적으로 (-)-nonactyl-(+)-nonactyl-CoA와 (+)-nonactyl-(-)-nonactyl-CoA를

구분할 분석 기법이 없으므로 각 enantiomeric nonactyl-thioester에서 thioester 부분을 다

르게 만들어 (CoA 또는 dpCoA), (-)-(+) 와 (+)-(-) 의 형성을 구분하고자 한 것이다

(figure 4A). HPLC 분석을 통하여 (-)-nonactyl-CoA와 (+)-nonactyl-dpCoA을 사용하였을

시에는 NonJ 반응의 주생성물이 acyl-dpCoA이며 (+)-nonactyl-CoA와 (-)-nonactyl-dpCoA

에서는 acyl-CoA 임을 확인할 수 있었다. 이를 통하여 NonJ의 입체 화학적 특이성을 figure

4B와 같이 (-)-(+)-thioester 생성으로 제안하였다.

라. Nonactic acid 생합성의 거울상 경로

Shen group은 nonS 불활성화 균주에 (±)-nonactic acid를 투여하였을 때에 nonactin

뿐 아니라 monactin, dinactin도 생산됨을 관찰하였다 [66]. 그림 2A에 보여 지듯이,

monactin, dinactin은 모두 (+)-homononactic acid를 구성요소로 포함하고 있다. 따라서

(±)-nonactic acid가 투여된 nonS 불활성화 균주에서 monactin, dinactin이 생성됨은 이 균

주가 (+)-homononactic acid를 생합성할 능력이 있고, 즉 (+)-경로는 정상적임을 의미하며,

나아가서 nonS의 소실로 (-)-경로만이 소실되었음을 암시하여 준다. 즉 NonS가 (-)-경로에

만 상관되는 nonactate synthase임을 제시하여 준다. 이와 같은 제안과 일치하여

macrotetrolide 생합성 유전자군에는 nonS와 유사한 nonX 유전자가 존재한다. 유전자 불활

성화 실험을 통하여 nonX 또한 macrotetrolide 생합성의 필수 요소임을 확인하여 NonX를

(+)-nonactate synthase로 제안하였다.

NonU, NonT, NonQ, NonP에 의하여 생성될 polyketide 골격의 구조는 figure 2C의 6 과

같다. 구조 6에서 구조 7로의 전환은 ketoreduction/dehydration에 의하여 이루어질 것으로

예상되어지지만 이를 지정하는 효소에 관하여서는 현재로는 적당한 제안을 할 수 없는 상태

이다. 아마도 macrotetrolide 생합성 유전자군에서 그 기능의 추론이 불가능한 유전자들

(unknown function) 중에 이에 관계하는 것들이 존재할 가능성이 있다.

구조 7 (figure 2C) 까지의 비입체화학적 생합성 경로 이후 (+) 와 (-) 으로 갈라지는 경

로는 입체화학특이적인 두 번의 ketoreduction 반응에 의하여 이루어질 것으로 예측되어진다

(figure 2C, step d, step e). 이와 일치하여 macrotetrolide 생합성 유전자군에는 4 개의 독

립적인 ketoreductase 유전자들 (figure 3; nonO, nonN, nonM, nonE)이 존재한다. 이들 각

각에 유전자 불활성화 작업을 진행하여, nonO를 제외한 3 개의 유전자에 대한 불활성화 균

주를 제조하였다. 이들 세 균주 모두 macrotetrolide 생합성 능력이 소실됨을 확인하였다. 이

후 nonS의 경우에서와 같이 (-)-경로를 지정하는 유전자를 선정하기 위하여 (±)-nonactic

acid 투여 실험을 진행하였다. 예상과 달리 3 개의 균주 모두 nonactin 이외의

macrotetrolide 생산을 관찰되지 않았다. (+)-경로의 소멸 경우 nonactin 이외의

macrotetrolide 의 생합성을 기대할 수 없으나 (figure 2A), 이 실험 결과만으로 해당 유전자

를 (+)-경로로 규정할 수는 없었다. 간단히 말하여 이것이 negative 결과이기 때문이다; (-)-

경로가 소멸된 경우 (±)-nonactic acid 투여 시, monactin 이 생성된다면 (+)-경로가 존재

한다고 할 수 있으나, monactin이 생성되지 않은 경우에서는 (-)-경로가 존재한다는 결론을

도출할 수 없다.

S. griseus DSM40695에서 유전자 불활성화가 실패한 nonO 경우, S. lividans

(nonX-nonH)에서 그 불활성화를 달성하였다. 얻어진 균주, S. lividans (nonX-nonH;

nonO::tsr)에 (±)-nonactic acid 투여하였을 때 nonactin 이외에도 monactin 과 dinactin의

생성을 확인하여 NonO 또한 NonS와 같이 (-)-경로를 지정하는 것으로 확인할 수 있었다.

특히 S. lividans (nonX-nonH; nonO::tsr)에 (-)-nonactic acid를 투여하였을 시에는

nonactin이 생성되었으나 (+)-nonactic acid의 경우 nonactin의 생성은 관찰할 수 없었다.

이 결과로서 NonO가 입체화학 특이성을 갖는 ketoreductase 로서 (-)-(homo)nonactic acid

의 생합성에 관련함을 증명할 수 있었다 (figure 2C, step d 와 step e).

4. 끝마침

Macrotetrolide 의 생합성을 지정하는 polyketide synthase (PKS)는 5 개의 특이적인

ketosyntase 반응에 의하여 이루어진다. NonUQP는 NonT (CoA transferase)와 함께

polyketide 골격을 완성하고 NonEMNO (stereospecific ketoreductase) 와 NonXS

(enantiospecific nonactate synthase)에 의한 거울상 경로에 의하여 (+)-nonactyl-CoA 또는

(-)-nonactyl-CoA로 전환된다. (+)-nonactyl-CoA 와 (-)-nonactyl-CoA는 NonJK에 의하여

nonactin이 된다. NonJK는 C-O 결합을 형성하는 독보적인 ketosyntase 일 뿐 아니라, type

II-PKS ketosyntase와 구조적으로 (이는 아미노산 서열상의 유사성) 유사하면서서도 기능면

에서는 type III-PKS와 같이 acyl-CoA를 기질로 직접 사용한다는 면에서도 유일무이한 KS

이다. 또한 NonJK와 같이 NonUQP 또한 유전자 실험을 통하여 제안되었듯이 acyl-CoA를

기질로 직접 사용하는 독특한 ketosynthase 임을 강하게 시사 하여준다. 결국 macrotetrolide

PKS는 C-O 결합을 형성하는 최초의 ketosynthase를 포함하고, 나아가 type I, II, III 의 경

계를 허무는 [noniterative (type I), monofunctional (type II), acyl-CoA-utilizating (type

III)-PKS] 새로운 형태의 PKS 이다.

Figure 1. A: General model for polyketide biosynthesis. B: The modification steps after the

KS-mediated condensation. All three steps are essential to fatty acid biosynthesis but none

of them are involved in type II-PKS-mediated pathway. In type I-PKS, the extend of this

three step-modification is optional to each module to generate diverse structures as

exemplified in C. D: Structures and mechanisms of bacterial polyketide synthases. A: Type

I PKS consists of noniteratively acting domains. B: Type II PKS consists of iteratively acting

subunits; both types utilize ACP to activate substrates and channel intermediates. C: Type

III PKS consists of an iteratively acting single subunit and utilizes acyl CoA directly as

substrates. Domains or subunits shown are hypothetic. ACP, acyl carrier protein; AT, acyl

transferase; DH, dehydratase; ER, enoyl reductase; KR, ketoreductase; KS, ketoacyl

synthase.

S

R

O

KS

KS

SH

AT

AT

KSb

KR

KR

S

O

O

O

ACP

ACP

ACP

SH

KS

KS

SH

SH

AT

AT

S

O

O

O

ACP

ACP

SH

KS

CO2S

R

OS

O

O

O

S

R

O

S

O

O

O

CoA

CO2

KS

KS

CO2(3x)

SH

SH

AT

AT

SR

OOOH

KS

SH

KR

KR

SH

DH

DH

KSb

S

O

O

O

ACP

ACP

S

R

O

O

S

R

O

O

CoA

ACP

n

KSa x yz

KSa x y

z

m

n

m

O

O

O

CH3

CH3

OH3C

O

H3C

H3C

OHHO

OH

CH3

H3C

O

OCH3CH3OH

CH3

OHO

N(CH3)2CH3

O

OH O CH3

OOH

CO2H

H

HO

HO

OH

OH

O

ErythromycinA

2

Actinorhodin

Chalcone

T y p e I P K S

(n on i ter a t iv e)

T y p e II P K S

(i ter a t iv e)

T yp e II I P K S

(A C P -in d ep en d en t)

S

R

O

KSKS

KSKS

SHSH

ATAT

ATAT

KSbKSb

KRKR

KRKR

S

O

O

O

ACPACP

ACPACP

ACPACP

SHSH

KSKS

KSKS

SHSH

SHSH

ATAT

ATAT

S

O

O

O

ACPACP

ACPACP

SHSH

KSKS

CO2CO2S

R

OS

O

O

O

S

R

O

S

O

O

O

CoACoA

CO2

CO2

KSKS

KSKS

CO2(3x)CO2(3x)

SHSH

SHSH

ATAT

ATAT

SR

OOOHOH

KSKS

SHSH

KRKR

KRKR

SHSH

DHDH

DHDH

KSbKSb

S

O

O

O

ACPACP

ACPACP

S

R

O

O

S

R

O

O

CoACoA

ACPACP

n

KSaKSa x yz

KSaKSa x y

z

m

n

m

O

O

O

CH3CH3

CH3CH3

OH3CH3C

O

H3CH3C

H3CH3C

OHOHHOHO

OHOH

CH3CH3

H3CH3C

O

OCH3OCH3CH3CH3OHOH

CH3CH3

OHOHO

N(CH3)2N(CH3)2CH3CH3

O

OHOH O CH3CH3

OOHOH

CO2HCO2H

H

HOHO

HOHO

OHOH

OHOH

O

ErythromycinAErythromycinA

2

ActinorhodinActinorhodin

ChalconeChalcone

T y p e I P K S

(n on i ter a t iv e)

T y p e I P K S

(n on i ter a t iv e)

T y p e II P K S

(i ter a t iv e)

T y p e II P K S

(i ter a t iv e)

T yp e II I P K S

(A C P -in d ep en d en t)

T yp e II I P K S

(A C P -in d ep en d en t)

A B

C

D

R1 OH

O

R1 S

O

CoA

R1 S

O

KS

priming

OH

OHOOC

R2

S

OHOOC

R2CoA

starting unit extending unit

S

OHOOC

R2ACP

CO2

decarboxylative Claisen condensation

R1

O O

S ACPR2

S

OHOOC

R3ACP

n times condensation

R1

O O

Rxn

O

S ACP

R1

O O

S ACPR2

R1

OH O

S ACP

R2

R1

O

S ACP

R2

ketoreduction

dehydration

R1

OH O

S ACP

R2

enoyl reduction

R1

O OH

R2 R3 R4

R1

O O

S KSR2CO2

Figure 2. A: Structures of the macrotetrolides. B: Carboxylic acid precursors and their

incorporation pattern into the nonactic acid monomer. C: Proposed pathway for

macrotetrolide biosynthesis in S. griseus by a novel type II PKS that acts on acyl CoA

substrates and functions noniteratively. Only the steps catalyzed by KS (steps a, b, and c

by NonPQU and step g by NonJK) and KR (steps d and e by NonEMNO) are shown.

Figure 3. The macrotetrolide biosynthetic gene cluster from S. griseus DSM40695.

Color-coding indicates the five KS genes (nonJKPQU) (black), the enantiospecific genes of

four KR genes (nonEMNO) and nonS/nonX (yellow), and two biosyntehtic genes mentioned

in the text (nonT and nonL) (grey).

R O

O

S-CoA

OH

HO O

O

O

R

O

O

S-CoA

R

O R2

O

OO

OR4

O

OO

R1

R3 O

O

O O

R O

O

S-CoA

OH

(+)

(-)

Nonactin (1): R1 = R2 = R3 = R4 = CH3Monactin (2): R1 = Et, R2 = R3 = R4 = CH3Dinactin (3): R1 = R3 = Et, R2 = R4 = CH3Trinactin (4): R1 = R2 = R3 = Et, R4 = CH3Tetranactin (5): R1 = R2 = R3 = R4 = Et

(-)

(+)NonJ

NonK (NonJ)

R O

O

S-CoA

OH

R O

O

S-dpCoA

OH

7

5 3

R O

O

O

OH

O

O

S-dpCoA

R

+

+

R O

O

S-dpCoA

OH

R O

O

S-CoA

OH

R O

O

O

OH

O

O

S-CoA

R

+

(-)

(-)

(+)

(+)

A

B

R O

O

O

OH

O

O

S-CoA

R

R O

O

O

OH

O

O

S-dpCoA

R

OHO

O

O

R

O

O

CoA-S

R

Figure 4. Macrotetromerization catalyzed by NonJ and NonK. A: Experimental scheme to

access stereospeicifcity of NonJ recation. Each enantiomeric nonactic acid was converted

to nonactyl-CoA or nonactyl-2'-dephospho-CoA by using NonL. NonJ generated

(-)-nonactyl-(+)-nonactyl-CoA as the major and (+)-nonactyl-(-)-nonactyl-CoA or/and

(+)-nonactyl-(+)-nonactyl-CoA as the minor as seen in HPLC and mass analysis. B: NonJ

and NonK directed C-O bond formations in stereospecific manner by using nonactyl

(homononactyl)-CoAs to generate macrotetroldies.

5. 참고 문헌

[1] O'Hagan, D. The polyketide metabolites. Chichester, UK: Ellis Horwood; 1991.

[2] Barton, D.; Nakanishi, K.; Meth-Cohn, O. Comprehensive natural products chemistry,

vol. 1: polyketides and other secondary metabolites including fatty acids and their

derivatives. New York: Elsevier; 1999.

[3] Rawlings, BJ. Nat Prod Rep 2001, 18, 231, and references therein.

[4] Hopwood, D.A. Chem Rev 1997, 97, 2465, and the entire thematic issue on polyketide

synthase and nonribosomal peptide synthetase.

[5] Cane, D.E.; Walsh, C.T.; Khosla, C. Science 1998, 282, 63.

[6] Staunton, J.; Weissman, K.J. Nat Prod Rep 2001, 18, 380.

[7] Shen, B. Top Curr Chem 2000, 209, 1.

[8] Funa, N.; Ohnishi, Y.; Fujii, I.; Shibuya, M.; Ebizuka, Y.; Horinouchi, S. Nature 1999,

400, 897.

[9] Moore, B.S.; Hopke, J.N. Chem BioChem 2001, 2, 35.

[10] Ferrer, J.; Jez, J.M.; Bowman, M.E.; Dixon, R.A.; Noel, J.P. Nat Struct Biol 1999, 6, 775

[11] Jez, J.M.; Austin, M.B.; Ferrer, J.; Bowman, M.E.; Schröder, J.; Noel, J.P. Chem Biol

2000, 7, 19.

[12] Gaisser, S.; Trefzer, A.; Stockert, S.; Kirschning, A.; Bechthold, A. J Bacteriol 1997,

179, 271.

[13] Takeyama, H.; Takeda, D.; Yazawa, K.; Yamada, A.; Matsunaga, T. Microbiology 1997,

143, 2725.

[14] Metz, J.G.; Roessler, P.; Facciotti, D.; Levering, C.; Dittrich, F.; Lassner, M.; Valentine,

R.; Lardizabal, K.; Domergue, F.; Yamada, A.; Yazawa, K.; Knauf, V.; Browse, J.

Science 2001, 293, 290.

[15] Allen, E.E.; Bartlett, D.H. Microbiology 2002, 148, 1903.

[16] Wallis, J.G.; Watts, J.L.; Browse, J. Trends Biochem Sci 2002, 27, 467.

[17] Liu, W.; Christenson, S.D.; Standage, S.; Shen, B. Science 2002, 297, 1170.

[18] Liu, W.; Ahlert, J.; Gao, Q.; Wendt-Pienkowski, E.; Shen, B.; Thorson, J.S. Proc Natl

Acad Sci USA 2003, 100, 11959.

[19] Gaitatzis, N.; Silakowski, B.; Kunze, B.; Nordsiek, G.; Blocker, H.; Hofle, G.;

Muller, R. J Biol Chem 2002, 277, 13082.

[20] Olano, C.; Wilkinson, B.; Sanchez, C.; Moss, S.J.; Sheridan, R.; Math, V.;

Weston, A.J.; Brana, A.F.; Martin, C.J.; Oliynyk, M.; Mendez, C.; Leadlay, P.F.;

Salas, J.A. Chem Biol 2004, 11, 87.

[21] Moore, B.S.; Hertweck, C. Nat Prod Rep 2002, 19, 70.

[22] Challis, G.L.; Naismith, J.H. Curr Opin Struct Biol 2004, 14,748.

[23] Gokhale, R.S.; Khosla, C. Curr Opin Chem Biol 2000, 4, 22.

[24] Khosla, C.; Gokhale, R.S.; Jacobsen, J.R.; Cane, D.E. Annu Rev Biochem 1999, 68, 219

[25] Rodriguez, E.; McDaniel, R. Curr Opin Microbiol 2001, 4, 526.

[26] Du, L.; Shen, B. Curr Opin Drug Discov Dev 2001, 4, 215.

[27] McDaniel, R.; Welch, M.; Hutchinson, C.R. Chem Rev 2005, 105, 543.

[28] McDaniel, R.; Ebert-Khosla, S.; Hopwood, D.A.; Khosla, C. Science 1993, 262, 1546.

[29] Bisang, C.; Long, P.F.; Cortes, J.; Westcott, J.; Crosby, J.; Matharu, A.; Cox, R.J.;

Simpson, T.J.; Staunton, J.; Leadlay, P.F. Nature 1999, 401, 502.

[30] Matharu, A.; Cox, R.J.; Crosby, J.; Byrom, K.; Simpson, T.J. Chem Biol 1998, 5, 699.

[31] Zhou, P.; Florova, G.; Reynolds, K.A. Chem Biol 1999, 6, 577.

[32] Bao, W.; Wendt-Pienkowski, E.; Hutchinson, C.R. Biochemistry 1998, 37, 8132.

[33] Carreras, C.W.; Khosla, C. Biochemistry 1998, 37, 2084.

[34] McDaniel, R.; Ebert-Khosla, S.; Hopwood, D.A.; Khosla, C. Nature 1995, 375, 549.

[35] Shen, B.; Summers, R.G.; Wendt-Pienkowski, E.; Hutchinson, C.R. J Am Chem Soc

1995, 117, 6811.

[36] He, M.; Varoglu, M.; Sherman, D.H. J Bacteriol 2000, 182, 2619.

[37] Keating-Clay, A.T.; Maltby, D.A.; Medzihradszky, K.F.; Khosla, C.; Stroud, R.M. Nat

Struct Biol 2004, 11, 888.

[38] Meurer, G.; Hutchinson, C.R. J Am Chem Soc 1995, 117, 5899.

[39] Rajgarhia, V.B.; Strohl, W.R. J Bacteriol 1997, 179, 2690.

[40] Bao, W.; Sheldon, P.J.; Wendt-Pienkowski, E.; Hutchinson, C.R. J Bacteriol 1999,

181, 4690.

[41] Bao, W.; Sheldon, P.J.; Hutchinson, C.R. Biochemistry 1999, 38, 9752.

[42] Marti, T.; Hu, Z.; Pohl, N.L.; Shah, A.N.; Khosla, C. J Biol Chem 2000, 275, 33443

[43] Tang, Y.; Lee, T.S.; Kobayashi, S.; Khosla, C. Biochemistry 2003, 42, 6588.

[44] Tang, Y.; Koppisch, A.T.; Khosla, C. Biochemistry 2004, 43, 9546.

[45] Heathcote, M.L.; Staunton, J.; Leadlay, P.F. Chem Biol 2001, 8, 207.

[46] Schwarzer, D.; Mootz, H.D.; Linne, U.; Marahiel, M.A.Proc Natl Acad Sci USA 2002,

99, 14083.

[47] Austin, M.B.; Izumikawa, M.; Bowman, M.E.; Udwary, D.W.; Ferrer, J.-L.; Moore, B.S.;

Noel, J.P. J Biol Chem 2004, 279, 45162.

[48] Jez, J.M.; Bowman, M.E.; Noel, J.P. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99, 5319.

[49] Zizka, Z. Folia Microbiol (Prague) 1998, 43, 7.

[50] Teunissen, M.B.M.; Pistoor, F.H.M.; Rongen, H.A.H.; Kapsenberg, M.L.; Bos, J.D.

Transplantation 1992, 53, 875.

[51] Borrel, M.N.; Pereira, E.; Fiallo, M.; Garnier-Suillerot, A. Eur J Biochem 1994, 223, 125

[52] Mori, A.; Kaminuma, O.; Ogawa, K.; Nakata, A.; Egan, R.W.; Akiyama, K.; Okudaira, H.

J Allergy Clin Immunol 2000, 106, S58.

[53] Birch, A.W.; Robinson, J.A. In: Vining, L.C., Stuttard, C., eds. Genetics and

biochemistry of antibiotic production. Boston: Butterworth-Heinemann; 1995. p 443.

[54] Dutton, C.J.; Banks, B.J.; Cooper, C.B. Nat Prod Rep 1995, 12, 165.

[55] Fleming, I.; Ghosh, S.K. Studies in natural products chemistry. Atta-ur-Rahman, ed.

New York: Elsevier Science; 1996; vol. 18, p 229.

[56] Ashworth, D.M.; Robinson, J.A. J Chem Soc Chem Commun 1983, 1327.

[57] Clark, C.A.; Robinson, J.A. J Chem Soc Chem Commun 1985, 1568.

[58] Spavold, Z.M.; Robinson, J.A. J Chem Soc Chem Commun 1988, 4.

[59] Ashworth, D.M.; Robinson, J.A.; Turner, D.L. J Chem Soc Perkin Trans I 1988, 1719.

[60] Ashworth, D.M.; Clark, C.A.; Robinson, J.A. J Chem Soc Perkin Trans I 1989, 1461.

[61] Stahl, P.; Pape, H. Arch Mikrobiol 1972, 85, 239.

[62] Prikrylova, V.; Beran, M.; Sedmera, P.; Jizba, J. Folia Microbiol 1994, 39, 191.

[63] Fleck, W.F.; Ritzau, M.; Heinze, S.; Gräfe, U.J. Basic Microbiol 1996, 36, 235.

[64] Earle, M.J.; Priestley, N.D. Bioorg Med Chem Lett 1997, 7, 2187.

[65] Woo, A.J.; Strohl, W.R.; Priestley, N.D. Antimicrob Agents Chemother 1999, 43, 1662.

[66] Smith, W.C.; Xiang, L.; Shen, B. Antimicrob Agents Chemother 2000, 44, 1809.

[67] Nelson, M.E.; Priestley, N.D. J Am Chem Soc 2002, 124, 2894.

[68] Plater, R.; Robinson, J.A. Gene 1992, 112, 117.

[69] Walczak, R.J.; Woo, A.J.; Strohl, W.R.; Priestley, N.D. FEMS Microbiol Lett 2000, 183, 171

[70] Kwon, H.-J.; Smith, W.C.; Xiang, L.; Shen, B. J Am Chem Soc 2001, 123, 3385.

[71] Zhang, Y.M.; Rao, M.S.; Heath, R.J.; Price, A.C.; Olson, A.J.; Rock, C.O.; White,

S.W. J Biol Chem 2001, 176, 8231.

[72] Khosla, C.; Ebert-Khosla, S.; Hopwood, D.A. Mol Microbiol 1992, 6, 3237.

[73] Revill, W.P.; Bibb, M.J.; Hopwood, D.A. J Bacteriol 1996, 178, 5660.

[74] Schmoock, G.; Pfennig, F.; Jewiarz, J.; Schlumbohm, W.; Laubinger, W.; Schauwecker,

F.; Keller, U. J Biol Chem 2005, 280, 4339.

[75] Göbel, M.; Kassel-Cati, K.; Schmidt, E.; Reineke, W. J Bacterial 2002, 184, 216.

[76] Iwagami, S.G.; Yang, K.; Davies, J. Appl Environ Microbiol 2000, 66, 1499.

[77] Kwon, H.-J.; Smith, W.C.; Scharon, A.J.; Hwang S.H.; Kurth, M.J.; Shen, B. Science

2002, 297, 1327.

[78] Olsen, J.G.; Kadziolaa, A.; von Wettstein-Knowlesb, P.; Siggaard-Andersenb, M.;

Lindquista, Y.; Larsena, S. FEBS Lett 1999, 460, 46.

[79] Jez, J.M.; Ferrer, J.-L.; Bowman, M.E.; Dixon, R.A.; Noel, J.P. Biochemistry 2000, 39, 890.