MAKALAH FITOKIMIAKROMATOGRAFI

Disusun OlehKelompok 3Fitria Citra Ayu260110130093Femmi Anwar260110130097Dhita Dwi Pricilia260110130131Muhammad Ismail260110130132Avani Chairunnisa 260110130151

FAKULTAS FARMASIUNIVERSITAS PADJADJARAN2015

Kata Pengantar

Puji dan syukur kepada Allah SWT, karena atas berkah dan karunia-Nya penulis dapat menyelesaikan makalah Fitokimia untuk memenuhi tugas. Salawat serta salam semoga selalu tercurah pada junjungan kita semua Nabi Muhammad SAW.Penulis menyadari akan keterbatasan dan kemampuan yang dimiliki, sehingga dalam makalah ini masih terdapat kekurangan. Semoga makalah ini memberi manfaat kepada kita semua.

Jatinangor, Februari 2015

Penulis

DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR DAFTAR ISI BAB I PENDAHULUAN BAB II PEMBAHASAN 2.1Definisi Istilah 2.2 Dasar Kromatografi2.3 Jenis-jenis kromatografiBAB III KESIMPULAN DAFTAR PUSTAKA 15

BAB IPENDAHULUAN

Kromatografi adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu fasa gerak yang bisa berupa gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu padatan. Sedangkan menurut Farmakope Indonesia IV, kromatografi adalah suatu tekhnik atau prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu system yang terdiri dari 2 fase atau lebih yang salah satu diantarnya bergerak secara berkesinambungan dalam arah tertentu dan didalamnya, zat zat itu menunjukkan perbedaan yang disebabkan oleh adanya perbedaan dalam adsobsi, partisi, kelarutan, tekanan uap, ukuran molekul atau kerapatan muatan ion.Pengertian lain kromatografi menurut IUPAC adalah suatu metode yang digunakan untuk pemisahan komponen dalam sample dimana komponen tersebut terdistribusi dalam 2 fase yang salah satunya diam dan yang lainnya bergerak.Metode kromatografi memberikan cara pemisahan paling kuat di laboratorium kimia. Gagasan dasarnya sederhana untuk dipahami, cara sederhana sampai yang agak rumit dari segi kerja dan peralatan, dan metode ini dapat dipakai untuk setiap jenis senyawa. Metode kromatografi, karena pemanfaatnnya yang leluasa, dipakai secara luas untuk pemisahan analitik dan preparative. Jenis pemisahan, apakah analitik atau preparative, tidak ditentukan oleh ukuran cuplikan, melainkan lebih oleh keperluan khusus. Biasanya, kromatografi analitik dipakai pada tahap permulaan untuk semua cuplikan, dan kromatografi preparative hanya dilakukan jika diperlukan fraksi murni dari campuran.Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903,mencoba memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi kapur (CaSO4). lstilah Kromatografi diciptakan oleh Tswett untukmelukiskan daerah-daerah yang berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T. Day juga menggunakan Kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum, namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan tentang proses Kromatografi. Penyelidikan tentang Kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik dalam bentuk Kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian pada akhir tahun 1930 an dan permulaan tahun 1940 an, Kromatografi mulai berkembang. Dasar Kromatografi lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel) tidak hanya mengubah dengan cepat kromatografi cair tetapi seperangkat umum langkah untuk pengembangan Kromatografi gasdan Kromatografi kertas. Pada tahun 1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai Kromatografi gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an Kromatografi gas dikembangkan menjadi suatu teknik analisis yang canggih.Kromatografi cair, dalam praktek ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan. Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan Kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi Kromatografi gas. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan Tinggi atau High Preformance = Tekananatau Kinerja Tinggi, High Speed = Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja, saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat KCKT mencapai suatu keadaan yang sederajat dengan Kromatografi gas.

BAB IIPEMBAHASAN

2.1 Definisi IstilahFase padat yang bertindak sebagai fase diam dalam kromatografi cair padat (KCP) atau kromatografi gas padat (KGP) yang lebih jarang dipakai, disebut adsorben atau penjerap, sedangkan bahan tempat melekatnya fase disebut penyangga. Jika fase gerak digerakkan melalui fase dim untuk menghasilkan pemisahan kromatografi, proses ini dikenal sebagai pengembangan. Setelah senyawa senyawa dipisahkan dengan pengembangan, hasilnya dideteksi atau divisualisasi ( ditampakkan ). Jika senyawa senyawa yang dipisahkan benar benar keluar dari system, maka senyawa itu telah dielusi atau elusi telah terjadi. Senyawa yang dipisahkan biasanya disebut linarut, atau secara kelompok disebut cuplikan. Hasil keseluruhan disebut kromatogram.

2.2 Dasar KromatografiDalam melakukan metode kromatografi, terdapat beberapa hal yang harus diperhatikan, diantaranya adalah :1. Polaritas dari molekula. Suatu molekul polar atau non polar berdsarkan ada atau tidaknya unsur elektronegatif, apabila ada maka molekul cenderung polar.b. Bentuk geometrinya2. Adanya hydrogen asam yang menandakan kepolaran.3. Proporsi molekul terhadap atom elektonegatif atau hydrogen asam.4. Adanya gugus polarisasi atau atom.5. Susunan kepolaran.

2.3 Jenis-jenis Kromatografi

2.3.1 Kromatografi Lapis tipis (KLT).Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah suatu tehnik pemisahan yang sederhana dan banyak digunakan. Metode ini menggunakan lempeng kaca atau lembaran plastik yang ditutupi penyerap untuk lapisan tipis dan kering. Untuk menotolkan larutan cuplikan pada lempeng kaca, pada dasarnya dgunakan mikro pipet/ pipa kapiler. Setelah itu, bagian bawah dari lempeng dicelup dalam larutan pengulsi di dalam wadah yang tertutup.Lapisan tipis adsorben pada proses pemisahan berlaku sebagai fasa diam. Sebagai fasa diam dalam KLT adsorben berupa serbuk halus dengan ukuran 5 50 mikrometer. Serbuk halus ini dapat berupa adsorben penukar ion. Bahan adsorben sebagai fasa diam dapat digunakan gel, alumina, dan serbuk selulosa. Partikel silica gel mengandung gugus hidrosil dipermukaannya yang akan membentuk ikatan hydrogen dengan molekul molekul pokar. Kromatografi lapis tipis lebih bersifat reproduksibel ( bersifat boleh diulang) dari pada kromatografi kertas.Untuk membuat lapisan tipis pada KLT perlu dibuat bubur (slurry) beri air dari serbuk halus tadi. Zat pengikat dapat menggunakan gips, barium sulfat, polivenil alcohol atau kanji perlu ditambahkan, untuk membantu peletakan lapisan tipis pada penyangga. Bubuk halus ini kemudian ditebarkan pada papan penyangga (kaca, plastik atau aluminium), secara merata sehingga diperoleh ketebalan lapisan 0,1 0,3 mm. lapisan tipis adsorben diaktifkan dengan pengeringan didalam oven pada suhu 100 oC selama beberapa jam.Penentuan jumlah komponen senyawa dapat dideteksi dengan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan menggunakan plat KLT yang sudah siap pakai. Terjadinya pemisahan komponen-komponen pada KLT dengan Rf tertentu dapat dijadikan sebagai panduan untuk memisahkan komponen kimia tersebut dengan menggunakan kolom kromatografi dan sebagai fasa diam dapat digunakan silika gel dan eluen yang digunakan berdasarkan basil yang diperoleh dari KLT dan akan lebih baik kalau kepolaraan eluen pada kolom kromatografi sedikit dibawah kepolaran eluen pada KLT.Prinsip Kerja KLTPada proses pemisahan dengan kromatografi lapis tipis, terjadi hubungan kesetimbangan antara fase diam dan fase gerak, dimana ada interaksi antara permukaan fase diam dengan gugus fungsi senyawa organik yang akan diidentifikasi yang telah berinteraksi dengan fasa geraknya. Kesetimbangan ini dipengaruhi oleh 3 faktor, yaitu : kepolaran fase diam, kepolaran fase gerak, serta kepolaran dan ukuran molekul.Pada kromatografi lapis tipis, eluent adalah fase gerak yang berperan penting pada proses elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Interaksi antara adsorbent dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab itu pemisahan komponen secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir eluent dan jumlah umpan. Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah jenis adsorben alumina atau sebuah lapis tipis silika. Suatu pelarut yang bersifat larutan relatif polar, dapat mengusir pelarut yang tak polar dari ikatannya dengan alumina (gel silika). Semakin dekat kepolaran antara senyawa dengan eluen maka senyawa akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. Hal ini berdasarkan prinsip like dissolved like.Prosedur Kerja Pemisahan dengan KLTPada kromatografi lapis tipis, fase diam berupa plat yang biasanya disi dengan silica gel. Sebuah garis pensil di gambar dekat bagian bawah fase diam dan setetes larutan campuran ditempatkan di atasnya. Garis pada fase diam berguna untuk menunjukkan posisi asli campuran. Pembuatan garis harus menggunakan pensil karena jika semua ini dilakukan dengan tinta, pewarna dari tinta juga akan bergerak sebagai kromatogram berkembang. Ketika titik campuran kering, fasa diam diletakkan berdiri dalam gelas tertutup yang telah berisi fasa gerak dengan posisi fase gerak di bawah garis. Digunakan gelas tertutup untuk memastikan bahwa suasana dalam gelas jenuh dengan uap pelarut.Pelarut (fasa gerak) perlahan-lahan bergerak naik, komponen-komponen yang berbeda dari campuran berjalanan pada tingkat yang berbeda dan campuran dipisahkan memiliki warna yang berbeda.

Gambar tersebut menunjukkan plat setelah pelarut telah bergerak. Pelarut diperbolehkan untuk naik hingga hampir mencapai bagian atas plat yang akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen pewarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam. Nilai R untuk setiap warna di hitung dengan rumus sebagai berikut :

Rf = Jarak yang di tempuh oleh komponen Jarak yang di tempuh oleh pelarut

Untuk identifikasinya dapat di gunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam lapisan tipis kurang tepat bila dibandingkan pada kertas.Harga-harga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan harga-harga standard. Perlu diperhatikan bahwa harga-harga Rf yang diperoleh berlaku untuk campuran tertentu dari pelarut dan penyerap yang digunakan, meskipun daftar dari harga-harga Rf untuk berbagai campuran dari pelarut dan penyerap dapat diperoleh.Kelebihan metode kromatografi lapis tipis adalah sebagai berikut :1. Kromatografi lapis tipis banyak digunakan untuk tujuan analisis. 2. Identifikasi pemisahan komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluorosensi atau dengan radiasi menggunakan sinar ultraviolet.3. Dapat dilakukan elusi secara menaik (ascending), menurun (descending), atau dengan cara elusi 2 dimensi.4. Dapat untuk memisahkan senyawa hidrofobik (lipid dan hidrokarbon) yang dengan metode kertas tidak bisa5. Hanya membutuhkan sedikit pelarut.6. Waktu analisis yang singkat (15-60 menit)7. Investasi yang kecil untuk perlengkapan (Biaya yang dibutuhkan ringan).8. Preparasi sample yang mudah9. Kemungkinan hasil palsu yang disebabkan oleh komponen sekunder tidak mungkin10. Kebutuhan ruangan minimum11. Dalam analisis kualitatif dapat memberikan informasi semi kuantitatif tentang konstituen utama dalam sampel12. Cocok untuk memonitor identitas dan kemurnian sampel13. Dengan bantuan prosedur pemisahan yang sesuai, dapat digunakan untuk analisis kombinasi sampel terutama dari sediaan herbal.Dalam bidang farmasi contoh penggunaan metode pemisahan secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dapat diterapkan dalam menganalisis adanya senyawa paracetamol dan kafein dalam sediaan obat paten seperti poldanmig yang beredar di pasaran apakah memenuhi persyaratan mutu obat atau tidak. Sehingga dengan kadar yang tepat obat dapat memberikan efek terapi yang dikehendaki.KLT PreparatifKLT Preparatif dapat digunkaan untuk memisahkan bahan dalam jumlah gram, namun sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah milligram. Seperti halnya KLT secara umum, KLT Preparatif juga melibatkan fase diam dan fase gerak. Dimana fase diamnya adalah sebuah plat dengan ukuran ketebalan bervariasi. Untuk jumlah sampel 10-100 mg, dapat dipisahkan dengan mengunakan KLT Preparatifdengan adsorben silika gel atau aluminium oksida, dengan ukuran 20x20 cm dan tebal 1 mm, jika tebalnya di dua kalikan, maka banyak nya sampel yang dapat dipisahkan bertambah 50%, seperti halnya KLT biasa, adsorben yang paling umum digunakan pada KLT Preparatif adalah silika gel . Prinsip KLT preparativeKromatografi Lapis Tipis Preparatif merupakan proses isolasi yang terjadi berdasarkan perbedaan daya serap dan daya partisi serta kelarutan dari komponen-komponen kimia yang akan bergerak mengikuti kepolaran eluen oleh karena daya serap adsorben terhadap komponen kimia tidak sama, maka komponen bergerak dengan kecepatan yang berbeda sehingga hal inilah yang menyebabkan pemisahan.Tahapan Kerja KLT Preparatif1. Sampel dilarutkan terlebih dahulu dalam sedikit pelarut. Pelarut yang baik adalah pelarut yang mudah menguap, misalnya n-heksana, dikloro metanaatu etil asetat.Karena jika pelarut yang digunakan tidak mudah menguap, maka akan terjadi pelebaran pita. Konsentrasi sampel juga sebaiknya hanya 5-10%.2. Sampel ditotolkan pada plat KLT preparative. Sampel yang ditotolkan harus berbentuk pita yang sesempit mungkin karena baik tidaknya pemisahan juga bergantung pada lebarnya pita3. Setelah plat KLT Preparatifdielusi, pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari plat.4. Selanjutnya senyawa harus diekstraksi dari adsorben dengan pelarut yang sesuai (5 ml pelarutuntuk 1 gram adsorben). Diupayakan untuk menggunakan pelarut yang paling nonpolar yang mungkin.Harus diperhatikan bahwa makin lama senyawa kontak dengan adsorben, maka makin besar kemungkinan senyawa tersebut mengalami peruraian. Selanjutnya ekstrak yang diperoleh disaring menggunakan corong berkaca masir atau menggunakan membran.Kelebihan KLT Preparatif adalah:1. Biaya yang digunakan murah dan memakai peralatan paling dasar.Sementara kekurangannya antara lain :1. Adanya kemungkinan senyawa yang diambil dari plat adalah senyawa beracun, waktu yang diperlukan dalam proses pemisahan cukup panjang , adanya pencemar2. Setelah proses ekstraksi senyawa dari adsorben dan biasanya rendemen yang diperoleh berkurang dari 40%-50% dari bahan awal

2.3.2 Kromatografi KertasTeknik kromatografi kertas diperkenalkan oleh Consden, Gordon dan Martin (1994), yang menggunakan kertas saring sebagai penunjang fase diam. Kertas merupakan selulosa murni yang memiliki afinitas terhadap air atau pelarut polar lainnya. Bila air diadsorbsikan pada kertas, maka akan membentuk lapisan tipis yang dapat dianggap analog dengan kolom. Lembaran kertas berperan sebagai penyangga dan air bertindak sebagai fase diam yang terserap di antara struktur pori kertas. Cairan fase bergerak yang biasanya berupa campuran dari pelarut organik dan air, akan mengalir membawa noda cuplikan yang didepositkan pada kertas dengan kecepatan yang berbeda. Pemisahan terjadi berdasarkan partisi masing-masing komponen di antara fase diam dan fase bergeraknya.Kromatografi kertas digunakan baik untuk analisis kualitatif maupun kuntitatif. Senyawa - senyawa yang dipisahkan kebanyakan bersifat sangat polar, misalnya asam amino, gula - gula, dan pigmen - pigmen alam.Prinsip kromatografi kertasPrinsipnya didasarkan pada adsorbsi dan kepolaran, di mana adsorbsi didasarkan pada panjang komponen dalam campuran yang diadsorbsi pada permukaan fase diam. dan kepolaran komponen berpengaruh karena komponen akan larut dan terbawa oleh pelarutjika memiliki kepolaran yang sama serta kecepatan migrasi pada fase diam dan fase gerak. Dalam teknik kromatografi kertas, proses pengeluaran asam mineral dari kertas disebut desalting. Larutan ditempatkan pada kertas dengan menggunakan mikropipet pada jarak 2-3 cm dari salah satu ujung kertas dalam bentuk coretan garis horizontal. Setelah kertas dikeringkan, diletakkan di ruang yang sudah dijenuhkan dengan air atau dengan pelarut yang sesuai. Penjenuhan dapat dilakukan 24 jam sebelum analisis. Descending adalah salah satu teknik di mana cairan dibiarkan bergerak menuruni kertas akibat gravitasi. Pada teknik ascending, pelarut bergerak ke atas dengan gaya kapiler. Nilai Rf harus sama baik pada descending maupun ascending. Sedangkan yang ketiga dikenal sebagai cara radial atau kromatografi kertas sirkuler. Kondisi - kondisi berikut harus diperhatikan untuk memperoleh nilai Rf yang reprodusibel. Temperatur harus dikendalikan dalam variasi tidak boleh lebih dari 0,5oC. Kertas harus didiamkan dahulu paling tidak 24 jam dengan atmosfer pelarutnya, agar mencapai kesetimbangan sebelum pengaliran pelarutnya pada kertas. Dilakukan beberapa pengerjaan yang parallel, Rfnya tidak boleh berbeda lebih dari 0,02.Mekanisme kromatografi kertas adalah sebagai berikut:1. Tahap penotolan cuplikanMula-mula menyiapkan kertas kromatografi dengan ukuran tertentu. Kertas yang digunakan memiliki susunan serat kertas membentuk medium berpori yang bertindak sebagai tempat untuk mengalirnya fase bergerak. Lalu membuat garis awal dengan jarak 2-3 cm dengan salah satu ujung kertas dengan menggunakan pensil. Selanjutnya totolkan larutan cuplikan dengan menggunakan mikropipet atau pipa kapiler pada garis awal tadi, kemudian keringkan. Misalkan Kita ingin mengetahui tinta mana yang digunakan untuk menulis pesan. Dalam diagram pena diberi label 1, 2 dan 3 dan tinta pesan sebagai M.2. Tahap pengembanganPada tahap ini ujung kertas kromatografi dekat garis awal yang telah berisi totolan cuplikan dicelupkan ke dalam pelarut (pelarut untuk contoh ini misalnya etanol) yang terdapat di dalam bejana kromatografi. Pencelupan diusahakan tidak merendam totolan cuplikan atau garis awal. Kemudian bejananya ditutup. Biarkan pelarut merembes melewati totolan cuplikan. Komponen-komponen cuplikan akan terbawa oleh rembesan cuplikan. Perbedaan kelarutan komponen-komponen cuplikan dalam pelarut akan mengakibatkan kecepatan bergerak komponen-komponen dalam kertas juga berbeda. Perbedaan kecepatan bergerak komponen-komponen ini lebih umum disebut migrasi deferensial. Pemisahan komponen-komponen ini terjadi karena migrasi deferensial. Hasil pemisahan akan nampak sebagai noda-noda berwarna pada kertas dengan jarak yang berbeda-beda dari garis awal. Noda-noda ini selanjutnya disebut sebagai kromatogram. Perembesan pelarut dihentikan setelah pelarut hampir mencapai ujung kertas. Pekerjaan selanjutnya adalah memberi tanda batas gerakan pelarut, dan kemudian kertas diangkat dari cairan pengelusi untuk seterusnya dikeringkan.3. Tahap identifikasi atau penampakan noda.Dari contoh kromatogram yang dihasilkan diatas, maka dapat disimpulkan bahwa yang mengandung pewarna yang sama dengan pena yang digunakan untuk membuat pesan adalah nomor 2. Pada kasus ini, tidak dibutuhkan pengukuran nilai , karena kita dapat melihat secara langsung perbandingan warnanya pada kertas kromatogram. Tetapi, bila kita menguji sampel dengan menggunakan satu kertas untuk satu sampel, maka kita harus menghitung nilai nya.Menghitung nilai RfRf (rate of flow) menyatakan derajad retensi suatu komponen dalam fase diam. Karena itu Rf juga disebut faktor refensi. Rf adalah jarak tempuh relatif terhadap pelarut. Harga Rf mengukur kecepatan bergeraknya zona relatif terhadap garis depan pengembang. Kromatografi yang dihasilkan diuraikan dan zona-zona dicirikan dengan nilai-nilai Rf. Nilai Rf didefinisikan oleh hubungan:Nilai R untuk setiap warna di hitung dengan rumus sebagai berikut :

Rf = Jarak yang di tempuh oleh komponen Jarak yang di tempuh oleh pelarut

Pengukuran ini dilakukan dengan mengukur jarak dari titik pemberangkatan (pusat zona campuran awal) ke garis depan pengembang dan pusat rapatan tyiap zona. Nilai Rf harus sama baik pada descending maupun ascending. Nilai Rf akan menunjukkan identitas suatu zat yang dicari.Jika ada substansi yang memiliki nilai yang sangat serupa, maka dilakukan pemisahan dengan menggunakan metode kromatografi kertas dua arah. Pada prosesnya menggunakan dua pelarut yang berbeda.Misalnya kita menggunakan zat warna sebagai sampel. Prosedur yang harus dilakukan adalah:1. Tahap pertamaMula-mula titik tunggal campuran ditempatkan pada salah satu ujung garis dasar. Kemudian masukkan kedalam pelarut seperti yang sebelumnya hingga pelarut mendekati ke atas kertas.2. Tahap keduaPada kromatogram, posisi depan pelarut ditandai dengan pensil sebelum kertas mengering, diberi lebel sebagai SF1. Kemudian masukkan kedalam pelarut yang pertama, dihasilkan titik sentral besar dalam kromatogram yaitu sebagian biru dan sebagian hijau. Dua pewarna dalam campuran memiliki nilai yang sudah hampir sama.3. Tahap ketigaMenunggu kertas kering sepenuhnya, dan kemudian memutar kertas sampai 900 dan kemudian mengembangkan kromatografi lagi di dalam suatu pelarut yang berbeda. Bintik-bintik akan bergerak dengan jumlah yang berbeda, hal ini menyebabkan terjadinya perbedaan nilai . Jika kita ingin mengidentifikasi titik-titik dalam campuran maka kita harus menghitung nilai nya untuk disetiap tempat, dan kemudian membandingkannya dengan nilai-nilai yang telah diukur untuk senyawa yang dikenal dengan kondisi yang sama persis. Apabila kita mengidentifikasinya dengan zat pembanding pada kromatogram yang sama seperti yang dilakukan diawal dengan pena, maka kita tidak bisa mengidentifikasinya. Karena campuran yang dipisahkan pada contoh ini terpisah menjadi empat tempat yang berbeda.Aplikasi teknik pemisahan kromatografi kertas dalam kehidupan sehari-hari adalah:1. Menentukan komponen yang terkandung dalam uang logam2. Menguji apakah bahan pewarna yang digunakan dalam makanan aman atu tidak untuk dikonsumsi.3. Menguji tinta yang digunakan pada pemalsuan dokumen, seperti surat perjanjian, cek dan giro.4. Menguji apakah terdapat obat terlarang dalam urin manusia.5. Memeriksa apakah pestisida yang terdapat dalam sayuran atau bahan-bahan masih dalam batas aman atau tidak.6. Mengetahui kandungan asam amino tertentu dari campuran asam amino.7. Dapat mengidentifikasikan keberadaan suatu unsur.2.3.3 Kromatografi KolomKromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Alat tersebut berupa pipa gelas yang dilengkapi suatu kran di bagian bawah kolom untuk mengendalikan aliran zat cair. Prinsip KerjaPemisahan kromatografi kolom adsorpsi didasarkan pada adsorpsi komponen-komponen campuran dengan afinitas berbeda-beda terhadap permukaan fase diam. Kromatografi kolom adsorpsi termasuk pada cara pemisahan cair-padat. Substrat padat (adsorben) bertindak sebagai fase diam yang sifatnya tidak larut dalam fase cair. Fase bergeraknya adalah cairan (pelarut) yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom. Pemisahan tergantung pada kesetimbangan yang terbentuk pada bidang antarmuka di antara butiran-butiran adsorben dan fase bergerak serta kelarutan relatif komponen pada fase bergeraknya. Antara molekul-molekul komponen dan pelarut terjadi kompetisi untuk teradsorpsi pada permukaan adsorben sehingga menimbulkan proses dinamis. Keduanya secara bergantian tertahan beberapa saat di permukaan adsorben dan masuk kembali pada fase bergerak. Pada saat teradsorpsi komponen dipaksa untuk berpindah oleh aliran fase bergerak yang ditambahkan secara kontinyu. Akibatnya hanya komponen yang mempunyai afinitas lebih besar terhadap adsorben akan secara selektif tertahan. Komponen dengan afinitas paling kecil akan bergerak lebih cepat mengikuti aliran pelarut. Jadi yang digunakan sebagai prinsip pada kromatografi kolom adalah: Didasarkan pada absorbsi komponen2 campuran dengan afinitas berbeda terhadap permukaan fase diam. Absorben bertindak sebagai fase diam dan fase geraknya adalah cairan yang mengalir membawa komponen campuran sepanjang kolom. Sampel yang mempunyai afinitas besar terhadap absorben akan secara selektif tertahan dan afinitasnya paling kecil akan mengikuti aliran pelarut.Tahapan pemisahan kromatografi kolom adalah sebagai berikut:1. Sampel yang dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan melalui atas kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam adsorben (bahan penyerap).2. Komponen dalam sampel diadsorbsi dari larutan secara kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada permukaan atas kolom.3. Dengan penambahan pelarut secara terus menerus, masing-masing komponen akan bergerak turun melalui kolom dan akan terbentuk pita yang setiap zona berisi satu macam komponen.4. Setiap zona yang keluar kolom dapat ditampung dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar kolom.Teknik pemisahan kromatografi kolom dalam memisahkan campuran, kolom yang telah dipilih sesuai ukuran diisi dengan bahan penyerap (adsorben) seperti alumina dalam keadaan kering atau dibuat seperti bubur dengan pelarut. Pengisian dilakukan dengan bantuan batang pemanpat (pengaduk) untuk memanpatkan adsorben dengan gelas wool pada dasar kolom. Pengisian harus dilakukan secara hati-hati dan sepadat mungkin agar rata sehingga terhindar dari gelembung-gelembung udara.Untuk membantu homogenitas pengepakan biasanya kolom setelah diisi divibrasi, diketok-ketok atau dijatuhkan lemah pada pelat kayu. Sejumlah cuplikan dilarutkan dalam sedikit pelarut, dituangkan melalui sebelah atas kolom dan dibiarkan mengalir ke dalam adsorben. Komponen-komponen dalam campuran diadsorpsi dari larutan secara kuantitatif oleh bahan penyerap berupa pita sempit pada permukaan atas kolom, dengan penambahan pelarut (eluen) secara terus-menerus, masing-masing komponen akan bergerak turun melalui kolom dan pada bagian atas kolom akan terjadi kesetimbangan baru antara bahan penyerap, komponen campuran dan eluen. Kesetimbangan dikatakan tetap bila suatu komponen yang satu dengan lainnya bergerak ke bagian bawah kolom dengan waktu atau kecepatan berbeda-beda sehingga terjadi pemisahan.Jika kolom cukup panjang dan semua parameter pemisahan betul-betul terpilih seperti diameter kolom, adsorben, pelarut dan kecepatan alirannya, maka akan terbentuk pita-pita (zona-zona) yang setiap zona berisi satu macam komponen. Setiap zona yang keluar dari kolom dapat ditampung dengan sempurna sebelum zona yang lain keluar dari kolom. Komponen (eluat) yang diperoleh dapat diteruskan untuk ditetapkan kadarnya, misalnya dengan cara titrasi atau spektofotometri.Berdasarkan jenis fasa diam dan fasa gerak kromatografi kolom dibagi menjadi dua yaitu:a. Kromatografi Kolom Fase NormalKromatografi dengan kolom konvensional dimana fase diamnya normal bersifat polar, misalnyasilica gel,sedangkan fase geraknya bersifat non polar.b. Kromatografi Kolom FaseTerbalikKromatografi dengan kolom yang fase diamnya bersifat non polar, sedangkan fase geraknya bersifat polar; kebalikan dari fase normal.

Jika kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum, maka metode kromatografi tersebut disebut kromatografi cair VakumKromatografi Cair VakumCara ini pertama kali dipublikasikan oleh Coll dkk., pada tahun 1977 dengan menggunakan corong Buchner kaca masir atau kolom pendek untuk mengisolasi diterpena sembrenoida dari terumbu karang Australia. Prinsip kerja KCV Kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum agar diperoleh kerapatan kemasan maksimum. Vakum dihentikan, pelarut yang kepolarannya rendah dituangkan ke permukaan penjerap lalu divakumkan lagi. Kolom dihisap sampai kering dan sekarang siap dipakai

Tahap kromatografi cair vakum1. Sampel dilarutkan dalam pelarut yang cocok, dimasukkan langsung pada bagian atas kolom atau pada lapisan penjerap dan dihisap perlahan-lahan ke dalam kemasan dengan memvakumkannya.Pemilihan sistem pelarut untuk kromatografi kolom vakum cair dapat dilakukan dengan 3 pendekatan, yaitu: a. penelusuran pustaka, b. mencoba menerapkan data KLT pada pemisahan dengan kolom, dan c. pemakaian elusi landaian umum dari pelarut non polar yang tidak menggerakkan zat terlarut sampai pelarut polar yang menggerakkan zat terlarut2. Kolom dielusi dengan campuran pelarut yang cocok, mulai dari pelarut yang kepolarannya rendah lalu kepolarannya ditingkatkan perlahan-lahan, kolom dihisap sampai kering pada setiap pengumpulan fraksi, oleh karena itu kromatografi cair vakum menggunakan tekanan rendah untuk meningkatkan laju aliran fase gerakKelebihan KCV 1. Jika dibandingkan dengan kromatografi kolom biasa terletak pada kecepatan proses (efisiensi waktu) karena proses pengelusian dipercepat dengan memvakumkan kolom2. KCV juga dapat memisahkan sampel dalam jumlah banyak.

Keuntungan dari kromatografi kolom ini adalah sebagai berikut:a. Dapat digunakan untuk sampel atau konstituen yang sangat kecil.b. Cukup selektif terutama untuk senyawa-senyawa organik multi komponen.c. Proses pemisahan dalam dilakukan dalam waktu yang relatif singkat.d. Seringkali murah dan sederhana karena umumnya tidak memerlukan alat yang mahal dan rumit

BAB IIIKESIMPULAN

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahanmolekulberdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Jenis-jenis kromatografi diantaranyaa. Kromatografi lapis tipis, dimana salah satu jenisnya adalah kromatografi preparativeb. Kromatografi kertas c. Kromatografi kolom yang berdasarkan fase diam dan fase geraknya terdiri dari kromatografi fase normal dan kromatografi fase terbalik. Namun, Jika kolom kromatografi dikemas kering dalam keadaan vakum, maka metode kromatografi tersebut disebut kromatografi cair Vakum

DAFTAR PUSTAKA

Alimin, dkk. Kimia Analitik. Makassar: AlauddinIskandar, Yusuf. 2007. Karakteristik Zat Metabolit Sekunder Dalam Ekstrak Bunga Krisan (Chrysanthemum cinerariaefolium) Sebagai Bahan Pembuatan Biopestisida.FMIPA. SemarangKhopkar, SM.2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI-Press. Jakarta.Kristanti, Alfinda Novi., dkk. 2008. Buku Ajar Fitokimia. Surabaya: Airlangga UniversityPadmawinata, K., 1991, Pengantar Kromatografi, Edisi Ke dua, ITB Press, Bandung. Terjemahan: Introduction to Chromatography, Gritter, R.J.: J. M. Bobbit; A. E Schwarting, 1985, Holden Day Inc., USA.Rahman, Abdul.,dkk., 2008, Kimia Farnmasi Analisis, PustakaPelajar: Yogyakarta.Rudi,L. 2010. Penuntun Dasar-Dasar Pemisahan Analitik. Universitas Haluoleo. KendariSoebagio,dkk. 2002. Kimia Analitik. Malang : FMIPA UNMSofia, Lenny. 2006. Isolasi dan Uji Bioaktifitas Kandungan Kimia Utama Puding Merahdengan Metoda Uji Brine Shrimp. USU Repository. Sumatera UtaraYazid, Estien. 2005.Kimia Fisik untuk Paramedis. ANDI. Yogyakarta.

1ii