Snieguolė Ščeponavičienė NMVRVI Direktoriaus pavaduotoja

2019 10 03, Vilnius

Maisto saugos laboratorinių tyrimų metodai

Nacionaliniame maisto ir veterinarijos rizikos vertinimo institute

Vizija – profesionali ir kompetentinga gyvūnų sveikatos ir maisto saugos oficialios kontrolės institucija,

kurianti skaidrius, pasitikėjimu ir bendradarbiavimu parentus ryšius su visuomene, verslu ir socialiniais

partneriais.

Misija – kurti ir įgyvendinti optimalią ūkio subjektų priežiūros sistemą, siekiant apsaugoti visuomenę,

gyvūnus ir aplinką nuo jiems pavojingų veiksnių maisto, pašarų ir veterinarijos srityse.

Maisto grandinės kontrolė: pagal principą

„NUO LAUKO IKI STALO“

LAUKAI

IR FERMOS

Augalų apsauga

Gyvūnų sveikata ir

gerovė

Poveikis

aplinkai

VEIKSNIAI

ĮTAKOJANTYS

GALUTINĮ

PRODUKTĄ

Transportavimas ir

saugojimas

Gamyba ir

inovacijos

Duomenys apie

maisto sudėtį

MOKSLO VAIDMUO

SAUGANT

VARTOTOJUS

EFSA

Maisto sauga – pasiekimas!

Valstybinė maisto ir veterinarijos tarnyba

Nacionalinis maisto ir veterinarijos

rizikos vertinimo institutas

Atliekama virš 1 mln. tyrimų kasmet.

2018 m. teiktos paslaugos daugiau kaip 6000

verslo subjektų.

2012-2018 m. pateikta virš 400 mokslinių

nuomonių ir rizikos vertinimų.

Akreditacijos:

• ISO/IEC 17025 (nuo 2015 05 06 Nacionalinis akreditacijos biuras);

• ISO/IEC 17025 (iki 2015 – DAkkS, Vokietija); 423 akredituoti tyrimų metodai;

Lanksti akreditavimo sritis nuo 2018 09 21;

ILAC-MRA ženklas nuo 2018 04

LABORATOR

INIAI

TYRIMAI

RIZIKOS

VERTINIMAS

MOKSLINĖ

VEIKLA

NMVRVI

Teritoriniai

skyriai

Nacionalinis maisto ir veterinarijos

rizikos vertinimo institutas

Žmonių zoonozių atvejai ES, 2017 m.

EFSA Journal 2018;16(12):5500

Dažniausi protrūkių sukėlėjai

Bakterijos Salmonella

Campylobacter

Listeria monocytogenes

Patogeninė E. coli

Yersinia enterocolitica

Virusai Hepatitas A

Norovirusas

Pirmuonys Toxoplasma gondii

Parazitai Trichinella

Per maistą plintančių užkrečiamųjų ligų protrūkius

dažniausia sukelia šios bakterijos:

Campylobacter

Salmonella

E.coli

VTEC

Listeria

Ūmių žarnyno infekcijų protrūkiai, siejami su maisto

tvarkymo subjektų veikla 2014-2018

8 10 13 14 15

62

143

160 168

124

5 6 9 11

13

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

2014 2015 2016 2017 2018

Protrūkių skaičius Susirgusių asmenų skaičius Salmonelių sukelti protrūkiai

Protrūkių, siejamų su maisto tvarkymo subjektų veikla,

sukėlėjų etiologija 2014-2018

0 2 4 6 8 10 12 14

2014

2015

2016

2017

2018

5

6

9

11

13

2

4

4

2

2

1

1

Maisto toksinės infekcijos Nenustatytos etiologijos žarnyno infekcijos Salmoneliozės

Ūmių infekcinių žarnyno susirgimų protrūkiai, siejami

su maisto tvarkymo subjektų veikla 2014-2018 m.

3

4

5

6

8

2

5

7

6

7

1 1

2 2

1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

2014 2015 2016 2017 2018

Vaikų ugdymo įstaigos Viešojo maitinimo įmonės Konditerijos cechai Prekybos centrai

Pagrindinės priežastys protrūkiams atsirasti

Kryžminė tarša

80%

Laikymo sąlygų

pažeidimai

5%

Higienos pažeidimai

4%

Savikontrolės pažeidimai

4%

Priežastis neišaiškinta

7%

• Salmonella spp. aptikimas LST EN ISO 6579-1:2017;

• Salmonella spp. aptikimas BAX sisteme Q7 SDP M.4 (alternatyvus metodas)

• Listeria monocytogenes aptikimas LST EN ISO 11290-1:2017;

• Listeria monocytogenes aptikimas BAX sistema Q7 SDP M.2 (alternatyvus metodas);

• Listeria monocytogenes skaičiaus nustatymas LST EN ISO 11290-2:2017;

• Escherichia coli O 157 H:7 aptikimas SDP M.3 (alternatyvus metodas);

• Campylobacter spp. aptikimas LST EN ISO 10272-1:2017;

• Campylobacter spp. skaičiaus nustatymas LST EN ISO 10272-2:2017;

• Koagulazę gaminančių stafilokokų skaičius LST EN ISO 6888-1+A1:2005;

• Enterobakterijų skaičius LST EN ISO 21528-2:2017;

• E. coli skaičius LST ISO 16649-2:2002;

• Aerobinių mikroorganizmų skaičius LST EN ISO 4833-1:2013.

Maisto produktų mikrobiologinių tyrimų

skyriuje taikomi tyrimo metodai

• Salmonelių (Salmonella spp.) aptikimas LST EN ISO 6579-1:2017;

• Salmonella spp. kultūros serotipo nustatymas CEN ISO/TR 6579-3:2014;

• Monocitogeninių listerijų (Listeria monocytogenes) aptikimas LST EN ISO

11290-1:2017;

• Listeria spp. aptikimas SDP B.39 (8 leidimas);

• Labiausiai tikėtinas numanomų žarninių lazdelių (Escherichia coli) skaičius

LST ISO 7251:2006;

• Koliforminių bakterijų aptikimas SDP 5.4.4.B.17 (5 leidimas);

• Auksinio stafilokoko (Staphylococcus aureus) aptikimas SDP B.28 (5

leidimas);

• Verotoksinių Escherichia coli nustatymas realaus laiko PGR metodu SDP

5.4.4.G.25;

• Campylobacter spp. nustatymas PGR metodu SDP 5.4.4.G.26;

• Gyvūninės kilmės komponentų nustatymas realaus laiko PGR metodu SDP

5.4.4.G.15.

Bakteriologinių tyrimų ir Molekulinės biologijos ir GMO

tyrimų skyriuose taikomi tyrimo metodai

Tyrimų

protokolas

MĖGINIŲ

INFORMACIJOS

VALDYMO SKYRIUS

Bakteriologinių

tyrimų skyrius

Mikrobiologinių

tyrimų skyrius

GMO/MB

tyrimų skyrius

Veterinarijos rizikos

vertinimo skyrius

Maisto rizikos vertinimo

skyrius

Kokybės

vadybos skyrius

Maisto produktų

mikrobiologinių tyrimų

skyrius

Rezultatas ATITINKA

teisės aktų reikalavimus

Rezultatas NEATITINKA teisės aktų

reikalavimus

Bakteriologinių tyrimų

skyrius

GMO/MB tyrimų

skyrius

Maisto

mėginys

Tyrimų

protokolas

Tyrimų

protokolas

VTEC aptikimas (SDP 5.4.4.G.25)

Maisto produktų

mikrobiologinių tyrimų skyrius

Maisto produktų

mikrobiologinių tyrimų skyrius

Rezultatas ATITINKA

teisės aktų reikalavimus

Genų (vtx1, vtx2, eae)

nustatymas

Maisto

mėginys

Rezultatas

NEATITINKA

teisės aktų

reikalavimus

Tyrimų

protokolas

Tyrimų

protokolas

GMO/MB tyrimų

skyrius

Next generation sequencing (NGS)

Duomenų analizė

Laboratorijoje bus naudojama

BioNumerics duomenų

apdorojimo ir analizės platforma

Naujos kartos sekvenavimas

Illumina MiSeq sekvenatoriumi

Patogenų identifikavimas, MLST tipavimas, antimikrobinio

rezistentiškumo genų nustatymas, virulentiškumo faktorių

nustatymas

Metodo privalumai

Viso genomo sekvenavimo duomenys – pilna organizmo DNR informacija:

• Pilna informacija, reikalinga rūšių ir porūšių identifikavimui ir charakterizavimui

• Duomenys rūšių tarpusavio ryšių nustatymui ir palyginamumui

• Pilna informacija genų nustatymui

• Duomenų pakartotinis naudojimas įvairiems tikslams

• Duomenų banko kaupimas, dalyvavimas LT ir ES protrūkių tyrime

• Palyginimas su iš žmonių išaugintų bakterijų kultūrų tipu

NMVRVI žingsniai diegiant NGS metodus laboratorijoje:

• Įsigytas naujos kartos sekvenatorius Illumina MiSeq

• Standartinių metodų ruošimas ir vystymas

• Dalyvavimas mokymuose : DTU Food organizuojamuose NGS mokymuose „ EURL-AR Training Course on Whole Genome Sequencing “ (2018 ir 2019 metais, Danijos technikos Universitetas, Lungbiu, Danija)

Mokymai skirti Listeria monocytogenes tipavimui NGS „Listeria monocytogenes typing by Whole Genome Sequencing : DNA preparation“ (ANSES, Paryžius, Prancūzija)

Mokymai „Training course on Bioinformatics Tools for Next Generation Sequencing data mining: use of bioinformatics tools for typing pathogenic E. coli“ (Istituto Superiore di Sanita, Roma, Italija)

• Listeria monocytogenes, Salmonella – WGS, duomenų bazės kūrimas analizuojant išskirtus sukėlėjus, antimikrobinio rezistentiškumo genų nustatymas

• Šigatoksinių E.coli štamų viso genomo sekvenavimas (WGS): (Antimikrobinio rezistentiškumo genų nustatymas, virulentiškumo faktorių nustatymas)

• Campylobacterijų – WGS, molekulinis tipavimas MLST, virulentiškumo faktorių nustatymas

• Tolimesnis naujos kartos sekvenavimo technologijos panaudojimas: gyvūnų genotipavimas, virusinių patogenų identifikavimas, naujų GMO linijų analizė.

Listeria monocytogenes augimo potencialo įvertinimas

• KOMISIJOS REGLAMENTAS (EB) Nr. 2073/2005 „Dėl maisto

produktų mikrobiologinių kriterijų“

Komisijos reglamento (EB) Nr. 2073/2005 3 straipsnis: 2. Prireikus, už produkto gamybą atsakingi maisto verslo operatoriai atlieka tyrimus pagal II priedą, stengdamiesi išsiaiškinti, ar

produkto tinkamumo vartoti laikotarpiu laikomasi kriterijų.

Visų pirma tai taikytina gataviems maisto produktams, kuriuose yra palankios sąlygos Listeria monocytogenes dauginimuisi ir kurie

gali kelti Listeria monocytogenes riziką visuomenės sveikatai.

Listeria monocytogenes augimo potencialo

vertinimas NMVRVI

NRL

* Tinkamumo vartoti tyrimų ir bandymų apibūdinimas

Produkto

charakteristika

visą galiojimo

laikotarpį (fiziko-cheminis ir mikrobiologinis

įvertinimas)

Pagrindiniai

produkto

gamybos etapai

Produkto

įpakavimo tipas (vakuumuotas, modifikuotos

dujos ir kt.)

Laikymo sąlygų

analizė (gamintojo, rinkos ir namų

sąlygų įvertinimas)

Produkto sudėtis

Produkto vertinimo kriterijai

Listeria monocytogenes augimo

potencialo nustatymas

• Įvertinama:

Listeria monocytogenes augimo potencialas;

Listeria monocytogenes skaičius produkto galiojimo laiko

pabaigoje.

Kaip mes galime kontroliuoti maisto saugą?(1)

Nulinė mikroorganizmų tolerancija dažnai neįmanoma!

• Natūrali tarša

• Neįmanoma visko patikrinti

• Koks efektyvus yra galutinio produkto tyrimas?

- tarša (patogenais) yra reta

• Ką galima pasiekti atrenkant mėginius?

Kaip mes galime kontroliuoti maisto saugą? (2)

Ūkis

Perdirbimas

Rinka

Vartotojas

Dozė

Liga?

Didelis paplitimas, bet

toli nuo suvartoto

produkto

Arti nuo suvartoto

produkto, bet žemas

paplitimas

Vartotojas negali būti

kontroliuojamas

Maisto grandinės

metodas

• Proceso kontrolė

• RVASVT

• Rizikos analizė

Temperatūros įtaka mikroorganizmų dauginimuisi

• Pavojinga zona +4 oC iki +60 oC • Esant +4oC +5oC pradeda daugintis mikroorganizmai, kurie buvo maiste prieš užšaldant

• Kambario temperatūroje kiekviena bakterija gali padvigubėti kas 20 min.

• Per 7 val. greitai gendančiame maiste gali išaugti iki 2 097 152 bakterijų.

• Mielės išlieka atsparios iki -7oC -10oC

• Pelėsiniai grybai iki -12oC -15oC

Mikroorganizmų proteolitiniai ir lipolitiniai egzo- ir endofermentai išlieka aktyvūs iki -28oC -35oC

Salotų mikrobiologinės taršos tyrimas

• Tikslas – įvertinti kaip plovimas įtakoja salotų mikrobiologinę taršą.

• Mėginiai atrinkti iš įvairių turgaviečių.

• 2 tyrimo etapai: prieš ir po plovimo (kiekvienas lapelis buvo atskirtas ir kruopščiai

nuplautas po tekančiu vandeniu).

• Mikroorganizmai: salmonelės, žarninės lazdelės (E. coli), koliforminės bakterijos,

aerobiniai mikroorganizmai, sulfitus redukuojančios klostridijos.

https://jp.lt/wp-

content/uploads/2019/04/vilniaus-

kalvariju-turgus-

5943c3313919b.jpg

https://images.wisegeek.com/wa

shing-vegetables-near-sink.jpg

Rodiklis Mėginiai

Neplautų salotų

tyrimų

rezultatai

Plautų

salotų

tyrimų

rezultatai

Skirtumas

kartais

Skirtumas

proc.

Salmonelių aptikimas, 25 g

1 Neaptikta Neaptikta - -

2 Neaptikta Neaptikta - -

3 Neaptikta Neaptikta - -

4 Neaptikta Neaptikta - -

5 Neaptikta Neaptikta - -

E coli skaičius 1 g

1

Salotų mikrobiologinės taršos tyrimas

• Rezultatai:

- Patogeninių mikroorganizmų nenustatyta;

- Ženklus mikroorganizmų skaičiaus sumažėjimas: aerobinių mikroorganizmų ir

koliforminių bakterijų po plovimo sumažėjo 60-97,8 proc.

• Išvados: salotų plovimas sumažina bakterijų skaičių jose, todėl kruopštus jų plovimas

tekančiu vandeniu yra efektyvi apsaugos priemonė nuo įvairių žarnyno infekcijų!

https://jp.lt/wp-

content/uploads/2019/04/vilniaus-

kalvariju-turgus-

5943c3313919b.jpg

https://images.wisegeek.com/wa

shing-vegetables-near-sink.jpg

Laboratorinių tyrimų pagrindu NMVRVI parengtos moksliškai pagrįstos nuomonės

Nuomonė dėl VTEC maisto produktuose galimos rizikos sveikatai

Nuomonė dėl B. cereus prieskoninėje dašio žolėje

Nuomonė dėl E. coli šviežiose lapinėse salotose

Nuomonė dėl nustatytų koagulazę gaminančių stafilokokų migdoliniame braškių torte

Nuomonė dėl salmonelių serotipų patogeniškumo

Nuomonė dėl mažiems vaikams skirtų produktų mikrobiologinių tyrimų rizikos įvertinimo

Nuomonė dėl grietinės mėginyje nustatytų enterobakterijų

Nuomonė dėl E. coli mėsoje

Nuomonė apie nustatytą stafilokokų kiekį salotose bei galimą riziką sveikatai

Nuomonė dėl nustatytos Salmonella Derby šviežioje paukštienoje

Nuomonė dėl prieskonių mikrobiologinės taršos

Nuomonė dėl L. monocytogenes rizikos įvertinimo šaldytose daržovėse bei termiškai neapdorotuose mėsos

gaminiuose

Perduodami duomenys EFSA‘i

Zoonozių, antimikrobinio atsparumo ir per maistą plintančių ligų protrūkių duomenys

perduodami:

XML

Duomenys perduoda bei patvirtina paskirtas duomenų

perdavėjas (Data provider/validator). Duomenys

perduodami, juos koduojant specialiai sukurtu vieningu

duomenų klasynu – Standard Sample Description.

* „Norint dirbti kartu – privalėjome rasti bendrą duomenų perdavimo kalbą, kitu atveju būtų kilę labai daug

nesusipratimų bei netikslumų !!!“ - EFSA

DUOMENŲ EKSPORTAS

IŠ DB IR PIRMINĖ

PATIKRA, TRŪKSTAMŲ

DUOMENŲ SUVEDIMAS

DUOMENŲ

RINKINIŲ

SUDARYMAS, JŲ

SUTIKRINIMAS SU

TAISYKLĖMIS

(BUSINESS RULES)

Duomenų

validavimas

Duomenų rinkinio

galutinis

patvirtinimas DWH

DUOMENŲ

TEIKIMAS DCF

PLATFORMOJE

NMVRVI

VMVT

ULAC

ULAC

VMVT

NMVRVI

Dalyvavimas EFSA Keitimosi

kylančiomis rizikomis tinklo

(EREN) veikloje

Dalyvavimas EFSA

Mikrobiologinės rizikos

vertinimo tinklo veikloje

AČIŪ UŽ JŪSŲ DĖMESĮ